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Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. Laboratorio de Diagnóstico Clínico. 2º curso.

Protocolos de pruebas de identificación bacteriana - 1 UT 16 - 2 Bloque temático III

Protocolos de pruebas de identificación bacteriana
Quizás las más utilizadas cuantitativamente sean las pruebas bioquímicas que nos permiten determinar características metabólicas de los microorganismos objeto de identificación, aunque las reacciones de aglutinación o precipitación utilizadas son más rápidas y más específicas. Las pruebas podríamos clasificarlas fundamentalmente en aquellas que nos permiten la identificación de Gram positivos y pruebas para identificación de Gram negativos, aunque hay una serie de pruebas comunes a ambos grupos que vamos a enumerar,

Pruebas de identificación iniciales:
-

Morfología bacteriana Tinción de Gram Agrupamiento celular Movilidad Atmósfera de crecimiento
Gram positivos

-

Catalasa Citocromo - oxidasa Oxidación -fermentación Fermentación de azúcares
Gram negativos

-

Lisostafina Coagulasa DNAsa Fosfatasa CAMP Hidrólisis de esculina Hidrólisis del hipurato Sensibilidad a novobiocina Sensibilidad a optoquina Sensibilidad a bacitracina Sensibilidad a SXT Crecimiento en ClNa Crecimiento en bilis Producción de hemólisis Pruebas inmunológicas

-

ß galactosidasa (ONPG) Lisina y ornitina decarboxilasa Utilización de citrato Producción de SH2 Ureasa Triptófano desaminasa (TDA) Producción de indol Reducción de nitratos a nitritos Arginina dehidrolasa Rojo de metilo Voges Proskauer Kligler Hidrólisis de la gelatina Pruebas inmunológicas

Gustavo A. Díaz Martín. I. E. S. Jaime Ferrán Clúa.

Profesor Técnico de Formación Profesional. San Fernando de Henares. (28830 Madrid)

Curso 2003-2004 Código 28038616

No invertir el orden 3) Observar la inmediata formación de burbujas. * 1) .Excepciones: Corynebacterium pyogenes y Corynebacterium haemoliticum. al poseer catalasa pueden dar positiva la prueba. S. (28830 Madrid) Curso 2003-2004 Código 28038616 . • Tween 80 al diluido al 10% en Buffer fosfato M/15 pH:7. lejos de la luz y refrigerado). * 2) . formándose agua y O2 . Utilización: Se usa para diferenciar 1) Cocos gram positivos: Familia Micrococcaceae (Staphilococcus y Micrococcus) (+) de Géneros Streptococcus y Enterococcus (-). aumenta la duración de las burbujas formadas) Procedimiento: 1) En un porta limpio y seco depositar una colonia bacteriana procedente de un cultivo joven 2) Añadir una gota de H2 O2 al 30% sobre la colonia. como 10%. La quemadura con agua oxigenada al 30% debe lavarse con alcohol etílico de 70º. método del tubo capilar.2 UT 16 . no con agua. Jaime Ferrán Clúa. Excluyendo los estreptococos. Prueba negativa: no hay formación de burbujas. 2º curso. Laboratorio de Diagnóstico Clínico.2 Bloque temático III Catalasa Fundamento: Se basa en la capacidad del enzima catalasa de descomponer el peróxido de hidrógeno añadido. dando lugar a falsos positivos. la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa.Algunos autores utilizan H O 2 2 a concentraciones menores. Profesor Técnico de Formación Profesional. Protocolos de pruebas de identificación bacteriana . Métodos: Método del portaobjetos. 3% o 0. Gustavo A. (La adición de un detergente como el Tween 80 al H2 O2 . Díaz Martín.5%. sin mezclar. que son (-).(1) (Conservar en frasco topacio. Las colonias viejas pueden perder su actividad para la catalasa.. Reactivos: • Peróxido de hidrógeno (agua oxigenada H2 O2 ) al 30% (Superoxal). San Fernando de Henares.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. el cual se libera en forma de burbujas. Interpretación: Prueba positiva: formación inmediata de burbujas bien visibles. Precauciones: Si tomamos la colonia de un agar sangre. E. I. hemos de tener en cuenta que si tocamos el agar podemos arrastrar eritrocitos que.. 2) Bacilos gram positivos esporulados: Género Bacillus (+) de Género Clostridium (-) 3) Bacilos gram positivos no esporulados: Listeria (+) y Corynebacterium (+)(1) de Erysipelothrix (-) Control de calidad: Prueba positiva: Staphilococcus aureus Prueba negativa: Enterococcus faecalis. Otros métodos: Método en tubo de ensayo. método del cubreobjetos. Lectura: Inmediata.

Método directo en placa: 1) Añadir 2 o 3 gotas de reactivo a algunas colonias sospechosas. I. Con rectivo de Nadi: Antes de 1 minuto. Con reactivo de Gordon: La positividad con el reactivo de Gordon y McLeod puede aparecer entre 10 y 30 minutos. 2) Observar un eventual cambio de color. Gustavo A.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. Díaz Martín. Método de la torunda impregnada de reactivo. • Reactivo de Carpenter: Oxalato de p-amino-dimetil-anilina al 1%. San Fernando de Henares. Profesor Técnico de Formación Profesional. más rápido y menos tóxico que los demás. • Reactivo de Gordon y McLeod: Diclorhidrato de dimetil-p-fenilendiamina. Lectura: Con reactivo de Kovacs: Antes de 10 segundos. Los reactivos más utilizados son: • Reactivo de Kovacs: Diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiemina al 1%.3 UT 16 . 2º curso. (28830 Madrid) Curso 2003-2004 Código 28038616 . • Con reactivo de Nadi: color azul intenso.Método indirecto en disco o tira reactiva. E. Este reactivo es más sensible. • Reactivo de Nadi: Una mezcla por partes iguales de -naftol al 1% en etanol de 95º y aminodimetilanilina al 1%.2 Bloque temático III Oxidasa Descripción: Es una prueba que detecta la presencia del enzima citocromooxidasa. Prueba negativa: • Sin cambio de color o permanece el color de la colonia. Método del disco impregnado de reactivo. 2) Observar un eventual cambio de color. Procedimiento: Método del disco: 1) Colocar una colonia bacterian sobre la superficie del disco. . Protocolos de pruebas de identificación bacteriana . Reactivos: Los reactivos pueden usarse en solución para utilizar en el método directo en placa o impregnando algún soporte. No inundar toda la placa ni invertirla.marrón y negro final. como discos.Método directo en placa. Métodos: Método directo en placa (adición de reactivo a las colonias). . tiras. en presencia de oxígeno atmosférico. Fundamento: La enzima citocromooxidasa. • Con reactivo de Gordon: cambio de color a rosado . Jaime Ferrán Clúa. o torundas. Laboratorio de Diagnóstico Clínico. oxida el reactivo fenilendiamina oxidasa para formar un compuesto coloreado: indofenol. Resultado: Prueba positiva: • Con reactivo de Kovacs: color negro purpúreo en 10 segundos. S.

2 Bloque temático III • Utilización: Se usa para diferenciar: 1) Bacilos Gram negativos:(1) Familia Pseudomonadaceae (+)(1) de Familia Enterobacteriaceae (-) 2) Cocos Gram negativos: Género Neisseria (+) de otros cocos gram negativos (-) Se usan también para ayudar a la identificación de: Aeromonas (+).. .4 UT 16 . 2º curso. Gustavo A. por esta razón pueden producirse resultados falsamente negativos si un cultivo mixto contiene especies de ambos géneros. Laboratorio de Diagnóstico Clínico. pero ellas suponen cuantitativamente el grupo más numeroso. . S.La utilización de asas de hierro puede dar pruebas falsamente positivas. Acinetobacter (-). Profesor Técnico de Formación Profesional.No debe realizarse una prueba de oxidasa de las colonias cultivadas en un medio que contenga glucosa. pero no en éstas.Las especies de Pseudomonas producen una sustancia inhibidora que impide la producción de oxidasa en las especies de Neisseria. .Dentro de la división de bacterias gram negativas hay otras familias y géneros diferentes a los citados. Díaz Martín.. . (28830 Madrid) Curso 2003-2004 Código 28038616 . La viabilidad de las colonias dura mientras éstas permanecen de color rosado con el reativo de Gordon y McLeod. . Protocolos de pruebas de identificación bacteriana . * 4) . . una coloración negra en el medio que rodea a las colonias. debe ser considerada como una prueba de oxidasa negativa. Jaime Ferrán Clúa. E.Con el método directo en placa es posible recuperar colonias oxidasa positivas mientras son viables. Control de calidad: Prueba positiva: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.La excepción más importante es Stenotrophomonas maltophilia (-). * 3) . Prueba negativa: Escherichia coli ATCC 25922.Rotular el reactivo como Reactivo oxidasa de Kovacs para evitar la confusión con el Reactivo de indol de Kovacs. Precauciones: . pues su fermentación puede inhibir la actividad de la enzima oxidasa y dar lugar a falsos negativos. San Fernando de Henares.Los compuestos p-fenilendiamina son relativamente inestables y pierden su actividad si son expuestos a la luz. I.Después de la adición del reactivo sobre las colonias sospechosas. Moraxella (+).Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico.

Gustavo A. Lectura: A las 24-48 h. I. Fundamento:: En la vía oxidativa. el aceptor final de electrones es un compuesto orgánico y el proceso es anaerobio. Con medio de Hugh . Incubar a 35º-37º C. a su vez las bacterias producen sustancias básicas tras la degradación aeróbica de las peptonas. solamente el tubo abierto vira ligeramente en la parte superior a amarillo ( y más tarde se extenderá por todo el tubo) y nunca con producción de gases. mientras que en la vía fermentativa. San Fernando de Henares. Profesor Técnico de Formación Profesional. Díaz Martín. Utilización: Precauciones: Control de calidad: Fermentador de glucosa: Escherichia coli Oxidador de glucosa: Pseudomonas aeruginosa No reacciona: Micrococcus spp. Los microorganismos oxidativos producen ácido en la zona de contacto con el aire. Jaime Ferrán Clúa.2%) y glucosa (1%). determina el tipo de metabolismo. originando mucha acidez. Si la vía es fermentativa hay un viraje intenso a amarillo que comienza en la parte inferior de los dos tubos con o sin producción de gases. que hace virar el medio de rojo a amarillo. 2º curso. Protocolos de pruebas de identificación bacteriana . E. Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Procedimiento: Para cada bacteria en estudio se utilizan dos tubos de O/F. S. (28830 Madrid) Curso 2003-2004 Código 28038616 . A las concentraciones de Otros Reactivos: Vaselina o aceite de parafina estéril.2 Bloque temático III Oxidación . pero no lo hacen en profundidad Los microorganismos fermentativos producen mucho ácido en todo el tubo Medios de cultivo utilizados: El medio utilizado es el de Hugh-Leifson.Fermentación: Descripción La prueba de oxidación-fermentación.Leifson Se siembran en picadura y se cubre uno de ellos con vaselina o aceite de parafina estéril. oxidativo o fermentativo que utilizan las bacterias al actuar sobre un hidrato de carbono. La acidez producida por el metabolismo oxidativo es baja. La acidez se detecta por la presencia de un indicador de pH (rojo de fenol). el aceptor final de electrones debe ser el oxígeno y por consiguiente el proceso es aerobio y produce poca acidez.5 UT 16 .Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. que contiene peptona en baja concentración (0. (a veces es necesaria una incubación de hasta 14 días) Resultado: Si la vía es oxidativa.

El agar hierro de Kligler y el agar triple azucar (TSI) son medios diferenciales mixtos en tubo. d) Producción de gas: . (28830 Madrid) Curso 2003-2004 Código 28038616 . Existen bacterias que no fermentan ni lactosa ni glucosa. Si el organismo es facultativo hay reacción alcalina : color rojo. es un organismo que sólo utiliza la peptona aeróbicamente. El medio de Kligler contiene dos hidratos de carbono: lactosa y glucosa.en la zona inclinada reacción alcalina: rojo.desdoblamiento del medio. La fermentación alcalina/ácida se observa en aquellos organismos capaces de fermentar sólamente la glucosa. Díaz Martín.precipitado negro en la zona profunda pero que no oculta totalmente la acidez. . . La fermentación de la glucosa se observa solamente por el viraje de la parte inferior debido a que la pequeña cantidad de glucosa se consume rápidamente en la superficie que se realcaliniza por el ataque a la peptona (en caso de lactosa -) Esta fermentación puede estar acompañada con producción de gases o no ( H2 y CO2 ) que se observa por la formación de burbujas o ruptura del medio. cisteina. I.1%) es baja y el organismo la ha consumido y empieza a utilizar las peptonas como nutrientes para su crecimiento. esta utilización de la peptona produce liberación de NH3 dando pH alcalino con el rojo de fenol incorporado al medio. d) Producción de SH2 : . b) Fermentación de la glucosa y de la lactosa: . Los fundamentos bioquímicos son los mismos en el Kligler que en el TSI. El medio TSI lleva. sacarosa. Laboratorio de Diagnóstico Clínico. En la capa profunda del medio se observa color amarillo debido a la fermentación anaeróbica de la glucosa. la zona inclinada es alcalina (roja) lo que indica degradación aeróbica de la glucosa ya que la concentración de glucosa en el medio (0.) se detecta por el desprendimiento de SH2 que se traduce por un ennegrecimiento del medio debido a la formación de un sulfuro metálico.formación de una o varias burbujas. . . Si la zona inclinada es alcalina y la zona profunda sin cambio. la producción de gas y la producción de SH2 . ésta lactosa no se habrá consumido y la reacción permanecerá ácida. en los que se puede determinar las fermentaciones de los hidratos de carbono. .ligera muesca en el lateral del tubo. La fermentación de la lactosa se observa por el viraje de la parte superior del tubo inclinado.en la zona profunda reacción ácida:amarillo.en la zona profunda reacción ácida: amarillo.en la zona inclinada reacción ácida:amarillo . Cuando las peptonas son degradadas se produce un pH alcalino por la liberación de NH que da al medio un color rojo intenso. La lectura se efectúa tras 16 a 24 horas de incubación a 37º. .Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. etc. E.2 Bloque temático III Kligler: Fundamento: Determina la capacidad de un organismo de utilizar un hidrato de carbono específico incorporado a un medio de crecimiento básico con producción o no de gas u de SH2. c) No fermentación de la glucosa ni de la lactosa: . Jaime Ferrán Clúa. Gustavo A. . Si la zona inclinada es alcalina y la zona profunda alcalina.desplazamiento del medio. consiguiendo los nutrientes de la peptona que contiene el medio. Protocolos de pruebas de identificación bacteriana . San Fernando de Henares. con formación del productos terminales ácidos estables y por lo tanto pH ácido (amarillo). En este test se observan: La desintegración de los aminoácidos azufrados (cistina. Material: Agar hierro de Kligler. Resultados: a) Fermentación sólo de glucosa: . se trata de un organismo que degrada la peptona tanto aeróbica como anaeróbicamente. La lactosa se encuentra en una concentración del 1% (10 veces más que la glucosa ) por lo que en el período de incubación 18-24 horas. S. Profesor Técnico de Formación Profesional. inocular hasta el fondo y a continuación en estria en la zona inclinada.en la zona inclinada reacción alcalina: rojo.color negro por toda la capa profunda que oculta la acidez. además de estos dos azucares. metatión. Técnica: Tomar una colonia de un cultivo puro y con hilo de siembra.anillo negro en la parte superior de la zona profunda. 2º curso. al reaccionar el SH2 con una sal de hierro.6 UT 16 .en la zona profunda : si el organismo es aeróbico no hay crecimiento y no hay cambio de color.

5 ml de plasma debe formar un coágulo 1. Gustavo A.Es preferible el plasma de conejo al humano por dar coágulos más firmes y por producirse éstos más rápidamente.5 ml. Díaz Martín. Profesor Técnico de Formación Profesional. Control de calidad: Prueba positiva: Staphylococcus aureus Prueba negativa: Staphylococcus epidermidis Control de calidad del plasma: la adición de una gota de Cl2 Ca al 5% a 0. 5) Observar cada 30 minutos hasta las 4 horas.Los microorganismos que utilizan el citrato pueden provocar la coagulación de un plasma citratado sin necesidad del enzima coagulasa. 4) Incubar en baño a 37ºC durante 4 horas.7 UT 16 . 2º curso. San Fernando de Henares. S. 6) En caso de negatividad incubar hasta las 24 horas. se recomienda añadir 5 uu de heparina por ml de plasma.(1) Procedimiento: 1) Poner 0. Laboratorio de Diagnóstico Clínico.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. Lectura: Prueba en tubo: 30 minutos/ 4 horas/ 1 día. . E. Utilización: Se utiliza para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de otras especies de Staphilococcus (-). Resultado: Prueba positiva: Formación de un coágulo de plasma visible. 2) Añadir 0. Fundamento: Se basa en la capacidad de este enzima de producir un coágulo visible al mezclar una suspensión de microorganismos con plasma oxalatado de conejo. capaces de producir la coagulación del plasma .5 ml de plasma en un tubo estéril. Protocolos de pruebas de identificación bacteriana . fresco o liofilizado.2 Bloque temático III Coagulasa Descripción: Es una prueba que detecta las enzimas coagulasas. Métodos: En tubo Reactivos: Plasma estéril.5 ml de cultivo en caldo en fase exponencial o una colonia grande y aislada. (28830 Madrid) Curso 2003-2004 Código 28038616 . Jaime Ferrán Clúa. I. Precauciones: . congelándose posteriormente para una futura utilización. Para evitar estos falsos positivos. 3) Homogeneizar suavemente.El plasma fresco debe ser repartido en alícuotas de 0.. humano o de conejo. Prueba negativa: Ausencia de un coágulo perfectamente formado.

Color inicial: Incoloro Prueba positiva: Amarillo débil Prueba negativa: Incolora Géneros con prueba positiva: Escherichia. El orto-nitrofenil-beta-D-galactopiranósido ( ONPG) es una molécula que también es hidrolizada por la beta galactosidasa. Protocolos de pruebas de identificación bacteriana . por lo que es difícil ver la hidrólisis de la lactosa y posterior utilización de los monosacáridos. algunos Proteus Gustavo A. Klebsiella. Las sales de amonio se desdoblan en amoniaco (NH3) provocando la alcalinidad del medio y el viraje hacia un color azul intenso. Profesor Técnico de Formación Profesional. Enterobacter Fermentación de glucosa y arabinosa (GLU. toda la cúpula de reacción vira a amarillo. E. Esta difusión es facilitada por otro enzima. Proteus Providencia Lisina y ornitina decarboxilasa (LDC. que confiere al medio una tonalidad amarillenta. donde se producirá la hidrólisis y posterior fermentación de los azúcares. El medio utilizado para la fermentación del citrato contiene sales de amonio inorgánicas. La existencia de betagalactosidasa podría ponerse de manifiesto mediante la visualización de la disminución de pH. gracias a la presencia de un indicador de pH adecuado. rojo anaranjado Prueba negativa: Amarillo Especies con LDC positiva: Variable Especies con ODC positiva: Variable Utilización de citrato (CIT) Esta prueba sirve para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono para su metabolismo. azul claro Géneros con prueba positiva: Klebsiella. Pero hay bacterias que. responsable de la ruptura del disacárido lactosa en dos monosacáridos: glucosa y galactosa Para que se produzca esta hidrólisis es necesario que la lactosa difunda hacia el interior de la bacteria. capaces de decarboxilar los aminoácidos lisina y ornitina dando lugar a dos sustancias. Si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono para su metabolismo.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. Color inicial: azul claro Prueba positiva: Azul intenso Prueba negativa: Verde claro. 2º curso. que en presencia de un indicador da lugar a la aparición de un color púrpura Color inicial: Amarillo Prueba positiva: Rojo cereza. San Fernando de Henares. poseyendo la betagalactosidasa. ya sea por metabolismo fermentativo u oxidativo da lugar a productos finales ácidos que provocan el viraje a amarillo del indicador presente en la solución.2 Bloque temático III Pruebas para bacilos Gram negativos (API 10S) Beta galactosidasa (ONPG) Esta prueba determina la presencia del enzima beta galactosidasa. Díaz Martín. dando lugar a un producto final. S. cadaverina y putrescina de carácter alcalino. ARA) La utilización de glucosa. (28830 Madrid) Curso 2003-2004 Código 28038616 . si el metabolismo es oxidativo solo virará la zona aeróbica. Si el metabolismo es fermentativo. I. Color inicial: Azul Prueba positiva: Amarillo limón Prueba negativa: Azul o azul verdoso Géneros con GLU positiva: Todas las enterobacterias Géneros con ARA positiva: Todas las enterobacterias menos Morganella. Laboratorio de Diagnóstico Clínico. ODC) Estas pruebas determina la presencia de estas dos enzimas. la galactósido-permeasa. no poseen permeasa. Jaime Ferrán Clúa. el ortonitrofenol.8 UT 16 . utiliza también las sales de amonio como su única fuente de nitrógeno.

Color inicial: Incoloro Prueba positiva: Anillo rosa en superficie Prueba negativa: Incoloro Especies con prueba positiva: E. el indol. San Fernando de Henares. Morganella Indol (IND) Esta prueba determina la capacidad de un microorganismo de formar indol a partir de una molécula de triptófano. Color inicial: Amarillo Prueba positiva: Fucsia Prueba negativa: Amarillo Géneros con prueba positiva: Klebsiella. es revelado mediante la adición de un reactivo. (28830 Madrid) Curso 2003-2004 Código 28038616 . añadiendo los reactivos 1 y 2 en dicho pocillo. con la consiguiente acidez resultante. Proteus Gustavo A. cisteina y metionina). vulgaris Reducción de nitratos a nitritos (NO2) Determina la capacidad de un microorganismo de reducir el nitrato en nitritos o en nitrógeno libre.2 Bloque temático III Producción de SH2 (SH2 ) Esta prueba determina si se ha liberado ácido sulfhídrico por acción enzimática a partir de los aminoácidos que contienen azufre (cistina. grisáceo Géneros con prueba positiva: Proteus. coli. oxytoca. 2º curso. Esta reacción es catalizada por un conjunto de enzimas que reciben el nombre de triptofanasa. Protocolos de pruebas de identificación bacteriana . produciendo junto con determinados indicadores presentes en el medio. S. Esta prueba se hace después de la lectura de la cúpula de fermentación de la glucosa.Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. Klebsiella. Profesor Técnico de Formación Profesional. La lectura se hace en los dos minutos siguientes a la adición de l reactivos Color inicial: Amarillo o azulado Prueba positiva: Rojo sangre lacada Prueba negativa: Amarillo o azulado Especies con prueba positiva: Escherichia. La lectura de esta prueba se hace tras la adición de un reactivo: el cloruro férrico que provoca un cambio de color marrón fuerte en caso de positividad Color inicial: Incoloro Prueba positiva: Marrón oscuro Prueba negativa: Marrón claro o amarillo Géneros con prueba positiva: Proteus. formando dos moléculas de amoníaco que alcalinizan el medio y producen un viraje de color a rojo grosella. Salmonella. K. Jaime Ferrán Clúa. un precipitado visible de color negro Color inicial: Incoloro Prueba positiva: Negra Prueba negativa: Incoloro. Proteus Triptófano desaminasa (TDA) Determina la capacidad de un microorganismo de desaminar la fenilalanina en ácido fenilpirúvico. el reactivo de Kovacs. E. Citrobacter Ureasa (URE) Determina la capacidad de un microorganismo de desdoblar la urea gracias a la enzima ureasa. I. El producto formado. Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Esta reacción se pone de manifiesto mediante la adición de dos reactivos que provocan la aprición de un color rojo sangre en caso de positividad. Díaz Martín. P.9 UT 16 .