1.

Colorația GRAM – efectuarea unui frotiu, colorarea și examinarea microscopică - Principiu-evidenţiază forma, gruparea şi afinitatea tinctorială a germenului, clasificând germenii Gram pozitivi şi Gram negativi pe baza structurii fizico-chimice a peretelui celular. Germenii Gram pozitivi au peretele gros, dar simplu care rezistă la decolorare şi păstrează culoarea violet iniţială. Germenii Gram negativi au peretele subţire dar complex ca structură după culorare devenind roşii. Metodologie • frotiul uscat şi fixat se acoperă cu violet de genţiană 2 minute. • mordansarea-se acoperă lama cu Lugol care se menţine 2 minute, apoi se varsă fără a se spăla. • diferenţierea-se acoperă frotiul cu un amestec alcool-acetonă şi se imprimă mişcări de inclinare a lamei. După 10 secunde se spală frotiul cu apă de la robinet. • recolorarea-se acopera frotiul cu fuxină Ziehl diluată 1/10 timp de 1-2 minute Se spală cu apă de la robinet. Se usucă şi se examinează la microscop. 2.Coloraţia Ziehl-Neelsen – principui, metodologie, interpretare Principiu-bacilii acido-alcoolo-rezistenţi au în structura peretelui substanţe lipidice care se colorează greu dar odată coloraţi nu-şi pierd culoarea nici cu un decolorant puternic rămânând coloraţi în roşu. Celelalte microorganisme, împreuna cu elementele celulare, se decolorează şi, după recolorare, devin albastre. Metodologie • se acoperă frotiul cu fuxină fenicată. Se aşează flacăra sub frotiu şi se menţine până la emisie de vapori. Încălzirea durează 5 minute. Se înlătură fuxina, se spală lama cu apă de la robinet . • decolorarea cu o soluţie de acid sulfuric 20% timp de 1 minut. Se spală pe ambele feţe. • recolorarea cu albastru de metilen 1% timp de 1 minut. Se spală cu apă de la robinet. Se usucă şi se examinează la microscop cu obiectivul cu imersie. În coloraţia Ziehl-Neelsen bacilii alcool-acido rezistenţi apar roşii, iar restul florei şi elementele celulare colorate cu albastru. 3. Caractere de cultura ale germenilor patogeni
Caractere de cultura pe medii solide: Elementul caracteristic al multiplicării bacteriene în mediul solid este reprezentat de "colonia bacteriană" care genetic reprezintă multiplicarea în generaţii successive pornind de la un singur individ iniţial. ■ Dimensiuni: Mici: dimensiuni cuprinse intre 0,1-1 mm. Exemplu: germeni din genul Haemophylus, Brucella, Bordetella. - Mijlocii: dimensiuni de 1-2 mm. Exemplu: Proteus, Salmonella, Streptococcus. - Mari: dimensiuni de 2-3 mm. Exemplu: Staphylococcus, E. Coli. ■ Formă: Rotunde; Ovalare; Dendritice;Lenticulare;Filamentoase.

1

încastrate in mediu ■ Culoarea: Prin pigment propriu: coloniile pot fi: albe (stafilococ alb). suprafaţă rugoasă.lobate. Strălucire-Matitate .forma „R" („rough"): contur încreţit.■ Suprafaţă: Netede: în general tulpinile proaspăt izolate. streptococ a-hemolitic (viridans). ■ Aderenţa Ia mediu Neaderente {streptococ. Aderente: (bacilulpiocianic). galben-citrin (stafilococ citrin).Virarea culorii indicatorului din mediu: culoare galbenă (indicator albastru de bromtimol) sau roşie (indicator roşu fenol) la bacteriile lactozo-pozitive (E. CARACTERE DE CULTURĂ PE MEDII LICHIDE ■ Turbiditatea care se traduce prin tulburarea mediului fie în mod omogen. Translucide: Salmonella. ca albuşul de ou bătut spumă. galben-aurii (stafilococ aureu). E. Klebsiella). Transparente. Spumoasă.încreţit: forma „gravis" Ondulat-invaziv: cu valuri successive de invadarea a mediului . Streptococ fî-hemolitic (forma "glossy"). Enterobacter (figura 11). Bordetella. sau mamelonată. Streptococ /3-hemolitic (forma "mucoides") (figura 9). suprafaţă). stafilococ. granulare: bacilul tuberculors.Lucioase (strălucitoare): Brucella. Bombate: Stafilococul. Untoasă. majoritatea germenilor la primoizolare. culoare galbenă: stafilococ aureu in cazul tulpinilor manito-pozitive (figura 12). Mamelonate: Bacilul tuberculos. Aplatizate: Pseudomonas. în toată masa mediului de cultură {stafilococ. . filante: Klebsiella. „Corn ars": Clostridium tetanii. Rugoase: unele tulpini întreţinute "in vitro " prin pasaje repetate. ■ Hemoliza La zona de hemoliză se apreciază: Dimensiunile zonei în raport cu diametrul bacteriei: dimensiuni mari: la stafilococ beta-hemolitic. Bacilii difterici . coli. . bombate. verde fluorescent (Pseudomonas aeruginosa). fie in mod inegal. turtite. .forma „S" („smooth "): contur circular. Shigella).formele "gravis " şi "intermedius ". Haemophyllus („în picătură de rouă"). Ombilicate („în farfurie"): Pneumococ. păstoasă. filamentoase. regulat. Salmonella.Mucoase. E. Contur (margini) Circular. ■ Consistenţa Friabile: bacilul tuberculos. hemofili.Proteus Cu prelungiri . Vibrionul holeric. coli.Mate: Streptococ fi-hemolitic (forma "matt"). Prin coroborarea a câteva dintre caracterele coloniilor microbiene (contur. Shigella. portocalii (streptococ de grup B). Fecaloid: E. Transparenţă-Opacitate (densitate optică) Hipertransparente: vibrion holeric. dimensiuni mici: stafdococ. ■ Mirosul degajat de unele colonii poate fi caracteristic: Aromă de flori de tei: Pseudomonas aeruginosa. coli. Proteus. coli. întreg. suprafaţă netedă. se disting două mari categorii: . Uscate. Opace: Stafilococ. sub forma unui depozit grunjos la 2 . . culoare albastră. Shigella. Proteus etc). . in cazul tulpinilor care folosesc citratul ca unică sursă de carbon (indicator albastru de bromtimol): Klebsiella. Putrid: Proteus.

dispuşi în cordoane. C. Examenul direct Prezintă o etapă esenţială în diagnosticul de laborator al tuberculozei şi constă în efectuarea de frotiuri direct din produsul patologic.fecaloid: E. Este testarea sensibilităţii unei tulpini bacteriene la agenţi chimioterapici sau antibiotice. polimorfonucleare. 5. însămânţată “în pânză” cu bacteria de testat. formarea unei membrane uscate. ■ Culoarea Apariţia unei coloraţii diferite de cea a mediului neînsămânţat. Miros caracteristic: aromat. După incubare 24 de ore la 37oC. „scuamoase" (Bacillus subtillis). dată de eliberarea de pigmenţi bacterieni hidrosolubili ca fluoresceina. coli. În mediul lichid.1. coli). Probele pozitive trebuie controlate prin coloraţia Ziehl-Neelsen. Inoculul constă dintr-o suspensie din tulpina microbiană de testat diluată de ordinul 105germeni/ml. încreţite la suprafaţă. 16 mg/l).„screeningul" prin fluorescentă cu auramină şi rodamină şi examinare în ultraviolet (puncte strălucitoare pe fondul pal-verzui al câmpului. 2. în caz de prezenţă a bacililor Koch). Aspecte la suprafaţa mediului: formare de val subţire la suprafaţă: vibrion holeric. mediul fiind clar în rest (bacilul antraxului). 3 . CMI este indicată de tubul sau godeul care conţine cea mai mică concentraţie de antibiotic la care creşterea bacteriană nu mai este vizibilă. fie sub aspectul unui depozit floconos şi aderent la fundul eprubetei. inoculul bacterian se distribuie într-o serie de tuburi sau godeuri. 2. formarea unui inel aderent la joncţiunea dintre concavitatea nivelului superior al lichidului şi pereţii eprubetei (unele tulpini de E. conţinând bulion Mueller-Hinton cu antibioticul în concentraţii crescânde(0.baciloscopie directă prin coloraţia Ziehl-Neelsen permite diagnosticul de certitudine: barili roşii. de flori de tei: Pseudomonas. a) Metoda difuzimetrică-gradientul de concentraţie necesar determinării se realizează în mediu agarizat prin difuzarea radială a antibioticului dintr-un depozit depus pe suprafaţa mediului. restul mediului fiind limpede (bacilul tuberculos).partea inferioara şi pe pereţii eprubetei si cu un aspect mai limpede in celelalte doua treimi superioare. Diagnosticul de laborator in tuberculoza. Metoda difuzimetrică se utilizează numai pentru bacteriile cu creştere rapidă. Se efectuează: . b) Metoda diluţiilor permite determinarea concentraţiei minime inhibitorii(CMI). rugoase. celelalte elemente (floră de asociaţie. Cultura nu apare în aria în care antibioticul realizează CMI pentru bacteria testată. Principiul metodei constă în punerea în contact a suspensiei bacteriene cu diferite antibiotice. Acest gradient scade proporţional cu pătratul distanţei de la antibiotic. melanină (coloraţie verde-albăstruie în cazul Pseudomonas aeruginosa). 0. 1. (streptococul b-hemolitic). Antibiograma: principiu si interpretare.corn ars: bacilul tetanic. piocianina. 8. formarea unei membrane groase. 9. diphteriae. 4.25. Produsele patologice (în special sputa) sunt supuse în prealabil omogenizării prin tratare cu hidroxid de sodiu şi agitare (fluidificarea produsului şi repartizarea uniformă a bacililor) şi concentrării bacililor în stratul superior cu xilol şi apă distilată. . formarea unei pelicule fine (unele tulpini de Proteus). DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC 2./putrid: Proteus. Permite testarea mai multor antibiotice pe aceeaşi floră. celule epiteliale întregi sau detritusuri) albastre (figurile 1 şi 2).

. Diagnosticul de laborator in infectiile cu E. Se injectează pe faţa anterioară a antebraţului 0. uscate. pe faţa internă a coapsei 1-2 ml produs patologic. în funcţie de gradul de răspuns imun faţă de tuberculină.3. „conopidiforme". pielite.2 ml tuberculină. cele de tip bovin după 30 de zile. La autopsie se poate observa invadarea întregului sistem limfatic şi a viscerelor. Reacţia se citeşte după 72 de ore de la injectare. copil mic. enterocolite). DIAGNOSTICUL IMUNOBIOLOGIC Prezenţa imunităţii celulare. • Caractere de patogenitate Animalul de elecţie pentru reproducerea experimentală a infecţiei tuberculoase e cobaiul. alb-gălbui. după care cobaiul slăbeşte şi moare. abcedând. Intradermoreacţia la tuberculină testează răspunsul imun celular (hipersensibilitate întârziată). se inoculează subcutanat. coli poate determina diareea malignă a nou-născutului. în cazurile cu rezistenţă scăzută a organismului.Coli Sunt germeni condiţionat patogeni ce pot determina: .2. După 2-5 minute se face citirea reacţiei. • Caractere morfologice: Frotiul din cultură (colorat Ziehl-Neelsen) evidenţiază bacili acido-alcoolo-rezistenţi. La scurt timp sunt prinşi ganglionii regionali. apoi devine fluctuentă. colecistite). care se inoculează subcutanat pe faţa internă a coapsei. pofta de mâncare scade. Izolare: Se face: • in vitro pe mediul Lowenstein-Jensen (bogat în substanţe nutritive şi conţinând verde-malahit ca inhibitor al florei de asociaţie) (figura 3) cu incubare la 37°C timp de 2 luni. Se acoperă coloniile obţinute pe suprafaţa mediilor solide cu soluţie de pirocathelor.000. • in vivo: se utilizează cobai masculi de 400 g. Organismele infectate cu bacili tuberculoşi reacţionează diferit faţă de tuberculină. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE Se pot recolta: 4 . care creşte şi se ramoleşte. • Caractere biochimice: . alături de celule epiteliale. • 2. pot apare şi septicemii. iar la locul inoculării apar modificări. suprafaţa mamelonată). La sugar. uneori dispuşi în cordoane prin bogăţia de factor „cord" (factor de patogenitate). comparativ cu cele indemne. roşii. Identificare • \ Caractere cultură: Pe mediul Lowenstein: colonii „R" (margini neregulate. cele atipice cresc în primele zile şi sunt colorate (figurile 4. când la locul inoculării apare un eritem şi un edem cu diametru diferit. E. cobaiul devine apatic. cele de tip uman cresc după 14 zile. 11.infecţii intestinale (enterite. floră de asociaţie. principala modalitate de apărare specifică antituberculoasă.Testul catalazei diferenţiază mycobacteriile atipice la care reacţia este pozitivă de bacilul Koch. perhidrol şi apă distilată. 1. în sensul că regiunea se împăstează. Reacţia este pozitivă dacă se observă apariţia bulelor de gaz. colite. pcritonite. pielonefrite). suprainfecţia plăgilor. dintr-o diluţie de 1/10. se testează prin IDR la tuberculină. unde reacţia este negativă.Testul la niacin (Konno) este utilizat pentru punerea în evidenţă a niacinei. leucocite. infecţii purulente (apendicite. După 10-15 zile.2. faţă de tuberculină. colorate în albastru (figura 8). de sănătate aparent deplină.infecţii urinare (cistite. iar la nivelul plicii inghinale se palpează un ganglion. iar evoluţia bolii se face timp de 2-6 luni. 6 şi 7). . 5.

exudate diverse focare inflamatorii). individualizate chiar pe traseul de însămânţare. Caractere metabolice E. varianta „S". bilă). care se emulsionează greu şi neuniform în ser fiziologic.2. E. ornitindecarboxilază variabilă. uscate. Aceste medii vor fi incubate la 37°C 18-20 de ore. . alimente. 5 . ■ Mediul Istrate-Meitert E. margini netede. frotiul colorat Gram efectuat direct din produsele patologice. ' LCR (localizări meningeale). uree negativă. Geloză-sânge E.1. coli este mediul Levine. umede. sau colonii R. Uneori. citrat negativă. produs de vărsătură (toxiinfecţiile alimentare). Diagnosticul de laborator al infectiilor stafilococice. exudat nazo-faringian. Izolarea Izolarea acestor enterobacterii se realizează prin însămânţarea prelevatului pe două tipuri de medii: medii simple. Diagnosticul de laborator in infectii cu E. urină pentru urocultură. 2. Colli. coli (figurai3): • fermentează glucoza cu producere de gaz în cantităţi moderate. Reactia ASLO: pricipiu. importanta practica medicala.este mobilă pe MIU. cu suprafaţă lucioasă. evidenţiază bacili Gram negativi. coli. DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC (BACTERIOLOGIC) 2. mediul special de cultură pentru E. fără legătură cu patogenitatea. relativ restrânsă. 6. uşor emulsionabile în ser fiziologic.• materii fecale din scaunul emis spontan sau recoltate cu sonda Nelaton (infecţii ale tractului digestiv). • puroi de la nivelul plăgilor. bilă (în infecţii ale căilor biliare). 7. • probe de organe de la cadavru (diaree malignă a nou-născutului). coli: determină colonii lactozo pozitive. mobili (E coli) 2. nesporulaţi. d. indol pozitivă. Identificarea germenilor Caractere de cultură Geloză simplă Escherichia coli determină colonii S.E. Tot pentru identificarea E. 10. opace. c. Istrate-Meitert). Secretia uretrala: rolul examenului direct microscopic in cadrul examenului de laborator al uretritelor. Identificarea se realizează în 2 etape: aglutinarea cu serul polivalent anti-E. Reacţia folosită în acest scop este reacţia de aglutinare pe lamă folosind trusa de seruri imune standard anti-E.3. coli: poate determina hemoliză incompletă. • sputa (infecţii ale tractului respirator). coli se poate folosi reacţia de imunofluorescenţă indirectă. coli enteropatogen (EPEC) care poate determina diareea malignă a nou-născutului (până la vârsta de 2 ani). necapsulaţi. urină. lizindecarboxilază pozitivă. drepţi sau uşor încurbaţi. acidifwă partea înclinată a mediului TSI (lactoză/zaharoză pozitivă). • sânge pentru hemocultură (în caz de septicemii). fără inhibitori (geloză glucozată 2%) şi medii cu inhibitori (slab sau moderat selective: EMB/Levine. 8. Caractere antigenice Această etapă se practică pentru: . • fenilalanină negativă. nu produce H2S. 2. cu margini crenelate. coli poate să determine şi colonii mucoide . Examenul direct Este important pentru produsele patologice normal sterile (LCR. coli. galbene. convexe. interpretare.

Diagnosticul de laborator pentru sifilis. Urocultura. 6 . 12. Coprocultura cu bacterii conditionat patogene. 16. 15. 13.11. Diagnosticul de laborator cu Shigella. 14. Diagnosticul de laborator in infectii cu Salmonella. Coprocultura cu bacterii patogene.