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Mtodos de separaes (GQB038)

Introduo Cromatografia

Prof. Eduardo Mathias Richter

2017
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Cromatografia:

Papel, camada delgada, gasosa,


lquida e fluido supercrtico.

Eletroforese:

Em gel e capilar
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Introduo

Cromatografia
Entre os mtodos modernos de anlise, a cromatografia
ocupa um lugar de destaque devido facilidade com que
efetua separao, identificao e quantificao de
espcies qumicas.

Estes objetivos so normalmente atingidos em conjunto com


outras tcnicas instrumentais de anlise, como a
espectrofotometria, espectrometria de massas,
fluorimetria, amperometria, etc........
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Introduo

CROMATOGRAFIA - DEFINIO

A cromatografia um mtodo fsico-qumico que permite a


separao de componentes de uma mistura, atravs da distribuio
destes componentes em duas fases, que esto em contato ntimo.

Em todas as separaes cromatogrficas, a amostra dissolvida


numa fase mvel (lquido, gs ou fluido supercrtico). A fase mvel
ento forada atravs de uma fase imiscvel (fase estacionria), a
qual est fixa na coluna ou em uma superfcie slida.

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Introduo

CROMATOGRAFIA - DEFINIO
Os componentes que so fortemente retidos pela fase
estacionria movem-se mais lentamente em relao ao fluxo da
fase mvel.

Em contraste, os componentes que interagem fracamente com


a fase estacionria se movem mais rapidamente.

Como conseqncia dessas migraes diferenciadas, os vrios


componentes da mistura se separam em bandas discretas (picos)
ou manchas e podem ser analisados qualitativamente e
quantitativamente.
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Introduo
ASPECTOS HISTRICOS

Em 1906, o botnico russo Mikhael Semenovich Tswett


descreveu suas experincias na separao dos componentes de
extratos de folhas.

Mikhail Semenovich Tswett


(1872 - 1919)

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Introduo
ASPECTOS HISTRICOS

Os termos cromatograma, cromatografia e mtodo cromatogrfico


aparecem em dois trabalhos descrevendo suas experincias para separar
pigmentos de um extrato de folhas (clorofila e xantofila) e xantofilas em
gemas de ovo

Uso de uma coluna de vidro empacotada com CaCO3 finamente dividido


(fase estacionria) e ter de petrleo (fase mvel);

A separao dos componentes pde ser verificada por meio de faixas


coloridas na coluna (escrever em cor).

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Introduo
ASPECTOS HISTRICOS

chrom = cor

graphe = escrever
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Investigando cinza da casca do arroz como fase estacionria em cromatografia: uma
proposta de aula experimental nos cursos de graduao

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Quim. Nova, Vol. 35, No. 2, 416-419, 2012
Introduo
ASPECTOS HISTRICOS - Cronologia

1906: experimento de Mikhael Tswett - Surgimento dos termos


cromatografia, cromatograma e mtodo cromatogrfico;
Mesma poca: Reed na Inglaterra e Day (USA) usaram colunas contendo
slidos e misturas de solventes na separao de sais orgnicos e amostras de
petrleo;
Anterior a estes eventos: Runge descreveu desenhos feitos por misturas
de sais e por tintas em papel de filtro e Schoenbein fez experimentos similares
com tiras de papel mergulhadas em solventes;
1889: Beyerinck camada delgada sobre vidro separao de sais
inorgnicos.
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Introduo
ASPECTOS HISTRICOS - Cronologia

1930: comeo da poca moderna da cromatografia Kuhn e Lederer


redescobriram e aperfeioaram a cromatografia em coluna separao de
xantofilas em gemas de ovo;
Nos anos 30: incio da cromatografia de troca inica;
1938: reintroduo da CCD (Izmailov e Schraiber)
1941: Martin e Synge publicao de um trabalho descrevendo a cromatografia
de partio, altura de um prato terico, cromatografia gasosa e lquida de alta
eficincia;
1941: Hesse e colaboradores descreveram a cromatografia gs-slido;

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Introduo

ASPECTOS HISTRICOS - Cronologia

1952: Martin e Synge receberam o Prmio Nobel por este trabalho (partio);
1952: Martin e James cromatografia gs-lquido;
1954: Ray detector de condutividade trmica;
1955: primeiro equipamento colocado no mercado;
1958: detector de ionizao por chama (Pretorius e colaboradores);
1958: introduo das colunas capilares (Golay);
1959: introduo das bombas de pisto (Hamilton e Andrews);
1960: aperfeioamento de sistemas de bombeamento e deteco em CL (Jentoff, Gouw, Huber e
Hulsman);
1960: desenvolvimento de partculas de dimetro pequeno (10; 5 e 3 m) por Kirkland e outros;
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Introduo

Separao planar ou em coluna

Detector
detector
Sinal do

Tempo 13
As diferentes formas de cromatografia podem ser
classificadas considerando-se diversos critrios:

(1) Forma fsica do sistema cromatogrfico;

(2) Fase mvel empregada;

(3) Fase estacionria utilizada;

(4) Modo ou mecanismo ou equilbrio de separao.

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Introduo

1. Segundo a forma fsica do sistema cromatogrfico

Cromatografia em Coluna:
- Cromatografia lquida, gasosa e supercrtica.

Cromatografia Planar:
- Papel, camada delgada e centrfuga.

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Cromatografia em Coluna
Conforme o tamanho do dimetro interno do tubo temos:

Colunas preparativas (6 a 50 mm)

Analticas (2 a 6 mm)

Com microdimetro (1 a 2 mm)

Capilares (< 1 mm)

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Colunas preparativas ou analticas: fase estacionria na forma de

partculas. A fase ativa na separao pode ser um slido ou um lquido, o qual (o

lquido) pode cobrir a superfcie do slido ou estar quimicamente ligado a ele (3

tipos de fases estacionrias);

Colunas com microdimetro ou capilares: tambm podem ser recheadas

com fase estacionria particulada ou podem possuir fase estacionria sob a forma

de um filme ou de partculas somente aderidas a parede do tubo;

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Introduo

2. Segundo o estado fsico da fase mvel empregada

So trs tipos:

Cromatografia lquida (LC);

Cromatografia gasosa (GC);

Cromatografia de fluido supercrtico (SFC).

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Introduo

2.1. Cromatografia lquida - subdivises

Cromatografia lquida clssica (CLC), a fase mvel arrastada


atravs da coluna apenas por fora da gravidade (presso atmosfrica);

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia ou High-Performance


Liquid Chromatography (CLAE ou HPLC) se utilizam colunas metlicas
com fases estacionrias constitudas de partculas menores, sendo
necessrio o uso de uma bomba de alta presso para eluio da fase
mvel;

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Diferentes denominaes (cromatografia lquida)

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)

Cromatografia Lquida de Alta Presso

Cromatografia Lquida de Alta Velocidade

Cromatografia Lquida de Alto Desempenho

Cromatografia Lquida de Ultra Alta Eficincia (mais recente)

High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)


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Introduo

2.2. Cromatografia gasosa subdiviso


Cromatografia gasosa simples (GC): colunas empacotadas;
Cromatografia gasosa de alta resoluo (HRGC): colunas capilares; (High
Resolution Gas Chromatography)

2.3. Cromatografia Supercrtica (SFC) - Utiliza-se um vapor

pressurizado como fase mvel, acima da sua presso e temperatura

crtica. (Supercritical fluid chromatography)

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Introduo

3. Segundo fase estacionria

So trs tipos:

3.1. Slidas: suporte slido;

3.2. Lquidas: lquido adsorvido ou imobilizado sobre um suporte


slido;

3.3. Quimicamente ligadas: fases quimicamente ligadas a um


suporte slido.

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Introduo

4. Classificao pelo modo ou mecanismo ou equilbrio de separao

Processos fsicos: adsoro, partio e mistura de adsoro/partio;

Processos qumicos: troca inica, bioafinidade ou especificidade

biolgica;

Processos mecnicos: excluso.

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Introduo
Classificao dos Mtodos Cromatogrficos

CCD (TLC): cromatografia de camada delgada; (Thin Layer chromatography)


CP (PC): cromatografia de papel;
CLAE (HPLC): cromatografia lquida de alta eficincia;
CSC (SFC): cromatografia supercrtica; (Supercritical fluid chromatography)
CG (GC): cromatografia gasosa (coluna empacotada);
CGAR (HRGC): cromatografia gasosa de alta resoluo (coluna capilar);
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Introduo
Cromatografia lquida (fase mvel: lquido)

Mtodo especfico de Fase estacionria Tipo de equilbrio


separao

Lquido-lquido Lquido absorvido ou ligado Partio entre


ou partio uma superfcie slida lquidos imiscveis

Lquido especfico para Partio entre lquido


Afinidade determinado grupo ligado a superficial e liquido mvel
uma superfcie slida

Lquido-slido
ou adsoro Slido Adsoro

Troca inica Resina de troca inica Troca inica


Excluso por Lquido em interstcios
tamanho de um slido polimrico Excluso / filtrao
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Introduo
Cromatografia gasosa (fase mvel: gs)
Mtodo especfico de Fase estacionria Tipo de equilbrio
separao
Gs-lquido Lquido absorvido ou ligado Partio entre
uma superfcie de um gs e o lquido
slido

Gs-slido Slido Adsoro

Cromatografia com fluido supercrtico (fase mvel: FS)


Mtodo especfico de Fase estacionria Tipo de equilbrio
separao
Espcies orgnicas ligadas Partio entre FS
Fluido supercrtico- lquido a uma superfcie slida e a fase ligada
(fase ligada)

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Introduo Cromatografia Mecanismos de separao
Gs Coluna Gs-slido

Adsoro Lquida em Coluna


Coluna
Lquido Lquida de Alta Eficincia
Planar Camada Delgada

Gs Coluna Gs-Lquido

Partio Fluido SC Coluna Fluido Supercrtico - slido


Lquido-Lquido
Coluna
Lquido Lquida de Alta Eficincia
Planar Papel

Troca inica
Troca inica Lquido Coluna
ons de Alta Eficincia

Permeao Lquido Coluna Permeao em Gel 27


Cromatografia critrio de separao
Tcnica: planar ou em coluna;
Fase mvel: lquido, gs e fluido supercrtico;
Fase estacionria: slida, lquida e fase ligada (lquida);

Tipos de cromatografia:
PC: cromatografia de papel;
TLC: cromatografia de camada delgada;
GLC: cromatografia gs-lquido;
GSC: cromatografia gs-slido;
BPGC: cromatografia gasosa de fase ligada;(bonded phase gas chromatography)
CGC: cromatografia gasosa quiral. (chiral gas chromatography) 28
Cromatografia critrio de separao

Tipos de cromatografia:
SPSFC : cromatografia supercrtica de fase estacionria slida
BPSFC : cromatografia supercrtica de fase ligada (Bonded Phase Supercritical Fluid C.)
LLC: cromatografia lquido-lquido
SLC: cromatografia lquido-slido
EC: cromatografia por excluso (Size-exclusion Chromatography)
BPLC: cromatografia lquida de fase ligada (Bonded-Phase Liquid Chromatography)
CC: cromatografia quiral
IEC: cromatografia por troca inica (Ion Exchange Chromatography)
CBC: cromatografia por bioafinidade (Bioaffinity Chromatography)
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Introduo

Cromatografia de soro (processos fsicos)

Dois processos: adsoro e absoro (partio);

So baseados principalmente em atraes eletrostticas ou

dipolares (foras de van der Waals), incluindo tambm a formao

de pontes de hidrognio.

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Introduo Cromatografia Mecanismos de separao

Cromatografia de adsoro: a fase estacionria slida e a fase mvel


pode ser lquida ou gasosa. Baseia-se nas diferentes afinidades adsorventes da
superfcie da fase estacionria pelas molculas da substncia a separar.
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Cromatografia de adsoro

Keq

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Introduo Cromatografia Mecanismos de separao

Cromatografia de adsoro:
A adsoro do soluto ocorre na interface entre o slido e a fase mvel, devido a
presena de grupos ativos em sua superfcie;

A dessoro (retorno fase mvel) ocorre por volatilidade (GC) ou solubilidade


(LC ou SFC);

nica varivel que afeta o coeficiente de distribuio dos analitos a composio


da fase mvel.

Mecanismo presente em: TLC, SGC, SLC e SFC;


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Introduo Cromatografia Mecanismos de separao

Fase estacionria
Fase mvel

Cromatografia de absoro (partio): a fase estacionria um lquido


imiscvel espalhado na superfcie de um suporte slido e inerte ou nas
paredes do tubo cromatogrfico.

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Introduo
Cromatografia de absoro (partio)
O processo interfacial ocorrendo uma absoro ou partio que se baseia nas diferentes
solubilidades dos componentes da amostra na fase estacionria.

A volta dos componentes fase mvel depende de sua volatilidade (GC) ou de sua
solubilidade nesta fase (LC).

O coeficiente de distribuio dos analitos afetado pela composio da fase mvel e pela
composio (polaridade) da fase estacionria;

Mecanismo presente em: PC, LGC, LLC e SFC.

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Cromatografia de partio Cromatografia de adsoro

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Cromatografia Mecanismos de separao

Troca
inica
nions Ctions

A fase estacionria constituda de um suporte, ou matriz, onde so adicionados grupos


funcionais ionizveis;

A fase estacionria altamente carregada, sendo que os componentes com cargas de


sinais contrrios a estas so seletivamente adsorvidos na fase estacionria (atrao
eletrosttica);

Os componentes adsorvidos podem ser subsequentemente eludos, por deslocamento com


outros ons, com o mesmo tipo de carga, porm com maior fora de interao com a fase
estacionria.
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Introduo

Troca inica
A afinidade entre ons da fase mvel e a matriz podem ser
controlados utilizando fatores como pH e fora inica.

Os trocadores aninicos (fase estacionria) que tem stios ativos


carregados positivamente estabelecem equilbrios (reteno temporria)
somente com nions.

Os trocadores catinicos (fase estacionria) que tem stios ativos


carregados negativamente estabelecem equilbrios (reteno
temporria) somente com ctions.

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Introduo
Troca inica
A fase mvel , geralmente, uma soluo inica com
propriedades tamponantes, escolhida de forma a ser compatvel
com o tipo de trocador usado.

Desta forma, se a fase estacionria retm ctions, a fase mvel


deve conter ctions capazes de substitu-los, preferencialmente. O
inverso verdadeiro para nions.

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Cromatografia de troca inica (separao de nions)

Eluente contendo nions


Analitos (nions)

Ocorre troca entre e e

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Introduo
Cromatografia Mecanismos de separao

Excluso por tamanho ou permeao em gel ou filtrao

Excluso

Fase estacionria
Fase mvel
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Introduo

Baseia-se em um processo puramente mecnico.

A fase estacionria uma matriz inerte, com partculas de forma, tamanho e porosidade
uniforme.

As molculas da amostra so separadas porque as menores so capazes de penetrar


facilmente em todos os poros da fase estacionria, enquanto que as maiores so
excludas de todos os poros, passando entre os grnulos, acompanhando a fase mvel.

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Introduo

As molculas com tamanho efetivo intermedirias migram com velocidades variveis


entre os dois extremos; possuem penetrao seletiva nos poros, entrando em alguns,
mas no em todos, e saindo da coluna em ordem relacionada a seu tamanho efetivo;

Portanto, nesta forma de separao h uma separao em funo do tamanho


efetivo das molculas, sendo que as de tamanho maior eluem primeiro;

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Introduo Cromatografia Mecanismos de separao

Bioafinidade

Fase estacionria
Fase mvel
o Grupos com especificidade biolgica quimicamente ligados a um suporte.

o Estes grupos podem ser, por exemplo, antgenos, substratos ou lectinas,


interagem (retm temporariamente) somente os componentes complementares, os
anticorpos, enzimas ou acares, respectivamente;
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Termos comuns usados em cromatografia
Papel
ou
Em coluna camada delgada

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Termos comuns usados em cromatografia

Eluio: um processo no qual os solutos so lavados atravs da fase


estacionria pelo movimento de uma fase mvel.

Eluente: um solvente empregado para transportar os componentes de uma


mistura atravs de uma fase estacionria.

Cromatograma: o registro do sinal do detector em funo do tempo de


corrida ou um grfico de alguma funo da concentrao do soluto versus o
tempo de eluio ou volume de eluio.

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Termos comuns usados em cromatografia

Tempo de reteno
Tempo morto
Tempo de reteno ajustado
Fator de reteno
Fator de separao ou seletividade
Resoluo
Eficincia
Nmero de pratos tericos
Altura de um prato terico
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Tempo de morto (tempo de reteno da fase mvel), tM: o tempo necessrio para que um soluto no
retido passe atravs de uma coluna cromatogrfica e chegue at o detector. Todos os componentes
permanecem por esse intervalo de tempo na fase mvel;

Tempo de reteno, tR: o tempo decorrido entre a injeo da amostra e o aparecimento do pico do soluto
retido temporariamente na fase estacionria da coluna, no detector posicionado logo aps a coluna
cromatogrfica.

tE

Tempo de reteno ajustado, tE: tempo que o analito permanece retido na fase estacionria (tR tM).
As separaes so baseadas nos tempos distintos tE que os componentes permanecem na fase estacionria.
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Tempo de reteno, tempo morto e tempo de reteno ajustado
Fator de reteno, kA: para o soluto A est relacionado velocidade com a qual A migra atravs da
coluna. o intervalo de tempo que um soluto (A) permanece na fase estacionria relativo ao tempo que
este permanece na fase mvel.

Fator de seletividade ou separao, (solutos A e B): definido como a razo entre a constante de
distribuio do soluto mais retido (B) e a constante de distribuio para o soluto menos retido (A). O fator de
seletividade para dois analitos em uma coluna fornece uma medida de quo bem a coluna vai separ-los.

Clculo a
partir de um
cromatograma
experimental
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Resoluo: de uma coluna cromatogrfica uma medida quantitativa da sua habilidade em separar os
analitos A e B.

R = 0,50 R = 0,75

R = 1,00 R = 1,50

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Eficincia: dois termos relacionados so empregados amplamente para as medidas quantitativas da
eficincia da coluna cromatogrfica:
(1) altura de prato, H;
(2) contagem de pratos ou nmero de pratos tericos, N.

Nmero de pratos tericos: caracterstica de uma coluna cromatogrfica empregada para descrever sua
eficincia.

L: comprimento da coluna
W: largura do pico na sua base

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Clculo de nmero de pratos tericos a partir de um cromatograma

Muitos sistemas de dados cromatogrficos empregam a largura meia-


altura (W1/2).

Nesse caso N = 5,54(tR/W1/2)2.


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Origem dos Termos Prato e Altura de Prato.

Adaptao de um modelo originalmente desenvolvido


para descrever as separaes ou fracionamentos em
colunas de destilao.
Martin e Synge trataram a coluna cromatogrfica como
se fosse feita de uma srie de pratos nos quais as
condies de equilbrio sempre prevaleciam.
Esse modelo de pratos bem-sucedido
ao explicar o formato gaussiano dos picos
cromatogrficos, bem como os fatores que influenciam
as diferenas nas velocidades de migrao dos solutos.

Pratos em uma
coluna de fracionamento. 54
Origem dos Termos Prato e Altura de Prato.

Contudo, o modelo de pratos no bem sucedido ao tentar


explicar o alargamento das zonas por causa da suposio
bsica de que as condies de equilbrio prevalecem atravs
da coluna durante a eluio (condies dinmicas).

Condies dinmicas: as fases esto se movendo


passando uma sobre a outra em um ritmo que no oferece
tempo suficiente para que o estado de equilbrio seja obtido.

Os termos prato e altura de prato permanecem por razes


histricas, mas no apresentam qualquer significado fsico.

Pratos em uma
coluna de fracionamento. 55
A Teoria do No-equilbrio (Rate Theory) da Cromatografia
(no interior da tubulao e da coluna)
Considerando somente o efeito da difuso por concentrao picos relativamente simtricos (ideais).
A teoria do no-equilbrio (rate theory) da cromatografia descreve os formatos e larguras das bandas de
eluio em termos quantitativos com base em um mecanismo de movimentao aleatria de migrao das
molculas atravs da coluna.
Alguns picos cromatogrficos no so ideais (A) e exibem uma cauda ou alargamento frontal (B).

(B) Uma causa comum de ocorrncia de caudas e


(A) alargamentos frontais a variao da constante de
distribuio com a concentrao.

O alargamento frontal tambm surge quando a


quantidade de amostra introduzida na coluna
muito grande.

As distores desse tipo so indesejveis porque


levam a uma separao mais pobre e a tempos de
eluio menos reprodutveis
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