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Ajo envejecido tiene más

potente antiglicación y
propiedades antioxidantes en
comparación con el extracto
de ajo fresco in vitro
1, 2
Abdulhakim Elosta 1, Mark Slevin y Khalid Rahman Nessar Ahmed 1

La glicación proteica implica la formación de productos finales de glicación temprana


(Amadori) y tardía avanzada (AGE) junto con radicales libres mediante la autoxidación de
glucosa y productos Amadori. La glicación y el aumento de la actividad de radicales libres
subyacen a la patogénesis de las complicaciones diabéticas. Este estudio investigó si ajo
envejecido tiene más potente antiglicación y propiedades antioxidantes en comparación con
el extracto de ajo fresco in vitro en un sistema libre de células. Las proteínas se glucosilada
por incubación con azúcares (glucosa, metilglioxal o ribosa) ± 5-15 mg / ml de los extractos
de ajo envejecido y frescas. Glicación avanzada productos finales se midieron
usando geles de SDS-PAGE y por ELISA mientras que los productos de Amadori se
evaluaron por el método de fructosamina. Los métodos colorimétricos se utilizaron para
evaluar la actividad antioxidante, la capacidad de captación de radicales libres, grupos
carbonilo unidos a proteínas, grupos tiol y las actividades de quelación de metal, además
de fenólico, contenido en flavonoides y flavonol total de extractos de ajo envejecido
y frescas. El ajo envejecido inhibió los AGE en un 56,4% comparado con el 33,5%
para una concentración equivalente de extracto fresco de ajo. Del mismo modo, el
ajo envejecido tenía un mayor contenido fenólico total (129 ± 1,8 mg / g) en
comparación con el extracto de ajo fresco (56 ± 1,2 mg / g). Ajo envejecido tiene
más potente antiglicación y propiedades antioxidantes en comparación con el extracto
de ajo fresco y es más adecuado para su uso en el futuro en los estudios in vivo.

La hiperglucemia crónica de la diabetes mellitus subyace en el desarrollo de complicaciones a largo


plazo que afectan los ojos, los nervios, los vasos sanguíneos, los riñones y la piel de las personas
afectadas. La hiperglucemia aumenta la glicación de las proteínas, que es la reacción no enzimática
entre los grupos carbonilo de los azúcares reductores y los grupos amino proteicos que forman una
base inestable de Schiff que se reorganiza a un producto Amadori más estable. Una vez formados,
los productos Amadori experimentan reacciones adicionales que implican intermedios de
dicarbonilo tales como 3-desoxiglucosonas y que finalmente forman estructuras fluorescentes y
reticuladas llamadas productos finales de glicación avanzada (AGE). La acumulación de AGE de
tejidos han sido implicados en el desarrollo de las complicaciones diabéticas 1,2. Glicación de
proteínas se los acompañaron por la producción de radicales libres a partir de la autooxidación de
glucosa (glicación autoxidative) y la oxidación de las proteínas glucosilada (glucoxidación) a partir
de los 2. Los radicales libres son capaces de biomoléculas perjudiciales y este estrés oxidativo
contribuye a la patogénesis de complicaciones diabéticas 2.

A pesar de los avances en el tratamiento, las complicaciones a largo plazo de la diabetes son una de
las principales causas de preocupación. Por lo tanto, la inhibición de daño tisular AGE-mediada y el
estrés oxidativo puede ofrecer potencial terapéutico para prevenir o retrasar la aparición o la
progresión de las complicaciones diabéticas 1. Diversos compuestos antiglicación se han estudiado
e incluyen aminoguanidina, un fármaco encontrado para ser eficaz tanto in vitro como in vivo 1.
Otros compuestos incluyen la edad reticulan interruptores tales como bromuro de N-fenaciltiazolio
se han propuesto como agentes para la reversión de reticulación de proteínas causada por AGEs 3.
Además, existe un interés considerable en los compuestos capaces de bloquear la interacción entre
las edades y sus receptor llamado receptor para AGE (RAGE) 4. Aunque muchos compuestos han
sido estudiados, ninguno ha sido aprobado para uso clínico. Mientras que la búsqueda de nuevos
agentes sintéticos de la antiglaciación continúa, poca atención se ha dedicado a los agentes
antiglycation de fuentes naturales. Varios estudios han indicado que la suplementación de la dieta
con nutrientes que poseen tanto antiglicación y antioxidantes prop-piedades puede ser un
complemento seguro y simple de las terapias tradicionales dirigidos a prevenir complicaciones de la
diabetes 5.

1Facultad de Ciencias de Salud de la Universidad Metropolitana de Manchester, Manchester M1


5GD, Reino Unido. 2 Facultad de Farmacia y Ciencias Biomoleculares, Liverpool John Moores
University, Liverpool L3 3Muestra, Reino Unido. La correspondencia y las solicitudes de
materiales deberán dirigirse a NA (e-mail: N.Ahmed@mmu.ac.uk)
www.nature.com/scientificreports/

Figura gel 1. (A) SDS-PAGE que muestra los efectos de los extractos de ajo envejecido y frescas
en la formación de reticulado Los AGE formados por glicosación de lisozima (10 mg / ml) por
glucosa 0,5 M en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4 durante 4 semanas a 37ºC. Lisozima no modificada
(carril a), lisozima glicosilada (carril b) o lisozima glicosilada en presencia de 5 (carril c), 10 (carril
d) o 15 mg / ml (carril e) de extracto de ajo envejecido o 5 (carril f) , 10 (carril g) o 15 mg / ml
(carril h) de extracto de ajo fresco. (B) Porcentaje de inhibición de los AGE reticuladas. Cada valor
representa la media ± SD (n = 3). La significancia estadística se definió como ** P <0,01 en
comparación con extracto de ajo envejecido.
El ajo (Allium sativum) se ha utilizado como un agente de sabor, alimentos funcionales y
en medicina tradicional. De hecho, sus propiedades medicinales se han utilizado para tratar
una amplia variedad de enfermedades desde la antigüedad 6. El ajo es un agente medicinal
profiláctico y terapéutico bien establecido, que ha sido investigado para la salud Ben-ficios,
lo que resulta en más de 3000 publicaciones de todo el mundo 7. El ajo es una fuente rica de
compuestos organosulfurados -soluble el agua y lípidos, pero los constituyentes
responsables de los beneficios para la salud de ajo puede variar en tipo y concentración,
dependiendo de diferentes procesamiento, preparaciones y las condiciones del suelo 8. El
ajo está disponible en diferentes formulaciones; uno de los cuales es el extracto de ajo
envejecido y se fabrica remojando el ajo crudo en rodajas en etanol acuoso al 15-20% hasta
20 meses a temperatura ambiente. A continuación, el extracto se filtra y se concentra a
presión reducida a baja temperatura. Durante este envejecimiento, los compuestos irritantes
olorosos y duras en el ajo se convierten en no irritantes, compuestos de azufre sin olor,
seguro 9. Este proceso provoca la pérdida de la alicina y aumenta la actividad de otros
compuestos organosulfurados solubles en agua, tales como S -alil cisteína (SAC),
mercaptocysteine S-alilo (SAMC), allixin y selenio, todos los cuales son antioxidantes 8,10.
Otro antioxidante presente en el extracto de ajo envejecido es arginina fructosil N-, que no
está presente en las preparaciones de ajo crudo o de calor tratados con 11. El objetivo de
este estudio fue investigar y comparar las habilidades de los extractos de ajo envejecido y
fresco para inhibir la formación de AGE. Además, también se investigó la actividad
antioxidante del extracto de ajo envejecido y se comparó con la del extracto de ajo fresco.

Resultados
Efectos de los extractos de ajo envejecido y fresco en los AGE
reticulados. Glicación de la lisozima por glucosa produce AGE reticulados que se
presentan como dímeros con un peso molecular aproximado de 28 kDa. La lisozima glicada
(figura 1A, carril b) mostró una movilidad electroforética reducida para el monómero de
lisozima y la presencia de dímeros formados a través de enlaces cruzados AGE en
comparación con la lisozima nativa (figura 1A, carril a). El ajo envejecido (Fig. 1A, carriles
c-e) y extractos de ajo fresco (Fig. 1A, carriles f-h) inhibieron la dimerización inducida por
AGE de la lisozima de una manera dependiente de la dosis. Los valores promedio de
extracto de ajo envejecido a concentraciones de 5, 10 y 15 mg / mL fueron 11,2%, 40,4% y
56,4%, frente al 5,9%, 24,9% y 33,5% respectivamente. Extracto de ajo envejecido mostró
una significativa (P <0,01) mayor efecto inhibidor en comparación con el extracto de ajo
fresco a concentraciones más altas solamente (10-15 mg / ml) (Fig. 1B).

Actividad de Amadorin de extractos de ajo envejecido y fresco. La


reincubación de bovinos ricos en Amadori dializados la albúmina sérica (BSA) después de la
glicación con ribosa da como resultado la formación de AGE como se muestra en la figura 2. La
cinética de la formación de AGE post-Amadori fue rápida durante 2 días en ausencia de cualquier
inhibidor. Ambos extractos de ajo envejecido y fresco inhibieron estas reacciones post-Amadori con
extracto de ajo envejecido siendo más eficaz en todos
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Figura 2. Efecto de (A) 5 mg / ml, (B) 10 mg / ml y (C) 15 mg / ml de los extractos de ajo
envejecido y frescas en la formación de AGE post-Amadori medidos usando ELISA a
diferentes puntos de tiempo. Los resultados se presentan como media ± SD (n = 3). En cada
intervalo de tiempo, la significación estadística se definió como * P <0,05, ** P <0,01,
*** P <0,001 en comparación con el extracto de ajo fresco.

concentraciones ensayadas comparadas con BSA glicada. A concentraciones bajas (5 mg / ml), el


extracto de ajo envejecido no mostró una inhibición significativa de la formación de AGE post-
Amadori en comparación con el extracto de ajo fresco (Figura 2A). De los datos de la Fig. 2B y C,
es evidente que el extracto de ajo envejecido a concentraciones más altas (10-15 mg / ml) mostró
significativa (P <0,001) la inhibición de la formación de AGE post-Amadori después de 8 días en
comparación con el extracto de ajo fresco.

Efecto de los extractos de ajo envejecido y fresco en la formación de


fructosamina. Un aumento de fructosamina se produce después de la incubación de
BSA con glucosa, pero no para BSA incubado solo (Fig. 3). Ambos extractos inhibieron la
producción de fructosamina después de 2 y 8 días de incubación con ajo envejecido siendo
más eficaz en comparación con el extracto de ajo fresco (Fig. 3). En comparación con la
BSA glucosilada, extracto de ajo envejecido mostró significativa (P <0,001) la inhibición
en la formación de fructosamina después de 2 y 8 días. Del mismo modo, el extracto de ajo
fresco mostró una disminución significativa (P <0,01) inhibi-ción de la formación de
fructosamina. Formación de fructosamina se inhibió más por extracto de ajo envejecido que
por extracto de ajo fresco en día 8 (P <0,01), pero no en el día 2 (Fig. 3).

Home Idiomas Ingresar a Epistemonikos Búsqueda avanzada Efecto de los


extractos de ajo envejecido y fresco en glycotion inducida por la formación
de carbonilo y grupo tiol. La albúmina sérica bovina glicada durante 4 días mostró un aumento
en los grupos carbonilo unidos a proteínas
en comparación con BSA solo como un control negativo (Tabla 1]. Ambos extractos inhibieron la
formación de grupos car- bonilo unidos a proteínas con un extracto de ajo envejecido que era más
eficaz (Tabla 1). En comparación con BSA glucosilada, extracto de ajo envejecido mostró
significativa (P <0,001) la inhibición de la formación de grupos carbonilo. Del mismo modo, el
extracto de ajo fresco mostró significativa (P <0,01) la inhibición de la formación de grupos
carbonilo. Glucosilada BSA tenía un significativamente (P <0,001) menor contenido de tiol en
comparación con BSA solo. Extracto de ajo envejecido tuvo un efecto significativo (P <0,001
efecto) pro-protectora contra la oxidación de grupos tiol y el extracto de ajo fresco también mostró
una disminución significativa (P <0,01) efecto

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Figura 3. Efectos de 10 mg / ml de extractos de ajo envejecido y fresco sobre la


formación de fructosamina. BSA (10 mg / ml) se glucosiló con glucosa 0,5 M en tampón
de fosfato 0,1 M, pH 7,4 durante 10 días a 37 ° C. Cada valor representa la media ± SD (n
= 3). En cada intervalo de tiempo, la significación estadística se definió como ** P <0,01,
*** P <0,001 en comparación con BSA glucosilada.

Grupos
carbonilo Grupos tiol
nmol / mg de pmol / mg de
proteína proteína
BSA 0,4 ± 0,2 11,4 ± 0,9
BSA glicada en ausencia 12 C
± 0,4 5 C
± 0,2
de extractos
Glycated BSA in
presencia de ajo
envejecido 5.9 Ab
± 0,5 9.4 Ab
± 0,5
extraer
Glycated BSA in
presencia de ajo fresco 8.3 Ba
± 0,6 8 Ba
± 0,5
extraer

Tabla 1. Efectos de 10 mg / ml de extractos de ajo envejecido y fresco sobre los grupos


de proteína carbonilo y tiol de BSA modificado con metilglioxal y glucosa
respectivamente. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (n = 6). los
símbolos A y B se refieren a la diferencia significativa entre los valores marcados en
comparación con la BSA glucosilada en ausencia de extractos. Medios etiquetados en cada
columna sin letras mayúsculas comunes difieren significativamente de glicada-BSA, P
<0,001 y P <0,01 respectivamente. Medios etiquetados en cada columna sin letras
minúsculas comunes difieren significativamente de extracto de ajo envejecido, P <0,05.

ABTS [TEAC] DPPH [IC 50]


(Μ M Trolox) (mg / ml)
Ácido ascórbico 19.5 C ± 0,3 11.7 C ± 0,2
Extracto de ajo
envejecido 19 Cb
± 0,1 15 Ab
± 0,2
Extracto de ajo fresco 12 Aa
± 0,7 24 Ba
± 0,5

Tabla 2. Actividades antioxidantes de ácido ascórbico, ajo envejecido y extractos de ajo fresco
según se determina por los ensayos de barrido de radicales ABTS y DPPH. Los datos se
presentan como media ± SD (n = 6). El símbolo UN y segundo se refieren a la diferencia significativa
entre los valores marcados en comparación con el ácido ascórbico. Medios etiquetados en cada
columna sin letras mayúsculas comunes difieren significativamente de ácido ascórbico, P <0,001.
Medios etiquetados en cada columna sin letras minúsculas comunes difieren significativamente de
extracto de ajo envejecido, P <0,001.

en comparación con la BSA glucosilada. Extracto de ajo envejecido fue significativamente


(P <0,05) más eficaz que el extracto de ajo fresco en la prevención de la oxidación de
grupo tiol (Tabla 1).

Actividades antioxidantes de extractos de ajo envejecido y fresco. En los 2,


2-azino-bis de ácido 3-ethylbenzthiazo-line-6-sulfónico o de ensayo ABTS, ambos extractos
muestran actividades antioxidantes, ya que eran capaces de captar el ABTS +. El extracto de ajo
envejecido tenía una mayor capacidad antioxidante Trolox equivalente (TEAC) en comparación con
el extracto de ajo fresco (Tabla 2). No hubo diferencias significativas en TEAC entre el extracto de
ajo envejecido y el ácido ascórbico. Sin embargo, el extracto de ajo fresco mostró una disminución
significativa (P <0,001) diferencia en TEAC comparación con el ácido ascórbico. Extracto de ajo
envejecido tuvo un efecto protector y significativamente (P <0,001) redujo TEAC en comparación
con el extracto de ajo fresco. En el 1, 1-difenil-2--picryl hidracilo (DPPH) Ensayo de eliminación
de radicales, ascórbico mostró signifi-cant (P <0,001) la inhibición de los radicales DPPH en
comparación con los extractos de ajo envejecido y frescas. El efecto del extracto de ajo envejecido
fue significativamente (P <0,001) diferente de extracto de ajo fresco. De hecho, el extracto de ajo
envejecido demostró una capacidad de barrido de DPPH más fuerte que el extracto de ajo fresco
(Tabla 2).

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Actividades de quelación de metales de extractos de ajo envejecido y
fresco. La Figura 4 mostró el metal quelante efectos de los extractos de ajo envejecido y fresco.
Ambos extractos mostraron potentes habilidades quelantes para los iones ferrosos. Sin embargo, en
todas las concentraciones ensayadas el ajo fresco tuvo un efecto quelante más fuerte en
comparación con el extracto de ajo envejecido (Figura 4). A concentraciones más altas (15-20 mg /
ml), los extractos de ajo fresco mostró significativa (P <0,05) habilidades Chelat-ing para iones
ferrosos, mientras que el extracto de ajo envejecido mostraron significativa (P <0,001) efecto
quelante com-recortó a ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Sin embargo, EDTA mostró
significativamente (P <0,001) más fuerte Fe 2 + -chelation actividad incluso a concentraciones
mínimas de 0,1 mg / ml en comparación con los extractos de ajo envejecido y frescas.

Compuestos fenólicos, flavonoides y flavonólicos en extractos de ajo


envejecido y fresco. La Tabla 3 muestra la concentración de compuestos fenólicos
totales fue significativamente (P <0,001) mayor en ajo envejecido en comparación con el
extracto de ajo fresco. Del mismo modo, el total de las concentraciones de flavonoides y
flavonoles de ajo envejecido fueron significativamente (P <0,001) mayor que el extracto
de ajo fresco (Tabla 3).

Discusión
Existe un interés considerable en los agentes antiglicantes debido a su potencial terapéutico para
reducir la morbilidad y la mortalidad asociadas con la diabetes. Se han propuesto diferentes
estrategias para revertir los efectos de AGEs, centrándose en la inhibición de la formación de AGE,
la eliminación de AGEs o interferencia con efectos celulares de los AGE 2. Este estudio mostró
extractos de ajo tanto envejecidas y frescas inhiben la formación de AGEs y está de acuerdo con
estudios previos que demuestran extracto de ajo envejecido y SAC inhibir eficazmente la formación
de AGE in vitro 12. De hecho, se demostró que el extracto de ajo envejecido tiene propiedades
antiglaciación más potentes en comparación con el extracto de ajo fresco. Además, la adición de
SAC a extracto de ajo fresco aumentó la inhibición de AGE (resultados no mostrados). Además de
SAC, otros compuestos pueden estar presentes en el extracto de ajo envejecido que contribuye a su
antigelación
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Los compuestos naturales con propiedades antioxidantes pueden inhibir la formación de AGE. En
este sentido, los compuestos tales como la rutina 15, garcinol 16, té loubuma 17 y el té verde 18 se han
demostrado para prevenir la formación de AGE in vitro e in vivo. Por lo tanto, la actividad
antiglaciación de extractos de plantas podría atribuirse a sus propiedades antioxidantes. De hecho,
varios estudios han demostrado que los efectos protectores de ajo se deben a sus propiedades
antioxidantes y de eliminación de radicales capacidades 19,20. Las capacidades de los extractos de
ajo envejecido y frescas para barrer ABTS ˙ se compararon con ácido ascórbico, siendo este último
un excelente marcador para la determinación de la capacidad antioxidante de antioxidantes de
hidrógeno donación. La mayor actividad de barrido de ajo envejecido en comparación con el
extracto de ajo fresco se consideró similar a la capacidad antioxidante del ácido ascórbico y puede
estar relacionado con el alto contenido polifenólico de extracto de ajo envejecido. Los compuestos
antioxidantes también pueden reducir el color púrpura del DPPH ˙ proporcionando átomos de
hidrógeno o por donación de electrones y la producción de un complejo incoloro causando la
disminución de la absorbancia, que es una medida del grado de eliminación de radicales. La
actividad de eliminación de DPPH ˙ de compuestos fenólicos en extractos de ajo envejecido y
frescas se debe principalmente a sus propiedades redox y depende de la estructura química del
compuesto, el número de grupos hidroxilo, el patrón de sustitución de los grupos hidroxilo y en el
método de análisis 21 .

En el ensayo de quelación de metales, la ferrozina forma complejos con iones ferrosos y, en


presencia de agentes quelantes ferrosos; la formación del complejo se interrumpe, dando
lugar a la reducción del color complejo rojo. Por lo tanto, la medición de la reducción de
color refleja la actividad de quelación de metales de quelantes coexistentes 22. Los extractos
de ajo envejecidos y frescos interfieren con la formación de complejos ferrosos y de
ferrozina, por lo tanto son capaces de capturar iones ferrosos antes de la formación de
ferrozina y, por consiguiente, producir una actividad quelante de metal. De manera
inesperada, el extracto de ajo fresco produjo una actividad de quelación ferrosa más fuerte
en comparación con el extracto de ajo envejecido, aunque este último tenıa un contenido de
flavonoides mayor. La capacidad de quelación de metales de los extractos de ajo
envejecidos y frescos depende de su estructura fenólica y del número y posición de los
grupos hidroxilo. Puede ser que los flavonoides en extracto de ajo envejecido no tengan la
estructura requerida, explicando este resultado. Además, se cree que los aminoácidos
ácidos y / o básicos pueden desempeñar un papel importante en la quelación de iones
metálicos.

El extracto de ajo envejecido, que contiene la mayor cantidad de compuestos fenólicos,


flavonoides y flavonoles, exhibió la mayor actividad antioxidante. Estos resultados
concuerdan con los de los trabajadores anteriores que informó de que el contenido de
fenoles totales del extracto de ajo envejecido fue mayor que la de fresco y extractos de ajo
cocido al vapor 23. Los flavonoides y flavonoles son fenólicos naturales importantes, y son
el grupo más extendido de compuestos naturales. El mecanismo (s) de la acción de los
flavonoides y flavonoles son a través del proceso de barrido o Chelat-ing 24. Los hallazgos
de este estudio apoyan la hipótesis de que el compuesto fenólico en ciertos extractos de
plantas inhibe efectivamente la formación de AGE. De hecho, los compuestos con
contenido fenólico, flavonoides y flavonoles inhibieron eficazmente la formación de
compuestos de dicarbonilo y AGEs 25. Por lo tanto, la diferencia en las actividades
antioxidantes y antiglaciación entre los extractos de ajo envejecido y fresco podría deberse
a su composición de compuestos fenólicos y / u otros compuestos no fenólicos.

El envejecimiento del ajo convierte los compuestos ásperos, inestables e irritantes


encontrados en el ajo crudo tal como alicina a los compuestos únicos y beneficiosos
estables. Así, el método de procesamiento del ajo envejecido puede influir en sus
actividades antioxidantes. Las altas actividades antioxidantes del extracto de ajo envejecido
pueden deberse a compuestos antioxidantes distintos de los compuestos fenólicos. La
actividad antiglaciación del extracto de ajo envejecido se debe principalmente a sus
compuestos organosulfuros. El extracto de ajo envejecido contiene principalmente
compuestos de organosulfuros solubles en agua, como SAC y SAMC, que son poderosos
antioxidantes y son en gran parte responsables de los beneficios para la salud del extracto
de ajo envejecido. La farmacocinética de SAC está bien establecido in vivo, que tiene una
alta biodisponibilidad y que se utiliza para la normalización de extracto de ajo envejecido
26.
Ambos compuestos fenólicos y organosulfurados presentes en ajo poseen propiedades de
barrido de radicales 27. Sin embargo, la presencia de otros compuestos antioxidantes
potenciales, tales como la vitamina C, la vitamina E y β - caroteno, también puede
desempeñar un papel importante 21. Esta propiedad antioxidante del extracto de ajo
envejecido puede, al menos en parte, tienen en cuenta sus propiedades antiglaciación.

Este estudio tiene varias limitaciones, uno de los cuales es el uso de altas concentraciones de azúcar
para acelerar la reacción Gly-catión, que de otro modo se produce lentamente in vivo depender de
grado y la duración de la glucemia. Sin embargo, este enfoque es útil para los estudios mecánicos
que permiten realizarlos en una escala de tiempo aceptable y reducir la posibilidad de
contaminación microbiana de la muestra. No está claro cómo se metabolizan estos extractos in vivo
y si los ingredientes activos relevantes estarían presentes en la sangre en apropiadas con-
centraciones o si los efectos sinérgicos todavía serían operacional. Sin embargo, el enfoque
utilizado proporciona un simple proceso de selección para evaluar las propiedades antioxidantes y
antioxidantes de extractos interesantes.

La suplementación dietética con antioxidantes puede ser una forma sencilla y segura de
complementar los tratamientos tradicionales dirigidos a detectar y prevenir complicaciones
diabéticas. Este estudio demuestra que los extractos de ajo envejecido y frescas protegen contra la
glicación de proteínas in vitro. El extracto de ajo envejecido inhibe la formación de AGE más
eficazmente que el extracto fresco de ajo, y este hallazgo junto con datos previos sugieren que el
consumo diario de extracto de ajo envejecido podría ser beneficioso para la prevención de
enfermedades relacionadas con el estilo de vida. Es importante identificar todos los compuestos en
el extracto de ajo viejo y aclarar su papel preciso. La biodisponibilidad de diferentes componentes
del ajo y su capacidad para inhibir la formación de AGE requieren una investigación adicional. Se
necesita investigación adicional para aclarar si el extracto de ajo envejecido atenúa el desarrollo de
lesiones vasculares diabéticas in vivo.

Materiales y métodos
El ácido etilendiaminotetraacético se obtuvo de Fisher Scientific International, Reino Unido. El
extracto de ajo envejecido fue proporcionado amablemente por Wakunaga of America Company
Ltd. Se obtuvieron Ribosa, dodecilsulfato sódico (SDS) y Tris (hidroximetil) -amino metano de
BDH, UK. La solución de acrilamida se obtuvo de Bio-Rad Laboratories (Hemel Hempstead, RU).
El azul de bromofenol se obtuvo de Serva, Alemania. El etanol, el ácido acético glacial y el metanol
se obtuvieron de Fisher Scientific International, Reino Unido. Tubo de diálisis con un peso
molecular de corte de 3,5 kDa y 67 kDa se obtuvo de Medical International Ltd Company (Londres,
Reino Unido). El anticuerpo avanzado del producto final de la glicación (anticuerpo policlonal de
conejo a AGE) y anticuerpo IgG de conejo secundario

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anticuerpo (cabra policlonal a IgG de conejo) se adquirieron de Abcam, UK. Todos los
demás reactivos eran de calidad reactiva analítica de Sigma-Aldrich Company (Poole, RU).

Proteína glicación. Brevemente, se incubaron BSA o lisozima (10 mg / ml) en glucosa


0,5 M o 0,1 M metilglioxal con o sin inhibidores prospectivos (extractos de ajo envejecido
y fresco) en tampón de fosfato de sodio 0,1 M que contiene azida de sodio 3 mM, pH 7,4 a
37 ° C en la oscuridad durante un período de tiempo definido 12. Se incubaron muestras de
control con o sin inhibidores prospectivos bajo las mismas condiciones. Las alícuotas se
almacenaron a - 20 ° C hasta el análisis.

Preparación de extracto de ajo fresco. El ajo fresco fue comprado en una tienda
minorista de alimentos (Manchester, Reino Unido). Los bulbos del ajo fueron identificados
por un botánico en la universidad. Los bulbos (50 g) en buena forma fısica fueron pelados y
pesados. Extracto de ajo acuosa se preparó de acuerdo con un método establecido 28. En
pocas palabras, se homogeneizaron 50 g de ajo en 75 ml de NaCl frío al 0,9% en presencia
de algún hielo triturado. La homogeneización se llevó a cabo en un mezclador a la
velocidad más alta con ráfagas de 1 minuto durante un total de 12 minutos. La mezcla
homogeneizada se filtró a través de tela de queso, se centrifugaron a 2000 xg durante 10
minutos y el sobrenadante claro se completó hasta 100 ml con solución salina. Este extracto
de ajo acuosa se almacenó en pequeñas alícuotas a - 20 ° C hasta su uso. La dosis de ajo
fresco se calculó sobre la base del peso de ajo fresco en mg utilizado para preparar un
extracto de 1 ml (un mililitro de extracto acuoso contenía material de 500 mg de ajo). El
extracto acuoso de ajo contiene aproximadamente el 50% de material de ajo.

Interrupción del ensayo post-Amadori. La proteína glicosilada con ribosa rica en


aductos Amadori se preparó como descrito previamente 12. Brevemente, se incubó BSA (10
mg / ml) en ribosa 0,5 M en tampón de fosfato de sodio 0,1 M que contenía azida sódica 3
mM, pH 7,4 a 37ºC durante 24 horas. El azúcar sin unir se eliminó mediante diálisis
extensiva contra agua destilada y esta proteína rica en Amadori se reincubó con o sin el
extracto prospectivo a 37ºC. Se tomaron alícuotas a varios intervalos (0 - 8 días) y se
congelaron para análisis subsiguiente antes de la medición de AGE usando el ensayo de
inmunoabsorción enzimática (ELISA) a continuación.

Medida de fructosamina. El contenido de fructosamina se cuantificó por un método


colorimétrico utilizando nitroazul de tetrazolio (NBT) como se describe previamente 29
y el
método de calibrado usando estándares de 1-desoxi-1-morfolino-D-fructosa (DMF).

Medición de los AGE. AGE reticulados. Estos se evaluaron mediante el porcentaje de


reticulación del proteína después de la electroforesis de sodio dodecil sulfato-
poliacrilamida gel (SDS-PAGE) utilizando geles al 10% como se ha descrito previamente
12.
Estos geles se tiñeron con azul de Coomassie, se desnaturalizaron, fotografiaron y
analizaron usando el programa Gene snap de G Box Chem HR16 y el software de análisis
de imágenes de herramienta Gene de Bio Tools, Inc. (Edmonton, Alberta, Canadá),
respectivamente. Se midió la densidad integrada (ID) para analizar los geles
electroforéticos unidimensionales y se calculó el porcentaje de inhibición de los AGE
reticulados utilizando la fórmula:

% De inhibición = 100 x (I D sin inhibidor -.. I D con inhibidor) / I. D sin inhibidor

EDADES por ELISA. Las placas de microtitulación se recubrieron con 100 μ l de


estándares (1 ng / ml-1 mg / ml) y muestras
(1 μ g / ml) diluido en tampón carbonato 50 mM, pH 9,7, durante la noche a 4 ° C. Después del
recubrimiento, los pocillos se lavaron con 300 l de solución salina μ contiene 0,05% de Tween-20.
Los pocillos se trataron con 200 L μ de tampón de bloqueo (leche seca no grasa al 3-5% o 5% de
BSA en suero) en tampón de carbonato de sodio o de PBS durante 2 horas a temperatura ambiente,
seguido de lavado. Un volumen de 100! L de anticuerpo AGE (policlonal de conejo a anticuerpos
AGE) como anticuerpo primario se añadió a un título adecuado (1: 2500 a 1: 20.000) diluido en
tampón de bloqueo y se incubó durante 2 horas a 37 ° C, seguido por lavado. Luego, 100 mu L de
anticuerpo IgG de conejo; policlonal de cabra a IgG de conejo (peroxidasa de rábano) como
anticuerpo secundario se añadió a un título de 1: 4000 a 1: 10000 diluido en tampón de bloqueo
inmediatamente antes del uso y se incubó durante 1 hora a 37ºC, seguido de lavado. Se añadió
solución de sustrato ABTS sal de diamonio (100 μ L / pocillo) a las placas, seguido de una
incubación a temperatura ambiente durante hasta 30 minutos. Se añadió una 100 μ l de solución de
parada (ácido 0,625 M oxálico), se mezcló y la absorbancia determinada a 450 nm.

Medición de los grupos carbonilo enlazados a proteínas. Se midieron los


grupos carbonilo unidos a proteínas usando derivatización DNPH como se ha descrito previamente
30.
El contenido de carbonilo se calculó utilizando un molar absorber-ance de 22.000 M - 1 cm - 1 y
los resultados se expresaron como la relación de nmoles de DNPH hace reaccionar por mg de
proteína.

Medición de grupos tiol. Se determinó el contenido de tiol libre en BSA solo y en


BSA glicada en presencia o ausencia de extractos de acuerdo con un método establecido 31
usando 5,5 'ácido -dithiobisnitrobenzoic (DTNB) y clorhidrato de L-cisteína como
estándares. Concentración de tiol libre se calculó utilizando 14.150 M - 1 cm - 1 como el
coeficiente de extinción molar de DTNB. Los resultados se expresaron como la relación de
nmoles de DTNB reaccionado por mg de proteína.

ABTS ensayo antioxidante. El ensayo de ABTS estándar 32 se utilizó para la


determinación de TEAC de ambas edades y extractos de ajo fresco. Trolox disuelto en
etanol se utilizó como patrón de referencia (0-20 μ M) mientras que el ácido ascórbico se
utilizó como control positivo.

DPPH ensayo de capacidad de captación de radicales. 1, actividad de barrido del


radical 1 - difenil - 2 - picril - hidrazilo de los extractos fue medido de acuerdo con una versión
modificada de un método existente 33. Se usó Trolox como compuesto patrón de referencia y se
utilizó ácido ascórbico como control positivo. La actividad antioxidante de una muestra fue

Los informes científicos | 7: 39613 | DOI: 10.1038 / srep39613 7

www.nature.com/scientificreports/
expresada en términos de equivalentes micromolares de trolox. Se determinó la inhibición
del 50% de concentración que causa (IC 50) de cada extracto y se compara con la TEAC
correspondiente.

Ensayo de quelación de metales. La capacidad de ajo extrae para quelar iones ferrosos
(Fe 2 +) se evaluó según una versión modificada de un método establecido 34. Se usó EDTA como
un control positivo y se diluyó a 0,01 - 20 mg / ml para uso posterior. La actividad quelante del
extracto para Fe 2 + se calculó usando la fórmula:

Tasa quelante = [1 - (absorbancia de la muestra) / (absorbancia del control)] x 100

Medición de compuestos fenólicos totales. La cantidad de compuestos


fenólicos totales en el ajo extractos se estimó de acuerdo con una versión modificada de un
método previamente reportado usando Folin-Ciocalteu reactivo 35. El método se calibró
utilizando una solución etanólica de ácido gálico 0,024-0,3 mg / ml (10 g / L) y los
resultados se expresaron en miligramos por gramo de extracto de equivalentes de ácido
gálico.

Medición de los flavonoides totales. El contenido de flavonoides se determinó de


acuerdo con una versión modificada de un procedimiento colorimétrico descrito previamente el uso
de la quercetina como un compuesto de referencia 36. La quercetina se utilizó para las normas y el
contenido de flavonoides se expresó en miligramos de equivalente de quercetina por gramo de
extracto.

Medición de los flavonoles totales. El contenido de flavonoles se determinó de


acuerdo con un método 35. Se utilizaron patrones de rutina para calibrar el método y el
contenido de flavonol se expresó en miligramos de equivalente de rutina por gramo de
extracto.

Análisis estadístico. El análisis estadístico se realizó utilizando el software SPSS 19


(SPSS Inc., Chicago, Illinois, ESTADOS UNIDOS). Los datos se presentan como media ±
desviación estándar (DE) de al menos tres experimentos independientes. La diferencia
significativa entre los grupos de ensayo se analizó mediante análisis de varianza de dos vías
(ANOVA de 2 factores), seguida por las pruebas de Bonferroni Post-Hoc para las
comparaciones entre las concentraciones ensayadas en extractos de ajo envejecido y fresco.
Una prueba de Dunnett Post Hoc se utilizó para comparar entre los extractos de ajo
envejecido y fresco contra el control. La significancia estadística se definió como * P <
0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001.

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Expresiones de gratitud
Estamos muy agradecidos a Wakunaga de América Company Ltd para que nos proporciona
el extracto de ajo envejecido utilizado en este estudio.
También se agradece al Ministerio de Educación Superior,
Libia para proporcionar una beca de doctorado para el Dr.
Abdulhakim Elosta. Nos gustaría reconocer Tor Yip por su
ayuda con las ilustraciones.

Contribuciones de autor
AE, MS, KR y NA destinadas a la investigación. AE realizó la investigación; AE, MS, KR y
NA analizaron los datos y NA y AE escribió el documento.
Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
Información Adicional
Conflicto de intereses financieros: Los autores declaran no tener intereses financieros en
competencia.

Cómo citar este artículo : Elosta, A. et al. ajo envejecido tiene más potente antiglicación
y propiedades antioxidantes
en comparación con el extracto de ajo fresco in vitro . Sci. Rep. 7 , 39613; doi: 10.1038 /
srep39613 (2017).

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