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Capítulo

1
Exploración de los Procesos Cognitivos: Metodo-
logías y Técnicas

Introducción
En el curso de la investigación de las bases neuronales de los procesos cognitivos,
los avances más importantes han ido de la mano del desarrollo de nuevos métodos de
estudio basados en la naturaleza química, eléctrica y metabólica del sistema nervioso. Las
diferentes técnicas proporcionan información cualitativa y cuantitativa, y dependiendo de
sus especificidades, permitirían obtener información acerca de propiedades estructurales
y/o funcionales del sistema nervioso. En este texto, se revisarán algunos de los principales
métodos empleados en el campo de las neurociencias.

Invasividad y resolución de las técnicas de estudio en Neurociencias


Los primeros acercamientos a la estructura y función del cerebro fueron princi-
palmente a través de la exploración de sus propiedades macroscópicas en organismos sin
vida. De esta manera, se lograron identificar los principales surcos y fisuras del encéfalo,
además de las principales estructuras subcorticales.
Hoy en día, los estudios in vivo han permitido obtener información sobre el en-
céfalo y sus funciones mientras los sujetos se encuentran realizando alguna actividad o
procesando algún tipo de información. Al eliminar la necesidad de esperar o provocar la
muerte de los sujetos experimentales para hacer análisis estructurales, se logró reducir
de manera significativa los errores en cuanto a correlación anatómica-funcional. Muchos
de estos métodos han abierto una amplia gama de estudios en humanos, sin embargo, no
todos pueden ser utilizadas en ellos.
Es posible diferenciar las técnicas in vivo según el grado de intervención sobre el
sujeto, lo que se denomina invasividad de una técnica (Figura 1.1). Habitualmente, las
técnicas son divididas en técnicas invasivas y no invasivas. Las técnicas invasivas supo-
nen un alto nivel de compromiso de la integridad física del sujeto experimental y requieren
mayor intervención —quirúrgica, en algunos casos, — por lo que no son utilizadas en ani-
males humanos, con excepción de algunos pacientes neurológicos pre-quirúrgicos. Por su
parte, las técnicas no invasivas obtienen información del sistema nervioso sin sobrepasar
los límites del organismo, pues no requieren incisiones en la piel o inserción de sustancias
o dispositivos médicos, o, de hacerlo, son mínimos los efectos adversos en el sujeto.
A la hora de implementar una técnica in vivo, un criterio que cobra relevancia para
el investigador son sus respectivos alcances y limitaciones. En este sentido, un determina-
do método será escogido dependiendo de su precisión temporal y anatómica para estudiar
un determinado proceso neuronal. Así, se vuelve necesario introducir los conceptos de
resolución temporal y espacial (Figura 1.1).
La resolución espacial guarda relación con el grado de detalle anatómico que
permite la técnica utilizada. Mientras mayor resolución espacial tenga una técnica, ma-
yor detalle será capaz de observar el investigador. Una técnica será considerada mejor
en términos de resolución espacial cuando permitan distinguir diferencias en un área en
función de su orden de magnitud (milímetros, nanómetros, etc.), es decir, en la medida
que se ajuste a las dimensiones de la estructura de estudio.
De una forma similar, se habla de resolución temporal para referirse a la veloci-
dad de medición de una técnica. Ésta cobra importancia en los estudios funcionales del
cerebro, es decir, aquellos que miden actividad cerebral. Los procesos cerebrales ocurren
en el orden de los milisegundos. Es por esto que una técnica tendrá buena resolución
temporal cuando pueda informarnos sobre la ocurrencia de la actividad en cuestión de
milisegundos y será peor en la medida que tarde más tiempo.

Figura 1.1. Representación gráfica de diferentes métodos y técnicas de investiga-


ción empleadas en neurociencia cognitiva en función de su resolución espacial
y temporal. EEG: electroencefalografía; EMT: estimulación magnética transcra-
neal; MEG: magnetoencefalografía; RMf: resonancia magnética funcional; TC:
tomografía computarizada; WADA: test de WADA (prueba del amital sódico)
De la Estructura a la Función en el estudio del sistema nervioso
Entre las técnicas y métodos utilizados en investigación en neurociencias existen
aquellas que se han orientado al estudio de las estructuras que componen el sistema ner-
vioso, mientras que otros han apuntado a la evaluación de la actividad cerebral a propósito
de la realización de una función específica.

1. Técnicas para el estudio estructural


1.1 Post-mortem y disección del encéfalo
La exploración macroscópica del encéfalo constituyó una de las primeras aproxi-
maciones al estudio del cerebro, Debido a limitaciones tecnológicas de la época, dicha
exploración sólo pudo llevarse a cabo post-mortem o "después de la muerte".
Por un lado, la observación externa del cerebro de un organismo proporciona in-
formación general de la estructura del encéfalo. El examen visual de la corteza cerebral
permite establecer distintas divisiones en función de la presencia de grandes surcos (o
hendiduras) que recorren la superficie de dicha corteza. Algunos de estos surcos permi-
ten diferenciar los cuatro lóbulos cerebrales (frontal, parietal, temporal, occipital), Estas
diferencias aún constituyen una foco de interés para el estudio de la neuroanatomía com-
parada.
Por otro lado, la disección del cerebro, permite establecer divisiones entre las
áreas subcorticales (que están cubiertas por la neocorteza). Esta consiste en separaciòn y
corte del tejido cerebral para su análisis anatòmico detallado (Figura 1.2).
De esta forma, resulta relativamente sencillo diferenciar, sustancia blanca (axones
mielinizados y glias) de la sustancia gris (somas neuronales). Además, es posible distin-
guir los principales núcleos cerebrales subcorticales como el tálamo, el hipotálamo o los
ganglios basales.

Figura 1.2. Se aprecian los pasos necesarios para la disección del cerebelo y
Puente Troncoencefálico en un cerebro de rata. La flecha blanca indica el Colícu-
lo Inferior. Tomado de: Spijker, S. (2011). “Dissection of rodent brain regions,” in
Neuroproteomics Neuromethods, ed K. W. Li (Totowa, NJ: Humana Press),13–26.
De cualquier modo, esta forma de estudiar el cerebro resulta ser muy limitada, ya
que no permite el estudio microscópico de las distintas áreas del cerebro. Es por esto, que
se utilizan una serie de técnicas que permiten observar el tejido nervioso a nivel celular.

1.2 Histología: tinciones


El desarrollo de diversas técnicas histológicas —de fijación, seccionado y tinción
de tejido— y los avances progresivos en microscopía (óptica, electrónica o láser confocal)
han permitido profundizar la descripción morfológica de diferentes células nerviosas, las
sinapsis entre ellas, y su naturaleza molecular.
Para prevenir la degradación tisular (del tejido) y preservar la arquitectura de las
células, existen métodos de fijación química y criogénica. Los primeros se basan en
el uso de agentes químicos como formaldehído, mientras que los segundos producen la
fijación por medio de la congelación del tejido a temperaturas bajas.
Con el fin de diferenciar, cuantificar y clasificar distintos tipos de neuronas, existen
diferentes métodos de tinción. La Tinción de Golgi utiliza sales de plata con las que
neuronas se tiñen en su totalidad de forma aleatoria. Por medio de ésta, es posible conocer
las características morfológicas de las neuronas. Otra tinción utilizada tradicionalmente
es la Tinción de Nissl que, a través del uso de azul de metileno o de toluidino,se tiñen los
ácidos nucleicos en el núcleo de las neuronas (ADN y ARN). Al visualizar los núcleos de
éstas neuronas, es posible cuantificarlas (Figura 1.3).

Figura 1.3. FIgura 3. La imagen de la izquierda muestra el resultado obtenido por


una Tinción de Golgi, mientras que la imagen de la derecha corresponde a una
Tinción de Nissl.

1.3 Estudios in-vivo


Una de las primeras ocasiones en las que se empleó una técnica de imagen cerebral
en la era moderna, se produjo a principios del siglo XX de manera accidental. Fue a partir
de las radiografías (Rayos X) que se abrió la posibilidad de estudiar la morfología del
cerebro en organismos vivos. Fue a partir de lo anterior que se comenzaron a detectar y
estudiar las lesiones y patologías cerebrales de diversos pacientes.
1.3.1 Estudios de neuroimagen estructural: resonancia magnética y tensor de difu-
sión.
Una de las técnicas mejor conocidas y con mejores resultados es la resonancia
magnética (en adelante RM). La RM se ha establecido desde su origen como la técnica
de imagen que ofrece mayor resolución espacial. Su resolución espacial puede ser inferior
al milímetro y su resolución temporal, del orden de los segundos. Se ha demostrado que la
técnica es inocua, ya que la inserción del paciente en un campo magnético convencional
para estos equipos no parece suponer un riesgo para la salud.
En RM se emplean ondas electromagnéticas para «bombardear» los tejidos a fre-
cuencias de radio del orden de los megahercios. Los protones de átomos de hidrógeno en
las células hacen de antena emisora y receptora, de modo que la interrupción del pulso
provoca la reorientación del núcleo con magnetismo, que pasa de un estado de alta ener-
gía a un estado de relajación o baja energía, «devolviendo» la energía que lo ha hecho
desplazar.
Esta devolución de energía puede ser captada desde el exterior mediante un sensor
de campo magnético adecuado. Una de las principales ventajas del estudio del núcleo
del hidrógeno es que tiene una elevada presencia en la mayor parte de los tejidos que
conforman el sistema nervioso Central (SNC), ya que se encuentra formando parte de las
moléculas de agua.

Figura 1.4. Se describen los resultados obtenidos luego de la aplicación de una


RM. Se puede apreciar el cerebro de un sujeto a través de algunos de los dife-
rentes ejes anatómicos. La primera columna corresponde a vistas sagitales del
encéfalo, mientras que las dos restantes son vistas axiales.

Gracias a la RM es posible obtener, dentro de la misma sesión de registro, diferen-


tes tipos de imagen que informan sobre las propiedades de los distintos tejidos observables
en el sistema nervioso central. Cada una de estas imágenes muestra un contraste diferente
(niveles de gris), lo que permite distinguir tejidos. De un modo sencillo, el contraste de
la imagen dependerá del instante en el que se adquiera la imagen en cuestión, ya que los
diferentes tejidos se comportan de manera distinta, pues los protones del átomo de hidró-
geno se relajan de forma diferencial en función del entorno fisicoquímico en el que se
encuentren (Figura 1.4).
La RM además permite medir la difusión de agua en el cerebro. Las moléculas
de agua, gracias a ciertas propiedades químicas, se mueven paralelas a los axones de
la sustancia blanca. Esto permite observar los tractos cerebrales, que corresponden a una
conglomeración de fascículos compuestos por axones. Los tractos conectan distintas áreas
del cerebro entre sí, permitiendo la comunicación de éstas. La técnica que permite obser-
var estos tractos se denomina Imagen por Tensor de Difusión (DTI, por sus siglas en
inglés) y otorga la capacidad de identificar lesiones o patologías en las conexiones entre
áreas del cerebro.

2. Técnicas para el estudio funcional


Las técnicas utilizadas en este tipo de estudio se pueden dividir en dos grandes
categorías de acuerdo al tipo de registro que presentan. En primer lugar, nos encontra-
mos con aquellas técnicas que evalúan funciones cerebrales a través de lesiones. Por otro
lado, se encuentran las técnicas de registro metabólico y hemodinámico, donde están la
tomografía por emisión de positrones (PET) y la resonancia magnética funcional (RMf).
Finalmente, las técnicas de registro electrofisiológico, dentro de las cuales están el elec-
troencefalograma (EEG) y el magnetoencefalograma (MEG).

2.1 Lesionales
Además del análisis neuroanatómico, también se han hecho estudios que relacio-
nan ciertas áreas del cerebro con funciones específicas, lo que es, un primer acercamiento
al estudio funcional del cerebro. Para ello, se han estudiado diferentes lesiones específicas
en el cerebro y sus respectivas consecuencias en la conducta de los sujetos.
Hasta mediados de los años 50 del siglo pasado, ésta era la única forma de estable-
cer relaciones entre área cerebral y función cognitiva, lo que muchas veces trajo consigo
correlaciones erróneas, dado lo insuficiente que resultaba este método ante la complejidad
estructural del sistema nervioso. Sin embargo, desde entonces los desarrollos tecnológicos
nos han permitido profundizar el conocimiento que tenemos de este sistema.

2.2 Metabólicos
Las técnicas metabólicas tienen como objetivo medir el grado de actividad de una
determinada región cerebral en función de su tasa metabólica neuronal. La técnica apro-
vecha la necesidad que tienen los tejidos de determinadas sustancias químicas, principal-
mente el oxígeno, el hidrógeno o la glucosa para establecer relaciones entre la actividad
cognitiva.

2.2.1 Resonancia Magnética Funcional


La resonancia magnética funcional o RMf (fMRI, en inglés) es una técnica de-
rivada de la RM. Esta técnica se aprovecha de las características magnéticas de moléculas
presentes en la sangre que se encuentran magnetizadas de diferente forma frente al efecto
de un campo magnético. Las moléculas que utilizan para el registro corresponden a la
hemoglobina, cuya principal función es transportar el oxígeno a través del torrente san-
guíneo a todo el cuerpo. Cuando la hemoglobina se encuentra acoplada a una molécula
de oxígeno se le denomina oxihemoglobina y, cuando se encuentra en ausencia de di-
cha molécula, se le llama desoxihemoglobina. Estas dos moléculas tienen características
magnéticas diferentes que el resonador magnético puede detectar para registrar actividad
metabólica.
Cuando una determinada región del cerebro aumenta su nivel de actividad (como
otros tejidos de un ser vivo), consume una mayor cantidad de energía (en este caso, gluco-
sa oxigenada). Así, cuando una región cerebral se activa por encima de su nivel basal, se
produce un aumento en el consumo de sangre oxigenada, que se compensa con un incre-
mento en la perfusión sanguínea y en la oxigenación de esa región. La técnica se basa en
el hecho de que la desoxihemoglobina en eritrocitos intactos es paramagnética (interactúa
con el campo magnético), mientras que la oxihemoglobina es diamagnética (no genera
alteraciones del campo magnético a su alrededor). Un aumento o disminución en la inten-
sidad de la señal debido a un cambio local en el flujo de sangre a causa de la actividad en
una determinada área, se denomina señal BOLD (Blood Oxigen Level Dependent).
Cuando en los vasos sanguíneos se produce una disminución de la desoxihemo-
globina a causa de un aumento en el metabolismo de las células nerviosas, se generará
un incremento local de la homogeneidad del campo magnético y un aumento en la se-
ñal de RMf, que será posteriormente comparada con una serie de imágenes obtenidas en
condición de reposo.
Por lo tanto, siempre será necesaria la comparación entre imágenes obtenidas en
dos momentos diferentes: durante la realización de la tarea de interés (relacionada con
el proceso cognitivo que se quiere estudiar) y una condición de reposo o línea base. La
sustracción de estas imágenes (mediante un tratamiento estadístico de los datos) permite la
obtención de mapas de actividad cerebral asociados a la tarea que ha realizado el individuo
(Figura 1.5).
La RMF presenta una resolución espacial muy buena, con detalles al milímetro,
pero una resolución temporal no tan buena.

2.2.2 Tomografía por Emisión de Positrones


La tomografía por emisión de positrones (PET) corresponde a una segunda téc-
nica que se basa en la tasa metabólica, es decir que, aprovecha la necesidad de los tejidos
de determinadas sustancias químicas para inferir la relación entre actividad cognitiva y
actividad metabólica de ciertas áreas cerebrales. Estas sustancias, entre las que encontra-
mos al oxígeno, el hidrógeno y la glucosa, son marcadas radiactivamente e inyectadas en
la sangre, consiguiendo que queden fijadas al tejido que las consumen.
Una vez fijada al tejido que la ha absorbido y transcurrido un tiempo (variable
para cada sustancia radiactiva), los átomos inestables del isótopo liberan positrones que se
aniquilarán al contactar con los electrones de otros átomos circundantes. Dicho proceso
de aniquilación generará en última instancia dos fotones que se desplazarán a la misma
Figura 1.5. Describe a la izquierda un esquema que representa el equipo necesa-
rio para un protocolo de resonancia magnética funcional. Se observa a un sujeto
recostado realizando una tarea conductual mientras se desarrolla el registro. A
la derecha se observa una representación de los resultados obtenidos, las re-
giones de interés se observan coloreadas de acuerdo al nivel de actividad de
éstas.

velocidad, pero en sentido opuesto. El tomógrafo es un sistema de detección externo que,


mediante detectores de fotones situados en forma de cilindro alrededor de la cabeza, será
capaz de mapear el origen del proceso de aniquilación positrón-electrón y, por lo tanto,
estimar la localización del proceso metabólico de interés (Figura 1.6).

Figura 1.6. Tomografía por emisión de positrones. Describe el procedimiento a


realizar para la obtención de una imagen por tomografía por emisión de posi-
trones (PET), En A en B se indican el ciclotrón y el sintetizador automatizado,
aparatos fundamentales para generar un isótopo radioactivo. En C se describe
una glucosa marcada radiactivamente con un isótopo de flúor, se observa la li-
beración de un positrón que se aniquila con un electrón generando radiación
gamma. En D se describe al paciente siendo inyectado con la glucosa marcada
radioactivamente. Finalmente en E, se observa la imagen obtenida por medio de
los procedimientos anteriores.
2.3 Métodos electrofisiológicos
Gran parte del conocimiento actual sobre el funcionamiento del sistema nervioso
se debe al desarrollo de métodos invasivos de registro de la actividad eléctrica de las
neuronas. Estos métodos permiten el registro intra o extracelular de una unidad neuronal
(mediante el registro de la actividad de la membrana y sus canales con técnicas como,
por ejemplo, patch-clamp), así como el registro extracelular de la actividad de grupos
discretos de células neuronales.
Para llevar a cabo este tipo de registro es fundamental el uso de uno o más elec-
trodos, los que consisten en conductores eléctricos que se ponen en contacto con el tejido
nervioso permitiendo el registro del cambio de potencial del mismo. Existe una amplia
serie de métodos basados en el registro de la actividad eléctrica de las neuronas y, según
sea el caso, el tipo de electrodo también variará (Figura 1.7). A continuación, veremos
algunos de los métodos más relevantes de medición de actividad electrofisiológica.

2.3.1 Registros de neurona individual


A la hora de determinar patrones de descarga de neuronas relacionados con la con-
ducta, un método que ha sido de especial importancia es el registro de neuronas individua-
les. Éste precisa del uso de microelectrodos situados extracelularmente para monitorear
la actividad eléctrica de una neurona. Una de las ventajas de esta técnica es que permite
establecer diferencias de descarga respecto a dichos niveles basales.

2.3.2 Registros de unidades múltiples


Por otro lado, el registro de neuronas múltiples, cuyo fundamento es similar al
registro de neuronas individuales, cuenta con un electrodo de mayor tamaño que permite
detectar los cambios de potencial de población de neuronas y, por lo tanto, ofrece a los
investigadores la posibilidad de estudiar el comportamiento de éstas en distintas condi-
ciones.

2.3.3 Magnetoencefalografía (MEG)

Toda corriente eléctrica genera un campo magnético perpendicular a ella y, por


consiguiente, resulta posible medir dicho campo magnético fuera de la cabeza. La Mag-
neto Encefalografía (MEG) es una técnica que permite registrar estos cambios en los
campos magnéticos.
En un estudio de MEG se registran los débiles campos magnéticos originados
por las corrientes eléctricas que se generan a lo largo de las neuronas que componen el
cerebro. La MEG registrará fundamentalmente los potenciales neuronales postsinápticos.
La detección extracraneal de los campos magnéticos está también determinada por las
características morfológicas neuronales y por su orientación con respecto a la superficie.
Los registros de MEG se realizan utilizando un neuromagnetómetro compuesto
por un número variable de sensores de campo magnético. Posteriormente, y al igual que en
la técnica de los potenciales evocados, los campos magnéticos evocados de cada ensayo se
promedian juntos y, posteriormente, se procede a la eliminación de los posibles artefactos
aparecidos en el registro.
El MEG, tiene una resolución temporal considerable, pero una resolución espacial
precaria. Además, el MEG es una técnica mucho más cara que el electroencefalograma
por su necesidad de requerir salas aislantes especiales, pues su sensibilidad puede llegar
a registrar los campos magnéticos de la Tierra, lo que obviamente altera los resultados.

Figura 1.7. Métodos electrofisiológicos típicos. (A) Registro Macroscópico me-


diante electroencefalografía (EEG) y registro mesoscópico a través de electro-
corticografía (ECoG) y electrodos implantables, con sus sus formas de onda co-
rrespondientes, registradas en un paciente con epilepsia refractaria. Las ampli-
tudes medidas son mayores para ECoG y electrodos implantados (Registro de
Potencial de Campo Local) en comparación con EEG. (B) Registro mesoscópico
y microscópico usando un tétrodo (extracelular) y una micropipeta de vidrio (in-
tracelular), respectivamente. Tomado de M. E. J. Obien et al, Revealing neuronal
function through microelectrode array recordings, Frontiers in Neuroscience 8
(January) (2015)1–30

2.3.4 Electrocorticograma
El electrocorticograma es una técnica que consiste en la aplicación de «mantas»
de electrodos sobre la superficie del cerebro para la obtención de corticografías. Dichas
mantas están formadas por una superficie de material flexible que incorpora una serie de
electrodos (entre 20 y 60) cuya distancia entre sí determinará el nivel de resolución espa-
cial de las respuestas observadas. Las mantas se sitúan sobre la superficie del cerebro de
los individuos, con el fin de registrar la actividad de la superficie cerebral. Una de las más
claras ventajas de la técnica frente a las técnicas no invasivas análogas, como el electro-
encefalograma convencional, es el mayor nivel de resolución espacial en la localización
de la actividad eléctrica del cerebro (del orden de los milímetros).

2.3.5 Electroencefalograma
El electroencefalograma (EEG) es una técnica que mide el campo eléctrico gene-
rado por las sinapsis de las neuronas. Específicamente, mide la energía eléctrica generada
por los potenciales postsinápticos a modo de una serie de ondas. Esta técnica consta de
una serie de electrodos que se ubican sobre el cuero cabelludo, sensibles a la electrici-
dad generada por el cerebro. La gran ventaja que tiene esta técnica es que su resolución
temporal es muy buena, ya que arroja resultados casi instantáneamente después que se
produce actividad cerebral. El problema es que es muy difícil ubicar esta actividad dentro
del cerebro, ya que las capas que cubren lo cubren, incluyendo el cráneo y la piel, desvían
la electricidad a diferentes partes de la cabeza. Por este motivo, por ejemplo, medir con
un electrodo actividad eléctrica en la superficie temporal del cerebro, no significa necesa-
riamente que se esté produciendo en dicha región. Existen algoritmos que intentan ubicar
el lugar de origen de la actividad, pero no son lo suficientemente precisos. Es por esto,
que el EEG se considera una técnica con baja resolución espacial.

2.3.5 Potenciales evocados o ERP


Una de las medidas derivadas del EEG más empleadas en neurociencias cogniti-
vas para el estudio de las relaciones entre los cambios en la actividad eléctrica cerebral y
el procesamiento cognitivo son los potenciales evocados (ERP por sus siglas en inglés)
relacionados con acontecimientos discretos. Los potenciales evocados cerebrales son fluc-
tuaciones de voltaje visibles en el EEG e inducidas por los cambios de la actividad del
cerebro, que están asociadas temporalmente a la ocurrencia de estímulos sensoriales, mo-
tores o sucesos cognitivos.
Los potenciales evocados proporcionan una medida directa y no invasiva del curso
temporal de la actividad cerebral, y consisten en variaciones de voltaje positivas y negati-
vas, denominadas componentes (Figura 1.8). Los componentes reflejan diferentes proce-
sos cognitivos, los que se clasifican en función de su distribución en el cuero cabelludo, su
respuesta a las variables experimentales, su polaridad (positiva o negativa) y su latencia.
Es a partir de éstas características que los potenciales evocados reciben su nombre (por
ejemplo el N400 y el P300) . Esto permite el estudio de actividad asociada a cierto tipo de
eventos, luego de un proceso de adquisición, amplificación, promediado, representación y
análisis de los resultados. Al hacer esto, se pueden identificar ondas cerebrales presentes
ante un tipo de estímulo, eliminando el ruido trasero.

Figura 1.8. Se describe el proceso para generar y evaluar un potencial evocado


visual. Primeramente se observa un sujeto siendo expuesto a un estímulo visual,
mientras es registrado con un EEG. La señal es amplificada y luego promediada
para la obtención del evento eléctrico asociado al estímulo visual (PE).