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Lo de virologa

Actividad Individual:

Cada estudiante debe proponer 1 artculo cientfico en el que se hayan empleado vectores virales.

Actividad Grupal:

El equipo debe abordar los siguientes temas en el foro de trabajo colaborativo:

Qu son los vectores virales?

https://www.news-medical.net/life-sciences/What-are-Viral-Vectors-(Spanish).aspx

http://www.fihu-diagnostico.org.pe/revista/numeros/2000/novdic00/323-328.html

http://revistageneticamedica.com/blog/tag/vectores-virales/

https://www.ugr.es/~eianez/Biotecnologia/tergen-1.htm

Qu familias de virus son empleados en terapia gnica?

Para qu enfermedades es recomendable emplear vectores virales?

http://www.monografias.com/docs111/uso-vectores-virales-terapia-genica-consecuencias-y-beneficios/uso-
vectores-virales-terapia-genica-consecuencias-y-beneficios.shtml

Explique los pasos para la creacin de un vector viral

http://recursos.cnice.mec.es/biosfera/alumno/2bachillerato/biotec/contenidos3.htm

Cmo se emplean los vectores virales en protocolos de vacunacin?

Cmo se ha planteado el uso de plantas para el desarrollo de vacunas en humanos?

Plantear el modelo de un vector empleado en vacunacin.

Bibliografa

1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2629647/
2. http://dasher.wustl.edu/kathy/papers/kresina-4-77-00.pdf
3. http://kaylab.stanford.edu/manuscripts/NGR-THOMAS-2003.pdf
4. http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fnmol.2014.00076/full
5. http://web.stanford.edu/dept/EHS/prod/researchlab/bio/docs/Working_with_Viral_Vectors.pdf
2. A partir de la segunda actividad, el grupo debe disear una pgina Web empleando la herramienta Wix disponible en
http://es.wix.com/. Dentro de esta deben incluir los 7 aspectos mencionados en el punto anterior

La pgina Web debe ser original (no se acepta similitudes con otras pginas web relacionadas) y contener imgenes,
videos, links de consulta, entre otros que enriquezca la temtica propuesta. Para el diseo de la Wix pueden apoyarse en
el siguiente tutorial: https://youtu.be/2RH8ccls_aE No olviden incluir literatura indexada.

La actividad finaliza el 29 de Noviembre a las 23:55. Los estudiantes que no realicen a tiempo sus aportes (antes de 3 das
para la fecha de cierre) no se les calificar la actividad.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2629647/pdf/bph0157-0153.pdf
Qu son los vectores virales?

Concepto de vector

Entendemos por vectores a los sistemas que utilizamos como ayuda en el proceso de transferencia de un gen exgeno al
interior de la clula. Ellos facilitan la entrada y biodisponibilidad intracelular del material gentico a transducir y, por
consiguiente, su funcionamiento correcto. Se ha utilizado una gran variedad de vectores con fines experimentales y de
forma genrica los podemos clasificar en: vectores no virales y vectores virales

Vectores no virales

Los vectores no virales engloban aquellas tcnicas de transduccin donde el material gentico es introducido utilizando
tanto mtodos qumicos (fosfato clcico, liposomas) como fsicos (biobalstica, electroporacin, microinyeccin). Los Commented [F1]: Poner grafiacas que expliquen cada no
vectores qumicos fueron los primeros en utilizarse, alguno de ellos, como el fosfato de calcio y los liposomas, en la dcada de estos sucesos
de los sesenta y setenta del siglo pasado aunque no se lograron buenas eficiencias en la transduccin hasta mediados de
Mandar un link de cada una de estas tecn9cas en videos de
los ochenta. La utilizacin del fosfato de calcio se basa en la capacidad que presentan los iones calcio para precipitar el you tuve
ADN provocando que la clula, mediante endocitosis, introduzca el ADN en su interior.

No es una tcnica que provoque toxicidad en las clulas, pero la expresin del transgn es transitoria y con una eficacia
de transfeccin cercana al 10%. Su utilizacin se ve reducida a cultivos celulares en aplicaciones ex vivo. Los liposomas
constituyen bolsas rodeadas de una membrana lipdica, a semejanza de una clula eucariota animal, capaces de introducir
ADN en la clula diana. Los liposomas catinicos interaccionan tanto con el material gentico a transferir como con las
membranas celulares que deben atravesar, debido a la presencia de cargas netas negativas originadas por los grupos
fosfato en el ADN y por residuos del cido silico de la superficie celular. As, los lpidos catinicos condensan el ADN y, ya
en forma de complejos transfectantes, se unen a las protenas azucaradas de la membrana plasmtica mediante enlaces
electrostticos.

Disparos de proyectiles

El disparo de partculas, biolstica o bombardeo de microproyectiles, el plsmido de ADN a transferir es situado sobre la
superficie de pequeas gotas de 1 a 3 micras de dimetro de oro o tungsteno que posteriormente son aceleradas,
disparadas bien mediante una descarga elctrica o por un pulso de gas, hacia la clula diana. La fuerza fsica del impacto
supera la barrera de la membrana celular. An as, la capacidad de penetracin es limitada y se utilizan con frecuencia en
cultivos de lneas celulares, epidermis, msculo e hgado.

Microproyectiles

Los microproyectiles constituyen un mtodo efectivo de transferir genes en modelos tanto in vitro como in vivo. Entre las
ventajas que presenta este mtodo, y que le confieren un potencial de aplicabilidad general, destacan su fcil manejo y
que un nico disparo puede producir integraciones mltiples. Sin embargo, presenta algunas desventajas, como que en
la zona de descarga se produce muerte celular; adems, dependiendo de la rigidez de los tejidos, la procedencia del ADN
extrao y la capacidad de transcripcin intrnseca aparecen grandes variaciones en la eficiencia de la expresin de los
genes.

Adems, presenta una utilizacin potencial en la transformacin de clulas vegetales, en la creacin de plantas
transgnicas tanto monocotiledneas (maz, arroz, trigo, avena y caa de azcar) como en dicotiledneas (soja, tabaco y
algodn).

Microinyeccin

La microinyeccin, en el que el ADN es introducido por inyeccin directamente en el ncleo de las clulas gracias a la
ayuda de un micromanipulador, evitando de este modo la degradacin citoplasmtica y lisosomal. Las clulas que
sobreviven este dao y han insertado el material gentico presentan una alta eficacia de su expresin. Esta tcnica es
muy laboriosa y necesita clulas aisladas para su realizacin.
Electroporacin

La Electroporacin es la aplicacin de una corriente elctrica a clulas es capaz de abrir poros en la membrana celular que
permiten la entrada del gen en su interior. Entre sus ventajas se encuentran que las clulas pueden ser aisladas del
organismo y sometidas a un control de calidad en el que se realiza una seleccin de las mejores clulas que son cultivadas
en el laboratorio antes de ser implantadas en el paciente. Entre sus desventajas est el hecho de que muchas clulas
mueren al no soportar el choque elctrico, por lo que no es la forma ms indicada en algunos tipos celulares, aunque s
en clulas con una alta tasa de proliferacin.

Mtodos qumicos

Liposomas catinicos (Lipoplexes): Se emplean lpidos catinicos (cargados positivamente) para encapsular DNA.
Presentan niveles de eficacia aceptablemente altos, inmunogenicidad casi nula, capacidad de transporte de DNA sin
restriccin de tamao, gran estabilidad de almacenaje y sencillez de uso. Sin embargo, son difciles de caracterizar
estructuralmente y no presentan especificidad celular.

Quimeras HVJ-liposomas (virosomas): liposoma quimrico obtenido por la fusin con el virus HVJ. Se combinan las
ventajas del vector no viral con la capacidad de unin celular y la facilidad de fusin aportadas por las protenas de la
envuelta vrica.

Conjugados moleculares (poliplexes): molculas bifuncionales obtenidas por unin covalente entre un policatin que
posibilita la unin y condensacin de DNA, junto con un ligando o anticuerpo monoclonal que confiere especificidad
celular. Estas molculas forman complejos con DNA de estructura definida que permite su fcil captura por la clula,
siguiendo una ruta endoctica mediada por receptor.

Policationes (poliplexes): complejo policatin-DNA. Permite la interaccin con el DNA, su condensacin y la interaccin
de los complejos resultantes con las membranas celulares.

Vectores de naturaleza peptdica (peptiplexes): los dos tipos principales son los que emplean protenas multidominio
(basadas en el carcter modular de las toxinas bacterianas) y pptidos modulares (aplicacin de pptidos con
funcionalidades especficas).

Vectores virales

Los virus constituyen, probablemente, la forma de vida ms simple y representan el ente natural ms evolucionado para
transferir material gnico exgeno al interior celular. Hasta el da de hoy, el ser humano no ha sido capaz de crear
artificialmente un sistema que supere la eficiencia de transferencia gnica que han alcanzado los virus tras millones de
aos de evolucin. Este hecho ha llevado al empleo y manipulacin de los virus como vectores para transferir material
gnico con fines experimentales y teraputicos.

Los mtodos utilizados para construir los distintos vectores virales siguen un patrn similar. Las funciones codificadas por
los virus pueden dividirse en elementos que actan en cis o en trans. Las secuencias que actan en cis, como los orgenes
de replicacin o la secuencia de encapsidacin, deben encontrarse en el propio genoma del vector viral; mientras que los
elementos que actan en trans, como las protenas estructurales y/o de la envuelta o la maquinaria necesaria para la
replicacin viral, no es necesario que sean codificados por el propio genoma viral y pueden ser suministradas por clulas
transfectadas de forma estable con los genes que las codifican (clulas empaquetadoras), mediante plsmidos o virus
helper
El mtodo general para la construccin de vectores virales consiste en la sustitucin de elementos que actan en trans,
imprescindibles para la replicacin, por el material gnico que se desea transferir. De este modo se consiguen partculas
virales no replicativas pero infectivas, y con capacidad para transferir el material gnico teraputico introducido en su
genoma.

Los virus no pueden ser utilizados directamente como se encuentran en la naturaleza, necesitan ser modificados para
poder ser utilizados como vectores. Es necesario convertirlos en entes deficientes en replicacin en el interior de la clula
diana. Se trata, por tanto, de producir una anulacin parcial del genoma viral. Frecuentemente se retiran regiones
codificadoras de algunas protenas estructurales como gag, pol y env en los vectores retrovirales, o de los elementos E1
en adenovirus, que son remplazadas por el gen o genes de inters.

Estas partculas son incapaces de replicarse, pero mantienen la capacidad de infectar. As, el vector viral slo podr
multiplicarse o crecer en cultivos de lneas celulares modificadas genticamente que sobreexpresan la parte genoma viral
que ha sido delecionado; a estas clulas se las conoce como clulas de empaquetamiento.

Presentan el inconveniente de que, junto a la informacin gentica que pretendemos transducir, se encuentra el material
gentico propio del virus y que, en algunos casos, al igual que los adenovirus, pueden resultar inmunogenticas.

Qu familias de virus son empleados en terapia gnica?

El nmero de vectores virales disponibles es amplio y la eleccin del mismo depender del objetivo. Los retrovirus son los
vectores ms adecuados para la transferencia gnica ex vivo y si se desea la expresin prolongada del transgn.

Si se pretende modificar clulas madre hematopoyticas o leucocitos, la eleccin ms acertada sern los lentivirus.

En caso de una aproximacin in vivo buscando la expresin prolongada del transgn nos decantaremos por los AAV o los
adenovirus gutless, dependiendo del tamao del mismo. Los adenovirus de primera generacin son el vector viral ms
apropiado en aproximaciones de terapia gnica del cncer que requieren altos niveles de expresin del transgn deseado
y no se necesita la expresin prolongada del mismo, como es el caso de la terapia gnica con genes suicidas o la
inmunoterapia gnica.

ADENOVIRUS

Los adenovirus (Ad) pertenecen a la familia Adenoviridae. Se conocen casi 50 serotipos distintos de adenovirus humanos
divididos en 6 subgrupos (A a F) en funcin de sus caractersticas inmunolgicas, biolgicas y secuencias genmicas. Los
adenovirus humanos mejor caracterizados y ms utilizados en terapia gnica son los Ad tipo2 y Ad tipo5, ambos
pertenecientes al subgrupo C.

Estructura y organizacin genmica de la partcula adenoviral

Los adenovirus son virus DNA cuyo genoma esta encerrado en una cubierta proteica de geometra icosahdrica,
denominada cpside, de 70-100 nm de dimetro, sin envuelta. La cpside est formada por tres protenas principales: el
hexn, la base pentona y la fibra con una protuberancia terminal, adems de otras protenas menores VI, VIII, IX, IIIa y
IVa2 (Fig. 2).

El genoma viral es una molcula lineal de DNA de doble hebra de unas 36 Kb con una protena terminal (TP) unida
covalentemente a cada uno de sus extremos 5. En ambos extremos del genoma viral se definen unas secuencias cortas
denominadas ITRs que constituyen el origen de replicacin del DNA.

El DNA viral esta ntimamente asociado con una protena muy bsica (VII) y con un pequeo pptido denominado . Otra
protena, denominada V, est empaquetada con este complejo DNA-protena y parece que constituye una unin
estructural con la cpside, a travs de la protena VI. El virus contiene, adems, una proteasa codificada por el genoma
viral (Pr) que es necesaria para el procesamiento de algunas protenas estructurales y para producir virus infecciosos
maduros
Vectores retrovirales

Los retrovirus son virus envueltos, cuyo cido nucleico es el RNA. Sus principales ventajas son que no inducen inmunidad
e integran su material gentico dentro del genoma celular. Por otra parte, muchos de ellos nicamente pueden introducir
el DNA en clulas que se estn dividiendo y pueden inducir mutaciones no esperadas (mutagnesis por insercin).

Los retrovirus comprenden una gran clase de virus desarrollados que contienen ARN de cadena sencilla como genoma
viral. Durante el ciclo de vida vrico normal, el ARN vrico se transcribe a la inversa para producir ADN de cadena doble
(gracias a la accin del enzima reversotranscriptasa) que se integra en el genoma de la clula hospedadora y se expresa
en perodos prolongados. Como resultado, las clulas infectadas vierten virus de forma constante sin dao aparente en
la clula hospedadora. El genoma viral es pequeo (aproximadamente 10 kilobases) , y su organizacin prototpica es
muy sencilla, comprendiendo tres genes que codifican:

gag, el grupo especfico de antgenos, protena de la cpsida y de la matriz sin actividad enzimtica.
pol , la transcriptasa inversa, proteasa e integrasa.
env , protenas de la envuelta del virus (transmenbrana y superficial).

El genoma tambin incluye una secuencia necesaria para el empaquetamiento del ARN vrico, otras secuencias para el
corte y empalme entre donador y aceptor y para la generacin de ARNs mensajeros envueltos de forma separada. De
forma importante, la mayora de los retrovirus se pueden integrar slo en clulas que se replican, aunque el virus de la
inmunodeficiencia humana (HIV) parece ser una excepcin. Esta propiedad, poseida por la mayora de los retrovirus,
restringe claramente su uso como vector para la terapia gnica.

Los retrovirus han sido estudiados de forma intensa en los ltimos veinte aos, en parte porque una categora de retrovirus
causa tumores en animales. Esta capacidad de causar tumores y trasnsformar las propiedades de desarrollo de las clulas
en un cultivo, se entiende bien ahora, y est basada al menos en dos mecanismos bsicos:

El primero es que ciertos virus han incorporado protooncogenes activados que por una mutacin han adquirido
la capacidad de transformar el desarrollo celular. La habilidad del retrovirus para transformar clulas por este
mecanismo no es asunto de importancia en la terapia gnica, porque los oncogenes son siempre suprimidos de
los vector.

El segundo mecanismo de transformacin por retrovirus, resulta de una mutagnesis insercional sobre la
integracin de un genoma vrico. Debido a que el LTR vrico tiene actividad promotora e incrementadora y est
presente en ambos finales del genoma, la insercin de una secuencia de LTR adyacente a un protooncogn celular
puede llevar a una expresin inapropiada de una protena involucrada en la regulacin celular. Este mecanismo
fue estudiado extensamente en la activacin del gen c-my por el virus de la leucosis aviar (ALV).

Los extremos del genoma cuando ya es ADN son llamados LTRs, ( long terminal repeats) e incluye actividades promotoras
incrementadoras y secuencias involucradas en la integracin.

Esencialmente los vectores de retrovirus son relativamente simples, conteniendo en los extremos 5' y 3' secuencias LTR,
una secuencia de empaquetamiento y una unidad de transcripcin compuesta por el gen o genes de inters. Para
desarrollar este vector, se deben suministrar las funciones perdidas del virus en "trans" usando la as llamada lnea de
clulas envase. Esta clula est creada para contener copias integradas de los genes gag-pol-env, pero no la seal de
empaquetamiento, as las secuencias del virus ayudante no llegan a ser empaquetadas. Rasgos adicionales aadidos o
quitados del vector o la lnea de clula envase reflejan intentos de hacer los vectores ms eficaces o reducir la posibilidad
de contaminacin del virus ayudante.

La principal ventaja de los vectores de retrovirus es que se integran y son capaces, potencialmente, de una expresin a
largo plazo. Pueden ser desarrollados en cantidades relativamente grandes, pero hay que tener precaucin para asegurar
la ausencia del virus ayudante.

VIRUS ADENOASOCIADOS (AAV)

El AAV es un virus muy pequeo, muy simple, no autnomo, que contiene ADN lineal de cadena sencilla. El virus requiere
la coinfeccin con adenovirus u otros para replicarse. El AAV est extendido en la poblacin humana, como evidencian los
anticuerpos al virus, pero no est asociado con ninguna enfermedad conocida.

La organizacin del genoma es extremadamente simple, comprendiendo slo dos genes:

rep, que codifica una familia de protenas superpuestas involucradas en la replicacin e integracin.
cap, que codifica una familia de tres protenas estructurales vricas.

Los extremos del genoma comprenden repeticiones terminales (TR) de cerca de 145 nucletidos.

Los AAV de tipo salvaje pueden integrar su ADN en el cromosoma del hospedador en ausencia del virus ayudante. Esta
integracin puede ocurrir con ms frecuencia en regiones del cromosoma 19 y est involucrada la protena rep.

Los vectores de base AAV son extremadamente simples. Contienen slo las secuencias vricas TR que bordean la unidad
de transcripcin de inters. El nico problema parece ser que la longitud del vector ADN no puede exceder mucho de la
longitud del genoma viral con 4680 nucletidos. Generalmente, el desarrollo de vectores AAV es voluminoso y lleva
consigo la introduccin en la clula hospedadora, no solo del propio vector, sino tambin de un plsmido que codifica rep
y cap para proveer de las funciones de virus ayudante.

La ventaja potencial del vector AAV es que parece capaz de una expresin a largo plazo en clulas que no se dividen,
posiblemente aunque no necesariamente porque el ADN vrico lo integra. Los vectores son estructuralmente simples, y
pueden de todas formas provocar menos respuesta de la clula hospedadora que del adenovirus. Su principal limitacin
en el presente es que los vectores son difciles de desarrollar en grandes cantidades.

HERPESVIRUS

El virus presenta un material gentico compuesto por ADN bicatenario lineal de 100 a 250 Kb. En el virus del herpes simplex
ronda las 50 Kb. mientras que en citomegalovirus las 220 Kb.

En la mayora de los casos el virus presenta dos trozos de ADN bicatenario lineal unidos dando una estructura nica
llamadas molcula L y molcula S. Poseen en sus extremos secuencias repetidas terminales ( TRL y TRS ) que son los sitios
mediante los cuales permite unirse a las dos molculas. As, al unirse pueden hacerlo en diferentes orientaciones segn la
combinacin de las diferentes secuencias creando as cuatro posibilidades o tambin llamados ismeros.
El potencial de estos virus como vectores gnicos recae en la habilidad de llevar grandes secuencias de ADN extrao
insertadas y su habilidad para establecer infecciones latentes de larga duracin en las cuales el genoma del virus existe
como un episoma con efectos no aparentes en la clula hospedadora . Los herpesvirus son , de cualquier manera,
enormemente diversos, variando en su tamao de genoma, en la organizacin del genoma, en el contenido gentico, en
las clulas sobre las que acta y la patognesis, y en consecuencia diferentes herpesvirus tienen muy diferentes usos
potenciales en reparto de genes. La naturaleza de la latencia viral es de particular relevancia.

Un inconveniente mayor al uso de estos virus en terapia gnica, de cualquier manera, es el hecho de que gamma-
herpesvirus estn asociados con daos linfoproliferativos y en algunos momentos con malignidad .El uso de gamma-
herpesvirus requerir la identificacin y eliminacin de estos genes involucrados en la transformacin celular y el
mantenimiento de aquellas funciones necesarias para la replicacin del virus y el mantenimiento del plsmido viral.

Los lentivirus

Los letivirus pertenecen al grupo de los retrovirus, muchos de los vectores lentivirus que se utilizan en terapia gnica se
basan en el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Los vectores HIV pueden permitir insertos de genes grandes e
inducir su expresin por mayor tiempo porque se integran en el cromosoma. A diferencia de los retrovirus convencionales,
los lentivirus tambin pueden infectar de forma eficiente a clulas que no se estn dividiendo y por lo tanto se pueden
utilizar para la expresin del transgen en las neuronas, de hecho, ya se han logrado introducir exitosamente construcciones
con intrones en lentivirus

Para qu enfermedades es recomendable emplear vectores virales?

Los vectores Virales se pueden aplicar en terapia gnica para tratar diversas enfermedades tales como cncer,
enfermedades metablicas, defectos del corazn y desordenes neurodegenerativa.

La Mayora de los vectores virales se inyectan generalmente en sangre, tumores o tejido del msculo, pero los vectores
adenoviral y adeno asociados se pueden tambin inocular va inhalacin, estos vectores tienen la capacidad de cruzar la
barrera hematoenceflica sobre la administracin intravenosa ha llevado a la posibilidad de la terapia gnica perinatal.
Esta aproximacin est llegando a ser esencial en tratar las enfermedades que manifiestan durante el escenario neonatal
(o an en el tero).

a terapia gnica ha demostrado ser factible en algunas enfermedades humanas. En concreto, la terapia gnica mediada
por el uso de vectores retrovirales y dirigida al tejido hematopoytico se ha utilizado para el tratamiento de
inmunodeficiencia por dficit de ADA, adrenoleukodistrofia, y otras. No obstante, el uso de estos vectores que se integran
en el ADN de la clula hospedadora ha sido asociado a efectos adversos graves, por lo que se han propuesto mejoras que
aumentan la bioseguridad. Por otra parte, el uso de vectores no integrativos, como los adenoasociados, ha mostrado
recientemente xito en el tratamiento de la hemofilia tipo B, debida a dficit en el factor IX de coagulacin, y se ha llegado
a la fase de comercializacin para el caso de hipercolesterolemia por mutaciones en la enzima LPL.

http://www.fundacionmencia.org/es/enfermedades-geneticas/terapia-genica/
Conclusiones

El xito de la terapia gnica se fundamenta en los siguientes requisitos:

Una transferencia eficaz en las clulas diana.

La estabilidad de los genes introducidos, que deben integrarse, preferiblemente, en un lugar especfico del genoma de
la clula blanco.

La consecucin de una expresin estable y apropiada de la informacin gentica introducida.

A pesar de los avances obtenidos en el diseo de los diferentes tipos de vectores, hasta el momento ningn sistema
vectorial cumple con todas las condiciones para convertirlo en ideal. Los vectores no virales resultan ms econmicos y
ms fciles de producir que los virales; adems, su falta de antigenicidad hace posible que puedan ser administrados
repetidamente y con menores riesgos patolgicos que los vectores virales. Con todo, los sistemas virales resultan ms
eficientes y presentan niveles de expresin ms altos y duraderos en el tiempo. Los vectores retrovirales son los ms
utilizados, por lo que debido a su eficiencia y seguridad se han iniciado ya los primeros ensayos clnicos.

Explique los pasos para la creacin de un vector viral

A la hora de elegir un mtodo para construir adenovirus recombinantes hay otra serie de puntos que se deben considerar:
1) la laboriosidad del mtodo,

2) el tiempo que se requiere para obtener el nuevo adenovirus recombinante,

3) la posibilidad de que se produzcan modificaciones difciles de detectar en el genoma adenoviral

4) la formacin de adenovirus con capacidad replicativa.

En los ltimos aos han aparecido nuevos mtodos, ms o menos eficaces y laboriosos, para la construccin de adenovirus
de primera generacin basados en la recombinacin in vitro en E. coli rec+ o el empleo de csmidos. As, frente a los
sistemas basados en la recombinacin en clulas de mamfero, existen otros mtodos basados en la recombinacin en E.
coli rec+ antes de la transfeccin en las clulas empaquetadoras con el genoma del nuevo virus recombinante.

La principal ventaja que ofrece este tipo de mtodo es el ahorro de tiempo y la ausencia de virus helper o parental
contaminante en la preparacin adenoviral. Esto supondra que, en principio, no fuera necesario la seleccin de una sola
partcula viral. El mayor inconveniente de estos sistemas, y de todos los que emplean el genoma viral en forma de
plsmido, es la inestabilidad de los plsmidos que contienen el genoma adenoviral. Esta inestabilidad es consecuencia de
su gran tamao, que a menudo hacen complicada su manipulacin y produccin, y de recombinaciones favorecidas por la
presencia de secuencias palindrmicas (ITRs).

El mayor inconveniente que es encuentra cuando queremos escalar la produccin de adenovirus, para su utilizacin en
ensayos in vivo o en protocolos clnicos, es la generacin de adenovirus con capacidad replicativa (RCAs).

Los RCAs se forman por recombinacin entre el genoma adenoviral recombinante y las secuencias adenovirales homlogas
presentes en el genoma de la clula empaquetadora. La recombinacin entre dichas regiones puede dar lugar a adenovirus
recombinantes con capacidad replicativa por adquisicin de la regin E1 presente en la clula empaquetadora. La
probabilidad de que se produzca este fenmeno es pequea pero se incrementa con el nmero de pases. Para solucionar
este inconveniente se han generado nuevas lneas de clulas empaquetadoras (como las clulas PER.C6 y nuevos genomas
adenovirales que no comparten secuencias homlogas solapantes.
Cmo se emplean los vectores virales en protocolos de vacunacin?

Cmo se ha planteado el uso de plantas para el desarrollo de vacunas en humanos?

http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0583-76932002000300016

http://porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo=1&note=74

Tradicionalmente los antgenos a usarse como vacunas son extrados directamente de los patgenos cultivados en el
laboratorio o son sintetizados por bacterias u hongos recombinantes. Estos sistemas requieren de mtodos laboriosos y
costosos de produccin, fermentacin y purificacin que acrecientan los costos del producto final.

Como las clulas vegetales comparten procesos biosintticos bsicos con clulas humanas, tericamente es posible alterar
genticamente plantas para que sinteticen protenas humanas o protenas de patgenos que normalmente infectan
humanos. Y, si estas protenas pudieran usarse luego de un procesamiento simple, an cuando el costo inicial de
manipulacin gentica sea alto, la produccin a larga escala sera barata. An ms, la clula vegetal puede actuar como
un sistema natural de bio-encapsulamiento: las capas de pared celular, membrana celular y membrana interna encapsulan
y protegen al antgeno de la barrera gstrica y favorecen la activacin del sistema inmune intestinal

La produccin de protenas recombinantes en plantas tiene muchas ventajas potenciales para generar compuestos
farmacuticos de importancia en medicina clnica.

1) los sistemas vegetales son ms econmicos que la infraestructura industrial que se basa en el uso de sistemas de
fermentacin o en biorreactores.

2) est disponible la tecnologa para cosechar y procesar plantas y sus productos a escala industrial.

3) el requisito de la purificacin del compuesto puede ser eliminado cuando el tejido de la planta que contiene la protena
recombinante se utiliza como alimento como en el caso de las vacunas comestibles.

4) se puede dirigir a las protenas recombinantes a determinados compartimientos intracelulares, o expresarlos


directamente en esos compartimientos (como por ejemplo el cloroplasto).

5) se puede producir la protena recombinante en plantas a escala industrial. Finalmente, los riesgos a la salud que se
presentan por posible contaminacin del producto recombinante con patgenos humanos son mnimos. Hay dos reas en
donde esta tecnologa est teniendo un impacto importante, en la produccin de anticuerpos y sus receptores y en la
produccin de vacunas comestibles.

Produccin de anticuerpos en plantas transgnicas


las plantas han demostrado ser sistemas verstiles de produccin para muchas formas de anticuerpos como IgG e IgA, IgG
/ IgA quimricos y otros. Las plantas tienen un gran potencial como fuente virtualmente ilimitada de anticuerpos
monoclonales baratos (llamados "planticuerpos") para terapia humana y animal.

La mayora de los anticuerpos expresados hasta la fecha han sido en tabaco, aunque tambin se han utilizado papa, soya,
alfalfa, arroz y trigo. La ventaja principal de usar hojas (como en tabaco y alfalfa) para producir el anticuerpo es el
rendimiento. Tanto la alfalfa como el tabaco pueden ser cosechados varias veces al ao, con una produccin potencial de
biomasa por ao de 17 toneladas / ha y > 50 toneladas / ha, respectivamente.
Los anticuerpos producidos en plantas son bastante estables tanto a temperatura ambiente a 4 C . El material vegetal
que contiene en al anticuerpo se puede almacenar y la purificacin se puede realizar en una planta de procesamiento que
no necesita estar cerca del lugar en donde estn las plantas y se puede utilizar todo el ao. Hay muchos ejemplos de
anticuerpos y sus receptores producidos exitosamente en plantas, aunque slo uno de stos se ha probado en seres
humanos: un anticuerpo secretor quimrico de IgG / IgA contra un antgeno superficial de Streptococcus mutans, el agente
causal de la caries dental. Este anticuerpo producido en tabaco fue aplicado tpicamente a los dientes de varios
voluntarios y se encontr que era tan eficaz como un IgG producido en un hibridoma de ratn para prevenir la
recolonizacin de las encas por S. mutans otro ejemplo, un anticuerpo contra el virus del herpes (HSV) fue producido en
soya y fue muy eficaz en la prevencin de la infeccin vaginal por HSV en ratn.

Aunque ha habido una cierta preocupacin por la inmunogenicidad potencial y la capacidad alergnica de los
planticuerpos, es probable que stos no presenten problemas para la mayora de la gente porque las glucoprotenas de
plantas son ubicuas en la dieta humana. En este sentido, no hubo evidencia de una reaccin alrgica a un anticuerpo
humano antiratn (HAMA) en 60 pacientes que recibieron la aplicacin oral tpica de IgA secretora especfica para S.
mutans.

Vacunas comestibles

El inters para hacer estos experimentos fue que determinadas protenas inmunognicas clave del patgeno se podran
sintetizar en plantas y despus usar el tejido vegetal como vacunas comestibles en seres humanos o en animales. Se ha
demostrado que esta idea es totalmente viable usando diversas protenas bacterianas y virales.

Los antgenos derivados de plantas han inducido respuestas inmunes a nivel de mucosa y de suero, cuando han sido
administrados tanto con inyecciones como por va oral en animales de laboratorio y, en varios experimentos, los han
protegido contra el patgeno.

Actualmente se est ensayando la modificacin del genoma de algunas plantas comestibles de manera que produzcan
ciertas protenas inmunognicas (antgenos) del patgeno. De esta forma, cuando las plantas son ingeridas, desencadenan
la respuesta inmune que confiere inmunidad contra los agentes patgenos especficos. A travs de este procedimiento el
tejido vegetal puede emplearse como vacunas comestibles para seres humanos y otros animales.

En muchos casos, se ha demostrado que los antgenos expresados en plantas transgnicas han inducido respuestas
inmunes cuando fueron administrados tanto con inyecciones, como por va oral en animales de laboratorio. Tambin
dieron buenos resultados las pruebas clnicas realizadas en voluntarios humanos en las cuales los antgenos consumidos
por va oral a partir de tejido vegetal fueron capaces de inducir una importante respuesta inmune. Por esta razn se
considera que las vacunas preparadas en plantas tienen un gran potencial.

Como se hace una vacuna comestible?

Debido a que en las plantas es posible expresar genes de cualquier origen, inclusive aquellos provenientes de virus o de
bacterias que desencadenan una respuesta inmune en humanos y otros animales, estos organismos pueden ser usados
exitosamente como fbricas de vacunas. Los pasos a seguir para la obtencin de una vacuna comestible, se resumen en
la siguiente imagen y se explican a continuacin:
Paso 1 y 2: identificacin de la protena antignica de un virus o bacteria capaz de desencadenar una respuesta inmune,
y aislar el gen que lo codifica. A continuacin se clona (inserta) dicho gen junto a otro que le confiere resistencia a algn
antibitico en un vector (por ejemplo, un plsmido) y se introduce en bacterias, para obtener mltiples copias. El plsmido
con el gen que codifica para el antgeno debe ser transferido a las clulas vegetales. Los mtodos que se emplean para
transformar plantas pueden ser: el bombardeo con microproyectiles o la transformacin mediada por la bacteria
Agrobacterium tumefaciens.

Paso 3: se realiza el reconocimiento y aislamiento de las clulas transformadas, es decir, aquellas que sobrevivieron en un
medio que contiene antibitico, por poseer el gen que les confiere resistencia a ese medicamento especfico. La presencia
del gen de resistencia al antibitico indica que tambin el gen de inters entr en las clulas vegetales.

Paso 4: las clulas vegetales se multiplican y se obtienen masas de clulas (callos) que se cultivan en medios nutritivos con
hormonas. De esta forma se estimula el crecimiento de races y tallos que dan lugar a plantas completas, un proceso
denominado organognesis.

Paso 5: Finalmente, se obtienen plantas que expresan el antgeno en su parte comestible (por ejemplo el tubrculo en las
papas). Las plantas transgnicas obtenidas se pueden multiplicar para obtener un gran nmero de ellas, mediante la
tcnica de micropropagacin.

Un parmetro importante a tener en cuenta es la eleccin de la planta a transformar, ya que debe ser simple de cultivar,
de crecimiento rpido y preferentemente, debe ser ingerida cruda ya que el calor podra disminuir la capacidad de
inmunizacin.

Plantear el modelo de un vector empleado en vacunacin.

http://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas-microbiologia-clinica-28-articulo-el-desarrollo-nuevas-
vacunas-S0213005X15002700

Vacunas recombinantes por vectores

Consisten en la introduccin de genes en vectores vivos, microorganismos no patgenos para el hombre de forma natural,
o tras someterlos a un proceso de atenuacin, que ulteriormente inoculados aporten todas las ventajas que proporciona
una vacuna viva facilitando la induccin de potentes respuestas de clulasT (incluidos LT citotxicos)6. Vacunas
prometedoras frente al citomegalovirus y el VRS emplean esta tecnologa. El vector ideal es aquel que posea un genoma
grande y que sea fcil de atenuar y producir. Otros vectores utilizados son enterobacterias como Salmonella, el bacilo de
Calmette-Gurin y otros virus, como poxvirus, adenovirus y flavivirus35.

Una variedad de estas vacunas son las llamadas vacunas recombinantes vivas. En este caso los genes de un virus se
introducen en otro serotipo del mismo virus pero atenuado. Esta tcnica se investiga en el desarrollo de una vacuna frente
al virus parainfluenza y dengue introduciendo los genes de 2 y 3 serotipos en el interior de un tercero y cuarto serotipo
atenuado, respectivamente36. Otra variante reciente es la obtencin de esos genes por procedimientos sintticos en el
laboratorio, vehiculizados en vectores modificados que pierden su capacidad de replicacin, denominndose vacunas de
replicones. Algunos alphavirus, tales como el virus Sindbis, el Semliki y el virus de la encefalitis equina venezolana, han
mejorado sensiblemente este campo. Estos replicones tienen la capacidad de introducirse en el interior de las clulas
humanas y expresar los genes insertados en su citoplasma, dando lugar a una inmunogenicidad incrementada pero sin
llegar a replicarse.
Vacunas vectores o de organismos recombinantes vivos: utilizan microorganismos no patgenos (virus o bacterias) a los
cuales se les incorporaron, mediante ingeniera gentica, genes de agentes patgenos que codifican para los antgenos
que desencadenan la respuesta inmune. El virus vacunal es uno de los vectores recombinantes ms utilizados en este tipo
de vacunas, ya que tiene un genoma amplio, totalmente secuenciado, y que permite acomodar varios genes forneos en
su interior. De esta manera, se ha desarrollado una vacuna contra la rabia al insertar en el genoma de este virus, un gen
del virus rbico, la cual provoca la respuesta inmune en el organismo hospedador. Tambin se han ensayado las
expresiones de genes que codifican para antgenos de virus de la hepatitis B, de la gripe y del herpes simple. Mediante
este mtodo, se podran desarrollar vacunas que inmunicen simultneamente para varias enfermedades, al insertar en el
virus recombinante varios genes de distintos organismos patgenos al mismo tiempo.

El paramyxovirus es una familia de virus que incluye agentes de enfermedad comunes como sarampin, paperas y
parainfluenza. La estructura genmica de estos virus es tal que se le podran insertar genes adicionales (coloreado en rojo
en la figura) que codificase una amplia variedad de protenas de fuentes diferentes. As el virus del sarampin ofrece varias
ventajas como portador de genes que provoquen respuesta inmune contra otras enfermedades al mismo tiempo. Con
tecnologas recombinantes se hace posible extender el rango de enfermedades contra las que una sola cepa atenuada del
virus puede conferir inmunidad.

Vacunas de subunidades: para aquellos agentes infecciosos que no se pueden mantener en cultivo, se pueden aislar los
genes que codifican para las protenas que provocan la respuesta inmune (por ejemplo, las protenas de las cpsulas de
los virus). Mediante tcnicas de ingeniera gentica, esos genes se pueden clonar y expresar en un husped alternativo
tales como bacterias (Escherichia coli), levaduras (Saccharomyces Cerevisiae) o lneas celulares de mamferos. Luego de
insertado el gen de inters, la bacteria o levadura recombinante comienza a producir subunidades de protenas en grandes
cantidades, las cuales son recolectadas y purificadas para utilizarlas como vacunas. La vacuna contra la hepatitis B fue la
primera vacuna puesta en el mercado producida por este mtodo. Esta vacuna se desarroll aislando el gen del virus que
codifica para la protena (antgeno) llamada HBsAg que provoca respuesta inmune. El gen que produce esta protena se
introdujo por ingeniera gentica en levaduras (Saccharomyces Cerevisiae). El antgeno se produce a altos niveles en
grandes fermentadores, de modo seguro. En la actualidad, se est avanzando en vacunas de subunidades frente al virus
del herpes simple (HSV), y a la glosopeda (fiebre aftosa).

Las vacunas de vectores recombinantes son vacunas experimentales similares a las vacunas de ADN, pero usan virus o
bacterias atenuadas para introducir ADN microbiano en las clulas del cuerpo. "Vector" se refiere al virus o bacteria
utilizado como portador.

En la naturaleza, los virus de adhieren a las clulas e inyectan su material gentico en ellas. Los cientficos de los
laboratorios han aprovechado la ventaja de este proceso. Descubrieron cmo aislar los genomas grandes de ciertos virus
inofensivos o atenuados e insertar porciones de material gentico de otros microbios en ellos. Los virus portadores llevan
el ADN microbiano a las clulas. Las vacunas de vectores recombinantes simulan una infeccin natural y, por esta razn,
son efectivas para estimular el sistema inmunitario.

Tambin pueden usarse bacterias atenuadas como vectores. En estos casos, debido al material gentico introducido, la
bacteria exhibe los antgenos de otros microbios en su superficie. De hecho, las bacterias inofensivas imitan el
comportamiento de un microbio nocivo y provocan una respuesta inmunitaria.
Actualmente los investigadores trabajan en la elaboracin de vacunas de vectores recombinantes virales y bacterianas
contra VIH, rabia y sarampin.

En el desarrollo de este tipo de vacunas, en primer lugar se clonan dentro de plsmidos bacterianos (en violeta),
segmentos del ADN del virus que codifican para las protenas que provocan respuesta inmune (en rojo). El nuevo plsmido
se inserta dentro de levaduras, las cuales comienzan a sintetizar las protenas vricas de inters (en color azul). La vacuna
que se administra a los pacientes contiene estas protenas recombinantes (por ejemplo, las que constituyen la cscara
del virus), las cuales provocarn la respuesta inmune. Un ejemplo de este tipo de vacunas, lo constituye la anti-hepatitis
B

Vacunas vectores

Uso de microorganismos no patgenos que incorporan genes determinantes de antgenos protectores para ciertas
enfermedades. El virus vacunal es un buen candidato a ser vector de vacunas, ya que entre otras cosas, ha venido siendo
usado para la erradicacin de la viruela. Se trata de un poxvirus con un genoma de 187 kb, totalmente secuenciado, y que
permite acomodar varios genes forneos en su interior.

Si colocamos un gen bajo el control de un promotor del virus vacunal, este gen se expresa en el organismo hospedador.
Se han ensayado las expresiones de genes interesantes, como antgenos de virus de la rabia, de la hepatitis B, de la gripe
y del herpes simple. Otros ejemplos de virus vectores candidatos: adenovirus, poliovirus, varicelazoster. Vectores
bacterianos: la idea es expresar antgenos de bacterias patgenas en la superficie de bacterias no patgenas.

ELEMENTOS QUE PUEDO UTILIZAR DEL FORO

C Para qu enfermedades es recomendable emplear vectores virales?


La Mayora de los vectores virales se inyectan generalmente en sangre, tumores o tejido del msculo, pero los
vectores adenoviral y adeno-asociados se pueden tambin entregar va la inhalacin. Los procedimientos de la
Salida y la disponibilidad de las clulas de meta sobre salida son los factores de decisin importantes que
influencian importante la extensin de las partculas del vector.
Las principales aplicaciones de la terapia gnica son:
1) Enfermedades hereditarias: hemoglobinopatas, inmunodeficiencias, etc; se consideran enfermedades
potenciales de recibir terapia gnica somtica ya que se ha demostrado que el trasplante de mdula sea tiene
funciones curativas.
2) El cncer.
3) Enfermedades auto inmunitarias: artritis reumatoide, lupus eritematoso sistmico.
4) Otras como las infecciones: SIDA, las cardiopatas isqumicas y otras. Muchas de las enfermedades genticas y
adquiridas son potencialmente tratables con terapia gnica; sin embargo, esta teraputica ha tenido grandes
dificultades. Se han realizado estudios de fase I y II con diversos vectores virales y no virales, pero hay problemas
por resolver, como la eficacia y la respuesta inmunitaria del husped, adems de su inocuidad.
c. Para qu enfermedades es recomendable emplear
Vectores virales?

Los vectores virales son recomendables emplearlas en enfermedades como:

1) CANCER:

El tratamiento del cncer est dirigido a destruir tejido canceroso sin afectar el tejido sano. Sin embargo, a pesar de
los avances en ciruga, quimioterapia y radioterapia, este objetivo es rara vez obtenido, siendo imposible cuando
los tumores son inaccesibles o muy diseminados. Las estrategias de terapia gentica para el tratamiento del cncer
son diversas y pueden asociarse en cuatro grupos: el reemplazo de genes supresores de tumores, el bloqueo de
genes promotores de la divisin celular, la activacin gentica de pro-drogas citotxicas y la activacin de la
inmunidad especfica contra determinados tumores.

Las mutaciones de los genes supresores de tumores resultan en neoplasia. P53 es un gen que detiene el
crecimiento celular cuando el ADN ha sido daado. Los experimentos in vitro que reemplazan el gen daado con
una copia normal, demuestran una disminucin en la proliferacin celular y un aumento de apoptosis del tejido
tumoral. Pacientes con cncer de pulmn con mutaciones de p53 actualmente estn siendo tratados con un vector
retroviral que lleva el gen p53 normal, con variados resultados (11). Otros genes supresores de tumores son el gen
de retinoblastoma, y los genes APC, DPC4, asociados a neoplasia de colon. El bloqueo de genes promotores de
divisin celular puede realizarse a travs de secuencias de nucletidos anti-sentido, con la habilidad de formar un
hbrido no funcional con las secuencias de estos genes cancergenos. Los vectores virales expresan estos genes
anti-sentido dentro de las clulas, con el efecto de detener la divisin celular

2) ENFERMEDADES METABOLICAS
3) DEFECTOS DEL CORAZON
4) DESORDENES NEURODEGENERATIVE.

Cmo se emplean los vectores virales en protocolos


De vacunacin?

Un nivel cada vez mayor de informacin utiliza uso viral recombinante del vector como medio para la vacunacin.
Los Estudios han demostrado que, al antgeno-expresar vectores virales est utilizados, las reacciones sacadas del
T y del Linfocito B estn ms de par en par y de un mayor orden de magnitud que despus de inmunizacin de la
DNA solamente.
El mecanismo subyacente est en la naturaleza explicativa de los virus - el interior de la rplica de los vectores la
clula deseada, imita una infeccin viral y un resultado autnticos en el estmulo de reacciones antivirus naturales
en la clula de antgeno-expresin. Una mirada de vectores vaccneos virales puede tambin inducir apoptosis en
la clula de meta.
Los sistemas Virales del vector que han sido estudiados lo ms extensivamente posible en vacuno logia son
vectores del adenovirus y vectores del poxvirus. Los vectores virales Recombinantes tambin se han utilizado para
entregar productos del gen del virus (HIV) de inmunodeficiencia humana, conjuntamente con un alza de la protena
usando env-gp120 al explorar para la vacuna del VIH, pero los resultados han sido en gran parte decepcionantes.
Cmo se ha planteado el uso de plantas para el
Desarrollo de vacunas en humanos?

Una aplicacin importante de la tecnologa de plantas es en el desarrollo de vacunas que puedan utilizarse para
proteger a la poblacin general contra una enfermedad comn.
En este caso el objetivo es expresar no el anticuerpo sino el antgeno y dejar al sistema inmune de la persona que
genere los Ac correspondientes. Esto resultara en proteccin activa de larga duracin. La comunidad cientfica ha
hecho progresos en la expresin de diferentes antgenos
En 1992, la OMS anunci la Iniciativa para la Inmunizacin de los Nios, un llamado a desarrollar vacunas de
bajo costo, que no necesiten refrigeracin, que puedan administrarse oralmente y que incluyan varios antgenos en
simultaneo. Esta lista de prioridades ha renovado el inters en vacunas enterales, pero como los inmungenos
orales son naturalmente ineficaces debe explorarse formas novedosas de producir y presentar el antgeno, tales
como el uso de sistemas de plantas Tradicionalmente los antgenos a usarse como vacunas son extrados
directamente de los patgenos cultivados en el laboratorio o son sintetizados por bacterias u hongos
recombinantes. Estos sistemas requieren de mtodos laboriosos y costosos de produccin, fermentacin y
purificacin que acrecientan los costos del producto final.
Como las clulas vegetales comparten procesos biosintticos bsicos con clulas
Humanas, tericamente es posible alterar genticamente plantas para que sinteticen protenas humanas o
protenas de patgenos que normalmente infectan humanos, Si estas protenas pudieran usarse luego de un
procesamiento simple, aun cuando el costo inicial de manipulacin gentica sea alto, la produccin a larga escala
sera barata. An ms, la clula vegetal puede actuar como un sistema natural de bio-encapsulamiento.

D Explique los pasos para la creacin de un vector viral


Construccin de retrovrus recombinantes Los retrovirus recombinantes fueron preparados usando como
"esqueleto", los vectores recombinantes de la serie pBabe derivados del virus de Leucemia Murina de Moloney
(MoMLV), provistos gentilmente por Morgenstem y Land, ICRF, London (Morgenstem and Land, 1990). El gen
HSV-tk (timidina kinasa del virus herpes simplex-l) fue aislado del plsmido pAGO (Colbere-Garapin et aL, 1979)
como un fragmento de 1.7 Kb cortando con BglII-Pvull. El vector pBabe Neo, conteniendo el marcador de seleccin
de neomicina (seleccin con geneticina: G-418 se cort en el sitio EcoRl (SMC), se rellen con Klenow para
generar extremos romos y se redigiri con BamHI. El fragmento de HSV-tk de 1.7kb,cortado con BgllI-Pvull fue
subclonado en los extremos romos BamHl y EcoRl de pBabe Neo.
La construccin obtenida se denomin pAGO Babe-neo (pBabepAGO), y tiene un sitio para EcoRl reestablecido en
la unin de los extremos romos de EcoRl con PvuIl.
La preparacin del vector de expresin de lL-12 que posee dos subunidades heterlogas se realiz introduciendo
entre ambos cADNs la secuencia IRES (internal ribosome entry site) que permite niveles de traduccin similar de
ambos mensajeros (Morgan et aL, 1992). El cADN completo correspondiente a las subunidades murinas p35 y p40
(provistas por Maurice Gately, Hoffman-La Roche Inc.) de lL-12 fueron clonadas tambin en el vector retroviral
pBabe Neo. Para insertar p35 en pBabeNeo, se cort p35 con Ncol, se rellen con Klenow y se cort con EcoRl. El
fragmento Ncol_blunt-EcoRI conteniendo el inserto p35 fue insertado en pBabe lineanzado con BamHl (MCS),
rellenado con Klenow y digerido con EcoRI. Para inserta la subunidad p40 ro abajo de la secuencia IRES, p40 fue
cortado con EcoRl, rellenado y cortado con Ncol. Este fragmento fue clonado en el vector pClTE previamente
cortado con Ncol- EcoRV. Este sitio dentro de pClTE contiene el ATG correspondiente al sitio de comienzo de la
transcripcin. La fusin lRES-p40 se sac cortando con EcoRl-Sall y se clon en pBabe Neo-p35, previamente
cortado con EcoRl-Sall. El vector resultante se denomin pBabe Neo.
Construccin vectores plasmdicos de expresin
Para la construccin de los plsmidos inducibles "autoregulaton'os", las construcciones finales y subclonados
fueron realizadas en el "esqueleto" del vector pGLZ-Basic (Promega; GenBankl/EMBL Accesion number; X65323).
Los plsmidos pUHG17-1, pUHD10-3 y pUHC13-3 (Gossen et aL, 1995) fueron cedidos generosamente por
Gossen y Bujard (Universidad de Heidelberg, Alemania). El sitio de restriccin Bbsl en el mCMV es comn al CMV
de tamao completo y al promotor tetP , y fue utilizado en la construccin de la unidad transactivadora rtTA.
El plsmido para control de fluorescencia de EGFP y de eficiencia de transfeccin, se construy aislando un
fragmento EcoRl -Notl de 700pb correspondiente al cADN del gen reportero, del vector pEGFP-l (vector carente de
promotores ro arriba del gen EGFP) de Clontech. Este fragmento fue subclonado en el plsmido pcDNA3cortado
tambin con EcoRlNotl. Elvector resultante fue denominado chGFP.

Para el clonado de mIL12 en pGTRT, se obtuvo el cADN completo de lL-12 murina, del vector retroviral mlL2 pBabe
Neo. El fragmento de 2,3 kB correspondiente a dicho cADN. fue cortado con BamHl y SaII del mlLlZpBabeNeo y
subclonado en el vector pUC19-TNF, previamente cortado con BamHl-Sall. El vector resultante se denomin
pUleLlZ. Posteriormente se cort el cADN de la mIL-12 de pUleLZ con BamHl y Accl. El vector compatible se
prepar realizando una digestin parcial del pGTRTL (pGTRT conteniendo el gen de luciferasa) con BamHl y
posterior digestin con Clal de modo tal de generar una ligacin con extremos cohesivos. El vector obtenido por
ligacin de ambos fragmentos se denomin pGTRTmlL12.
E Cmo se emplean los vectores virales en protocolos de vacunacin?
Hasta el momento, los vectores virales han hecho posible la transferencia de genes a clulas y tejidos de modo
relativamente estable, eficiente y aparentemente seguro. Estos sistemas de vectores virales hicieron posible que la
terapia gnica se volviera una realidad, con ms de 400 protocolos clnicos realizados (Mountain, 2000) hasta la
actualidad.
La mayora de las estrategias y protocolos clnicos actuales en terapia gnica utilizan vectores derivados de virus, ya
que stos han evolucionado naturalmente desarrollando maquinarias especficas de transferencia de ADN a clulas.
Por lo tanto son los vectores que presentan mayor eficiencia de transfeccin. Para ser utilizados como vectores, y
aplicando los conocimientos adquiridos en el campo de la estructura gnetica y biologa de virus, estos virus fueron
modificados por ingeniera gentica para anular su capacidad patognica e inmunognica (Verma and Somia, 1997).
Sin embargo, actualmente las principales desventajas de estos sistemas siguen siendo la inmunogenicidad, las
limitaciones en el tamao del inserto, la dificultad en la produccin y el potencial riesgo de generacin de virus
replicativos o salvajes.

BIBILOGRAFIA
Berenstein, Mariana G.. (2001). Diseo, caracterizacin, produccin y utilizacin de vectores virales y plasmdicos
para terapia gnica del cncer. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3412_Berenstein.pdf

1. Miller, AD; Miller, DG; Garca, JV. and Lynch, CM. Use of retroviral vectors for gene transfer and expression.
Methods Enzymol 1993; 217: 581-599.
2. Eglitis, MA; Kantoff, P; Gilboa, E. and Andreson, WF. Gene expression in mice after high efficiency retroviral-
mediated gene transfer. Science 1985; 230: 1395-1398.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2629647/
http://www.newmicrobiologica.org/PUB/allegati_pdf/2013/1/1.pdf
http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fnmol.2014.00089/full

http://www.medigraphic.com/pdfs/vertientes/vre-2012/vre121a.pdf
viral vectors from virology to transgene expresion
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2629647/pdf/bph0157-0153.pdf