You are on page 1of 9

Camphor Activates and Sensitizes Transient Receptor Potential Melastatin 8 (TRPM8) to Cooling and Icilin

Rezumat:
1.Camforul potenteaza senzatia de rece si cald astfel – cald TRPV1 si TRPV3 rece.
2. Camforul activeaza TRPM8 pentru rece si mentol – Canalele de Ca++ pentru camfor = HEK293 la om si
soarece; sunt inhibate de agonistii TRPM8 (4-(3-chloro-2-pyridinyl)-N-[4-(1,1-dimethylethyl) phenyl]-1-
piperazinecarboxamide si 2-aminoethyl diphenylborinate)
3. Camforul activeaza TRPM8: in prezenta ruthenium red (blocant TRPV1, TRPV3, si TRPA1), cultura de
ganglion dorsal la sobolan - senzitivitatea la camfor este cea mai inalta pe subpopulatie de neuroni senzitivi
de icilina si pentru rece; are efect de activare si inhibare pentru mentol; TRPM8 la pui insensibili la icilina
sunt insensibili la camfor, desi la TRPM8 mutant insensibil la icilina la om a fost activat de camfor.
4.TRPM8 mamifer – activare si sensibilizare la rece – este responsabil de recele inofensiv si senzatiile de
rece ca intepatura/usturatura/arsura dat de camfor.
Introducere:
Camforul este o monoterpena biciclica extrasa din arborele de camfor (Cinnamomum camphora) utilizat in
trecut ca aplicatie topica si inhalatie. Aroma de camfor este mediata prin receptorii olfactivi – la vertebrate
prin receptorii olfactivi cuplati cu proteina G. Green in 1990 a concis ca camforul potenteaza stimulul cald si
rece cand este aplicat pe pielea paroasa. Se aplica ca topic in concentratii de 10-20% (~0.6-1.3M). Camforul,
eucaliptul si mentol evoca senzatia de rece prin stimularea receptorilor din nas.
TRPM8 este Transient receptor potential, subfamilia M, membrul 8, canal cationic neselectiv activat de
temperaturi scazute (8-28 grd) si de compusi precum mentol si derivati, eucalipt si agentul de racire rapida
icilina. Icilina este Ca2+ dependenta si scade sau lipseste in prezenta EGTA (etilen glicol tetraacetic acid).
TRPM8 se gaseste in neuronii trigeminali cu diametru mic cat si in neuronii olfactivi.
Camforul pare fie agonist de TRPV3 – senzor de caldura, agonist partial al TRPV1 – senzor termic si
inhibitor al sezorului de caldura nociv TRPA1. La insecte camforul activeaza homolog TRPA1 la albina de
miere Hymenoptera TRPA canal specific activata de caldura si partial inhibata de canalul TRP Painless la
Drosophila.
Camforul, mentolul si cinnamaldehida inhiba activitatea fosforilazei C bazale (PLC) in celulele HEK293T,
pe cand PLC mediata prin influx de Ca2+ inhiba TRPM8 prin depletia pe calea fosfatidil-inozitol-difosfat.
Desi s-a dovedit lipsa efectelor sau efecte minore asupra TRPM8 efectuate prin metoda patch-clamp pe
celule intregi, tehnica pare sa interfere cu caile de semnalizare intracelulara.
Un studiu anterior (Babes et al. 2006) basat pe microflurimetrie cu calciu a aratat pe neuroni DRG non-
adaptativi la rece ca prezinta sensibilitate la camfor si un profil farmacologic TRPM8-like (sensibilitate la
mentol si icilina si absenta inhibitieie la ruthenium red RuR).
In studiu se observa actiunea camforului pe TRPM8 recombinat om-sobolan-pui (cTRPM8) precum si pe
TRPM8 pe DRG de sobolan utilizand imagistica de calciu prin tehnica patch-clamp (whole-cell/perforated).
Actiunea pe TRPV1 pe DRG neuroni de sobolan s-a observat prin actiunea diferita RuR pe TRPV1 si
TRPM8; RuR blocheaza si TRPV3 care lipseste la rozatoare.
cTRPM8 a fost cercetat in relatie cu camforul pe considerentul ca TRPV1 de pui este camfor insensibil si
permite observarea activarii sensibilitatii intre diferite canale ionice TRP.
Materiale si metode:
Expresia canalului ionic heterolog
hTRPM8 este exprimat in celulele HEK293. Prin calciu precipitare pe celule HEK293T s-au observat: la
sobolan rTRPV1; inauntru pcDNA3; cTRPM8 inauntru pcDNA3-Sfi2 si hTRPM8 D802A inauntru p1RES-
EGFP. Experimentele pe rTRPV1 au folosit celule HEK293 care explimau cert rTRPV1. Dupa procesul de
transfectare, celule au fost puse in cutiii Petri de 35mm sau sticla borosilicata coverslips de 24mm 0,17mm
grosime care au fost tratate cu poly-D-lisina concentratie 0,1mg/dL 30 min. Celulele au fost lucrate in 1-2
zile.
Clonarea cTRPM8
cTRPM8 a fost clonat de la pui Gallus domesticus de 2-4 zile. S-au folosit aparate Clonetech, Promega,
Turbo Pfu – stratagene, Agilent Technologies , enzime. Primerii pentru PCR au fost obtinuti de la pui Gallus
gallus; enzimele pentru situsurile Sfi 1 au fost adaugate mai tarziu. Dupa amplificare, rezultatul dupa PCR a
fost taiat si legat la un vector modificat din pcDNA3 (invitrogen) prin inlocuirea mai multor situsuri clonate
cu cele care contin Sfi 1.
Cultura DRG de sobolan
Cultura (DRG nivel T12-S1) a fost obtinuta de la sobolani/soareci Wistar masculi adulti (150-200g) prin
expunere la CO2 2 minute, apoi decapitare (cu acordul Comisiei de Etica a Universitatii Bucuresti). DRG
recoltat a fost incubat in mixtura de colagenaza tip XI 2mg/mL cu dispaza 2,5mg/mL (Bacillus polymyxa-
invitrogen) pentru 1 ora la 37 grd, in solutie IncMix (155 mM NaCl, 1.5mM K2HPO4, 5.6mM 4-(2-
hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid [HEPES], 4.8 mM Na-HEPES, 5 mM glucose, adjusted to
pH 7.4 with NaOH). Dupa triturare suspensia a fost strecurata printr-o mesa de nylon cu pori de 35µm
(N35S Biodesign Inc.), celulele disociate au fost plasate pe sticla coverslips si cultivate pe mediu -
Dulbecco’s modifed Eagle medium/Ham’s F12 medium (1:1) supplemented with 10% horse serum and
gentamicin (50 μg/mL) prin Sigma.
Ca2+ microfluorimetrie
Celulele HEK293 si neuronii DRG de pe coverslips de 24mm au fost incubati in solutie standard
extracelulara ce contine 2 μM Calcium Green-1 AM and 0.02% Pluronic F-127 (amandoua Invitrogen) si
lasate la recuperare inca 30 min pana la inregistrare. Pentru inregistrare s-a folosit Axon Imaging
Workbench 2.2 (Molecular Devices). Dupa scaderea de fond, datele imagisticii de Ca au fost reprezentate
grafic ca referite ± in deviatie standard. Datele au fost cuantificate prin software ΔF/F0 (amplitudinea) pentru
fiecare celula observata, raportul dintre fluorescenta maxima care se schimba in timpul stimularii si
florescenta bazala inainte de stimul. Pentru neuroni DRG ΔF/F0 a fost setat la 10% arbitrat ca sa identifice
neuronii care raspund la stimul. Aria situata sub curba (AUC) calculeaza inceputul raspunsului pana la
semnalul recuperat la baseline sau daca baseline-ul nu a fost atins, pana la aplicarea stimulului urmator.
Electrofiziologie
Curentii din patch-clamp whole-cell au fost amplificati prin WPC-100 patch clamp amplifier (ESF
Electronic), filtrati la 3kHz si digitalizati la 5-25kHz prin Axon Instruments DigiData 1322A interface
driven by pCLAMP 8 (Molecular Devices). Solutia extracelulara continea (in mM) 140 NaCl, 4 KCl, 2
CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, 4.54 NaOH, and 5 glucose (pH 7.4 at 25 °C [NaOH]). Solutia intracelulara
pentru whole-cell patch-clamp pe celule HEK293 si neuroni DRG continea (in mM) 140 KCl, 0.05 CaCl2, 1
MgATP, 0.1 EGTA, and 10 HEPES (pH 7.2 at 25 °C [KOH]). Pentru patch-clamp perforated pe celule
HEK293 s-a folosit amfotericina B si solutii basate pe gluconat de K continand (in mM): 100 K-gluconate,
40 KCl, 8 NaCl, 1 MgCl2, and 10 HEPES (pH 7.2 at 25 °C [NaOH]). Pentru cresterea solubilitatii
amfotericinei B, solutia pipetata a fost preparata conform tehnicii descrise de Yawo and Chuhma.
Amfotericina B 5mg si sarea disodica de fluoresceina 20mg au fost amestecate cu 2mL metanol. Dupa
amestecare riguroasa si agitare 100µL din mixtura a fost pus pe fundul tubului test de polietilena de 2mL.
Volumul a fost vaporizat complet sub vapori de gaz CO2 si apoi 1mL de solutie de baza Gluconat de K
(20µm filtrati) s-au adaugat. Solutia rezultata continand 250 μg/mL amphotericin B si 1mg/mL fluoresceina
nu a mai fost filtrata. Toate s-au desfasutat pe intensitate luminoasa mica. Capilarele borosilicate cu filament
(GC150F-10; Harvard Apparatus) au fost trase folosind un puller de micropitete vertical (PUL-100; World
Precision Instruments), varf slefuit pentru rezistente de 2-5 MΩ si umplute cu solutia mai-sus-mentionata.
Presiunea pozitiva a fost aplicata pipetei in timp ce cursul solutiei extracelulare din directia opusa
corespunzatoare efluxului din pipeta de patch-clamp. Utilizarea de celule HEK293 cu etansare-giga a fost
obtinuta natural si prin perforare graduala; capacitanta membranara si rezistenta la penetranta s-a stabilizat
dupa 3-5 minute.
Controlul temperaturii
In timpul Ca2+ microfluorimetriei temperatura la nivelul baii a fost controlata computerizat prin Peltier-
driven perfusion system imbunatatit. Care are 2 elemente peltier mari (30x15mm) cotate la 20.9W fiecare
(Eureca Meβtechnik), cu rata rapida de schimb pentru un transfer rapid de concentratii de la stimuli chimici
la celule.(Esential pentru raspunsul la camfor). Pe scurt, camera descrisa anterior, facuta din coverslips de
sticla au fost inlocuite cu un ecartament de 18 tuburi de otel inoxidabil, reduce volumul de racire al solutiei
de la 150 la <100µL, un colector miniatural a fost folosit (MM-6; Harvard Apparatus) si toate celelate
volume moarte au fost scoase, acolo unde rata de curgere a fost mentinuta starns la valoare optima de
1,5mL/min. Temperatura a fost masurata in timpul inregistrarilor in imediata apropiere a campului de celule
de vizualizat, folosind thermocouple type T (IT-1 E; Physitemp). Experimentele s-au desfasurat la
temperatura de 25 grd. In timpul patch-clamp temperatura in camera de inregistrare a fost la 25 grd folosind
micro-incubator Peltier driven (PDMI-2 controlled by TC-202A; Harvard Apparatus).
Analiza datelor
Toate datele au fost trecute prin OriginPro 8.0 (OriginLab). Compararea datelor raspunsurilor celulare s-au
facut prin corelarea t-test Student sau t-test de raport. Rezultatele sunt prezentate ca referit ± SD. Forma
clasica a ecuatiei Hill a fost folosita la integrarea ΔF/F0 pe concetratia de camfor.
Solutii si chimicale
Solutiile stoc au fost realizate fie in dimethyl sulfoxide (camphor, icilin, 2-aminoethyl diphenylborinate [2-
APB], 4-(3-chloro-2-pyridinyl)-N-[4-(1,1-dimethylethyl)phenyl]- 1-piperazinecarboxamide [BCTC], si allyl
isothiocyanate [AITC]), ethanol (menthol and capsaicin) sau H2O (RuR). Solutia stoc de camfor (2M) a fost
efectuata prin inlocuirea volumetrica a 20% camfor. Solutiile de lucru de 0.5-10mM au fost agitate viguros
la 37 grd pentru 15 min. Solutia extracelulara standard a fost corectata prin vehiculare (dimethyl sulfoxide
and ethanol).
Toate chimicalele sunt de la Sigma-Aldrich, cu exceptia icilinei si BCTC de la Tocris Bioscience. Mentolul
utilizat este (1R,2S,5R)-(−)-menthol si camforul (1R)-(+)-camphor.
Rezultate:
Camphor activates hTRPM8 in a concentration- and temperature-dependent manner
Efectul camforului pe hTRPM8 a fost examinat pe linia celulara HEK293 stabila ce exprima hTRPM8.
Inainte de inregistrare celulele au fost lasate sa se revigoreze in perfuzie de solutie extracelulara la 25 grd.
Celulele netransfectate HEK293T au prezentat fie nici o variatie sau una usoara in descresterea concentratiei
de Ca intracelular in timpul aplicarii de camfor (2–10 mM, 30s–2-min duration; data not shown). La celulele
hTRPM8-HEK293 tinute la 25 °C concentratii crescande de camfor (0.5, 1, 2, and 10 mM, 30 s fiecare)
arata nivele crescute tranzitoriu de [Ca2+]i ce semnifica ΔF/F0 ± SD cu valori de 0.03 ±0.06, 0.06 ±0.03,
0.16±0.08, si respectiv 0.47 ±0.14 , (n = 59; Figure 1A). La 2 si 10mM, raspunsurile la camfor au fost rapide
si temporare, desensibilizate la sfarsitul celor 30-s de perfuzie a camforului. Integrarea rzultatelor in ecuatia
Hill, rezultatul EC50 pentru hTRPM8 activat de camfor a fost de 4.48mM si coeficientul Hill a fost 1.38
(Figure 1B). Menthol (100µM, 30s) s-a aplicat la sfarsitul inregistrarii ca sa confirme exprimarea hTRPM8.
Curentii culesi pe whole-cell la o concentratie de 10mM camfor in celule hTRPM8-HEK293 a fost
inregistrat pe mod voltaj-clamp (la potential de -80mV). Densitatea curentului a avut variatie mare (raza -3.2
la -109.8 pA/pF; mediana -7,9 pA/pF si o medie -18.8±30.5 pA/pF; n=12). Camforul (10nM) s-a aplicat la
25grd pentru 10s, de 2-3 ori la interval de 2 minute. Curentii mai mari au fost temporari si au urmat o
marcare desensibilizanta (not shown), acolo unde curentii mai mici dati de camfor erau mentinuti (Figure 1C
inset). Inregistrarile curent-voltaj in timpul rampelor de voltaj (-100 la +80mV si inapoi la -100mV timp de
3.4s) au fost realizate pe parcursul duratei curentilor de mica intensitate (Figure 1C). Scoaterea intrapipetei
de Ca si neutralizarii cu 2mM de EGTA nu a afectat amplitudinea curentilor (not shown). Aparenta
discrepanta a amplitudiniilor si tachifilaxiei a raspunsurilor evocate ale camforului dintre imagistica de Ca si
inregistrarile patch-clamp whole-cell cu intricarea factorului intracelular, am realizat perforated patch-clamp
pe celule hTRPM8-HEK293. Aceste experimente au aratat o intrare mai mare de curenti la potential de -
80mV cu o mica variatie (raza -19.9 la -85.7 pA/pF; mediana -37.0 pA/pF si o medie -47.3±27.2pA/pF;
n=8). Curentul a fost temporar si tachiofilaxia a fost similara rezultatelor din imagistica cu Ca (Figure 1D).
Temperatura prin activarea evocata a camforului a hTRPM8 recombinat – temperatura solutiei extracelular a
fost schimbata de la 32rgd la 25 grd, care a rezultat in cresterea Ca in toate celulele. (Figure 2A).
La 32 grd, raspunsul la camfor (10mM) a fost foarte scazut si incet cu o medie de ΔF/F0 la 0.03±0.04 (n=54)
la sfarsitul primului minut de aplicare; in contrast raspunsul la 25 grd a fost rapid si temporar cu o medie
ΔF/F0 la 0.24±0.06 (n=54; Figure 2A right). Perfuzia de 1 minut a aratat raspunsul temporar la camfor in
comparatie cu concentratia de Ca++ creata de mentol, reprezentate prin diferenta duratelor la jumatatea
latimii si media UAC al raspunsului celor 2 compusi (14.7±6.4s/323.6±251.3 unitate relativa pentru semnal
de fluorescenta (AUS) la camfor si 70.3±4.9 s/1567.1±556.2 AUS pentru mentol; p<0.001, n=54).
Acelasi experiment a fost facut pe celule HEK293T temporar transfectate cu TRPM8 de sobolan –rTRPM8;
Figure 2B). Aplicarea camforului (10mM) la 32grd a dus la o reducere a fluorescentei unor celule, acolo
unde la 25 grd camforul evoca trasee rapide de Ca++ cu o medie ΔF/F0 de 0.19±0.01 (n=50).
Efectul sensibilizant al camforului la activarea la rece a hTRPM8 a fost studiata prin aplicarea compusului in
timpul succesiunii rampelor de racire domoale (de la 33 la 27 grd in cca 44s). Camfor (5 mM) a fost aplicat
inainte, in timpul si dupa a 4 a rampa de temperatura din serie si de asemena in portiunea descendenta a
rampei 5 de temperatura (Figure 2C). Nivelul basal de temperatura de 33 °C, camforul nu a reactionat
singur. La jumatea latimii duratei induse de rece cresterea in [Ca2+]i a fost inflentata de marirea data de
camfor (de la 26.4 ± 23.9 s pentru a 3a rampa tla 138.9±83.5 s pentru a 4a rampa; P < 0.001, n = 51). AUC a
crescut (Figure 2D) de la 286.4± 204.1 a.u.s pentru a 3a rampa la 2220.2± 1175.1 a.u.s pentru a 4a (n = 51, P
< 0.001), acolo unde media ΔF/F0 crescuta de la 0.27±0.16 la 0.48±0.22 (n = 51, P < 0.001). Camforul a
desensibilizat raspunsurile la rampele de racire in serie (6a si 7a). Pentru a arata originea temporarelor
[Ca2+]i, am schimbat perfuzia la o solutie de calciu liber extracelular nominal. Scoaterea ionilor de Ca
externi a inhibat cresterea [Ca2+]i evocata de camfor si mentol la 96.3 ± 8.0% (n = 114) si respectiv 54.3 ±
28.9% (n = 114), (Figure 3A). Contrar mentolului, camforul nu declanseaza eliberarea de Calciu din
reticulul endoplasmic.
TRPM8 antagonists block hTRPM8 activation by camphor
Am testat efectul inhibitor al TRPM8 si TRPV1 agonist BCTC asupra activarii hTRPM8 de camfor. Cand
BCTC (5µM) a fost aplicat pana si dupa punerea 5mM de camfor este blocat reversibil si complet raspunsul
camforului la 25 grd. (94±20.9%, n=109) (Figure 3B). Am testat efectul @-APB, un agonist ale altor 2
canale ionice activate de camfor (TRPV1 si TRPV3) si cunoscut inhibitor TRPM8. 2-APB (150µM) a blocat
complet (93.8±7.3%, n=77) si reversibil trecerea [Ca2+]i la 5mM camfor in celule hTRPM8-HEK293 la
25grd. Acesti 2 antagonisti (BCTC si 2-APB) au dat o descrestere a fluorescentei la 25grd ce sustine o
activare a hTRPM8 la aceasta temperatura. De altfel BCTC (1µM) pare sa inhibe complet si permanent
activarea TRPV1 de camfor (10mM), nu ca in cazul TRPV1 agonistilor competitivi (Figure S1).
Camphor modulates differently the TRPM8 responses to its agonists menthol and icilin
Am cercetat efectul camforului pe activarea hTRPM8 prin metol si icilina utililizand microflurometria.
Concentratia de mentol (5µM) si icilina (0.1µM) au fost estimate pe baza valorilor EC50 din inregistrarile
imagisticii de calciu pe expresia hTRPM8 din celule HEK293 si similare altor cercatari. La co-aplicarea de
camfor (5mM) a inhibat puternic si sustinut (cca 62%) raspunsul la mentol (5µM) (Figura 4A) de la
0.36±0.15 la 0.14±0.09 (ΔF/F0; n=77, P<0.001, Figure 4D). Inhibitia a fost testata si confirmata atat la
concentratii mari mentol (10-50µM) si scazute de camfor (1-2mM; data not shown).
Inhibitia a fost notata si prin whole-cell patch clamp pe hTRPM8-HEK293 inregistrata la potentiale
constante de -60mV si +80mV (Figure 4B) si tot la rampe de voltaj de +100mV peste 400ms (Figure 4C).
Cmaforul (5mM) a inhibat in medie cca 68% a platoului de curent de intrare legat de mentol (100µM)
la -60mV, unde la +80mV media platoului de curent de iesire inhibitia a fost de 85% si reversibila. (Figure
4D). Normalizarea curentilor inainte si dupa co-aplicarea camforului au fost 0.32±0.20 si 1.74±0.63,
P<0.001, n=7; la -60mV, unde la +80mV valorile au fost 0.15±0.17 si 1.17±0.09, P<0.001, n=7.
Raspunsul hTRPM8-HEK293 la camfor (2mM) prin aplicare icilina (0.1µM, 20s) a lipsit, indicand o
tachifilaxie intersectata intensa si sustinuta. Dupa secunda aplicare de icilina prelungita, dupa acuta
desensibilizare (la 2.2% a amplitudinii de raspuns a icilinei), co-aplicarea de camfor (2mM) a dat o crestere
a [Ca2+]i, revenindu-si la o stare de 118% fata de prima aplicare de icilina (ΔF/F0 = 0.33±0.13, comparat cu
0.297±0.096, pentru icilina; a 2a aplicare, n=66, Figure 5A). Potentarea icilinei trecerii [Ca2+]i a fost prin
aplicarea multipla de camfor (data not shown).
Varful curentilor whole-cell sub camfor (10mM) si icilina (2µM) inregsitrati la hTRPM8-HEK293 la
voltage-clamp (-80mV) a fost amplificat cand cei 2 compusi au fost adaugati impreuna, notand o potentare
de supraexprimare mutuala (Figure 5B). Densitatile varfului curentului au fost -6.6±3.0pA/pF numai pentru
camfor, -25.0±20.8 pA/pF numai pentru icilina si -119.2±19.8 pA/pF pentru camfor cu icilina (n = 4, P <
0.01). Potentarea camforului pentru legat de curentii de intrare dati de icilina au scazut in acest tip de
experimente (Figure 5B). Potentarea data de camfor pe curent de icilina in conditii de Ca++ liber extra- si
intracelular (inlocuirea Ca cu 2mM EGTA extracelular si 5mM intracelular), la co- aplicarea icilin si camfor
nu s-au inregistrat curenti (data not shown).
Camphor activates native rTRPM8
Toate experimentele pe DRG de sobolan/soarece s-au facut pe neuroni cu diametru mic (filtrati prin sita de
celule 35µm) in prezenta RuR (10µM) pentru a bloca alte canale ionice cunoscute activate de camfor
(TRPV1 și TRPV3) sau prin icilin (TRPA1, deși este activată considerabil la concentrație mai mare de
icilina decat cea utilizata aici [Story et al. 2003]).
Am arătat deja că canalele rTRPM8 recombinate sunt activate de camfor (10mM) la 25 °C (figura 2B).
RuR (10 μM) nu inhiba camforului (5mM) activarea rTRPM8 (Suplimentare Figura S2), întrucât a blocat în
întregime răspunsul rTRPV1 la camfor, cum a fost descris anterior (data not shown; Xu et al. 2005).
Eficacitatea blocarii date de RuR asupra TRPV1 și TRPA1 a fost testat prin aplicarea cu capsaicina (2 µM,
30 s) la 32 °C și AITC (100 µM, 1-2 min) la 32 sau 25 °C: numai 9.0% (15/166) din totalul populatiei
neuronale tratate cu RuR a fost activată de capsaicina comparativ cu 51.9% (80/154) a grupului control (P
0,001, Fisher’s Exact test, lot 2). În mod similar, numai 6.0% (10/166) din neuronii tratati RuR au răspuns la
100 µM AITC în comparație cu 21.4% in conditiile de control (P 0,001). Mai mult, raspunsul mediu al
amplitudinii (ΔF/F0) la AITC fost puternic reduse, 0,15 ± 0,013 până pentru grup RuR tratat comparativ cu
0,38 ± 0,04 pentru control (P 0,001, unpaired Student t-test).
În prezența RuR, capsaicina s-a activat numai 1 din 26 neuroni sensibili la camfor și AITC a activat 4 de 39
neuroni sensibili la icilina. Efectele camforului (10 mM) și icilin (2 μM) au fost înregistrate la 25 °C (Figura
6A și B). Din numărul total de neuroni înregistrati, 15,6% (26/166) au fost activati de camfor și 23,5%
(39/166) au fost activati de icilina (Figura 6C). Neuroni camfor- și icilin sensibili au reprezentat 69.23%
(18/26) din grupul camfor-sensibil și 46.15% (18/39) a grup icilin sensibil. Răspunsurile evocat de camfor-
au fost rapid și trecătoare, similare cu cele mediate de TRPM8recombinat.
O etapa blanda de răcire (de la 32 la 25 °C) a fost de asemenea folosita pentru a identifica neuroni sensibili
la rece cu activare la temperatură înaltă (Prag scăzut). Am descoperit că 42,3% (11/26) din neuroni camfor-
sensibili, 28,2% (11/39) din neuroni icilin-sensibili, și 81.8% (9/11) din neuroni camfor- și icilin sensibili au
fost de asemenea activati de etapa de răcire (Figura 6C). În total, 20 neuroni au fost considerati sensibili la
rece, din care 45% (9/20) au fost la camfor și icilina, 1 neuron a fost icilin-sensibil, și 1 neuron camfor-
sensibil. Restul de 9 neuroni nu au fost activate de camfor sau icilina. În total, aceasta indică o puternica co-
expresie la rece, sensibilitatea la camfor și icilina în populația tratate cu RuR pe neuroni de dimensiuni mici
DRG.
În alt set de experimente cu ajutorul RuR, neuronii DRG au fost expuse la icilin (2 µM) pentru 1min și
ulterior la camfor (10 mM) 30-s prin co-aplicare. Cele mai multe răspunsuri la neuroni DRG tratati cu
icilina afișeaza desensibilizare ferma.
Co-aplicarea de icilina și camfor a evocat trecerea [Ca2+]i în toti cei 26 neuroni sensibili la icilin
înregistrati, cu amplitudine medie de recuperare la 99.4±20.08% cu amplitudine inițiala de răspuns la
icilina, comparativ cu 61.0 ± 22.08% cu aceeasi amplitudine inițială în timpul starii de desensibilizare (n =
26, P<0,001; figura 7B și C dreapta), similar cu efectul observată cu hTRPM8 recombinat.
Am investigat ulterior acest efect pe DRG neuroni de sobolan cu convenționalul whole-cell patch clamp pe
neuroni sensibili la rece preselectati cu ajutorul imagisticii de calciu. O rampă de răcire de la ~ 34 la ~ 18 °C
în cca. 42 s a fost folosita ca un stimul pentru identificarea neuronilor sensibili la rece (Figura 7A stânga).
RuR (10 μm) a fost prezent în soluția extracelulara pe intreaga durata a înregistrărilor patch clamp, efectuată
la 25 °C. În perioada inițială de 1-min de expunere la icilin (2 µM), numai 3 din 6 neuroni înregistrati au
prezentat un influx rapid de curent de potential la -80 mV (densitatea medie de curent -13,6 ± 11.0 pA/pF) și
a notat urmarea unei desensibilizari acute. Toti 6 neuroni sensibili la rece afișeaza o desensibilizare mare la
influx rapid de curent atunci când camforul (10 mM) și icilina erau co-aplicate (Figura 7A dreapta, urme de
curent de la 5 din 6 neuroni înregistrati), cu o medie a densitatii curentului semnificatv mai mare comparativ
cu cea înregistrată în starea de icilin-desensibilizare, respectiv -33.7 ± 25.0 și 4.3 ± 8,5 pA/pF (P 0,05, n = 6;
Figura 7C dreapta). Repetarea co-aplicarii după alte 30 s - 1 min prin expunerea la icilin a dezvoltat un
curent mai mic și mai susținut (Figura 7A dreapta).
La 1 neuron, am înregistrat un curent de intensitate mica atunci când camforul a fost aplicat singur (data not
shown), in acord cu amplitudinea mica înregistrata de curenti dezvoltat de camfor folosind modul whole-cell
conventional cu aceeași soluție intracelulară în celulele HEK293 care exprima hTRPM8 (Figura 1C inset).
Camphor does not activate cTRPM8: relation between camphor and icilin sensitivity
cTRPM8 este cunoscut a fi sensibile la mentol și insensibil la icilina (Chuang et al. 2004). Camforul (5 mM)
nu evoca o creștere a [Ca+]i în celulele care exprima cTRPM HEK293T8 la 25 °C, dar totuși afișeaza
efectul inhibitor pe trecerea calciului evocat de mentol (Figura 8A): inhibarea medie exercitată de 5mM de
camfor prin răspuns susținut al cTRPM8 la 100 μM de mentolul a fost 46.3± 26,9% (n = 12, p 0,01). În
experimentele constând din 3 aplicari de mentol succesive (100 µM) cu o a doua în prezența camforului
(10mM; Supplementary Figure S3), media de inhibare atinsă este 71,8 ±14,9% (n = 28, P 0,001).
Structural legate de camfor, componenta eucaliptol, care este un agonist rTRPM8 (McKemy et al. 2002), de
asemenea a eșuat sa activeze cTRPM8 la 25 °C atunci când este testată la 2-5mM (figura 8B). Eucaliptol (2
mM) inhiba răspunsul susținut de cTRPM8 la 100 µM de mentol (49.6 ±25,3% inhibare medie; n = 24,
P<0,001). De asemenea, am constatat ca desi eucaliptolul activeaza rTRPM8 și hTRPM8, acesta poate
inhiba răspunsul la mentolul ale acestor homologi (Supplementary Figure S4; data not shown), similar cu
efectele camforului pe TRPM8.
Relatia sensibilității dintre icilina și camfor în hTRPM8 a fost cercetata cu ajutorul unui mutant insensibil la
icilina - D802A (Chuang et al. 2004). Răspunsul la camfor (10mM) a fost prezent la 25 °C ca în cazul
canalului wild-type (Figura 8C). Cum era de asteptat, mutantul D802A nu a fost activat de icilina (10 µM).
Discutii:
În acest studiu, vom descrie activarea hTRPM8 și rTRPM8 de camfor. Desi experimentele noastre au fost
efectuate la 25 °C, temperatura la care TRPM8 recombinat a fost activ, camforul a evocat o mare și creșterea
trecerii [Ca2+]i cu un CE50 la 4.5mM.
Trecerea [Ca2+]i crește în timpul expunerii agonistului TRPM8 au fost raportate în trecut pentru linalool,
geraniol, hidroxicitronellal, și eucaliptol când a fost testat pe celule HEK293 transfectate cu TRPM8 de
soarece (Behrendt et al. 2004).
Așa cum este de așteptat pentru un activator TRPM8, actiunea camforului a depins de temperatură și a
potențat creșterea [Ca2+]i în timpul răcirii. În timpul stimulării repetate la rece, amplitudinea răspunsurilor
la rece în urma tratarii cu camfor au fost atenuate, probabil o consecinta a influxului mare de Ca2+, cunoscut
a induce desensibilizarea TRPM8 mediate de către PLC prin hidroliza PIP2 (Yudin et al. 2011).
Deja raportate proprietatile farmacologice comune ale TRPM8 și TRPV1 (Weil et al. 2005) pot fi acum
extinse. Având camforul ca agonist comun in acelasi nivel de concentratie, vom demonstra că TRPM8 și
TRPV1 împartășesc BCTC ca antagonist în raport cu camforul.
Acțiunea sinergică a capsaicinei si camfor pe TRPV1 (ax XU et al. 2005; Marsakova et al. 2012) este
comparabila cu acțiunea dată de icilină și camfor pe TRPM8. Este cunoscut ca urme importante pentru
mecanismul capsaicina și icilina fata de TRPV1 și TRPM8, respectiv, sunt amplasate în pozițiile analogică
pe indicatorul prezumtiv S2-S3 (Chuang et al. 2004). Ne indica de asemenea că cTRPM8 insensibil la icilina
- homolog este insensibil la camfor, similar cu omologul său TRPV1 (Chuang et al. 2004). Aceasta poate
sugera că icilina și camforul au în comun un domeniu de activare important pentru TRPM8. Prin
experimente pe un mutant al hTRPM icilinin-sensibil (D802A), am arătat că sensibilitatea icilinei nu este
necesara pentru sensibilitatea TRPM8 la camfor.
Bine-cunoscutul eucaliptol agonist TRPM la mamifere (McKemy et al. 2002), care este structural legat de
camfor, de asemenea a eșuat sa activeze cTRPM8 și, în mod similar camforului, a inhibat trecerea [Ca2+]i
indusă de mentol în cTRPM8, rTRPM8, și hTRPM8 exprimate în celulele HEK293.
Luate împreună, rezultatele noastre arată că camforul are o acțiune bimodală, fiind nu numai un inhibitor al
răspunsurilor TRPM8 evocat de mentol ci și un activator TRPM mamifer, aparent independent de normele
de la mentol și icilină. Camforul si mentolul sunt monoterpene, întrucât camforul și eucaliptolul sunt
biciclice și mentolul este monociclic. Această diferență poate explica actiunile diferite date de aceste 2 clase
de compusi pe TRPM8, si anume intervalele de concentrație eficientă și posibil diferite mecanisme de
activare. În contrast cu efectul sinergic al icilinei și camforului vom descrie, absența semnalată a unui astfel
de efect de la icilină și mentol (Kühn et al. 2009), cu accepțiunea ipotezei unui alt mod de acțiune al
camforului si mentolului pe TRPM8.
Noi am putut înregistra curenți whole-cell (desi afișează o variație mare) dezvoltați de 10 mM de camfor la
~25 °C la hTRPM8-care exprima celulele HEK293, spre deosebire de studii anterioare (McKemy et al.
2002; Xu et al. 2005; Macpherson et al. 2006). Acest lucru poate fi datorat în parte unei metode de pipetare
a soluției diferită și de viteza de schimb în soluție.
Când au înregistrat curenți cu ajutorul metodei perforated patch clamp, curenții erau mai mari, aveau o
variație mai mică, și afișau tahifilaxie redusă, similar cu rezultatele obtinute cu ajutorul imagisticii de Ca2+.
Aceasta sugerează că un factor citozolic este esențial pentru activarea TRPM8 prin camfor.
Deși natura acestui factor rămâne pentru moment necunoscută, posibili candidați sunt enzime citozolice ca
PLA 2 (Andersson et al. 2007) sau dependența de spectru citozolic restrâns de Ca2+. Naturii trecerii a
creșterii [Ca2+]i și al unui mare volum de curenți whole-cell evocat de camfor este probabil să fie
calmodulin dependenți (Sarria et al. 2011). Alte studii despre mutanti mentol- și rece-insensibili va fi de
asemenea necesară pentru a furniza mai multe informații referitoare la factorii determinanti moleculari și a
mecanismelor implicate în „gating-ul” TRPM8 dat de camfor si eucaliptol. Incapacitatea camforului de a
induce eliberarea Ca2+ din reticulul endoplasmic în condiții de Ca2+ liber, sugerează că camforul nu
interacționează cu TRPM8 într- o maniera de activare a proteinelor Gq, cel puțin în absența lichidului
extracelular de Ca2+. Studiul recent ce discută despre aceste efecte (Klasen et al. 2012) nu este mentionează
activarea Gq ca fiind indusă de icilină ca agonist TRPM8 dependentă de calciu.
Sensibilitatea la camfor în culturi DRG neuroni de șobolan înregistrată în prezență continuă de RuR a fost
cea mai mare într-o sub-populație de neuroni moderată (25 °C) sensibilă la rece și la icilină, 81% din care a
răspuns la camfor. Acesta sugerează că camforul activează TRPM8 nativ. Neuronii sensibili la camfor din
experimentele noastre sunt susceptibile de a fi aceia sensibili la stimuli TRPM8-like. Deși proporția de
neuroni ce răspund la rece a fost scăzută chiar și în comparație cu populația sensibilă la icilină, acest fapt
poate fi explicat prin stimulul relativ blând de răcire utilizat în acest studiu. Răspunsurile la rece a neuroni
icilin-insensibili pot fi mediate de către un alt receptor. Ar mai trebui remarcat că icilina și camforul afișează
în neuroni aceeași acțiune sinergică observată în experimentele pe TRPM8 recombinat.
Aceste rezultate arată că camforul poate activa TRPM8 într-o gama fiziologică de concentrații relevante,
mai mici aplicate decât cele disponibile de obicei în preparate topice.
Mai mult, potențarea sensibilității hTRPM8 la rece a camforului poate explica rezultatele experimentale pe
subiecți umani (Vizuina et al. 1983; Verde 1990).
Trecerea camforului prin activarea TRPM8 observat în studiul nostru, procedura lentă de răcire imaginată de
Green (1990), și utilizarea de etanol (80%) ca vehiculul ar putea explica de mica îmbunătățire a senzației de
rece raportate de subiecți. Etanolul este cunoscut că inhibă TRPM8 prin limitarea interacțiunii PIP2-TRPM8
(Benedikt et al. 2007).
Potențarea camforului a senzatiei de rece care "arde" evocat a fost raportată de către Green (1990) ar putea fi
explicată de activarea fibrelor tip 2 C mediate prin TRPM8 sensibile la rece și mentol, care evoca senzații ca
"arderea/ înțepătură" (Campero et al. 2009) și acceptat de dovezi imunohistochimice suplimentare pentru
fibre C pozitiv-TRPM8 (Kobayashi et al. 2005). În mare parte camforul indus de creștere relativă pentru
senzația rece care "arde" este indicată de Green (1990) la 27 °C, aproape de TRPM8 și pragul de
temperatură de bază folosite în experimentele noastre. În alt studiu, se raportează senzația de rece la nivelul
mucoasei nazală și senzația prin flux nazal crescut după inhalarea vaporilor de camfor, eucalipt, sau mentol
(Vizuina et al. 1983); camforul a fost raportat de către un număr mai mare de subiecte a evoca rece și crește
fluxul de senzații comparativ cu uleiul de eucalipt. Mult mai susținute sunt dovezile psihofizice ale Burrow
et al. (1983) care reflectă probabil timpul de acces mai scurt la terminalele nervoase ale camforului în
mucoasa nazală după inhalare, comparativ cu impregnare în piele a vaporilor de camfor.
Ca un posibilă aplicabilitate a descoperirilor noastre, camforul nu pare a fi un adjuvant adecvat în
preparatele care conțin mentolul direcționat către activarea TRPM8, întrucât pot fi eficiente ca un potențiator
TRPM8 în soluții care conțin icilină.
Material suplimentar
Material suplimentar poate fi găsit la http://www.chemse.oxfordjournals.org/
Finanțare
Această lucrare a fost sprijinită de Fondul Social European [POSDRU 107/1.5/S/80765 la T.S.],
Consiliului Cercetării Român (CNCS) [PCE 117/2011 la C.D., A.C.C., și A.B.], și de Fundatie pentru știință
Irlanda [BIM085 la G.R.].
Multumiri
Autorii mulțumesc lui Cristian Neacșu și Liviu Soltuzu pentru dezvoltarea software-ului pentru extragerea și
analizarea datelor de imagistică de calciu.

You might also like