You are on page 1of 9

I.

Latar Belakang : Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa


kimia yang paling penting dalam makhluk hidup.DNA merupakan senyawa yang
mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi
selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom
meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme.
DNA genom meliputi gen danintergen (Suryo, 2004).
Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi
atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi
atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008). Isolasi DNA diawali
dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik
dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara
enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-
bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer
nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan
deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS).
Saliva dapat digunakan sebagai sampel DNA karena pada saliva terdapat
enzim, protein, sel, leukosit, bahan anorganik. Saliva mengandung berbagai macam
komponen (seperti air, mineral, elektrolit, buffer, enzim dan inhibitor enzim, faktor
pertumbuhan dan sitokin, imunoglobulin, mucin, dan glikoprotein lainnya) yang tidak
hanya melindungi integritas jaringan rongga mulut, tapi juga memberikan petunjuk
terjadinya penyakit atau kondisi sistemik dan lokal. Oleh karena itu pada percobaan
ini akan dilakukan isolasi DNA helicobacter pylori dari saliva

II. Tujuan :Untuk dapat mengetahui tahapan-tahapan dalam proses


isolasi DNA bakteri pada sampel saliva

III. Landasan Teori : DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi
genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk
kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas.
Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat
dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular
dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan
kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari
garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua
orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein
histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki
protein histon (Kirsman, 2010).
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsipisolasi
DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untukmemisahkan
campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat
molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada
pada bagian atas tabung . Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi
yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah
(Rachmat, 2012). Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain:
preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun
isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau
bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya
senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat
pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air
pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula.
Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin
sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Kirsman, 2010).
Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane
sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan
lemak pada membrane membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”.
Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik
dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu
ikatan kimia (Kirsman, 2010).

Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis),
ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta
pemurnian DNA ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA
antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan
RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang
dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya
harus sederhana dan cepat. Air liur adalah sumber DNA yang berpotensi untuk
digunakan dalam mengkaji genetik manusia. Kemajuan dalam penggunaan air liur
sebagai cecair diagnostik adalah hasil daripada kepesatan kemajuan teknologi semasa.
Kesannya, kemajuan teknologi semasa telah membawa kepada penggunaan air liur
sebagai sumber diagnostik alternatif untuk menilai kesihatan oral malah mampu
menilai kesihatan secara keseluruhan (Wong 2006). Air liur telah menjadi sumber
diagnostik yang penting bagi mengkaji penyakit disebabkan oleh komposisi, fungsi
dan interaksi air liur dengan sistem organ yang lain (Lima et al. 2010).

Madalli et al. (2013) mendapati Saliva atau air liur berpotensi untuk berfungsi
sebagai bahan diagnostik yang memberikan banyak kelebihan berbanding serum. Air
liur didapati mampu memberi maklumat terhadap ciri fisiologi dalaman yang normal
mahupun keadaan penyakit seseorang (Javaid et al. 2015). Ini kerana perubahan
terhadap ciri fisiologi seseorang akibat daripada penyakit yang dihidapinya akan
menyebabkan perubahan terhadap cecair plasma yang terdapat di dalam air liur,
menjadikan air liur sebagai bahan spesimen yang berpotensi untuk mendiagnosis
penyakit (Lima et al. 2010). Pada masa kini, air liur telah digunakan dalam
menganalisis beberapa penyakit seperti penyakit sistemik, autoimun, keturunan,
kanser, kandungan paras hormon, paras dadah, pembuktian forensik dan juga penyakit
oral (Javaid et al. 2015; Malathi et al. 2014; Mohd Faiz et al. 2012; Rathnayake et al.
2013). Saliva atau Air liur didapati mengandungi pelbagai bahan biologi seperti
enzim, hormon, antibakteria, antibodi, glikoprotein, elektrolit, mukosa dan bahan
biologi lain (Chiappin et al. 2007; Daniel et al. 2006; Luke et al. 2015; Spielmann &
Wong 2011) yang berguna dalam melakukan diagnosis

Saliva atau air liur relatif mudah diperoleh dalam jumlah yang cukup untuk
keperluan analisis, selain itu biaya penyimpanan dan pengirimannya juga lebih rendah
dibandingkan dengan pemeriksaan serum dan urin. Teknik pengambilan saliva yang
non-invasif akan mengurangi kecemasan dan ketidaknyamanan pasien. .

IV. Prosedure kerja :

A. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah:

a. Pot sampel steril


b. Tabung 1,5 mL
c. Mikropipet 100 mL
d. Meja praktikum
e. Tip 100 mL
f. Gelas kimia 500 mL
g. Sentrifuse
h. Kompor listrik

2. Bahan

Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah sampel saliva, larutan lisis ,
EDTA (etilendiamin tetra asetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat), kloroform
(CHCI3), NaCL 1,2 M .etanol absolut dingin dan akuabides steril.

B. Cara Kerja

1. Lisis Sel

500 ul saliva

tabung ependroff 1,5


mll

 Ditambahkan larutan lisis 400 ul


 Dan ditambahkan 100 ul larutan EDTA

Divorteks

 Ditambahkan 6 ul EDTA dan 6 ul RNAse


 Diinkukubasi di watebath pada suhu 650C selama 20
menit
Didinginkan
2. Pemisahan DNA dari Materi Organik

saliva

 Ditambahkan 600 ul kloroform


 Dihomogenkan selama 10 detik dengan cara dibolak-
balik.
 Disentrifugasi dengan 10.000 rpm selama 10 menit

Hasil

3. DNA binding/presipitasi

Larutan bagian atas

 Ditambahkan 100 ul larutan NaCL 1,2 M


 Disetrifugase 10.000 rpm selama 10 menit
 Setelah itu dibuang supernatannya
 Kemudian, endapan DNA ditambahkan 300 ul etanol absolut
dan disimpan di freezer selama 10-20 jam
Hasil

Sampel

 Disentrifuse 10.000 rpm selama 10 menit


 Ditambahkan etanol 70 % sebanyak 100 ul
 Disentrifuse lagi selama 10 menit
 Di buang supernatannya atau etanol
 Setelah kering ditambahkan aquades 50 ul

Hasil
V. Data Pengamatan :

Tabel.1. Hasil Pengamatan


NO Sampel Hasil Pengamatan Keterangan
1 SALIVA Ada terlihat
presipitat
didasar tabung

VI. Pembahasan : Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah


satu prinsipisolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik
untukmemisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang
mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul
ringan akan berada pada bagian atas tabung . Hasil sentrifugasi akan menunjukkan
dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada
bagian bawah (Rachmat, 2012).. Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya
merupakan hal yang signifikan dan mengharuskan penyallinan DNA menjadi RNA
dan translasi RNA menjadi protein berlangsung dalam kompartemen( ruang ) yang
berbeda yaitu secara berturut-turut dalam nucleus dan sitoplasma. Pada praktikum ini
dilakukan isolasi dna yang bertujuan untuk mengetahui tahapan-tahapan dalam proses
isolasi DNA bakteri pada sampel saliva.
Sampel yang digunakan dalam praktikum ini yaitu saliva atau yang biasa
dikenal dengan air ludah. Air liur adalah sumber DNA yang berpotensi untuk
digunakan dalam mengkaji genetik manusia. Kemajuan dalam penggunaan air liur
sebagai cecair diagnostik adalah hasil daripada kepesatan kemajuan teknologi semasa.
Kesannya, kemajuan teknologi semasa telah membawa kepada penggunaan air liur
sebagai sumber diagnostik alternatif untuk menilai kesihatan oral malah mampu
menilai kesihatan secara keseluruhan (Wong 2006). Air liur telah menjadi sumber
diagnostik yang penting bagi mengkaji penyakit disebabkan oleh komposisi, fungsi
dan interaksi air liur dengan sistem organ yang lain (Lima et al. 2010). .

Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi
atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian
DNA. Selain itu ada 2 prinsip lagi dalam melakukan isolasi DNA, yaitu sentrifugasi
dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan
berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang
lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak
di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama
mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi.

Hal yang pertama dilakukan dalam yaitu proses perusakan atau penghancuran
membran dan dinding sel.Pemecahan sel(lisis) merupakan tahan dari awal isolasi
DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel yang dilakukan dengan cara melisis
500 µL saliva dimasukan kedalam tabung ependrof (1,5 µL) kemudian ditambahkan
dengan larutan lisis 400 µL dan 100 µL larutan EDTA fungsi EDTA dalam proses ini
yaitu untuk melisiskan didnding sel lalu di vorteks setelah itu ditambahakan 100 µL
SDS (sodium dodesil sulfat dan 6 µl lalu di inkubasi pada suhu 90ºC selama 20 menit.
Setelah itu sampel didinginkan pada suhu ruang pada proses lisis dengan
menggunakan detergen, sering digunakan sodium dodesil sulfat (SDS) sebagai tahap
pelisisan membran sel. Stergen ini selain berperan dalam melisiskan membran sel
juga dapat berperan dalam mengurangi aktifitas enzim nuklease yang merupakan
enzim pendegradasi DNA, Selanjutnya tahap kedua pemisahan DNA dari materi
organik ditambahkan 600 µL kloroform setelah itu dihomogenkan selama 10 detik
dengan cara bolak balik. Disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit.
Hasil sentrifus terbagi atas tiga bagian. Proses deproteinisasi yang efektif tergantung
pada besarnya fase diantara klorofom. Proses ini dapat dilakukan dengan membentuk
emulsi dari air dan klorofom ini hanya dapat dilakukan dengan bantuan sentrifugasi
karena klorofom tidak dapat larut dalam air. Isoamil alkohol berfungsi sebagai emulsi
fier dapat ditambahakan pada klorofom untuk membantu pembentukan emulsi dan
meningkatan luas permukaan klorofom-air yang mana protein akan mengalami
presipitasi. Pada tahan presipitasi ini, DNA yang akan terpresipitasi akan terpisah dari
residuh-residuh RNA dan protein yang masih tersisah . Residu tersebut juga
mengalami koagulasi namun tidak terbentuk struktur viber dan berada dalam bentuk
presipitat granulad. Pada saat etanol dan iso propanol dibuang dan pelet dikeringkan
dalam tabung, maka yang akan tersisah yaitu DNA pekat.

Proses presipitasi kembali dilakukan dengan etanol pekat sebelum pelet


dikeringkan dengan cara di angin-anginkan dapat meningkatkan derajat kemurnia
dari DNA yang diisolasi. Pencucian kembali kembali pelet yang dipresipitasi oleh iso
propanol dengan menggunakan etanol pekat bertujuan untuk menghilangkan residu
garam yang masih ada. Garam-garam yang terlibat dalam proses ekstrasi bersifat
kurang larut dalam isopropanol sehingga dapat terpresipitasi bersama DNA .Setelah
dilakukan proses presipitasi dan dilakukan pencucian dengan etanol, maka etanol
kemudian dibuang dan pelet dikering anginkan,perlakukan ini bertujuan agar
menghilangkan residu etanol dari pelet DNA. Penghilangan residu etanol dapat
dilakukan dengan cara evaporasi kerana etanol dapat menguap.

Tahap selanjutnya setelah pelet DNA dikering anginkan yaitu penambahan


akuabides kedalam tabung yang berisi pelet dan kemudian disimpan didalam frezer
dengan suhu kira-kira -20ºC . Selanjutnya ditambahkan etanol 70% yang bertujuan
mengeluarkan endapan garam yang telah bercampur

VII. Kesimpulan : Berdasarkan praktikum yang dilakukan dapat disimpulkan


bahwa DNA dari saliva dapat diekstraksi dengan tahapan yang terdiri dari lisis
sel,penghilangan protein,pemurnian dan pengendapan

VIII. Daftar Pustaka :


Albert, B., 1994. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. PT. Gramedia Pustaka
Utama. Jakarta
Campbell, N.A., J.B. Reece, L.A. Urray, M.L. Cain, P.V. Minorsky, R.B Jackson &
S.A. Wasserman. 2008. Biology. 8th ed. Pearson Education Inc, San
Fransisco: 1465 hlm.
Chiappin, S., Antonelli, G., Gatti, R. & De Palo, E.F. 2007. Air liur specimen: A new
laboratory tool for diagnostic and basic investigation. Clinica Chimica Acta
383(1): 30-40.

DNA Cloning. 2004. DNA genome mini kit. 5 hlm. http://shop.dna-


cloning.com/download/dbc-proto.pdf. 14 Mei 2015, pk. 00.00

De Las Rivas, J., Lozano J.J., Ortiz, A.R. 2015. Comparative analysis of chloroplast
genomes: functional annotation, genome-based phylogeny,

Javaid, M.A., Ahmed, A.S., Durand, R. & Tran, S.D. 2015. Air liur as a diagnostic tool
for oral and systemic diseases. Journal of Oral Biology and Craniofacial
Research 6: 67-76.

Wong, D.T. 2006. Air liurry diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and
genomics. The Journal of the American Dental Association Vol. 137(3): 313-
321.