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BIOLOGA MOLECULAR

I. OBJETIVOS

Describir el proceso de la electroforesis.

Detallar los componentes necesarios para llevar a cabo una electroforesis.
Preparar una electroforesis.

II. INTRODUCCION
Dado a que la mayora de los polmeros biolgicos poseen carga y, por lo tanto,
cuentan con la capacidad de migrar bajo la influencia de un campo elctrico. El
transporte de partculas a travs de un disolvente mediante un campo elctrico
el cual es conocido con el nombre de electroforesis.

El trmino electroforesis se usa para describir la migracin de una partcula

cargada bajo la influencia de un campo elctrico. Muchas molculas importantes
biolgicamente (aminocidos, pptidos, protenas, nucletidos, cidos
nucleicos) poseen grupos ionizables y existen en solucin como especies
cargadas, bien como cationes, o bien como aniones. Estas especies cargadas
se van a separar en funcin de su carga cuando se aplica un voltaje a travs de
los electrodos.
Por lo general para caracterizar la molcula se determina la velocidad a la que
esta se mueve en un campo elctrico y se utiliza para determinar el peso
molecular en el caso de protenas o para detectar cambios de aminocidos y
separar cuantitativamente distintas especies moleculares.
La electroforesis en geles de poliacrilamida es utilizada para ver secuencias de
ADN de bajo peso molecular, entre 80pb y 300pb. Ha sido ampliamente utilizada
para el trabajo con microsatlites o SSR en la construccin de mapas de
ligamiento, estudios poblacionales y en la seleccin asistida por marcadores
moleculares (MAS). Adicionalmente es una herramienta til para el aislamiento
de pequeas secuencias cuyo trabajo se dificulta en geles de menor resolucin,
geles de agarosa.
En el presente informe mostramos el procedimiento a seguir para realizar una
electroforesis en gel de poliacrilamida, el cual utilizamos el Nitrato de Plata en
lugar de rayos UV para que el DNA sea revelado. Se explica tambin los
componentes que se utilizan para elaborar este gel como son: solucin de
acrilamida, TBE, agua destilada, TEMED y APS.
Para la deteccin precisa del bacilo tuberculoso, el ADN obtenido de las
muestras se someti a amplificacin mediante Reaccin en Cadena de la

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Polimerasa (PCR) de la secuencia gentica IS6110 e IS3/4, especfica de

Mycobacterium tuberculosis, cuyo producto final se observ en geles de
poliacrilamida teidos con nitrato de plata.

III. MARCO TEORICO

El trmino electroforesis se refiere a una tcnica separativa que emplea un
campo elctrico aplicado que acta sobre partculas cargadas causando su
movimiento a travs de una matriz.
El primer aparato sofisticado de electroforesis fue empleada por Tiselius en el
ao 1937. Raymond Weintraub en 1959 emplearon como soporte para la
electroforesis un gel de poliacrilamida (PAGE), posteriormente el mtodo fue
perfeccionado por varios investigadores como Davis y Ornstein. Para separar
cidos nucleicos es comn utilizar geles de agarosa.
Esta es una tcnica para la separacin de molculas segn la movilidad de estas
en un campo elctrico a travs de una matriz porosa, la cual finalmente las
separa por tamaos moleculares y carga elctrica, dependiendo de la tcnica
que se use.

La tcnica clsica utiliza una tira recubierta de una sustancia porosa impregnada
de un electrolito. Sus extremos se sumergen en dos depsitos independientes
que contienen ambos al electrolito y estn unidos a los electrodos del generador
de corriente. La muestra se deposita en forma de un pequeo trazo transversal
en la tira. La distancia de migracin se mide en relacin un marcador interno. Las
placas son reveladas con sales de plata, azul de Coomassie, o reactivos en
particular.

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La electroforesis en geles de poliacrilamida es utilizada para ver secuencias de

ADN de bajo peso molecular, entre 80pb y 300pb. Ha sido ampliamente utilizada
para el trabajo con microsatlites o SSR en la construccin de mapas de
ligamiento, estudios poblacionales y en la seleccin asistida por marcadores
moleculares (MAS). Adicionalmente es una herramienta til para el aislamiento
de pequeas secuencias cuyo trabajo se dificulta en geles de menor resolucin,
geles de agarosa.
La tcnica consiste en la elaboracin de una fina capa de gel de acrilamida
adherida a una lmina de vidrio por la cual migra el ADN. Al igual que en un gel
de agarosa, la migracin responde a la carga negativa neta de la molcula de
ADN y la concentracin del gel. Las secuencias de ADN ms pequeas migran
a mayor velocidad mientras que las grandes se quedan atrs.
La tcnica se lleva a cabo en cinco pasos: el montaje de la cmara de
electroforesis, la preparacin de la solucin de poliacrilamida y el llenado de la
cmara, la pre-corrida del gel, la corrida de las muestras y la tincin del gel.
Los geles de poliacrilamida pueden ser desnaturalizantes o no. Los que los son,
se utilizan para la corrida de microsatlites. Estos presentan altas
concentraciones de urea (5M) y son corridos a elevadas temperaturas (50-
55oC), permitiendo que las hebras de ADN permanezcan separadas durante la
electroforesis. Priori a la servida de este tipo de gel, los productos de PCR son
desnaturalizados, a fin de incrementar la resolucin de la separacin, mediante
calentamiento a 95oC y tratamiento con formamida.
La visualizacin de las bandas puede hacerse directamente por tincin con
bromuro de etidio (geles de agarosa) o nitrato de plata, a travs de
autoradiografa utilizando iniciadores marcados con radioistopos en la
reaccin de PCR o mediante fluorescencia cuando se utilizan geles de
secuenciacin. La deteccin mediante fluorescencia es el mtodo analtico con
mayor sensibilidad, mientras que la deteccin radioactiva y mediante tincin con
AgNO3 tienen sensibilidad equivalente (Comincini et al. 1995, Christensen et al.
1999, Creste et al. 2001).
La deteccin en geles de poliacrilamida teidos con nitrato de plata ofrece, segn
nuestra experiencia, la mejor relacin costo-beneficio. Aunque laboriosa esta
metodologa ofrece una alta resolucin, requiere de equipos poco sofisticados.
La deteccin mediante fluorescencia, en contraste, es costosa pues requiere de
equipos sofisticados, cuya adquisicin slo se justifica en aquellos laboratorios
que manejan grandes volmenes de muestras. La deteccin radiactiva requiere
P32, el cual es costoso. Adicionalmente, este radioistopo representa riesgos
para la salud por lo que su manejo en el laboratorio requiere de equipamiento de
seguridad que aumentan los costos de la deteccin.
Existen diversos protocolos para la tincin del ADN en geles de poliacrilamida
con AgNO3 (Beidler et al. 1982, Bassam et al. 1991, Sanguinetti et. al. 1994). La
tincin con AgNO3 consta de varias etapas o pasos cuyos tiempos de incubacin

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son crticos para la obtencin de buenos resultados. La preparacin de

soluciones para la tincin requiere agua de excelente calidad (bidestilada y
desionizada). Estas soluciones pueden ser reutilizadas un nmero limitado de
veces. Los pasos de lavado de los geles tambin requieren de agua bidestilada.
De especial cuidado con la metodologa de tincin con AgNO3 es todo lo relativo
a la limpieza y manejo de las cmaras de electroforesis utilizadas. El manejo de
estas cmaras requiere de un espacio de trabajo bien estructurado a fin de
minimizar accidentes que podran ocurrir durante la preparacin y corrida de los
geles, el lavado de los vidrios, o los distintos pasos del proceso de tincin. Aqu
describimos el ensamblaje y preparacin de dos modelos comerciales de
cmaras de electroforesis. Sin embargo, los principios son aplicables a otros
modelos.
El tratamiento de desechos luego de los procesos de electroforesis y tincin son
de vital importancia a fin de evitar la contaminacin de los espacios de trabajo y
del personal. La solucin de AgNO3 debe ser precipitada con sales y filtrada
antes de ser descartada en el lavaplatos. Los restos de poliacrilamida, luego del
desprendimiento de geles, al igual que todos aquellos desechables en contacto
con ella (servilletas, guantes, puntas, etc.), deben ser depositados en bolsas
plsticas aptas para incineracin debidamente etiquetadas.

Los geles de poliacrilamida son utilizados para separar la mayora de las

protenas o pequeos
oligonucletidos. A los fines
de este prctico se explicara
nicamente la aplicabilidad
de estos geles para la
separacin de protenas.
En presencia de radicales
libres, que son
proporcionados por el
persulfato de amonio (APS) y
estabilizados por el TEMED,
se genera una reaccin en cadena que es iniciada con monmeros de acrilamida
que polimeriza en largas cadenas que son entrecruzadas con la bis-acrilamida
para formar la matriz del gel. Esta polimerizacin es inhibida por el oxgeno. Para
la electroforesis en gel de poliacrilamida de muestras proteicas se puede utilizar
un sistema de buffers continuo o discontinuo. El sistema continuo tiene una nica
clase de gel, el separador (separating) y usa el mismo buffer que el de corrida.
El discontinuo esta formado por dos geles

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distintos. En la parte de arriba se coloca un gel

separador con un tamao de poro mayor
(stacking) que sirve a diferencia del stacking sirve
para concentrar las muestras (en una banda)
antes de que ingresen al gel separador. Cada uno
esta compuesto de un buffer que son distintos
entre si y a su vez distinto que el de corrida. El
sistema discontinuo otorga una mayor resolucin
ya que las protenas ingresan como una banda
discreta al gel de separacin.
La polimerizacin de los geles se realiza entre dos vidrios verticales, que
funcionan como moldes, para dar un gel de 0,5, 0,75, 1 o 1,5 mm de espesor.
Inmediatamente despus de preparar la mezcla de archilamida/bisacrilamida,
buffer, APS y temed, se coloca entre los vidrios el borde superior del gel se cubre
con agua y para evitar el contacto con el oxgeno que inhibe la polimerizacin.

IV. FUNDAMENTO
La electroforesis es la migracin de solutos inicos bajo la influencia de un campo
elctrico; Estas partculas migran hacia el ctodo o nodo (electrodos - y +), en
dependencia de una 1 Master en Ciencias Bioqumicas. Investigadora Agregada.
combinacin de su carga, peso molecular y estructura tridimensional. Es de destacar que
a escala analtica, los mtodos electroforticos son de alta sensibilidad, poder de
resolucin y versatilidad, y sirven como mtodo de separacin de mezclas complejas de
cidos nucleicos, protenas y otras biomolculas, donde aportan un potente criterio de
pureza. Se pueden conocer tambin mediante estas tcnicas, las caractersticas cido-
bsicas de las protenas presentes en un extracto crudo, lo que da la informacin
necesaria si se pretende realizar una separacin cromatogrfica basada en diferencias
de carga. Es til adems para determinar otros parmetros como peso molecular, punto
isoelctrico y nmero de cadenas polipeptdicas de las protenas. La velocidad de
migracin (v) de la partcula es directamente proporcional al producto de su carga
efectiva (q) y el gradiente de potencial elctrico (E) e inversamente proporcional al
coeficiente de friccin (f) relativo a la talla y forma de la molcula, o sea, a la resistencia
que le ofrece el medio. V = q E / f
La movilidad electrofortica (Me) es un caso particular de la velocidad de migracin de
un in, cuando se aplica un campo elctrico de 1 V/cm. Su signo es igual al de la carga
de la partcula. La velocidad de migracin electrofortica depende de la densidad de
carga de la molcula (relacin carga / peso), del voltaje aplicado y de la porosidad del
gel de electroforesis. El voltaje no se puede incrementar indiscriminadamente porque
se genera un excesivo calor. En contraste, al aplicar bajo voltaje puede ocurrir una pobre
separacin, por causa de la difusin por tiempo muy prolongado de la corrida

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electrofortica.1 La mayora de las biomacromolculas (protenas, cidos nucleicos y

polisacridos) poseen determinada carga elctrica con grupos aninicos y catinicos
capaces de disociarse. La carga neta de la partcula est dada por el pH del medio y
puede ser modificada por la interaccin con pequeas molculas de iones u otras
macromolculas. De lo anterior se deduce que el pH influye sobre la velocidad de
migracin de las molculas. 2 En el punto isoelctrico de la biomolcula, pH al cual su
carga neta es 0, esta no migra. Por debajo del punto isoelctrico tiene carga neta positiva
y migra hacia el ctodo, y por encima del punto isoelctrico tienen carga neta negativa
y migra hacia el nodo.

V. MATERIALES
Placas de vidrio.
Solucin de poliacrilamida(Acrilamida:Bisacrilamida)
TBE 5X, TBE 1X
Agua destilada.
Persulfato de amonio (APS)
TEMED
Buffer de carga.
Solucin fijadora o de parada.
Solucin de nitrato de plata.
Solucin reveladora.
Vaselina.
Alcohol.
Cmara electrofortica.
Fuente de poder o energa.
Micropipetas.
Lminas de vidrio.
Separadores.
Slips
Peina.
Tips o puntas.
Mycobacterium tuberculosis.

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VI. PREPARACIN
Limpieza de la cmara
1. Limpie el vidrio por ambos lados con gasa y alcohol, luego secar.
Ensamblaje de las piezas para el molde del gel
1. Limpie los separadores con alcohol y colquelos en los bordes laterales del
vidrio de la cmara.
2. Coloque el vidrio (cara tratada) sobre la cmara.

3. Coloque los slips, cuidando que queden al mismo nivel de la base de la cmara
y el vidrio.

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Preparacin del gel de poliacrilamida:

- Solucin de poliacrilamida 30:1(acrilamida: bis acrilamida)
- Solucin de TBE 5X y TBE 1X
- Solucin de Persulfato de Amonio 10%
- TEMED( N.N.N.N TETRAMETIL Etilen Diamin)
REACTIVOS
6 mL Sol. poliacrilamida
6 mL TBE 5x
18 mL Agua Destilada
375 L APS
37,5 L TEMED

Se vierte la mezcla de los componentes anteriormente mencionados a los

cristales previamente preparados.
Posteriormente homogenizamos la solucin final,

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y la vertimos en las placas de vidrio y colocamos el peine y se deja polimerizar

por un periodo de tiempo de 20-30 minutos.

Despus de 20 minutos se retira el peine y con una aguja hipodrmica se

limpian los pocillos con el fin de dejarlo libre de residuos, se enjuagan con
agua destilada.

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Se adiciona a las placas de vidrio vaselina con una jeringa.

Se coloca la placa en el sistema, uniendo las placas y los sistemas con los
slips.

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Se llena las cubetas del sistema con buffer TBE 1X.

Se colocan los cables que unen el sistema con la fuente de alimentacin y se

comprueba la funcionalidad de este con el burbujeo presente.
Se deja encendida para que limpie los pocillos.

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A cada muestra de PCR se le adiciona 1ul de buffer de aplicacin.

Orden de las muestras en la placa de electroforesis

- C(-) control negativo..10 ul
- 1148(IS3/4)..10 ul
- 1149(IS3/4)..10 ul
- MUESTRA SIN NOMBRE(IS6110)..10 ul
- 1148(IS6110)...10 ul
- C(-) control negativo....10 ul
-1149(IS6110).....10 ul
-9685(IS6110).....10 ul
-9685(IS3/4)........10 ul

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Se apaga la fuente de aplicacin y se procede a colocar las muestras en los

posillos.

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COLORACION DEL GEL

Materiales Para La Tincin Con Nitrato
De Plata (Agno3)
SOLUCION FIJADORA
Etanol absoluto
cido actico
H2O destilada
SOLUCIN NITRATO DE PLATA
AgNO3
Agua destilada
SOLUCIN REVELADORA
Formol 40% ( formaldehido)
NaOH
Agua destilada

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Se coloca el gel en solucin fijadora por un lapso de tiempo de 10-15 minutos.

Se retira el fijador y se procede a colocarlo en Nitrato de Plata por un periodo

de tiempo de 15-20 minutos.

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Posteriormente se enjuaga el gel dos veces con agua corriente.

Se le adiciona el gel revelador, se mantendrn en esta solucin hasta la
aparicin de las bandas respectivas.
Para la conservacin del gel se coloca en fijador.

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VII. RESULTADOS

Gel de poliacrilamida El carril 1 y 6 corresponde a los controles negativos

(reaccin sin ADN) carril 2, 3, 9: perteneciente al marcador IS3/4 no se logran
observar la amplificacin porque hubo en error en la elaboracin del PCR(ya
que debieron salir dos carriles positivos); carril 4 y 8:con marcador IS6110(ya
que el grupo que trabaj con IS3/4 les falt mix para su muestra de PCR)
sali negativo; los carriles 5 y 7 corresponden a los controles positivos.

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Nuestros resultados en la electroforesis indica que sali positiva.

Cada control positivo es una muestra de ADN amplificado, para cada regin,
estando estos ya cuantificados en relacin a su nmero de pares de bases.
Las bandas de las muestras observadas nos indican se amplific, puesto que
ests se parecen a las de los controles positivos. Hecho que lleva a la
conclusin que la tcnica electrofortica lleg a su objetivo que fue comprobar
los resultados de la PCR realizado anteriormente, aunque hubo errores de
PCR en el grupo que trabaj marcador IS3/4.
La visualizacin de las bandas puede hacerse directamente por tincin con
bromuro de etidio (geles de agarosa) o nitrato de plata, a travs de
autoradiografa utilizando iniciadores marcados con radioistopos en la
reaccin de PCR o mediante fluorescencia cuando se utilizan geles de
secuenciacin.
Cuando se ha completado la electroforesis, las molculas ms pequeas han
llegado al nodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adicin de un
colorante especfico para hacerlas visibles.
La deteccin mediante fluorescencia es el mtodo analtico con mayor
sensibilidad, mientras que la deteccin radioactiva y mediante tincin con
AgNO3 tienen sensibilidad equivalente.
Al final de la prctica observamos las bandas distribuidas de acuerdo a la
base en los pocillos en los que inyectamos al inicio, se muestra el gel en una
base de luz fluorescente para mejor visualizacin de las bandas de ADN.

VIII. CONCLUSIONES
Este trabajo representa un simple instrumento de gran utilidad para la exacta
y reproducible cuantificacin de las bandas de cidos nucleicos desarrollados
en el gel de poliacrilamida.
Los beneficios de disponer de mejores sistemas de diagnstico, con mayor
relevancia clnica, como la Reaccin en Cadena de la Polimerasa sern de
gran significancia en el combate, eliminacin de la tuberculosis y de profundo
impacto en la salud de la sociedad.
El TBE acta es un buffer que protege los cidos nucleicos contra la
degradacin enzimtica.El TEMED como componente del gel ayuda a
disminuir la longitud media de la cadena del polmero e incrementa la
turbidez del gel, al tiempo que disminuye su elasticidad.
Los geles de poliacrilamida ayuda a la electroforesis por ser inertes,
transparentes y estables en un amplio rango de pHs, temperatura y fuerza
inica.
Las molculas que tienen una carga negativa migraron hacia el polo positivo;
mientras que las molculas cargadas positivamente migraron hacia el polo
negativo. Las molculas cargadas viajaron a travs de la electroforesis segn
su carga y tamao.

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El ADN tiene una carga negativa a pH neutro por eso migr a travs del gel
hacia el electrodo positivo durante la electroforesis.
Todos los colorantes utilizados tienen una carga negativa, por lo tanto
migraron hacia el nodo.

IX. CUESTIONARIO
1. Cul es la funcin del TEMED y APS?
El APS es utilizado como iniciador, el TEMED como catalizador y la bisacrilamida
como agente entrecruzante.
El persulfato amnico en dis
olucin se disocia formando dos iones sulfato con un radical libre, que activa la
acrilamida inducindola a romper el doble enlace (C=C) para convertirse tambin
en un radical libre, que al encontrarse en otra molcula se une a ella formando
un polmero lineal de acrilamida, al encontrarse tambin en disolucin molculas
de bisacrilamida, tambin entran en el juego, pero doblemente, ya que pueden
integrar (como se ve en la figura) dos cadenas de acrilamida. El TEMED, es el
catalizador de la reaccin, de modo que la polimerizacin tendra lugar sin su
presencia, pero sera extremadamente lento. Hay que tener en cuenta que el O2
inhibe la polimerizacin de la acrilamida.
2. Qu otros catalizadores son empleados para la formacin de geles de
poliacrilamida?
La polimerizacin se lleva a cabo con la utilizacin de sistemas catalticos redox
como por ejemplo:
Persulfato de amonio (agente oxidante) y TEMED como agente reductor.
Persulfato de amonio y 3-dimetilamino propionitrilo (DMAPN).
Perxido de hidrgeno, sulfato de hierro y cido ascrbico.
La polimerizacin no ocurre a bajo pH, ya que requiere radicales de monmeros
libres formados por catlisis bsica de radicales oxgeno del persulfato.
La fotopolimerizacin con riboflavina no es inhibida por el oxgeno, sin embargo,
en ambos casos el TEMED acta como agente reductor suave y acelera la
polimerizacin.
3. Cules son las fuentes de error en una electroforesis?
La electroforesis es una tcnica muy sensible y puede ser afectada por muchos
errores experimentales, estos se reflejan a continuacin.
3.1. Temperatura durante la polimerizacin y la corrida del gel
La movilidad de las protenas vara entre otras causas porque la viscosidad del
agua aumenta a bajas temperaturas (la distancia recorrida es aproximadamente
20 % mayor en la regin central que es ms caliente). Este efecto puede
atenuarse con el empleo de un tampn ms diluido o manteniendo temperaturas
bajas durante el desarrollo de la electroforesis. En geles vertidos a 25 C ocurre
mayor variabilidad de los Rf si se comparan con los vertidos a bajas
temperaturas. La eficiencia de polimerizacin incrementa comparativamente a 0

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C por lo que sus propiedades fsicas son superiores (para SDS-PAGE) a las de
geles polimerizados a 25 C, posiblemente por una disminucin del promedio de
la longitud de la cadena de estos ltimos.8 Un promedio de la desviacin
estndar de los Rf determinados por geles hechos con la misma mezcla de
polimerizacin es de 0,01, mientras que entre geles hechos de diferentes lotes
de polimerizacin, aunque preparados con idntica cantidad de catalizadores es
de 0,13. Esto est dado porque no es igual el porcentaje de conversin de
monmero en polmero.
La uniformidad de la temperatura a travs del gel mientras ocurre la corrida
electrofortica generalmente elimina el efecto de la deformacin de las bandas
en forma de sonrisa.2
3.2. Velocidad de la polimerizacin.
Niveles de catalizador Una polimerizacin muy rpida puede deformar las
bandas, porque ocurre una contraccin no uniforme del gel, en este caso debe
reducirse el TEMED y el persulfato de amonio o adicionar ferricianuro de potasio,
con el objetivo de hacer ms lenta esta. El empleo de niveles bajos de catalizador
provoca que la superficie del gel se torne desigual y tienda a romperse con
facilidad, pero el empleo de altas concentraciones provoca que los geles tiendan
a cuartearse. Este problema puede solucionarse en geles de altas
concentraciones, al poner una capa de alcohol isobutlico en lugar de agua (en
geles de bajas concentraciones deben emplearse alcoholes de altas
densidades).
3.3. Pureza de los reactivos
El empleo de reactivos de alta calidad y agua desionizada es un prerrequisito
para hacer geles reproducibles y de alta resolucin, en particular esto es muy
importante para la acrilamida, ya que es el constituyente ms abundante del gel
y sus principales impurezas son cido acrlico residual (que puede retardar la
movilidad electrofortica de algunas protenas), poliacrilamida lineal e iones.4 O
Gaal y otros10 plantearon que el cido acrlico y otras impurezas pueden ser
eliminados por diferentes mtodos, entre ellos la recristalizacin de la acrilamida.
En SDS-PAGE la calidad del SDS es importante, porque las protenas pueden
unirse a impurezas como alkil sulfato C10, C14 y C16, y provocar que una simple
protena forme mltiples bandas en el gel. Con SDS puro ocurre una migracin
anmala en protenas muy bsicas o muy cidas, en varias glicoprotenas y
lipoprotenas por causa de su composicin inusual.
3.4. Tiempo de corrida
La determinacin del tiempo adecuado de corrida es muy importante, pues
corridas muy cortas impiden que las muestras avancen el espacio necesario para
su correcta separacin, pero tambin se ha probado que tiempos de corrida
cortos minimizan la dispersin de la muestra y el ensanchamiento de la banda.
3.5. Preparacin de las muestras

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En el caso de la SDS-PAGE es necesario lograr una completa desnaturalizacin

de las protenas, para evitar la aparicin de bandas fantasmas en la
electroforesis (bandas dobles por la concentracin de ME o por el tiempo de
incubacin).12 Seichi y Chait23 reportaron que la alquilacin de la cistena antes
de la electroforesis evita la formacin accidental de aductos de acrilamida
durante la electroforesis.
4. Qu es el efecto smile?
En general, las imgenes de geles de electroforesis presentan distorsiones,
una de ellas es el Efecto Sonrisa, provocado por las variaciones en la
velocidad de desplazamiento de las molculas en el gel.
5. Qu colorantes se utilizan en electroforesis?
- Azul de bromofenol
- Coomassie blue
- Bromuro de etidio
- Nitrato de plata
- Xileno cianol

6. Qu es una tincin argntica?

La tincin argntica es el uso de plata para modificar selectivamente el color o
la apariencia de un objeto. Es una tcnica frecuente de tincin
en histologa donde se utiliza para revelar detalles extremadamente finos.

X. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
B. Alberts, D. Bray, K. Hopkin, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts
y P. Walter. (2006) Introduccin a la Biologa Celular. 2 Edicin. Editorial
Mdica Panamericana.
B. Lemonte. Electroforesis en Gel de Poliacrilamida
Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach, 3 ed. IRL Press, 1998.
-Martin, R. Gel Electrophoresis: Nucleic Acids. ios Scientific Publishers,
1996. - Rickwood, D., Hames, B.D. Gel Electrophoresis of Nucleic Acids,
2 ed. The Practical Approach Series. IRL Press, 1990. - Walker, J.M. The
Protein Protocols Handbook, 2 ed. Humana Press, 2002. - Westermeier
Electrophoresis in practice: A guide to methods and aplications of DNA
and protein separations, 4 ed. John Wiley & sons, 2005.
Facultad de Medicina UNAM, Departamento de Bioqumica. Bioqumica y
Biologa Molecular. Objetivos del curso y manual de prcticas de
laboratorio. Mc Graw-Hill Interamericana Editores, Mxico, 2000.
Hames BD, Ricwood D (2002): Gel Electrophoresis of Proteins. A
Practical Approach, 3 ed. Oxford University Press.
Lehninger A, Nelson DL, Cox M. Principios de Bioqumica, Worth
Publishers, 5 edicin, 2008.

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