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Prcticas de Bioqumica Prctica: Estudio de los Carbohidratos

ESTUDIO DE LOS CARBOHIDRATOS


Objetivos

Al finalizar este trabajo prctico el estudiante estar en capacidad de:

- Detectar la presencia de carbohidratos en una muestra problema.


- Aplicar reacciones especficas que permitan la identificacin de carbohidratos en una
muestra problema.
- Determinar la concentracin de glucosa en una muestra de plasma bovino.
- Destacar la importancia del mantenimiento de la norglicemia y discutir los factores que
pueden modificar su concentracin.
Introduccin

Los carbohidratos representan un conjunto numeroso de molculas distribuidas


ampliamente en la naturaleza. Qumicamente se definen como aldehdos o cetonas
polihidroxiladas, diferencindose entre ellos bsicamente en el nmero de carbonos y en la
ubicacin espacial de los grupos hidroxilo de cada monmero, as como en el nmero de
monosacridos que los conforman. Basndose en las diferencias estructurales que stos presentan,
es posible la identificacin de los mismos utilizando reacciones qumicas que demuestren alguna
propiedad qumica especfica del carbohidrato cuya presencia se quiere determinar.

Las pruebas para la determinacin de los carbohidratos pueden ser generales como la
reaccin de Molisch, la cual no discrimina el tipo de carbohidrato analizado, o especficas si el
resultado final logra la identificacin de un carbohidrato en particular.

Independientemente de la prueba a que se haga referencia, existen dos propiedades que


sirven de fundamento a la mayora de stas: la formacin de derivados furfricos y el poder
reductor, cuyos fundamentos se explican ms adelante.

La reaccin de carbohidratos con Antrona es otra prueba basada en la formacin de


derivados furfricos que permite adems, cuantificar carbohidratos como la glucosa en una
muestra biolgica, ejemplo en el plasma sanguneo.

La determinacin de la concentracin de glucosa sangunea es una prctica de rutina en


los laboratorios de diagnstico clnico y representa un parmetro importante que refleja las

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condiciones nutricionales, emocionales, endocrinas y metablicas del organismo ya que


constituye un ndice entre la adecuada suplementacin de carbohidratos en la dieta del animal y
la utilizacin de los mismos.
En condiciones fisiolgicas, la concentracin de glicemia en plasma de bovino oscila entre
40-80 mg%. Bajo estas condiciones, la glucosa es utilizada como fuente de energa para las
clulas, como sustrato para la sntesis de galactosa y subsecuentemente sntesis de lactosa, o
como fuente de glicerol necesario para la sntesis de triacilglicridos.
La determinacin cuantitativa de glucosa en el plasma sanguneo sanguneo permite
evaluar el metabolismo de los carbohidratos, en particular la eficiencia de la utilizacin y sntesis
de la glucosa a travs de la gliclisis, el metabolismo del glucgeno y la gluconeogsis, segn la
condicin fisiolgica (alimentacin, ayuno, lactancia) o patolgica (enfermedad pancretica,
cetosis u otra) del animal.

MATERIALES Y EQUIPOS
- Tubos de ensayo.
- Gradillas.
- Pipetas graduadas.
- Bao de Mara a 100C.
- Goteros.
- Pinzas para tubos de ensayo.
- -naftol al 0,5% en etanol.
- cido sulfrico concentrado.
- Soluciones de glucosa, fructosa, almidn, sacarosa, maltosa al 3%.
- Muestra problema
- Plasma de bovino
- Reactivo de Benedict: preparar combinando las siguientes soluciones:
Solucin A: 173 g de citrato de sodio y 100 g de carbonato de sodio se disuelven en 800 mL de
agua destilada
Solucin B: disolver 17,3 g de CuSO4: 5 H2O en 100 mL de agua destilada.
Mezclar ambas soluciones y aforar a 1 L con agua.
- Reactivo de Seliwanoff: disolver 0,05 g de resorcinol en 33 mL de HCl concentrado. Aforar a
100 mL con agua destilada.
- Solucin diluida de yodo-yoduro de potasio en agua.
- Reactivo de Antrona: 0,2 g de antrona en 100 mL de H2SO4 al 95%. No es estable y debe ser
preparado diariamente.

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Reacciones basadas en la formacin de derivados furfricos

Estas reacciones se fundamentan en la formacin en medio cido de compuestos


conocidos como derivados furfricos. Estos se producen al deshidratar los azcares mediante
la aplicacin de calor y la exposicin a un medio fuertemente cido.
+
H O
CHO
Pentosas (C5H10O5)

furfural

O
H2COH CHO
+
H
Hexosas (C6H12O6)

5-hidroximetilfurfural

O
H3C CHO
+
H
6-Desoxihexosas (C6H12O5)

5-metilfurfural
Estos derivados furfricos reaccionan con compuestos fenlicos como el -naftol, el
orcinol, el resorcinol o la antrona, para formar cromgenos que evidencian la positividad de las
reacciones. El tipo de compuesto fenlico utilizado depender del tipo de carbohidrato a
determinar y por lo tanto, de la reaccin que se est realizando.

A continuacin se presentan tres ejemplos de reacciones donde hay formacin de furfurales.

Reaccin de Molisch

La reaccin de Molisch detecta la presencia de carbohidratos en general. En ella, el


carbohidrato reacciona en medio fuertemente cido y en caliente, produciendo el 5-
hidroximetilfurfural, cuya funcin aldehdo se condensa con dos molculas de -naftol generando
como productos compuestos de color violeta, como se muestra a continuacin.

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OH O

alfa-naftol
OH

+
2 H O C R
HC R

+
RCHO
OH OH
Cromgeno violeta
intermediario

Experimento N 1. Prueba de Molisch:

- Rotule dos tubos de ensayo (1 y 2)


- Coloque 2 mL del carbohidrato (tubo 1) y 2 mL de compuesto desconocido (tubo 2).
- Agregar a cada tubo 4 gotas de solucin alcohlica de - naftol al 0,5%.
- Agregar con cuidado 1 mL de cido sulfrico concentrado por las paredes de ambos tubos
de ensayo.
- La formacin de un anillo violeta indica la presencia de carbohidratos

Reaccin de Seliwanoff

La reaccin de Seliwanoff detecta la presencia de cetohexosas. Con el mismo principio de


la reaccin anterior, esta se basa en la formacin de derivados furfricos. En este caso el 5-
hidroximetilfurfural, producto de la deshidratacin de las cetohexosas, reacciona con el
resorcinol (derivado fenlico) produciendo un compuesto de color rojo. El resultado es positivo
tanto para las cetohexosas en forma monomrica, como para oligosacridos que contengan
cetohexosas en su estructura.

HO O
OH
O
HOH2C CHO H+
+ 2
OH
O
5-hidroximetilfurfural resorcinol
CH2OH
Cromgeno rojo

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Experimento N 2. Prueba de Seliwanoff:


- Rotule dos tubos de ensayo (1 y 2)
- Con la ayuda de una pipeta, agregue 4 gotas del carbohidrato (tubo 1) y 4 gotas del
desconocido (tubo 2).
- Aada 5 mL de reactivo de Seliwanoff en ambos tubos de ensayo.
- Caliente en agua hirviente durante 5-10 minutos.
La reaccin es positiva al aparecer un color rojo intenso, indicando la presencia de
cetohexosas.

Reacciones basadas en la propiedad reductora de los carbohidratos (azcares reductores):

Existe otra propiedad que permite la diferenciacin de algunos carbohidratos: el poder


reductor. Existen carbohidratos que al oxidarse permiten la reduccin de otros compuestos.
Durante dicha oxidacin se libera la energa necesaria para la reduccin de otra molcula, por lo
que se conoce este proceso como oxido-reduccin y ocurre como una reaccin acoplada. La
mayora de los reactivos que permiten evidenciar esta propiedad contienen cobre. Este metal se
reduce (gana electrones) y se hace insoluble originando un precipitado rojo, lo que demuestra que
el carbohidrato analizado es reductor.

El principal grupo de pruebas de azcares reductores incluyen: Benedict, Barfoed,


Fehling, Trommens, entre otras. Conocer la propiedad reductora o no del carbohidrato, junto a los
resultados de todas las pruebas aplicadas en conjunto, permitirn la identificacin del
carbohidrato presente en la muestra problema.

Reaccin de Benedict

Esta reaccin nos indica si un azcar es o no reductor. Para tal fin el carbohidrato se hace
reaccionar con el in cprico (Cu++) en medio alcalino a una temperatura de 100C. El
carbohidrato, a travs de su hemiacetal libre en el carbono 1, se oxida favoreciendo la reduccin
del cobre a oxido cuproso (Cu2O) el cual se presenta como un precipitado rojo ladrillo en el fondo
del tubo.

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RCHO + 2Cu++ + 4OH- RCOOH + Cu2O + 2H2O

precipitado rojo
Experimento N 3: Prueba de Benedict:
- Rotule dos tubos de ensayo (1 y 2)
- Aada 8 gotas del carbohidrato (tubo 1) y 8 gotas del compuesto desconocido (tubo 2).
- Agregue 5 mL de reactivo de Benedict en ambos tubos.
- Caliente en agua hirviente durante 5 minutos.
La reaccin es positiva al aparecer un precipitado rojo ladrillo, indicando esto la presencia
de sustancias reductoras.

Deteccin de polisacridos mediante la Reaccin de Lugol

La reaccin de Lugol se emplea para comprobar la presencia de polisacridos y nos


permite tener una idea de cul de ellos est presente. Se basa en poner en contacto el
carbohidrato con yodo; si se obtiene un color azul intenso, se trata de almidn, debido a que se
establece una relacin de adhesin del yodo en la estructura helicoidal del almidn. Dicha
coloracin desaparece al calentar a ebullicin y reaparece nuevamente al enfriar, esto debido a
que la estructura helicoide del polisacrido se desordena por efecto del calor y se reordena al
enfriarse. De esto se deduce que no hay formacin de enlaces qumicos permanentes entre el
yodo y el almidn.

Si la coloracin obtenida es rojiza el polisacrido presente es el glucgeno.


Experimento N 4. Prueba de Lugol:
- Rotule dos tubos de ensayo (1 y 2)
- Coloque 5 mL del carbohidrato (tubo 1) y 5 mL del desconocido (tubo 2).
- Aada 2 gotas de una solucin diluida de yodo-yoduro de potasio a ambos tubos. Mezclar.
- Observe la coloracin. Si sta es azul, caliente el tubo en agua hirviente por 2 min. y
observe. Deje enfriar y observe nuevamente.
Determinacin cuantitativa de la glucosa mediante reaccin de Antrona

La glucosa del plasma bovino es determinada de manera cuantitativa y


espectrofotomtricamente mediante la reaccin con Antrona, un derivado fenlico. La reaccin de
los glcidos con Antrona es muy sensible y tiene como fundamento la conversin en medio cido

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de los carbohidratos (excepto alditoles y aminoazcares). en derivados furfricos, los cuales


reaccionan con la Antrona produciendo un color azul verdoso. La intensidad de dicha coloracin
es cuantificada en el espectrofotmetro.
CH2OH
O
O H2COH CHO
H+

Glucosa 5-hidroximetilfurfural

OH
O
H2COH CHO
H+
+ Compuestos de color
verde-azul

5-hidroximetilfurfural Antrona

Figura 4. Formacin de 5-hidroximetilfurfural a partir de glucosa en medio cido y su reaccin


con la Antrona.

Experimento 5. Reaccin de Antrona

- En un baln aforado, prepare una dilucin del plasma bovino 1/100.


- Preparare los siguientes tubos:
TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3
REACTIVOS
BLANCO ESTANDAR MUESTRA
Plasma bovino ---- ---- 1 mL
Estndar de glucosa
---- 1 mL ----
0,25 mg/dl
Agua destilada 1 mL ---- ----

Reactivo de Antrona 2 mL 2 mL 2 mL

- Mezclar y esperar 10 minutos.


- Ajuste a cero (0,00) el espectrofotmretro con el tubo blanco.
- Leer la absorbancia de todos los tubos a una longitud de onda de 620 nm utilizando el
espectrofotmetro. Anote los resultados:

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TUBO ABSORBANCIA
Estndar
Muestra

Clculo de la concentracin de glucosa presente en la muestra.

CSt
Cm = x Am
ASt

Donde:
Cm: concentracin de la muestra expresada en mg/dl
Am: absorbancia de la muestra
CSt: concentracin del estndar
ASt: absorbancia del estndar

AUTOEVALUACIN

1. Qu utilidad tiene la reaccin de Molisch en la identificacin inicial de una muestra


desconocida?

2. Existen reacciones que permiten identificar polisacridos. Mencione una de ellas e indique su
fundamento bioqumico.

3. Al calentar el tubo donde se realiz la prueba del yodo y se obtuvo un resultado positivo
desaparece el color azul que se forma durante la misma. Por qu ocurre dicho fenmeno?

5. La formacin de furfurales es determinante en algunas reacciones de identificacin de


carbohidratos, qu condiciones son necesarias para que se formen dichos compuestos? Pueden
formarse furfurales a partir de otro tipo de biomolculas distintas a los carbohidratos? Razone su
respuesta.

6. Investiga bajo qu condiciones est disminuida la concentracin de glucosa sangunea en


monogstricos y rumiantes.

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7. Revisa las rutas metablicas de carbohidratos activas durante el ayuno y post alimentacin.
Relaciona las mismas con la liberacin de las hormonas insulina y glucagn.

BIBLIOGRAFA

Alemany, M; Font, S. Prctica de Bioqumica. Edit Alhambra. Espaa, 1983.

J.M. Clark. Bioqumica experimental. 1966.

Pavia, Donald; Lampman, Gary; Kriz George. Introduction to organic laboratory techniques.
Saunders editores. 1976.

Robyt, John; White Bernard. Bioquemical Techniques. Waveland Press. 1987.