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Transgnesis y Mutagnesis

Transcriben: Byron Moreno y Tannia Quiroz


Clase dictada por: Dr. Jos Suazo

1. Definiciones

Transgnico: Organismo(s) con genes de otro organismo. Puede ser tanto vegetal como animal, al
cual se le introduce un gen de otra especie para otorgarle una caracterstica que el organismo
receptor no posea. Es decir, aprovecho las caractersticas de un organismo y se las otorgo a otro
organismo de inters.

La transgnesis comienza a mediados de los aos 90s. En 1994 se lanza al mercado el primer
organismo transgnico que es el tomate larga vida. Hoy en da existen muchos organismos
transgnicos.

A estos organismos le han introducido genes para mejorar numerosas caractersticas, como por
ejemplo para resistir bajas temperaturas de los frigorficos o tener una mayor cantidad de
protenas.

2. Para que necesitamos organismos transgnicos?

a. Para estudiar la funcin y regulacin gnica. Podemos poner un gen X en un organismo y


ver como se regula su expresin, que fenotipo produce en este organismo receptor. Hay
animales que se utilizan como modelos de enfermedades humanas, a los cuales se les
introduce un gen mutado humano y se observa el fenotipo que produce en el animal
b. Para mejorar los productos agrcolas, p ej. Un animal que produzca menos grasa y ms
protena o un tomate que soporte fluctuaciones de temperatura y que no se pudra tan
rpidamente. Tambin podemos generar una planta que sea resistente a ciertas plagas y a
los herbicidas que se utilizan para tratar esa plaga.
c. Generar nuevas fuentes de drogas o vacunas, podemos generar un organismo del cual
nos comemos la carne o nos tomamos la leche que lleva un antgeno y nos inmuniza
d. Generar nuevas herramientas para la ciencia y la tecnologa

3. Cmo generamos organismos transgnicos?

Lo primero que se debe hacer es clonar el gen, es decir, tomo el gen de inters y mediante el
sistema de enzimas de restriccin y ligasas lo introduzco en un vector y ese vector con el gen lo
introduzco en el otro organismo receptor. La clonacin puede ser con enzimas de restriccin, con
un PCR junto a enzimas de restriccin o con los vectores de clonamiento, de manera tal de
obtener muchos plasmidios, los cuales portan el gen de inters en una gran cantidad de bacterias.

Estas bacterias portadoras de plasmidios luego pasarn por un sistema de seleccin. Si


observamos la imagen veremos dos sistemas de seleccin, un sistema en el cual el polilinker est
asociado al gen Lac Z, el cual codifica para una enzima que metaboliza un anlogo de la galactosa
que es el reactivo X-gal, de manera tal que cuando se introduce el gen de inters a clonar el gen
Lac Z quedar interrumpido y no se
expresar la enzima metabolizadora
de X- gal, de manera tal que la
colonia quedar blanca, ya que
cambia a azul solo cuando la enzima
si metaboliza a X-gal.

Entonces, si el gen de inters a


clonar NO se introdujo en el
polilinker, el gen Lac Z no estar
interrumpido y por tanto se
expresar, metabolizando a X-gal y
tornndose la colonia de color azul,
por tanto, esta colonia no nos sirve.
A veces el gen no se introduce
porque el proceso de corte y empalme result defectuoso, o porque muchas veces el plasmidio se
circulariza antes de poder introducirle el gen de inters.

Por el contrario, si el gen si se introdujo en el polilinker, el gen Lac Z quedar interrumpido y por
tanto no se expresar, no metabolizndose X-gal y por tanto quedando la colonia de color blanco.

Un segundo sistema de seleccin es el gen de resistencia a la ampicilina (AMP), por lo tanto, luego
de introducirle el plasmidio a la bacteria, por algn mtodo como transformacin o
electroporacin generalmente, las hago crecer en un medio de cultivo con Ampicilina, de manera
tal que las bacterias que crecen son
necesariamente las bacterias que tienen el
plasmidio, el cual puede o no portar el gen
de mi inters.

Entonces en la imagen observamos los dos


sistemas de seleccin. Por un lado,
tenemos que todas las bacterias que
crecieron en el medio de cultivo con
Ampicilina son portadoras del plasmidio*, y
de ellas aquellas que poseen un plasmidio con el gen de inters son las blancas, mientras que las
que poseen el plasmidio sin el gen de inters tambin denominado plasmidio vaci son las
colonias de color azul. Por tanto, con las blancas nos quedamos, las ponemos en un medio de
cultivo lquido y obtenemos una gran poblacin de bacterias con nuestro gen de inters. (*En la
primera imagen el plasmidio se llama pUC18, mientras que en la segunda se llama pUC 19, para
efectos de entender el concepto son lo mismo)

El paso siguiente es subclonar el gen y ponerlo en un vector de expresin eucarionte, que son
distintos a los de procarionte, porque tiene un protomor eucarionte. A este proceso, introducir
DNA forneo en una clula eucarionte, se llama transfeccin, mientras que lo que hicimos
previamente al clonar, que era introducir DNA forneo en una clula procarionte se llama
transformacin.
3.1. Mtodos para transfectar

3.1.1 Microinyeccin: Se inyecta directamente la clula mirando por el microscopio. Para ello
hay un sistema que sujeta la clula y un sistema inyector muy fino que introduce
directamente el DNA en la clula.
a. Ventaja: Es un mtodo directo de transfeccin
b. Desventajas: Es tedioso, porque a veces necesitamos grandes volmenes de
clulas transfectadas, por tanto, requiere de tiempo. Es por ello que este mtodo
se utiliza para clulas que tienen una alta tasa de divisin, por ejemplo, un
embrin.

3.1.2 Electroporacin: Se utiliza para


bacterias, en donde se le aplica un
campo elctrico produciendo poros
en la membrana, permitiendo que
el DNA entre a la clula.
a. Ventaja: Es ms eficiente que la
microinyeccin porque es ms
masivo
b. Desventaja: Hay que optimizar muy bien el protocolo de electroporacin, determinadas
condiciones de sal, de voltaje, etc. Porque si no se ajusta bien el medio, las bacterias se
pueden morir.

3.1.3 Sistema del fosfato de calcio: El fosfato de calcio co-precipita con


el DNA, es decir, se une con el DNA y forman un precipitado que
se une a la membrana celular y as es fagocitado por la clula
a. Ventaja: Es eficiente, barato y fcil de realizar
b. Desventaja: La tasa de transfeccin es baja

3.1.4 Policationes: Se unen al DNA y al igual que el fosfato de calcio van a ser fagocitados. Se
utilizan mucho en la terapia gnica.
a. Desventaja: Los policationes pueden ser un poco txicos, por tanto, se muere un
grupo de clulas que puede ser importante

3.1.5 Lipofeccin: Se utilizan liposomas que en su interior contienen el DNA


a. Ventaja: Es eficiente
b. Desventaja: A veces no funcionan bien con los cultivos primarios, porque la tasa de
mitosis de estos tejidos no es tan alta. Un cultivo primario es un tejido que se obtiene de
una persona, se disgrega y se hace crecer en el laboratorio.
Otro tipo de cultivo son los que se hacen a partir de lneas celulares que habitualmente
estn inmortalizadas o son derivadas de cncer, por lo cual crecen ilimitadamente.
3.1.6 Vectores virales: Se construyen modificando el genoma del virus, dejando solo aquellos
genes que son importantes para la infeccin (para que el virus entre a la clula e
introduzca su genoma en la clula receptora), y se eliminan todos aquellos genes que
producen la infeccin propiamente tal, la citotoxicidad, la muerte celular, etc. Por tanto,
se ocupa el espacio de los genes que se sacan para poner los genes de nuestro inters
a. Ventaja: son muy eficientes infectando clulas y por tanto transfectndolas con el gen
de inters. Adems, pueden ser muy especficos porque hay virus con tropismo para cierto
tipo de tejido
b. Desventaja: Tienen un tamao limitado para introducir DNA, por lo cual, genes muy
grandes no seran viables por este sistema. Algunos virus tambin pueden conservar
efectos citopticos (daar a la clula).

3.2. El DNA transfectado debe llegar al ncleo

Hasta el momento habamos visto como incorporar el DNA transgnico a la clula, pero ahora
debemos ver como ese DNA transgnico llega al ncleo para que pueda ser expresado.

En general a lo que uno debe ponerle mayor preocupacin es en elegir el mtodo de tranfeccin
(lo que vimos anteriormente) porque cuando el DNA ya est dentro, de alguna forma ste llega
hasta el ncleo utilizando sistemas propios de la clula.

3.2.1. Vectores retrovirales: Como vimos una forma de transfectar es utilizando virus. Si
se trata de retrovirus estos tienen la particularidad de tener su genoma de RNA y la
transcripatasa reversa lo retrotranscribe a DNA, y este DNA al interactuar con los
complejos de poro es reconocido como material gentico propio e ingresa al ncleo,
incorporndose al DNA de la clula y con ello utilizando la maquinaria de
transcripcin, hasta obtener el producto de nuestro inters.

3.2.2. Vector adenoviral: Este es un caso particular, ya que el adenovirus ingresa


completo a la clula, a diferencia de la mayora de los virus, donde ingresa la
nucleocpside o el material gentico directamente, mientras que el manto queda
fuera.
Entonces en el adenovirus se produce una fagocitosis, formndose un endosoma que
luego se fusiona con el lisosoma. Este virus tiene algunos mecanismos para escapar
del fagosoma y llegar entero al ncleo, donde libera su material gentico, pero no se
inserta en el material gentico de la clula, sin embargo, tambin es eficiente en
cuanto a transcripcin y traduccin, obtenindose el producto de inters.

3.2.3. Liposomas: Como vimos se trata de una doble membrana fosfolipdica circular en
cuyo interior se encuentra el genoma que queremos transfectar. Por tanto, cuando
la clula lo ve lo considera como algo propio, se fusiona con la membrana celular y
llega el DNA al ncleo. Ac dependiendo del vector se va a expresar, porque por
ejemplo podemos tener un vector con un DNA y un promotor eucarionte, por lo cual
para la clula va a ser algo habitual, va a producir un mensajero y posteriormente el
producto de inters.
3.3. El DNA transfectado debe insertarse de forma definitiva en el genoma celular

Ya vimos cmo hacer entrar al DNA forneo y que ste llegue hasta el ncleo, ahora veremos
cmo se inserta de forma definitiva en su genoma para que cuando se divida genera a ms clulas
transgnicas. Para este propsito se utiliza la recombinacin homloga.

La recombinacin es un proceso que


ocurre cuando la clula se est
preparando para dividirse, donde
revisa su material gentico para ver
si hay dao, por ejemplo, que a uno
de los cromosomas le falte un
fragmento de DNA, y si es que lo hay
utiliza la recombinacin homloga
para repararlo. Entonces se utiliza el
otro cromosoma como molde para
copiar la informacin que le falta al
cromosoma con la delecin,
pasndose material gentico entre
uno y otro cromosoma.

Cuando se utiliza este sistema se tiene un gen que es parte de un vector, el cual en sus extremos
tiene una secuencia que es homloga a la secuencia del genoma del organismo, de manera tal que
por homologa se produce la recombinacin o intercambio, incorporando este gen al genoma del
organismo receptor.

Existen sistemas de seleccin para verificar que esta recombinacin se haya llevado a cabo con
xito, porque la idea es que sea una recombinacin dirigida, es decir, utilizando un caso de terapia
gnica yo quiero que el gen defectuoso se intercambie por uno bueno que es el que lleva el vector,
por tanto, luego de la recombinacin, el gen bueno debiese quedar en la misma posicin que
ocupaba el gen original.

Entonces se tiene un sistema de seleccin positiva y un sistema de seleccin negativa. El sistema


de seleccin positiva est dentro de la secuencia, por ejemplo, en la imagen tenemos el gen de la
resistencia a la Neomicina, por lo cual aquellas clulas que hayan hecho la recombinacin
homologa con xito son resistentes a la neomicina.

Fuera de la secuencia hay un sistema de seleccin negativa, que en este caso es la HSV que es una
enzima de un virus que modifica la accin de ganciclovir (un antiviral), haciendo que las clulas
que tienen el gen presentan toxicidad hacia el ganciclovir.
Entonces tengo dos opciones, que el gen se inserte en el lugar que yo quera (recombinacin
homloga), o que el gen se inserte en cualquier parte (recombinacin heterloga). Si se inserta en
cualquier parte, tambin se va a insertar el segmento que tiene el gen de susceptibilidad al
ganciclovir, por lo tanto, la clula va a presentar toxicidad a este medicamento. En cambio, en
aquellas clulas en las cuales la recombinacin result de la manera correcta, solo queda
incorporado el gen de resistencia a la neomicina y no el gen de la toxicidad al ganciclovir.

Entonces a una clula normal el ganciclovir no le hace nada porque es un medicamento retroviral,
por lo cual no debiese afectar a una clula eucarionte, pero si la clula fue transfectada con el gen
del virus pueden pasar dos cosas: que la clula se muera al aplicar ganciclovir, lo cual quiere decir
que el gen se introdujo en cualquier parte, o que la clula sobreviva al aplicar ganciclovir, lo cual
quiere decir que el gen se introdujo correctamente, siendo ambos grupos resistentes a la
neomicina.
4. Modelos transgnicos
a. Vegetales transgnicos: En el caso de los vegetales desde una clula transgnica se puede
tener toda la planta transgnica, es decir, una clula da origen a todo el organismo planta.
Para generar la clula transgnica se utiliza la bacteria Agrobacterium tumefaciens, la cual
adems de su genoma tiene un plasmidio denominado Ti al cual se le puede introducir un
gen forneo, entonces esta nueva bacteria (que es una bacteria transformada) se pone en
contacto con la clula vegetal de manera tal que la clula vegetal sea infectada por la
bacteria y adquiera el plasmidio transgnico, obtenindose una clula vegetal
transfectada, la cual se cultiva con los medios de seleccin positivo y negativo para saber
si el gen se introdujo en la posicin correcta, y eventualmente se generar una planta
completa transgnica. Entonces, por ejemplo, el gen que introduje codificaba para un
antgeno X, de manera tal que cuando me coma la planta (en una ensalada) me voy a estar
inmunizando contra el antgeno X.

b. Animales Knock- out (KO): Un animal Knock-out es un animal que


no est expresando un gen, porque elimin el gen completo o
parte de ese gen, por tanto, ese animal tampoco va a tener un
mRNA de ese gen ni un transcrito del gen (protena).

c. Animales Knock Down (KD): Son animales que tampoco


expresan un gen determinado, pero no eliminando el gen, si no
ms abajo, eliminando el mRNA

4.1. Animales Knock out clula o tejido especfico = Sistema Cre-LoxP

Se comenzaron a generar estos organismos Knock out clula o tejido especfico, porque los
cientficos que trabajaban con estos animales se dieron cuenta que cuando se perda este gen en
todas sus clulas los animales a veces se moran. Adems de regular el tejido o la clula en la cual
quiero que sea knock out, puedo regular el momento (del desarrollo, por ejemplo) en que quiero
que el animal deje de expresar el gen.

Para lograr esto se utiliza el sistema Cre-LoxP, que consta de dos animales transgnicos, los cuales
se cruzan:

Animal 1: tiene el gen de una protena denominada Recombinasa CRE, que est bajo el mando de
un promotor tejido especfico, por tanto, yo escojo que promotor le pongo a ese gen, por lo cual
se va a expresar solamente en un determinado tejido. Por ejemplo, si quiero un knock out
heptico, pongo al gen bajo el mando de un promotor que solo se enciende en el hgado.

Animal 2: Tiene el gen que me interesa knockear interrumpido por intrones que tienen unos sitios
denominados Lox P.

Entonces, observemos la siguiente imagen: se presente el gen heptico que me interesa knockear
el cual se compone de tres exones y dos intrones, y rodeando al exn dos, el cual es muy
importante para la expresin del gen porque, por ejemplo, podra contener la secuencia para el
sitio cataltico de una enzima, existe un sitio Lox P a cada lado.
A ninguno de los ratones le pasa nada an, ambos son transgnicos, pero expresan la
Recombinasa CRE y el gen heptico respectivamente. Cuando cruzo los ratones obtengo una F1 en
que obtendr ambas cosas en un mismo animal; la expresin de la recombinasa y el Lox P,
obteniendo el Sistema CRE-LoxP. Entonces, lo que hace este sistema es formar un anillo que
contenga el exn dos y junta los sitios Lox P, eliminando lo que est entre los sitios, en este caso el
exn dos (es por esto que se utiliza la recombinasa, ya que recombino los sitios). Gracias a esto se
puede eliminar un exn importante e incluso un gen completo.

Por tanto, en este ratn F1 voy a tener la eliminacin de este gen solamente en el hgado porque
esta protena se expresar exclusivamente en ese rgano.

Adems, puedo tener un sistema Knock out tejido especfico pero temporal porque puede que me
interese estudiar un momento determinado del desarrollo del ratn. Para aquello se utiliza el
mismo Sistema CRE-LoxP, es decir, voy a tener una recombinasa al mando de un promotor
especfico (por ejemplo heptico), pero la diferencia radica en que la recombinasa es inducible, o
sea se va a expresar y posteriormente ingresar al ncleo de la clula, sin embargo no ejercer su
accin si yo no le agrego algo que induzca su activacin, como por ejemplo el Tamoxifeno. El gen
de esta recombinasa inducible se denomina CRE ERT2. Entonces, si tengo a una ratona preada y
le inyecto el Tamoxifeno voy a ver que se va a activar este sistema. De esta manera podemos ver
el efecto de la presencia o ausencia de un gen en un tejido especfico y en un periodo
determinado, lo cual resulta muy importante estudiar durante el desarrollo, en este caso, de un
ratn.
5. Animales transgnicos

Antes de todo lo nombrado en la pgina anterior debo crear un animal transgnico los que
habitualmente se generan utilizando sistemas de microinyeccin en embriones tempranos, como
en la etapa de blastocisto en donde se puede apreciar claramente la masa celular que ser la
encargada de producir el embrin propiamente tal. Por tanto, nosotros inyectamos DNA o una
clula previamente transfectada en esa masa celular y esperamos a que comience a dividirse.
Como nosotros inyectamos una o varias clulas es posible que no todos los tejidos de este animal
tengan el transgen cuando nazca. Posteriormente, cuando inyectemos este embrin en el tero de
una ratona y se desarrolle el individuo completo obtendremos animales llamados quimeras, es
decir, aquellos que tienen algunos tejidos con el transgen y en otros tejidos no, pero lo que se
busca es que est presente en todos los tejidos y sobre todo que estn en las clulas germinales
para que as el ratn herede a su descendencia el transgen.

Luego de esto, voy a tener diferentes quimeras y los voy a cruzar con un ratn normal, hasta que
pueda comprobar que obtuve un animal el cual tenga en todos sus tejidos el transgen pero en
forma heterocigota. Me interesa que est en forma heterocigota porque an no s lo que est
pasando con ese trangen y ha ocurrido que si tengo el transgen en forma homocigota el animal se
muere durante el desarrollo y por tanto no tendr animales transgnicos (de acuerdo a esto
ltimo es importante mantener una reserva de ratones con el transgen en forma heterocigota, ya
que si en algn momento se mueren todos los ratones en estudio contar con la reserva para
poder continuar con el experimento).

Teniendo cierta cantidad de animales heterocigotos para el transgen, algunos los voy cruzando
entre s y debera obtener, de acuerdo a las leyes mendelianas, un cuarto de la descendencia
homocigota para el transgen y ah veo el real afecto del transgen.

5.1. Formas de producir animales transgnicos


a. Produccin de una clula en el laboratorio la que ojal tenga una alta tasa de duplicacin,
como una stem cells, la que posteriormente inyectamos en un blastocito el que ser
introducido en una hembra piglet formando finalmente un animal quimera. La idea es que
este animal quimera produzca gametos que tengan el transgen.
b. Otra forma es tener el ncleo de una clula diferenciada previamente transfectada con un
gen, a la cual le saco el ncleo y se lo pongo a un ovocito que se enuclea. Te esta manera
estoy formando un embrin que va a producir un organismo 100% transgnico.
Ac hay una tctica importante, ya que se sabe que si tengo un ovocito con un ncleo
haploide y luego se lo saco para ponerle un ncleo diploide, este ovocito se siente como
cigoto sin haber pasado por el proceso de fecundacin, por lo que empieza a
reprogramarse y despus a dividirse. (la oveja Dolly se produjo as)
c. Una clula germinal la transfectamos y luego la inyectamos directamente a la gnada del
piglet, entonces as tendremos un porcentaje de los gametos transgnicos.
5.2. Ratones transgnicos y KO

El ratn es el organismo ms utilizado en ingeniera gentica porque se parece mucho a nosotros


en algunos procesos, como en el desarrollo el que est muy conservado entre mamferos.

Adems:

a. Es un animal pequeo que podemos mantener en un laboratorio.


b. Es resistente a cambios de temperaturas, paso del tiempo, etc.
c. Tiene un ciclo de vida y reproductivo corto.
d. Posible de realizar estudios genticos en el sentido que nosotros podemos conocer el
genoma de este animal y su semejanza con el humano.
e. Muchas herramientas desarrolladas para su estudio.

Hay ratones que son entre transgnicos y KO para modelos de leucemia (tambin hay para otras
patologas). Estos ratones se utilizan para estudiar la biologa de la leucemia al analizar distintos
factores como genes relacionados con la sealizacin, citoesqueleto y trfico celular, proliferacin,
interaccin con el medio ambiente, etc.

5.3. Cerdos y minicerdos transgnicos y KO

Tambin se utilizan cerdos y minicerdos porque el ratn es un buen modelo para estudio gentico,
pero tiene un volumen diferente respecto al humano. En cambio, los cerdos y minicerdos pueden
alcanzar un tamao y un peso bastante ms similar, incluso logrando tener rganos de un volumen
parecido al humano.
Hay modelos de estos animales transgnicos y KO
para enfermedades cardiovasculares,
enfermedades neurodegenerativas, diabetes,
enfermedades inmunolgicas, cncer y para algo
muy importante como el xenotrasplante, es decir,
tomar rganos desarrollados en estos cerdos KO
y trasplantrselos a humanos, como por ejemplo
una vlvula cardaca previamente manipulada
para evitar un rechazo inmunolgico.

Mutagnesis
Mutagnesis significa inducir cambios estables y heredables en el DNA. Cuando hablamos de
mutagnesis habitualmente nos referimos a mutaciones puntuales, es decir, una modificacin de
una o pocas bases y no de un trozo de cromosoma.

1. Mutaciones puntuales

Existen distintos tipos de mutaciones puntuales; sustitucin, insercin y delecin.

2. Mutacin somtica y germinal

Las mutaciones son de diferentes tipos y van a tener diferentes efectos en la descendencia. En la
mutagnesis nos interesa que la descendencia tambin presente la mutacin.

a. Mutacin somtica: la clula mutada est en un tejido que no es el germinal, por lo tanto la
descendencia de este individuo va a ser normal ya que sus gametos no presentarn la
mutacin.
b. Mutacin germinal: la clula
mutada est inserta en el tejido
germinal, por lo que cabe la
posibilidad que un porcentaje de la
progenie tenga la mutacin.
Recordar que la variabilidad de los
gametos es tan grande por el
crossing over y la permutacin que
existen millones de posibilidades de
gametos, entonces puede que hayan
gametos sin el gen mutado.
3. Para qu mutar un gen?
a. Analizar las consecuencias de los cambios del material gentico (fenotipo). Las
enfermedades humanas ocurren por mutaciones puntuales de un gen, por tanto es mejor
realizar el mismo tipo de mutacin en los modelos de estudio. No sera lo mejor knockear
un gen porque habra menos similitud, adems esto puede resultar demasiado agresivo.
b. La funcin normal de un gen puede ser conocida al perturbarlo o eliminarlo.
c. Se realiza sobre un organismo, clula o un DNA clonado.

4. Tipos de mutagnesis
a. Aleatoria: mutaciones puntuales en cualquier sitio del genoma por agentes mutagnicos
o a travs de PCR utilizando una polimerasa de DNA propensa a errores (error prone)
b. Dirigida: alteracin de un gen o secuencia en vectores. Las sustituciones, inserciones o
deleciones se introducen con la incorporacin de partidores modificados (asociado a
replicacin).

5. Mutagnesis aleatoria

5.1. Agentes mutagnicos

Estos agentes pueden ser fsicos y qumicos

5.1.1. Radiacin ultravioleta

La luz ultravioleta genera mutaciones al azar y la manera en que lo realiza es formando dmeros de
timina (las timinas se unen). Estos dmeros de timina se pueden reparar, pero cuando son muchos
los mecanismos de reparacin se saturan y los dmeros persisten.
Aun as puede ocurrir que durante la
replicacin se leen correctamente y se
les unen las adeninas
correspondientes, no modificando la
secuencia del DNA (abajo a la
izquierda). Sin embargo, s puede verse
afectada la secuencia del DNA al
aparecer unas enzimas susceptibles a
error que en vez de poner una adenina
pone una citosina (abajo a la derecha).
Estas enzimas estn funcionando en
todas las clulas que en ciertas
situaciones siguen replicando a pesar
de haberse equivocado y es por esto
que se postula que son necesarias para
la evolucin al causar variacin en el
genoma.

5.1.2. Anlogos de bases

Tambin generan mutaciones al azar, como por ejemplo el 5-Bromo Uracilo (5-BrU) que tiene una
forma enol y una forma ceto. Cuando est en su forma enol se une a la guanina y cuando est en
forma ceto se une a la adenina. Es un anlogo de base porque se comporta dependiendo del
enlace que establece, ya que puede comportarse como citosina o como timina, pero no es una ni
la otra.

Por ejemplo, en un comienzo tenemos la secuencia normal la que entra en un primer ciclo de
replicacin y este anlogo (B) no es reconocido como extrao por las polimerasas e ingresa a la
secuencia nucleotdica
comportndose como timina.
Posteriormente, despus de
realizado un segundo ciclo de
replicacin el anlogo cambia
su conformacin y se comporta
como citosina. Ya en el tercer
ciclo de replicacin la guanina
que antes estaba unida al
anlogo ahora se une a una
citosina consolidando una
mutacin. Se considera
mutacin cuando en ambas
hebras existe el cambio.
Otro compuesto que genera mutaciones es el
cido nitroso el que produce una desaminacin
de la citosina y la convierte en uracilo, por lo
que se finalmente se unir a una adenina.

5.2. PCR propenso a error (Error prone PCR)

El PCR debera copiar exactamente lo que estamos dando como molde, pero podemos generar un
PCR propenso a error, es decir, de baja fidelidad. De baja fidelidad quiere decir que la enzima va a
empezar a poner cualquier cosa.

Este PCR se realiza en ciertas condiciones:

a. Taq pol sin capacidad editora. Las Taq pol normales s tienen capacidad editora, lo que
quiere decir que cuando avanzan y se equivocan, son capaces de devolverse, arreglar el
error y luego continuar poniendo bases.
b. Mayor concentracin de Mg+2. Adems yo estimulo a que se equivoque al agregarle ms
magnesio teniendo presente que este ion es un cofactor que aumenta la velocidad de la
polimerasa, causando una mayor probabilidad de error.
c. Adicin de Mn+2. Produce el mismo efecto del magnesio, es decir, aumenta la velocidad
de la polimerasa y con ello una mayor probabilidad de error.
d. dNTPs con proporciones diferentes. Al tener la concentracin de nucletidos en
diferentes proporciones, como por ejemplo ms adenina, la polimerasa pondr mayor
cantidad de adenina. Todo esto teniendo presente el aumento en la probabilidad de error
de esta enzima.
Cuando uno hace un PCR la proporcin entre nucletidos es igual, pero si pongo ms
concentracin de un nucletido la polimerasa colocar ms de ese debido a su mayor
disponibilidad.

6. Mutagnesis sitio dirigida

Existen diferentes formar de generar una mutagnesis sitio dirigida, entre las cuales encontramos:

a. En la mutagnesis dirigida tambin se aprovechan las propiedades del PCR, particularmente


manipulando los partidores. Entonces, puedo generar diferentes tipos de mutaciones que se
basa en el uso de un plasmidio en el cual est clonado el gen que nos interesa mutar.

Si vemos la imagen, en el primer plasmidio puedo generar una mutacin puntual y tengo uno
de los partidores mutado. Entonces, se va a copiar la hebra en la que est actuando el partidor
mutado y tambin se copiar la hebra normal. A consecuencia de la utilizacin de un partidor
mutado, en los siguientes ciclos del PCR van a empezar a aparecer hebras con la mutacin.
Es importante que para
una mutacin puntual
debo colocar partidores
que se superponen y de
esta manera me aseguro
que todo el segmento de
inters se est copiando y
se est generando la
mutacin.

Tambin puedo generar


deleciones. En el
plasmidio objetivo pongo
partidores que no se
superponen, entonces el
segmento que no tienen
en comn en cada ciclo de
replicacin se ir
perdiendo.

Adems puedo producir


inserciones al poner
partidores ms largos, es
decir, son partidores que
se superponen pero que adems tienen una colita por lo que a medida que pasan los ciclos
de replicacin la colita tambin se va copiando y agregando al segmento.

Despus, sea cual sea el tipo de mutacin que se realiz, el plasmidio se recirculariza gracias a
un sistema de ligacin. Este sistema de ligacin consiste en que los partidores utilizados tienen
un extremo fosforilado el que ser reconocido por una ligasa que une los extremos del
plasmidio y lo recirculariza. Posteriormente, con un mtodo de seleccin, podr transformar
bacterias o lo que desee transformar.

b. En la mutagnesis sitio dirigida vamos a tener un plasmidio que viene habitualmente de una
bacteria, entonces nos encontraremos con el problema de que el PCR no ser eficiente y va a
quedar un porcentaje de plasmidio que no sufri la mutacin o que no se amplifica, el que
debemos eliminar para no perjudicar nuestro trabajo.
Una forma de identificar ese porcentaje de plasmidios que no amplific es que los plasmidios
que s replicaron por PCR no van a estar metilados (recordar que las bacterias metilan su DNA,
por tanto, contienen plasmidios metilados)
Entonces, despus de hacer los pasos de PCR realizamos una digestin con una enzima que es
sensible a la metilacin, es decir, va a degradar el DNA que est metilado y como lo nico que
est metilado es el plasmidio original que no fue utilizado, me quedar con el plasmidio que s
tiene la mutacin.
c. Existe un sistema que se llama CRISPR Cas9. Este es un sistema de edicin del genoma y se
puede utilizar en organismos completos, por ejemplo, a nivel embrionario para producir un
organismo que tiene una mutacin.
Se llama CRISPR, lo que significa Repeticiones palindrmicas cortas agrupadas y regularmente
interespaciadas.
Este sistema es derivado del sistema inmune de bacterias y arqueas, es decir, est
encargado de cortar ciertos DNA, pero que fue modificado por la ciencia para dirigirlo a un gen
especfico que se desea mutar. Gracias a esto se pueden hacer genes KO y mutagnesis
secuencia especfica.

El CRISPR Cas9 requiere:


Cas9 con NLS
RNA con secuencia gua de 20nt (gRNA). 5 se alinea con la secuencia de DNA y 3
stem-loop de unin a Cas9.
Un motivo adyacente al proto-espaciador 5-NGG-3 (PAM).
Vectores con genes de Cas9 y gRNA.

Es decir, esto se basa en introducir en una clula dos vectores que llevan un gen de una
enzima llamada Cas9 (encargada de cortar) y un RNA gua (gRNA) que le dir a la enzima a qu
gen tiene que dirigirse. Este gRNA forma una doble hebra con un gen especfico indicndonos
el gen que queremos mutar, knockear, etc.

En la imagen vemos el RNA gua (gRNA) con sus 20 nucletidos unidos al gen y tambin forma
un loop que se une a la enzima. Adems observamos el sitio PAM, el cual comprende el
espacio entre la unin del gRNA al gen y la continuacin de la doble hebra. En el sitio PAM es
donde se realiza el corte.

En el NHEJ repair podemos hacer una


insercin o una delecin para formar un
gen Knock-out. Esto comienza con el corte
de la doble hebra, y como vemos en el
ejemplo, se realiza una insercin
utilizando el sistema NHEJ repair (significa
Unin de extremos no homlogos), el cual
rellena con cualquier nucletido
interrumpiendo la secuencia del gen y
dando origen a un gen Knock-out.

Tambin podemos hacer un Knock-in


agregando una secuencia de un plasmidio
por ejemplo, con el fin de introducir un
gen o exn nuevo.
Otra forma de utilizar el Sistema CRISPR-Cas9 es usar dos de estos sistemas de forma
independiente que se van a unir y cortar en distintos sitios, teniendo como consecuencia que
la secuencia o gen completo que est entre ellos sea eliminado, es decir, se hace un Knock-out
de ese gen.