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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN


SETOR PALOTINA
CURSO DE TECNOLOGIA EM BIOTECNOLOGIA

ATIVIDADES DE PESQUISA EM CULTURA DE TECIDOS


VEGETAIS COM ESPCIES FLORESTAIS NATIVAS

Aluno: Mariana Moresco Ldtke


Supervisora: Prof Dra Lia Rejane Silveira Reiniger
a

Orientadora: Profa Dra Suzana Stefanello

Trabalho de Concluso de Curso


apresentado como requisito
parcial para a concluso do
CURSO DE GRADUAO
EM TECNOLOGIA EM
BIOTECNOLOGIA

PALOTINA - PR
Agosto de 2013
ii

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN


SETOR PALOTINA
CURSO DE TECNOLOGIA EM BIOTECNOLOGIA

ATIVIDADES DE PESQUISA EM CULTURA DE TECIDOS


VEGETAIS COM ESPCIES FLORESTAIS NATIVAS
REA: Biotecnologia Florestal

Aluno: Mariana Moresco Ldtke


Supervisora: Prof Dra Lia Rejane Silveira Reiniger
a

Orientadora: Profa Dra Suzana Stefanello

Trabalho de Concluso de
Curso apresentado como
requisito parcial para a
concluso do CURSO DE
GRADUAO EM
TECNOLOGIA EM
BIOTECNOLOGIA

PALOTINA - PR
Agosto de 2013
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O amor no est nem ai para

o que acreditamos e deixamos de acreditar.

Ele acontece, apesar de ns.

Liberdade na vida ter um amor para se prender.

Fabrcio Carpinejar
iv

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela vida e por proporcionar a concretizao desta importante etapa.


A minha famlia, pais, avs, tias, tios e primos, por todo o amor, carinho, dedicao e
confiana, no terei palavras para agradecer todo o esforo feito por vocs para a realizao
de mais este sonho.
Aos meus avs que prestaram suporte, estiveram do meu lado durante esse perodo me
aconselhando e me confortando.
A minha orientadora, professora Dra. Suzana Stefanello, exemplo de profissionalismo e
carter, por todo o aprendizado profissional e pessoal que me proporcionou. Pelo apoio, por
estar sempre presente, pela sua dedicao, pelos seus conselhos e entendimentos, pelas
oportunidades e pela parceria desde o princpio.
A minha supervisora, professora Dra. Lia Rejane Silveira Reiniger, pela oportunidade, pelo
ensino e dedicao para que fosse possvel a conquista de mais esta etapa da minha vida.
Muito obrigada!
Universidade Federal do Paran e aos professores do curso de Tecnologia em
Biotecnologia pela minha formao.
Universidade Federal de Santa Maria pela oportunidade de realizao do estgio.
Aos meus colegas de laboratrio, Charlene, Slvia, Jaqueline, Carla, Aline Paim, Enrique,
Jlio, Aline Curti, Leonardo, Karol, Clarissa, Victoria e Iana, obrigada pelo auxilio, pacincia,
conversas e amizade.
Ao meu irmo e amigo Matheus, por tudo que sempre fez por mim, pelos conselhos, e
amizade.
s minhas amigas Fernanda, Isadora, Las Fernanda, Gabriela, Evelyn, Flvia, Jssica e
Carolini e meu amigo Lus Felipe por estarem comigo em todos os momentos e pela amizade.
Aos meus colegas de faculdade, por todos esses anos de convivncia e amizade.

Muito obrigada!
v

SUMRIO

1 INTRODUO ..................................................................................................................... 7

2 REVISO BIBLIOGRFICA ................................................................................ .9

2.1 CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS ............................................................................. .9

2.1.1 Meios nutritivos e fitorreguladores...................................................................................9

2.1.2 Desinfestao superficial dos explantes...........................................................................12

2.2 DESCRIO DAS ESPCIES UTILIZADAS NOS EXPERIMENTOS.........................15

2.2.1 Canafstula (Peltophorum dubium (Spreng.) Taub.)........................................................15

2.2.2 Luehea divaricata (Mart. & Zucc.)..................................................................................16

3 OBJETIVOS.........................................................................................................................19

3.1 OBJETIVO GERAL...........................................................................................................19

3.2. OBJETIVOS ESPECFICOS.............................................................................................19

4 MATERIAL E MTODOS.................................................................................................20

4.1 DESCRIO DO LOCAL DE ESTGIO........................................................................20

4.2 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS DURANTE O ESTGIO........................................21

4.2.1 Germinao de sementes de Peltophorum dubium em meio gar-gua..........................21

4.2.2 Inoculao de explantes de Luehea divaricata provenientes de plntulas germinadas in

vitro em meio WPM e MS com cido 3-Indolbutrico (AIB) na ausncia e na presena de

carvo ativado...........................................................................................................................23

4.2.3. Acompanhamento de atividades de coleta de amostras de tecidos vegetais para fins de

isolamento de DNA...................................................................................................................23

5 RESULTADOS E DISCUSSO.........................................................................................24

5.1 ORGANIZAO DO LABORATRIO DE CULTURA DE TECIDOS E

ESTERILIZAO DO MATERIAL ......................................................................................24

5.1.1. Esterilizao em autoclave..............................................................................................24


vi

5.1.2. Preparo de etanol 70% (v/v) para assepsia......................................................................26

5.2 PREPARO DE MEIOS DE CULTURA WPM E MS........................................................26

5.3 INOCULAO DE SEMENTES E EXPLANTES EM CMARA DE FLUXO

LAMINAR................................................................................................................................30

5.4 OUTRAS ATIVIDADES...................................................................................................31

6 CONSIDERAES FINAIS..............................................................................................32

7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS...............................................................................33
7

1 INTRODUO

H grandes desafios atualmente para a humanidade, entre eles a preocupao com a


preservao do meio ambiente, que se manifesta nos pases desenvolvidos voltados para
pases em que ainda h grandes extenses territoriais cobertas por florestas tropicais e
subtropicais, como o caso do Brasil.
No entanto, embora o pas apresente dimenses continentais, sendo detentor da flora
mais diversificada do planeta (SANDES; DI BLASI, 2000) e, em consequncia disto, vtima
frequente da biopirataria; as espcies nativas no so integradas em sistemas produtivos,
reduzindo a sua explorao econmica. Assim, necessrio que sejam traadas estratgias no
intuito de manter esta diversidade a partir de uma tica sustentvel, evitando-se presses que
degradem os ecossistemas naturais.
As espcies florestais so de fundamental importncia econmica, pois delas
originam-se diversos produtos como madeira, biomassa para polpa celulsica, papel e energia
para as indstrias. Alm disso, muitas espcies ofertam produtos no madeirveis para a
indstria cosmtica, alimentcia e farmacutica (STUDART-GUIMARES et al., 2003).
Contudo, espcies florestais apresentam grande relevncia para a economia brasileira.
De acordo com os dados da Sociedade Brasileira de Silvicultura (SBS, 2007), a participao
do setor florestal no Produto Interno Bruto (PIB) do pas atinge 3,5%, o que equivale a US$
37,3 bilhes. So gerados 4,33 milhes de empregos relacionados s florestas plantadas e, no
tocante s florestas nativas, 2,58 milhes.
Com a crescente compreenso da funo ecolgica das florestas para a
sustentabilidade da vida no planeta e as possveis consequncias decorrentes da explorao
indiscriminada, florestamentos e reflorestamentos encontram-se nas agendas de diversas
naes (MURALIDHARAN; KALLARACKAL, 2004). Utilizar a biotecnologia para o
ganho de produtividade e sustentabilidade pode ser considerado, de acordo com Watanabe e
Raman (1997), como uma das prioridades mundiais, j que a excessiva demanda por produtos
oriundos de espcies vegetais, bem como o subsdio sustentabilidade e proteo do meio
ambiente, necessitam destas tcnicas para sua manuteno.
A propagao vegetativa est entre os principais mtodos de multiplicao de espcies
florestais, a qual extremamente vantajosa quando comparada reproduo sexuada, pois
permite reproduzir o componente gentico total, consequentemente, existem maiores ganhos
em uma mesma gerao (ASSIS; TEIXEIRA, 1998). Neste contexto, encontram-se as
tcnicas de cultura de tecidos vegetais, as quais oferecem potencial para a rpida
8

multiplicao de linhagens elite em larga escala. Em rvores, estas tecnologias so essenciais


frente aos longos perodos necessrios multiplicao e maturao das plantas (JAIN,
1997).
Assim, vrios estudos vm sendo desenvolvidos com espcies florestais nativas, os
quais visam obter informaes sobre o comportamento dessas espcies submetidas ao cultivo
in vitro, bem como contribuir com formas alternativas de propagao e conservao para
essas espcies.
Diante do exposto, este relatrio descreve algumas atividades desenvolvidas durante o
estgio realizado no Ncleo de Biotecnologia e Melhoramento do Departamento de
Fitotecnia da Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, no perodo de abril a
julho de 2013. As atividades envolveram a realizao de procedimentos de rotina do
laboratrio bem como o acompanhamento de experimentos de cultura de tecidos com as
espcies florestais Peltophorum dubium (canafstula) e Luehea divaricata (aoita-cavalo).
9

2 REVISO BIBLIOGRFICA

2.1 CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS

A propagao vegetativa in vitro ou micropropagao um processo, no qual


pequenos fragmentos vegetais so isoladas dos organismos ou obtidas a partir destes, sendo
assepticamente cultivadas em um meio de cultura apropriado sob condies favorveis
(AMARAL, SILVA, 2003). Tais caractersticas permitem aos tecidos, clulas e rgos
vegetais serem mantidos indefinidamente em cultura. De acordo com Vasil et al. (1979),
algumas clulas so capazes de serem separadas do organismo e continuarem crescendo
independentemente, o que permite tambm a cultura de clulas in vitro.
A cultura de tecidos consiste em um processo biotecnolgico de cultivo de rgos,
clulas ou tecidos vegetais em meio nutritivo apropriado, em condies ambientais
asspticas. uma tcnica que oferece excelentes oportunidades para a propagao comercial
de plantas, como tambm pode auxiliar em programas de melhoramento, possibilitando, neste
caso, grande economia de tempo. Facilita a obteno de grande nmero de plantas, em curto
espao de tempo e em rea reduzida de laboratrio (PAIVA; GOMES, 1995).
O uso da propagao vegetativa in vitro como instrumento para a implantao de
florestas clonais, substituindo-se as prticas convencionais por tcnicas que passaram a
garantir a superioridade gentica dos indivduos tem aumentado expressivamente durante os
ltimos anos (BASSAN, 2006).
O estabelecimento e a multiplicao de uma determinada espcie vegetal in vitro
dependem da combinao adequada de variveis que, sujeita influncia de diversos fatores,
proporciona o sucesso da propagao para cada espcie. As concentraes dos sais e dos
reguladores de crescimento nos meios de cultura, bem como a temperatura e fotoperodo, so
os fatores que mais variam entre as tcnicas utilizadas para a micropropagao. Outras
variveis como a utilizao de agentes geleificantes dos meios de cultura, o tamanho dos
frascos e os tipos de tampa empregadas no fechamento dos recipientes, pode influenciar o
desenvolvimento de algumas plantas (SOUZA et al., 1999).

2.1.1 Meios nutritivos e fitorreguladores

Os meios nutritivos utilizados para a cultura de tecidos e rgos de plantas fornecem


as substncias essenciais para o crescimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o
10

padro de desenvolvimento in vitro. Baseiam-se nas exigncias das plantas quanto aos
nutrientes minerais, com algumas modificaes para atender s necessidades especficas nas
condies de cultivo in vitro (CALDAS et al., 1998; TORRES et al., 2001).
Com base nessas exigncias, a composio dos meios de cultura utilizados para a
micropropagao varia entre as espcies e as diferentes etapas do processo (estabelecimento,
multiplicao e enraizamento). De modo geral, so compostos basicamente de macro e
micronutrientes, vitaminas, mio-inositol, sacarose, gua, agentes geleificantes e suplementos
de ferro. Quando necessrio so adicionados outros componentes, tais como reguladores de
crescimento, aminocidos dentre outras substncias (DOODS; ROBERTS, 1995).
O crescimento e desenvolvimento das plantas dependem de sinais internos e externos
que so transportados de uma parte para outra da planta atravs dos hormnios (HINOJOSA,
2000). Essas substncias podem ser produzidas pelas plantas (fitohormnios) ou podem ser
sintticas (fitorreguladores) (HARTMANN et al., 2002). A adio destas substncias
sintticas no meio visa suprir possveis deficincias endgenas de hormnios nos explantes
(GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). As auxinas e citocininas so os reguladores de
crescimento mais usados na cultura de tecidos. Neste sistema a morfognese regulada pela
disponibilidade e interao dessas classes de reguladores (SKOOG; MILLER, 1957).
Skoog e Miller (1957) demostraram que a reao do tecido in vitro depende do
balano entre auxina e citocinina: aumentando a concentrao de auxina haveria a formao
de razes; aumentando a de citocinina haveria formao de gemas adventcias; e, numa
relao intermediria a formao de calo, o qual considerado um tecido indiferenciado, ou
pouco diferenciado, podendo ser induzido, tornando-se determinado e, finalmente sofrer
diferenciao para formar gemas caulinares ou razes, conforme o balano hormonal
oferecido (SKOOG, MILLER, 1957).
Em vrios tecidos cultivados in vitro, a utilizao de substncias reguladoras de
crescimento tem se mostrado de importncia fundamental para o estabelecimento da
competncia e determinao, necessrias para a formao de meristemas caulinares e/ou
radiculares, condies estas fundamentais para o desenvolvimento da planta.
Hinojosa (2000) define os hormnios vegetais como substncias orgnicas naturais,
ativas em concentraes muito baixas, produzidas em um tecido e transportadas para outro,
onde provocam respostas fisiolgicas. Por outro lado, Grattapaglia e Machado (1998)
explicam que se, em caso de combinaes de hormnios, no houver um balano entre eles,
as concentraes excessivas de auxina, quando utilizadas, podem inibir a multiplicao ou
11

favorecer a formao de calo, enquanto as de citocinina, por exemplo, podem reduzir o


tamanho dos brotos.
As citocininas so substncias reguladoras de crescimento envolvidas principalmente
na diviso, crescimento e diferenciao de clulas. O tipo de citocinina e sua concentrao
so os fatores que mais afetam o cultivo in vitro. O BAP (Benzilaminopurina) tem sido muito
eficaz para promover a multiplicao de partes areas e a induo de gemas adventcias, alm
de ser a mais barata de todas as citocininas (HASEGAWA, 1980; HU, WANG, 1983;
ZAERR, MAPES, 1985).
A regenerao de plantas in vitro pode ocorrer por organognese ou embriognese
somtica. A organognese pode ser definida como o processo em que as clulas e os tecidos
so induzidos a sofrer mudanas que levam formao de uma estrutura unipolar, podendo
ser um primrdio caulinar ou radicular, cujo sistema vascular se encontra conectado ao
explante original. Diferentemente, a embriognese somtica leva produo de uma estrutura
bipolar, contendo pice caulinar e radicular, com um sistema vascular independente
(THORPE, 1994).
A produo de plantas in vitro pode ocorrer por duas vias, direta ou indiretamente.
Na organognese direta, acontece a formao de rgos diretamente, sem a passagem por
fases intermedirias, enquanto que, na organognese indireta, passa-se, obrigatoriamente,
pela fase de calo (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).
De forma geral, o sistema de produo vegetal est dividido em fases, sendo estas: I-
seleo de explantes, desinfestao e estabelecimento da cultura nas condies in vitro; II-
multiplicao dos propgulos, mediante sucessivas subculturas em meio de cultura adequado
propagao; III- enraizamento dos propgulos vegetativos, obtidos no estdio anterior; e
IV- aclimatizao das plantas obtidas in vitro, na condio ex vitro (GRATTAPAGLIA;
MACHADO, 1998; XAVIER et al., 2009).
Na maioria dos casos, os meios de cultura mais usados para as espcies florestais so
o MS de Murashige e Skoog (1962), cuja a formulao a mais utilizada para diferentes
processos de cultura de tecidos e o WPM (Woody Plant Medium) elaborado por Lloyd e
McCown (1981), para a propagao de plantas lenhosas, visto que a principal diferena do
meio MS para os demais meios sua alta concentrao de sais, sendo muitas vezes utilizado
em diluies (MANTOVANI; FRANCO, 1998), conforme a Tabela 1.
12

TABELA 1 - Composio dos meios nutritivos MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) e WPM


(LLOYD; MCCOWN , 1981).

2.1.2 Desinfestao superficial dos explantes

Alguns microrganismos podem ser endgenos ou estarem latentes, tanto em sementes


como em brotos, tendo assim, a desinfestao como uma etapa problemtica, na qual o
desinfestante deve eliminar os microrganismos do tecido vegetal, sem danific-lo. Por essa
razo, muitas vezes, a obteno de tecidos vegetais livres de microrganismos difcil e,
apenas com os meristemas retirados, estaro livres de microrganismos (BONGA; DURZAN,
1985).
13

A desinfestao do material juvenil geralmente no difcil; entretanto, tambm so


utilizados explantes de material adulto ou de plantas crescidas em condies de campo. A
desinfestao de explantes coletados no campo mais complicada, pois as percentagens de
contaminao so frequentemente altas, quando comparadas aquelas de explantes juvenis ou
retirados de mudas mantidas em casa-de-vegetao nas quais a contaminao pode ser
reduzida por pulverizaes com inseticidas e fungicidas (BONGA; ADERKAS, 1992).
Na introduo de explantes em condies in vitro a contaminao bastante
frequente, por eles estarem expostos s condies naturais, que so fontes de
microrganismos. No meio de cultura, o crescimento desses microrganismos, maioria no
patognica, acelerado a ponto de competirem por nutrientes com os explantes, prejudicando
o desenvolvimento destes (YAMAZAKI, 1995; apud XAVIER et al., 2009).
Para evitar a contaminao das culturas, devem ser mantidos em frascos fechados e
esterilizados mas, que permitam a troca gasosa no interior dos frascos com o exterior. A
introduo dos explantes nos frascos pode permitir a entrada de microorganismos do ar, surge
ento, a importncia de uma instalao com caractersticas apropriadas, bem como
equipamentos e normas de trabalho que possibilitem a criao de um ambiente externo ao
frasco com elevado nvel de assepsia (TEIXEIRA; TORRES, 1998)
A superexposio do tecido aos agentes desinfetantes, no geral, danifica o explante e
leva morte celular, sendo difcil recomendar um procedimento padro, assim necessrio
investigar os procedimentos de desinfestao para os diferentes tipos de espcies e tecidos,
para que o cultivo in vitro inicie com explantes saudveis e a cultura desenvolva-se com
sucesso (SMITH, 2000).
Dentre os agentes usados para a desinfestao dos explantes, inclui-se o cloreto de
mercrio, o cido clordrico, o cloreto de benzalcnico, o perxido de hidrognio
(GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Outras substncias com ao germicida, tambm,
so utilizadas na desinfestao dos explantes, sendo comum o etanol e os compostos base
de cloro, como hipoclorito de sdio e de clcio. As concentraes das solues
desinfestantes, assim como as combinaes dos seus princpios ativos e os tempos de
exposio podem variar bastante (XAVIER et al., 2009).
O etanol e os compostos base de cloro, tais como o hipoclorito de sdio e de clcio,
so os princpios ativos com ao germicida, mais utilizados na desinfestao. O hipoclorito
de clcio apresenta a vantagem de ser menos txico para os tecidos do que o sdio. As
concentraes mais comuns variam de 0,5 a 2,0% de cloro ativo, e o tratamento dura at 40
minutos, para tecidos lignificados. J o etanol utilizado no geral, a 70% e 80%; acima desta
14

concentrao ineficiente e pode at desidratar os tecidos, o tempo de exposio varia de


algumas dezenas de segundos at alguns minutos, dependendo da consistncia do tecido
(GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).
Uma vez obtida as condies desejadas na etapa de estabelecimento da cultura in
vitro, a etapa seguinte refere-se multiplicao da cultura para a obteno da quantidade de
mudas micropropagadas desejadas, quando se visa atingir alta taxa de multiplicao, com o
mnimo de variao de explante para explante, livres de contaminantes que prejudiquem a
micropropagao, gemas reativas e que produzam partes areas com qualidade suficiente para
a fase seguinte (XAVIER et al., 2009).
Este processo realizado assepticamente em cmara de fluxo laminar, utilizando
vidraria previamente esterilizada. Aps a desinfestao, so efetuadas trs lavagens
sucessivas com gua destilada e autoclavada, geralmente trs, para a remoo dos resduos
dos agentes desinfestantes (WENDLING et al., 2006). A maior dificuldade nessa etapa
obter tecido descontaminado sem conduzi-lo morte quando isolado (SOUZA; JUNGHANS,
2006). Os pr-tratamentos aplicados na planta matriz so determinantes para o sucesso dessa
etapa de trabalho, principalmente no que se refere aos microorganismos endgenos
(GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).
A propagao vegetativa in vitro vem-se destacando como ferramenta para a
implantao de florestas clonais, substituindo-se as prticas convencionais por tcnicas que
passaram a garantir a superioridade gentica dos indivduos. Nesse sentido, a cultura de
tecidos em espcies lenhosas vem ganhando grande impulso nas ltimas dcadas, sendo sua
utilizao rotineira em muitas empresas do ramo florestal, demonstrando ser uma ferramenta
tecnolgica vivel para a produo de mudas de alto padro gentico, fisiolgico e sanitrio.
Muitos trabalhos, visando micropropagao de espcies lenhosas, tm sido
realizados, como com Eucalyptus grandis (SITA, 1986); Pinus patula (McKELLAR et al.,
1994); Swietenia macrophylla (ROCHA; QUOIRIN, 2004), entre vrios outros.
Com o objetivo de contribuir para os esforos relacionados explorao sustentvel
de espcies florestais nativas, e mais especificamente Luehea divaricata (aoita-cavalo) e
Peltophorum dubium (canafstula) a partir do conhecimento de sua propagao in vitro e da
diversidade gentica de populaes naturais estudos desta natureza se fazem necessrios e so
desenvolvidos pela equipe do Ncleo em Biotecnologia e Melhoramento da UFSM.
15

2.2 DESCRIO DAS ESPCIES UTILIZADAS NOS EXPERIMENTOS

2.2.1 Canafstula (Peltophorum dubium (Spreng.) Taub.)

Peltophorum dubium pertencente famlia Caesalpiniaceae, tambm conhecida


popularmente por canafstula, farinha-seca, faveira, sobrasil, tamboril-bravo, guarucaia, ibir-
puit uma planta rstica e de rpido crescimento, comumente encontrada colonizando
pastagens, ocupando clareiras e bordas de matas, sendo tambm utilizada para a composio
de reflorestamentos mistos de reas degradadas de preservao permanente. Espcie
frequente em todo o domnio da floresta estacional semidecidual, abundante em formaes
secundrias, mas com poucos indivduos, geralmente de grande porte, ocupando o estrato
dominante do dossel em floresta primria.
A rvore pode ser empregada no paisagismo ornamental quando em florescimento e
proporciona tima sombra quando isolada. Suas flores so amarelas e encontram-se em
vistosas panculas terminais, sendo indicada para a arborizao de praas, parques e rodovias.
A espcie apresenta extensa distribuio natural, desde a Bahia, Rio de Janeiro, Minas
Gerais, Gois e Mato Grosso do Sul at o Paran (LORENZI, 1992; DURIGAN et al., 1997 e
MARCHIORI, 1997).
Desenvolve-se naturalmente em vrios tipos de solo, sendo pouco exigente em relao
fertilizao qumica apresentando um rpido crescimento e fcil adaptao (CARVALHO,
1994).
Em florestas nativas onde h sua ocorrncia, geralmente, existem poucos indivduos,
porm, esses so sempre de grande porte, quase sempre ocupando o dossel dominante na
floresta primria. Seu crescimento limitado, sobretudo, por fortes geadas (CARVALHO, -
2003). Pode atingir de 15 a 25 metros de altura em sua fase adulta e apresentar um dimetro
a altura do peito (DAP) que varia de 35 a 90 cm. O fuste atinge at 15 metros de
comprimento e a copa ampla com folhas compostas, bipinadas, alternas (CARVALHO,
2003; LORENZI, 2008).
Sua madeira utilizada em construes civis como vigas, ripas, marcos, portas,
janelas, assoalhos; na indstria de mveis e na construo naval e militar razes que a
tornam uma espcie com destacado potencial silvicultural (CARVALHO, 1994). A espcie
muito recomendada para reflorestamento homogneo (MARCHIORI, 1997). A ornamentao
de reas amplas outra utilidade desta rvore devido a beleza de suas flores e as razes bem
desenvolvidas, o que evita seu tombamento pelo vento (LORENZI, 2008).
16

Fotos: Paulo Ernani Ramalho Carvalho

2.2.2 Aoita-cavalo (Luehea divaricata Martius & Zucarini)

Luehea divaricata integrante da famlia Malvaceae (SOBRAL et al., 2006),


popularmente conhecida em diferentes regies do Brasil como aoita-cavalo, estriveira,
ivitinga, ivatingui, salta-cavalo, soita-cavalo, aoita-cavalo-vermelho, aoite-cavalo e saco-
de-gamb, uma espcie florestal com ampla distribuio geogrfica, indicada para
reflorestamentos. rvore que desenvolve troncos com tronco geralmente tortuoso e nodoso
de base alargada, quase retos e bastante altos, podendo atingir 20 a 25 m de altura e um
dimetro de 50 a 80 cm altura do peito. Apresenta madeira moderadamente pesada, de cor
clara, de boa trabalhabilidade e de acabamento delicado. A madeira, cerne de colorao
marrom e avermelhado (RICHTER; DALLWITZ, 2009), indicada para a confeco de
estruturas de mveis, principalmente em peas torneadas, por ser de baixa durabilidade
natural e de boa permeabilidade ao tratamento preservativo (REITZ et al., 1988).
De acordo com Lorenzi (1992), L. divaricata uma planta pioneira de rpido
crescimento que no pode faltar nos reflorestamentos mistos de reas degradadas de
preservao permanente. Reitz et al. (1988) atestaram que, considerando seu habitat natural e
sua vitalidade como espcie pioneira e helifita, possvel seu reflorestamento em campo
aberto e em populaes puras; contudo, possvel que, exposta luz direta, sua ramificao
se verifique de modo muito precoce, no desenvolvendo suficientemente o tronco e o fuste.
17

Possui diversos potenciais de uso, muito til em reflorestamentos de reas de


preservao permanente e para o enriquecimento de reas degradadas, encostas abruptas e
margens de rios, alm de fins paisagsticos e arborizao urbana (CARVALHO, 2003). As
folhas de aoita-cavalo so utilizadas como fitoterpico, no combate disenteria, leucorria,
reumatismo, blenorragia (gonorreia) e tumores, a infuso das flores empregada contra
bronquite; j a raiz, depurativa (TANAKA et al., 2005). A madeira pode ser utilizada para
produzir celulose e papel, sua casca fornece fibras, resina, mucilagens e tanino (BACKES;
IRGANG, 2002).
Encontra-se distribuda no nordeste da Argentina, no leste do Paraguai, no Uruguai e
no Brasil. Em territrio brasileiro abrange os estados da Bahia, Rio de Janeiro, So Paulo,
Minas Gerais, Gois e do Mato Grosso do Sul at o Rio Grande do Sul (LORENZI, 2008;
CARVALHO, 1994).
O aoita-cavalo teve uma presena marcante na histria do desenvolvimento da
indstria madeireira no sul do Brasil, no entanto sua explorao ocorreu de forma
descontrolada e extrativista, levando a reduo drstica dos exemplares desta espcie.
Atualmente raro encontrar exemplares com boas caractersticas fenotpicas adequadas ao
uso comercial. H um crescente interesse do uso de Luehea divaricata em programas de
reflorestamento e indstria madeireira, no entanto existe uma escassez de estudos sobre a
propagao vegetativa desta espcie, e estudos relacionados a tal questo so uma alternativa
promissora para solucionar o problema da produo de mudas desta espcie (FARIAS, 2006).
18

Fonte: Paulo Ernani Ramalho Carvalho (2008)


19

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Desenvolver conhecimentos tericos e prticos sobre a aplicao de tcnicas de


cultura de tecidos, na propagao in vitro de espcies florestais nativas, assim como conhecer
e acompanhar as atividades de rotina do Laboratrio de Cultura de Tecidos, do Ncleo de
Biotecnologia e Melhoramento do Departamento de Fitotecnia da Universidade Federal de
Santa Maria.

3.2. OBJETIVOS ESPECFICOS

Acompanhar e desenvolver atividades do laboratrio de cultura de tecidos, bem como,


os trabalhos cientficos realizados com micropropagao de Peltophorum dubium e
Luehea divaricata.
Obter conhecimentos tericos e prticos relacionados a tcnicas de propagao
vegetativa in vitro por meio de atividades prticas.
Identificar as principais dependncias, instalaes e equipamentos utilizados num
laboratrio de cultura de tecidos vegetais.
Conhecer a dinmica de trabalho de um laboratrio de cultura de tecidos, atravs da
execuo das atividades de rotina.
Desenvolver e acompanhar as atividades de coleta de amostras de tecidos vegetais
para fins de isolamento de DNA.
20

4 MATERIAL E MTODOS

4.1 DESCRIO DO LOCAL DE ESTGIO

O estgio foi realizado no perodo de abril julho de 2013 no Ncleo de


Biotecnologia e Melhoramento, do Departamento de Fitotecnia da Universidade Federal de
Santa Maria, Santa Maria - RS, correspondendo a uma carga horria de 6 horas dirias e 30
horas semanais, completando carga horria mnima de 360 (trezentas e sessenta) horas, e
algumas horas adicionais de trabalhos a campo e coleta de materiais para realizao de
atividades.
O Ncleo faz parte do Departamento de Fitotecnia, coordenado pela Profa Dra Lia
Rejane Silveira Reiniger e utiliza a Biotecnologia aplicada ao Melhoramento Gentico para a
gerao de conhecimentos, processos e produtos que contribuam para a soluo de problemas
especficos no contexto da agricultura, horticultura e produo florestal. Estudantes de
graduao em Agronomia e Engenharia Florestal alm de estudantes de ps-graduao
utilizam os ambientes do Ncleo e desenvolvem as seguintes linhas de pesquisa:
a) Biotecnologia aplicada ao desenvolvimento de germoplasma cujo objetivo a aplicao e
otimizao de tcnicas da cultura de tecidos visando manuteno e ampliao da
variabilidade gentica com utilizao de marcadores moleculares na anlise da diversidade
gentica.
b) Obteno, caracterizao e avaliao de germoplasma vegetal que consiste na coleta,
caracterizao, conservao in vivo de germoplasma silvestre e cultivado e avaliao do
germoplasma e identificao de gentipos com caractersticas de interesse.
c) Manipulao gentica e seleo de gentipos superiores cujo objetivo a incorporao e
seleo de caracteres agronmicos no germoplasma cultivado.
As atividades so desenvolvidas diariamente em salas de lavagem e esterilizao
(local destinado ao descarte de meios de cultura utilizados e outros resduos, lavagem de
vidrarias, autoclavagem de gua, aos meios de cultura e a utenslios diversos), sala de
preparo de meio de cultivo, rea para manipulao assptica (local onde exclusivamente so
realizadas inoculaes e transferncias de material vegetal), rea para incubao das culturas
(local dotado de sistema de controle de temperatura, luz e umidade, no qual as culturas so
mantidas at o momento de ser retiradas dos frascos), rea para observao e avaliao das
culturas (ambiente pequeno contendo bancada de trabalho para avaliaes parciais ou finais
de experimentos in vitro), almoxarifado ( nesse compartimento que so colocadas estantes
ou prateleiras para guardar reagentes qumicos e materiais diversos em estoque a ser
21

utilizados na rotina laboratorial), casa de vegetao, cmara de nebulizao e telado


(ambientes anexos ao laboratrio, destinados aclimatao de plantas produzidas in vitro) e
alm do laboratrio de marcadores moleculares (ambiente assptico onde so feitas as
extraes de DNA, gis e eletroforese).

4.2 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS DURANTE O ESTGIO

Durante o perodo de estgio houve o acompanhamento de todas as etapas que levam


a propagao in vitro nos diferentes ambientes do laboratrio que incluram o preparo de
meios de cultura e solues estoque (MS e WPM), esterilizao em autoclave do meio de
cultura e materiais utilizados, preparo de soluo com etanol para assepsia, inoculao de
sementes e explantes em cmara de fluxo laminar, bem como a manuteno da limpeza de
organizao do laboratrio.
Os pormenores de cada etapa sero apresentados no item Resultados e Discusso
deste trabalho. A seguir ser apresenta a metodologia empregada para a inoculao de
sementes de Peltophorum dubium e de explantes de Luehea divaricata, espcies florestais
nativas em estudo no laboratrio, bem como o acompanhamento de atividades de coleta de
amostras de tecidos vegetais para fins de isolamento de DNA.

4.2.1 Germinao de sementes de Peltophorum dubium em meio gar-gua

O objetivo do experimento foi promover a germinao de sementes para servirem


como fonte de explantes. As sementes utilizadas foram coletadas na Fundao Estadual de
Pesquisa Agropecuria Fepagro/Florestas em Santa Maria, RS. No laboratrio, ficaram
armazenadas em frascos de vidro contendo slica gel e acondicionadas sob temperatura de 8 a
10C na geladeira at sua utilizao nos experimentos, que vm sendo realizados desde
Janeiro de 2011.
Inicialmente calculou-se o nmero de sementes que seriam distribuidas para preparar
a quantidade de meio nutritivo necessrio, sempre contabilizando sementes a mais para o
caso de perda durante a inoculao. Primeiramente, as sementes foram submetidas
superao de dormncia por meio de escarificao mecnica com lixa N 100 na regio
oposta ao embrio (Figura 1). Em seguida, a desinfestao superficial foi realizada em
cmara de fluxo laminar, com soluo de etanol a 70% (v/v) por 30 segundos e,
posteriormente, as sementes foram submetidas a soluo de hipoclorito de sdio (NaOCl) a
22

2,5% (v/v) durante 15 minutos, passando, ento, por triplo enxgue em gua destilada e
autoclavada (Figura 2).

A C

FIGURA 1 A) Escarificao mecnica com lixa N 100 na regio oposta ao embrio B) Frascos de vidro
contendo slica gel e sementes de Peltophorum dubium C) Semente escarificada.

Foi utilizado, como meio de cultivo das sementes, o gar-gua a 0,7% (p/v). As
sementes foram inoculadas em cmara de fluxo laminar, em frascos de vidro com capacidade
para 150 mL, contendo 30 mL de meio previamente autoclavado, por um perodo de 40
minutos a 120C e 1 atm de presso. Em cada frasco foram inoculadas cinco sementes. Aps,
os frascos foram vedados com papel alumnio e dispostos em sala de cultivo, sob fotoperodo
de 16h/8h com escuro , intensidade luminosa de 20mol m-2s-1, fornecida por lmpadas
fluorescentes brancas frias tipo luz do dia e temperatura de 25 3 C.

A B C
FIGURA 2 A) Soluo de etanol a 70% e gua destilada e autoclavada; B) Triplo enxgue em gua destilada e
autoclavada ;C) Inoculao de sementes em meio de cultivo gar-gua a 0,7%.
23

4.2.2 Inoculao de explantes de Luehea divaricata provenientes de plntulas germinadas in


vitro em meio WPM e MS com cido 3-Indolbutrico (AIB) na ausncia e na presena de
carvo ativado
O objetivo do experimento foi obter o enraizamento dos explantes de aoita-cavalo.
Foram utilizados como explantes segmentos nodais que foram isolados das plntulas
estabelecidas in vitro.
Foram utilizados os meios nutritivos WPM e MS, contendo 100 mgL-1 de mio-
inositol, 30 gL-1 de sacarose, 7 gL-1 de gar e acrescido diferentes concentraes do
fitorregulador. Em 50% de cada tratamento foi adicionado 1gL-1 de carvo ativado. O pH foi
ajustado para 5,8 antes da incluso do gar, os frascos foram vedados com papel alumnio e,
posteriormente, o meio nutritivo foi autoclavado por 15 minutos a 120C e a 1 atm de
presso.
Antes da inoculao, foi realizada a assepsia da cmara de fluxo laminar, com um
algodo embebido em etanol a 70% (v/v) e aps, todos os materiais usados na atividade
foram colocados sobre a mesa, com a lmpada germicida ligada durante 30 minutos. Os
explantes foram inoculados sob condies asspticas em cmara de fluxo laminar com o
auxlio de pinas previamente esterilizadas em autoclave, a 120C e 1atm de presso, durante
40 minutos.
Os segmentos nodais foram inoculados em frascos de vidro com capacidade para 150
mL, contendo 30 mL de meio nutritivo e trs segmentos por frasco. Aps a inoculao, os
frascos foram vedados com papel alumnio e mantidos em sala de cultivo com temperatura de
253C e fotoperodo de 16 horas.

4.2.3. Acompanhamento de atividades de coleta de amostras de tecidos vegetais para fins de


isolamento de DNA
Folhas de Luehea divaricata foram coletadas na Universidade Federal de Santa Maria
(UFSM), alm do bairro do Cerrito na cidade de Santa Maria- RS e no municpio de Silveira
Martins - RS. O material foi coletado diretamente das rvores e, logo aps, receberam uma
assepsia realizada com algodo hidrfilo, visando retirar a poeira existente sobre o material
sendo, ento, acondicionadas em sacos plsticos com fecho hermtico devidamente
identificado, contendo slica em gel como agente desumidificante que, preserva
caractersticas e propriedades originais at a utilizao. Estes foram fechados procurando-se
retirar o ar existente em seu interior e, em seguida, o material foi armazenado em gelo at a
24

chegada ao laboratrio. O material foi mantido congelado em freezer (-20C) at a realizao


das extraes.

5 RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 ORGANIZAO DO LABORATRIO DE CULTURA DE TECIDOS E


ESTERILIZAO DO MATERIAL

As atividades de cultura de tecidos so realizadas em ambiente assptico e com


temperatura e iluminao controladas, visando, a otimizao das respostas aos estmulos
destes fatores para melhor crescimento das culturas. Elevado grau de assepsia a condio
limitante em qualquer situao j que fungos e bactrias encontram, no meio nutritivo e
ambiente apropriado para seu crescimento acelerado, causando a morte das culturas ali
contidas (TEIXEIRA; TORRES, 1998)
O ambiente ideal para instalao do laboratrio de cultura de tecidos deve assegurar o
mximo de isolamento do ambiente externo, a fim de evitar contaminantes que possam
inviabilizar as culturas in vitro. Surge, portanto, a necessidade de uma instalao com
caractersticas apropriadas e com equipamentos e normas de trabalho que possibilitem a
criao de um ambiente com elevado nvel de limpeza e assepsia.
As atividades de cultura de tecidos so realizadas em ambiente assptico a fim de
evitar qualquer tipo de contaminao. Isto torna fundamental que sejam realizadas
rotineiramente atividades relacionadas limpeza e esterilizao do material utilizado e dos
meios de cultura. Estas atividades devem ser desenvolvidas na sala de limpeza e na sala de
preparo do laboratrio e incluindo a lavagem de vidraria, autoclavagem de gua, de meios de
cultura e de utenslios diversos e descarte de meios de cultura utilizados. Tais atividades so
realizadas com o auxlio de equipamentos, como autoclave, destilador e estufa de secagem.

5.1.1. Esterilizao em autoclave

Os frascos so levados para a esterilizao do meio em autoclave, em temperatura de


120C e 1 atm de presso, por 15min. Na sequncia, os frascos so retirados da autoclave,
com o auxlio de luvas e so deixados resfriar temperatura ambiente para que o meio
geleifique e seja possvel a inoculao dos explantes.
relevante relatar que, alm dos meios nutritivos, os instrumentos utilizados para
inoculao como pinas, bisturis e placas de Petri, tambm, devem ser autoclavadas. De
25

maneira geral, esses instrumentos so autoclavados juntamente com os meios, embalados em


jornal.
O procedimento de uso da autoclave inicia com a verificao do nvel de gua dentro
da autoclave, este deve estar encostando na base de seu cesto, caso contrrio o equipamento
pode ser danificado. Aps, o material a ser esterilizado colocado dentro da autoclave, que
ento fechada e ligada na posio mxima. No momento em que esta fechada o registro de
sada de vapor aberto, este permanece assim at iniciar a sada de vapor pelo registro.
Com a sada intensa de vapor, fechado o registro de sada para que possa subir a
presso cuidando o manmetro, que indica a presso interna da autoclave, quando este subir
at atingir a presso de 1 atm a chave comutadora passa da posio mxima para a posio
mdia, diminuindo a presso interna. A partir da marcado o tempo de autoclavagem,
dependendo do material a ser esterilizado. Aps passado este tempo, a autoclave desligada e
o registro aberto aos poucos, para evitar acidentes. No momento que no h mais vapor
saindo da autoclave, ou seja, que a presso chegou a 0 atm, esta aberta e o material
retirado com o auxilio de luvas de amianto e bandeja.
A autoclave precisa de um tempo de 15 minutos para esterilizar meios nutritivos, aps
este procedimento o material levado imediatamente para a sala de transferncia. Para a
esterilizao de gua destilada, utenslios como pinas e vidrarias e do material contaminado,
so necessrios 40 minutos na autoclave sob uma presso mdia de 1 atm, a presena de
fungos e bactrias torna a esterilizao mais demorada, este tempo garante que tais
microorganismos sejam eliminados, e os materiais podem utilizados novamente em outros
procedimentos do laboratrio.
Outra observao a troca da gua que fica dentro da autoclave. Aps a esterilizao
de meios de cultura contaminados a gua utilizada retirada, e coloca-se gua destilada. Este
um cuidado importante para evitar a contaminao do material que ser colocado no
autoclave, aps a esterilizao do material contaminado.
O material contaminado descartado no lixo e os frascos lavados na sala de limpeza.
Os demais materiais, como por exemplo, beckers e provetas, utilizados para o preparo de
meios de cultura so lavados na sala de preparo de meios nutritivos. Aps a lavagem todo o
material levado para a estufa de secagem, na sala de preparo. Esta funciona como um forno
eltrico comum, que produz calor seco, muito eficiente na secagem rpida de vidrarias e
demais utenslios que no sejam plsticos. A estufa ligada a 50 C e permanece ligada at a
completa secagem do material. Aps esta sequncia de procedimentos, o material guardado
em seu devido lugar.
26

A gua utilizada para todas as atividades do laboratrio de cultura de tecidos, exceto


para as atividades relacionadas com a limpeza, destilada pelo destilador. Este equipamento
fica na sala de limpeza, e utilizado para a eliminao dos sais minerais da gua.

5.1.2. Preparo de etanol 70% (v/v) para assepsia

O etanol a 70% (v/v) um desinfetante de mdia eficincia que apresenta boa ao


germicida. Nessa concentrao, o lcool no desidrata a parede celular do microorganismo,
podendo penetrar no seu interior, onde ir desnaturar protenas, fato que no ocorre quando se
utiliza o lcool acima ou abaixo da concentrao ideal. Dessa forma, o etanol a 70% (v/v)
utilizado em diversas atividades do laboratrio de cultura de tecidos.

O processo de diluio de solues de etanol feito seguindo a frmula:

Ento,

Concentrao desejada = 70%

Volume desejado = 1L (1000 mL)

Concentrao de lcool na soluo pura = 92,8%

Aps este procedimento, coloca-se 754,3 mL de lcool etlico (92,8%) em uma


proveta de 1000 mL, completando-se o restante do volume com gua destilada. Em seguida,
distribui-se o contedo em frascos devidamente identificados para uso nas diversas atividades
do laboratrio.

5.2 PREPARO DE MEIOS DE CULTURA WPM E MS

Os meios nutritivos utilizados para a germinao e crescimento in vitro devem


fornecer as substncias essenciais para o seu crescimento e desenvolvimento. As mesmas
vias bioqumicas e metablicas bsicas utilizadas pelas plantas ex vitro, so conservadas
27

no material vegetal in vitro. Por isso, os meios nutritivos se baseiam nas exigncias das
plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas modificaes para atender as
necessidades especficas in vitro (CALDAS et al., 1998) e o estabelecimento de um
meio nutritivo adequado para o material em estudo de fundamental importncia
(SANTOS, 2003).

Para o incio do preparo dos meios realizado o clculo da quantidade de meio


nutritivo a ser preparado, a qual depender do nmero de explantes a ser inoculado, do
nmero de tratamentos e repeties do experimento e do volume de meio nutritivo usado em
cada frasco, geralmente usa-se 30 mL por frasco. Tambm, pesam-se os componentes
adicionais ao meio, como, por exemplo, sacarose, gar, mio-inositol e carvo ativado. Os
meios nutritivos so preparados na sala de preparo, local destinado ao preparo dos meios
nutritivos e, tambm outras solues necessrias, como as solues estoques, esta sala deve
ser totalmente assptica para evitar possveis contaminaes.
O preparo do meio nutritivo uma das etapas que mais demandam tempo e, por isso,
com a inteno de facilitar a rotina do laboratrio so utilizadas solues estoques
concentradas para elaborar os meios nutritivos WPM e MS. No total, so utilizadas 8
solues estoque que contm os macro, micronutrientes e vitaminas necessrios para atender
as necessidades da cultura in vitro. Essas solues ficam estocadas na geladeira, em frascos
opacos, do tipo mbar, em uma concentrao 100 vezes maior que a concentrao final.
Para o preparo do meio MS, utilizam-se oito solues estoque, sendo as solues, A,
B, C, D, E, F, G e H (Tabela 2). Desta maneira facilitam o trabalho, pois no preciso
prepar-las todas as vezes que ser preparado um meio nutritivo (Figura 3).
28

TABELA 2- Relao e concentrao das solues-estoque do meio de cultura MS.

FIGURA 3 - Solues do meio MS e WPM

O meio nutritivo MS diferenciado do meio MS somente pela concentrao das


solues-estoque, sendo utilizada a metade da concentrao, ou seja, 5 mLL-1. Para o meio
WPM so utilizadas nove solues, diferente do meio MS que so utilizadas oito solues
29

(Tabela 1, pg. 13). As solues do meio WPM so classificadas como A1, A2, B, C, D, E, F,
G e H.
Para a elaborao de 1000 mL de meio MS so pipetados 10 mL de cada uma das
solues-estoque que so colocados em um Becker. O volume de cada soluo deve ser
retirado com pipeta, para obter uma maior preciso, utilizando-se sempre uma pipeta para
cada frasco, a fim de evitar contaminao das solues. Em balana analtica, so pesados 7 g
L-1 de gar, 30 g L-1de sacarose e 100 mg L-1 de mio-inositol, sendo a sacarose e o mio-
inositol adicionados ao Becker com as solues-estoque. Em seguida, feito o ajuste do
volume, para uma maior preciso, transferindo o contedo do Becker para uma proveta de
1000 mL, onde completa-se o restante com gua destilada. Esse volume pode ser dividido
conforme o nmero e os tratamentos usados. Quando utilizados outros componentes no
meio, como vitaminas ou carvo ativado, a adio feita juntamente com o mio-inositol e a
sacarose, exceto o gar que deve ser colocado por ltimo, somente aps a correo do pH.
Em seguida, o meio nutritivo dividido de acordo com o nmero de tratamentos em
questo e, ento, pode-se acrescentar ao meio nutritivo os fitorreguladores, com auxlio de
micropipetas, pois estes, geralmente, so utilizados em concentraes muito pequenas, na
ordem de microlitros (L). importante que os fitorreguladores sejam guardados no
congelador, desta maneira possuem uma maior durabilidade. Antes de us-los devem ser
descongelados, a temperatura ambiente. O procedimento de preparo do meio WPM
semelhante, adicionando-se apenas outras solues.
Com o meio nutritivo preparado, o pH do meio ajustado. O pH ideal dos meios
nutritivos para cultivo in vitro de espcies arbreas 5,8. Inicialmente, o medidor de pH
deve ser ligado meia hora antes do uso e as solues tampes de pH 4,0 e 7,0 precisam estar
em temperatura ambiente, para ento ser feita a calibragem do aparelho conforme o manual
de instrues. Aps este procedimento o pH pode ser medido e ajustado, inserindo o eletrodo
no meio e aguardar a leitura, se esta no acusar um valor maior que 5,8 utilizado HCl a
1M, j se o pH acusar um valor menor que 5,8 utilizado NaOH a 0,3M, que uma
substncia bsica, portanto elevar o pH. Para homogeneizar a soluo usado um agitador
magntico, que no deve entrar em contato com o eletrodo, visto que este muito frgil e
pode ser danificado quando em movimento com o agitador.
30

Por fim, o gar, usado para geleificao do meio, adicionado ao meio nutritivo
aps o ajuste do pH a 5,8. A consistncia do meio depende da concentrao de gar utilizada,
pois ele facilita a difuso dos nutrientes, do meio para o explante. Na sequencia, a soluo
levada ao microondas, para que ocorra o cozimento, em potncia alta por aproximadamente
10 minutos, agitando no tempo intermedirio. O meio estar pronto quando ocorrer uma leve
fervura e o meio apresentar uma cor transparente. Aps a fervura, com o auxilio de um
Becker o meio vertido nos frascos. Em seguida, usado papel alumnio para vedar os
frascos cuidadosamente para que eles no abram durante o processo de autoclavagem.

5.3 INOCULAO DE SEMENTES E EXPLANTES EM CMARA DE FLUXO


LAMINAR

A cmara de fluxo laminar um equipamento essencial no laboratrio, pois ela fora


a passagem de ar por um filtro bacteriolgico, criando um ambiente estril com presso
positiva, que bloqueia a entrada do ar externo contaminado. Todas as atividades de
manipulao do material vegetal so feitas na sala de transferncia que deve estar sempre
limpa e com um bom nvel de assepsia.
A preparao da cmara de fluxo laminar tem por objetivo menor porcentagem de
contaminao dos explantes. A limpeza da cmara feita com algodo embebido de etanol
70% (v/v) antes do incio das atividades e ao final de cada dia de trabalho. Os instrumentos
utilizados para inoculao so pinas, bisturis, placas de Petri e ainda lamparinas e tubo de
ensaio com etanol absoluto que usado para a flambagem.
Para iniciar os trabalhos, esses materiais devem ser colocados na cmara sob
exposio de lmpada germicida ultravioleta por pelo menos 20 minutos, visando esterilizar
o ambiente interno da cmara de fluxo. Nesse caso, ningum deve permanecer no ambiente,
as portas de acesso sala de transferncia so fechadas e um aviso colocado na porta
proibindo a entrada de pessoas na sala. Esse cuidado necessrio, pois a lmpada germicida
extremamente nociva, podendo causar queimaduras e altamente mutagnica.
Todos os procedimentos desempenhados na mesa de fluxo laminar so feitos com o
uso de jaleco, mscara e luvas para evitar a contaminao do material. A fonte de explante
deve ser seccionada e transferida para o meio nutritivo. As atividades de inoculaes devem
ser feitas por mo-de-obra especializada , precisam ser rpidas e a manipulao do explante
requer preciso para evitar a desidratao dos tecidos vegetais. Devem ser usadas vrias
pinas, para que o uso seja alternado, permitindo que eles esfriem aps a flambagem. Se a
31

fonte de explante no originada de plntulas germinadas in vitro, como no caso de sementes


ou brotaes, realizada a desinfestao superficial antes da inoculao.

5.4 OUTRAS ATIVIDADES

Diariamente, os integrantes do Ncleo de Biotecnologia e Melhoramento do


Departamento de Fitotecnia avaliam e monitoram o crescimento das plantas cultivadas in
vitro e ex vitro, auxiliando aos ps-graduandos em vrios experimentos desenvolvidos no
laboratrio, como o preparo de experimentos com meios nutritivos e as avaliaes peridicas
dos trabalhos com o objetivo de verificar os avanos das pesquisas, alm de limpeza do
material utilizado em experimentos, adubao e rega das plantas que esto se desenvolvendo
em estufa.
32

6 CONSIDERAES FINAIS

Com a realizao deste estgio foi possvel acompanhar a dinmica de trabalho em


um laboratrio de pesquisa em cultura de tecidos. Atravs da realizao dos experimentos
desenvolvidos, foi possvel compreender a importncia das atividades de rotina do laboratrio
e entender os procedimentos para o manuseio dos equipamentos utilizados nos trabalhos do
laboratrio.
Alm da preparao tcnica e profissional, este estgio proporcionou um crescimento
pessoal atravs do trabalho em equipe, com pessoas especializadas, respeitando as diferenas
e maneiras de cada pessoa trabalhar, sendo isto, fundamental para o sucesso da futura atuao
profissional. Portanto, pode-se afirmar que a experincia do estgio vai muito alm da
aplicao tcnica e prtica dos conhecimentos adquiridos no curso. Consiste em uma
oportunidade de preparao para uma nova etapa profissional.
33

7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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