You are on page 1of 27

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang
Mikroorganisme halofilik merupakan mikroorganisme yang tahan terhadap
kadar garam tinggi (Kanlayakrit dan Bovornreungroj, 2002; Oren, 2003; Falb,
2005; Kushner, 1985) Bakteri halofilik dapat ditemukan dalam bittern yaitu
pekatan sisa dalam proses pembuatan garam Madura merupakan salah satu sentra
industri garam yang cukup besar di Indonesia Garam dapat dibuat dengan cara
menampung air laut pada saat pasang ke dalam tambak garam yang selanjutnya
dilakukan pemekatan dengan cara diuapkan sehingga akan diperoleh kristal garam
Para petani garam biasanya hanya mengambil kristal garam (NaCl) untuk
dipasarkan sedangkan air sisa hasil pemekatan (bittern) belum dimanfaatkan,
padahal didalamnya banyak terkandung berbagai macam mineral dan berbagai
jenis mikroorganisme seperti bakteri halofilik (Dodia et al, 2006)
Enzim bakteri halofil dapat bertahan pada lingkungan dengan kadar garam
tinggi Hal ini dikarenakan sebagian besar asam amino yang menyusun protein
dalam sel bakteri halofil merupakan asam amino yang bersifat asam, yaitu asam
amino yang memiliki rantai samping gugus asam karboksilat (COOH), misalnya
asam glutamat dan asam aspartat (Edwards, 1990) Penambahan NaCl akan
menstabilkan konformasi protease dengan menetralkan muatan-muatan negatif
(COO-) sehingga aktivitas protease halofil meningkat dengan penambahan NaCl
(Oren, 2003; Edwards, 1990)
Aktivitas protease dipengaruhi oleh beberapa faktor salah satunya adalah pH
Protease memiliki pH optimum yaitu pH dimana aktivitas protease paling tinggi
dalam mengkatalisis reaksi hidrolisis protein menjadi oligopeptida dan asam-asam
amino penyusunnya Perubahan pH dari nilai optimum akan menyebabkan
terjadinya protonasi dan deprotonasi sehingga akan berpengaruh pada sisi aktif
protease dalam membentuk komplek enzim substrat, hal ini akan mempengaruhi
aktivitas protease (Poedjiadi, 1994; Suhartono, 1989)

1.2 Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah :
1. Memperoleh enzim protease dari bakteri halofilik
2. Mendapatkan pH optimum protease halofil
3. Menentukan Pengaruh penambahan NaCl terhadap aktivitas protease halofil
pada berbagai pH

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Mikroorganisme
Mikroorganisme atau mikroba adalah organisme yang berukuran mikro
(10 m atau 10-3 mm) Berdasarkan bentuk selnya, mikroorganisme dibagi menjadi
-6

dua yaitu mikoorganisme eukariotik dan prokariotik Mikroorganisme eukariotik,
diantaranya adalah fungi, khamir, jamur dan protozoa, sedangkan yang tergolong
mikroorganisme prokariotik diantaranya adalah bakteri, sianobakteri, dan virus
Mikroorganisme di gambarkan dengan sel tunggal atau unisel Beberapa jenis
mikroorganisme prokariotik unisel dapat terlihat oleh mata, dan beberapa jenis
multisel tidak dapat terlihat oleh mata (Todar, 2004)

2.2 Tinjauan Umum Bakteri
Bakteri berasal dari bahasa Yunani yaitu”Bakterion”yang berarti batang
atau tongkat Bakteri berkembangbiak dengan membelah diri Studi mengenai
bakteri mulai berkembang setelah ditemukan mikroskop oleh Anthonie Van
Leeuwenhoek (1683), yang akhirnya berkembang sampai terbentuklah cabang
biologi yaitu bakteriologi
Bakteri gram negatif mempunyai struktur dinding sel multilayer,
mengandung 5-20 % peptidoglikan, dinding sel mengandung lipid, polisakarida
dan protein, biasanya ada pada membran di luar membran peptidoglikan Membran
luar mengandung lipopolisakarida (LPS) Bakteri gram positif mempunyai dinding
sel lapis tunggal dan lebih kuat Dinding sel mengandung 90 % peptidoglikan
tetapi tidak mengandung lipopolisakarida (Brock, 1979; Carman, 2001) Karena
adanya perbedaan ini maka bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu,
sedangkan bakteri gram negatif akan memberikan warna merah pada akhir
pewarnaan gram (Carman, 2001) Perbedaan dinding sel bakteri gram positif dan
gram negatif ditunjukkan oleh gambar 21

Gram +

peptidoglikan
Gram - LPS & Protein

Gambar 2.1 Ilustrasi Dinding sel bakteri gram positif dan gram negatif

2.3 Bakteri Halofilik
Bakteri halofilik merupakan jenis mikroorganisme yang habitatnya berada
pada kadar garam tinggi Bakteri halofil dapat diklasifikasikan berdasarkan kadar
garam yang dibutuhkan diantaranya; jenis halofil pada kadar rendah yang tumbuh
optimal pada 0,2-0,85 molL-1 (2-5%) NaCl, jenis halofil pada kadar sedang yang
tumbuh optimal pada 0,85-3,4 molL-1 (5-20%) NaCl dan untuk jenis halofil yang
ekstrim (kadar garam tinggi) tumbuh optimal pada kadar garam sekitar 3,4-5,1
molL-1 (20-30%) NaCl Protein-protein penyusun sitoplasma dan ribosom pada
bakteri halofil mempunyai tingkat keasaman yang lebih tinggi dibandingkan

1990) Ilustrasi permukaan protein bakteri halofil disajikan dalam gambar II.dengan bakteri lainnya (Edwards. 1989) : 1. putih : karakter netral (Oren. yaitu (Poedjiadi.4 Enzim Enzim berasal dari istilah Yunani. 1983) Enzim bersifat spesifik terhadap substrat tertentu Pada umumnya prinsip dasar mekanisme kerja enzim melalui dua mekanisme yaitu : 1. tidak terjadi kenaikan kecepatan reaksi walaupun konsentrasi enzim diperbesar (gambar 23) Gambar 2.4.1 Faktor-faktor yang Mempengaruhi Kerja Enzim Faktor-faktor yang mempengaruhi kerja enzim. Konsentrasi enzim Kecepatan reaksi bertambah dengan bertambahnya konsentrasi enzim Pada batas tertentu. Orientasi molekular (Molecular orientation) Setiap substrat akan terorientasi secara tepat pada sisi aktif enzim untuk terjadi reaksi 2. Suhartono. 1994. 2003) 2.1992) 2. biru : karakter basa.2 Ilustrasi permukaan protein bakteri halofilik (a) dan non halofil(b) merah : karakter asam. Pembentukan produk antara enzim-substrat (Intermedieted product) Ikatan enzim-sustrat (ES) terjadi karena adanya penyebaran elektron dari molekul substrat sehingga terjadi peregangan pada ikatan kovalen spesifik Hal ini menyebabkan ikatan mudah putus Pembentukan produk antara ES akan mempercepat laju kesetimbangan reaksi tanpa mempengaruhi konstanta kesetimbangan (Shahib.2 a b Gambar 2.3 Grafik pengaruh konsentrasi enzim terhadap kecepatan reaksi . yang artinya “di dalam sel” Enzim merupakan protein yang berfungsi sebagai katalisator untuk reaksi-reaksi kimia dalam sistem biologi (Winarno.

5 Grafik pengaruh suhu terhadap kecepatan reaksi 2. tidak terjadi kenaikan kecepatan reaksi walaupun konsentrasi substrat diperbesar (gambar 24) Gambar 2.4 Grafik pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan reaksi Suhu Perubahan suhu lingkungan akan berpengaruh terhadap efektivitas sisi aktif enzim dalam membentuk kompleks enzim-substrat Suhu optimum.1.6 Grafik pengaruh pH terhadap kecepatan reaksi 3. pH Perubahan pH lingkungan akan berpengaruh terhadap efektivitas sisi aktif enzim dalam membentuk kompleks enzim-substrat (gambar 26) Nilai pH optimum merupakan pH dimana aktivitas enzim paling tinggi dalam mengkatalisis suatu reaksi pH Optimum v pH Gambar 2. Inhibitor Inhibitor merupakan molekul atau ion yang dapat menghambat reaksi pembentukan kompleks enzim-substrat (ES) dengan cara menghambat pada bagian aktif enzim Inhibitor dapat berupa bahan yang secara struktural . Konsentrasi substrat Kecepatan reaksi meningkat dengan pertambahan konsentrasi substrat Namun pada batas tertentu. merupakan suhu dimana aktivitas enzim paling tinggi dalam mengkatalisis suatu reksi kimia (gambar 25) Suhu v Optimum Suhu Gambar 2.

1969) Berdasarkan sifat kimia dari lokasi sisi aktif enzim protease. dan pengolahan limbah cair Di Indonesia kebutuhan akan enzim protease semakin meningkat namun kebutuhan ini masih tergantung pada produksi impor Salah satu cara mengantisipasi ketergantungan terhadap impor tersebut perlu ada usaha untuk memproduksi enzim protease (Norberg. maka jenis- jenis protease dapat dibedakan menjadi: 1. Protease Sulfihidril Yaitu jenis protease yang mempunyai residu sulfihidril pada lokasi sisi aktif Contoh : Enzim papain dan bromelin 3. Protease serin Yaitu jenis protease yang mempunyai residu serin pada lokasi sisi aktif Contoh : enzim tripsin.7 Reaksi asam amino (tirosin) dan senyawa azo (Plummer. Protease Asam Yaitu jenis protease yang memiliki rantai samping gugus karboksil Contoh : Enzim pepsin dan renin (Winarno. kemotripsin dan substilisin 2. 2004. Frey dan Hegeman.5 Enzim Protease Enzim protease merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis protein menjadi polipeptida dan asam amino penyusunnya (Bugg. 2007) Penggunan enzim protease dalam berbagai produk komersial semakin meluas sejalan dengan kemajuan dalam bidang bioteknologi Protease dimanfaatkan dalam bidang industri antara lain dalam pengolahan pangan. deterjen. penyamakan kulit. 1979) . Protease Metal Yaitu jenis protease yang kereaktifannya tergantung dengan adanya logam Contoh : Enzim karboksil peptidase 4.menyerupai substrat enzimnya tetapi salah satunya tidak bereaksi atau bereaksi dengan sangat lambat dibandingkan dengan substrat 2. 1983) Protease dapat diidentifikasikan menggunakan substrat azokasein Azokasein merupakan protein yang mengikat zat warna azo Senyawa azo memiliki srtuktur umum R-N=N-R’ R dan R’ adalah rantai organik yang sama atau berbeda Seyawa azo dapat berupa senyawa aromatik maupun alifatik Senyawa azo aromatik bersifat stabil dan mempunyai warna menyala Senyawa azo alifatik lebih labil Reaksi zat warna azo dengan tirosin disajikan dalam gambar 27 : CH2CH(NH2)COOH CH2CH(NH2)COOH + -Cl N2 SO3H N N SO 3H + HCl OH OH Tyrosine Diazonium compound Azo dye Gambar 2.

larutan yodium. 2001).2.6 Identifikasi Mikrobiologi Salah satu cara identifikasi bakteri adalah teknik pewarnaan gram Dalam proses ini bakteri yang terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut: kristal ungu. McClelland. Todar. 2004) 2. dan safranin Bakteri yang diwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok yaitu gram positif dan gram negatif Pada bakteri gram negatif. sehingga dengan penambahan safranin akan menimbulkan warna merah pada dinding sel Sedangkan pada bakteri gram positif. penambahan kristal ungu dan iodin dapat menghasilkan kompleks ungu-iodin yang terbentuk di antara membran luar dan plasma yang dapat larut dalam alkohol-aseton Membran luar bakteri gram negatif yang tersusun atas LPS (lipopolisakarida). 1979. lapisan peptidoglikan yang dimiliki lebih tebal sehingga dengan penambahan alkohol-aseton hanya menyebabkan lapisan peptidoglikan terdehidrasi (Inglis. 1999.1989) . protein larut dan lapisan tipis peptidoglikan Lapisan peptidoglikan yang tipis membuat kompleks ungu-iodin yang terbentuk antara membran luar dan plasma menjadi tidak stabil karena penambahan alkohol-aseton (Beveridge.8 Kurva Pertumbuhan Bakteri (Suhartono. 2001) Hal ini menyebabkan pori-pori dinding sel menutup dan mencegah lepasnya kompleks ungu-iodin yang terbentuk (Brock.7 Kurva Pertumbuhan bakteri Fase –fase pertumbuhan pada bakteri (gambar 211) meliputi: a) Fase adaptasi Bakteri melakukan penyesuaian dengan kondisi lingkungan baru a) Fase pertumbuhan logaritma (eksponensial) Bakteri membelah dengan cepat dan konstan mengikuti kurva logaritma b) Fase pertumbuhan tetap (Stasioner) Jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati c) Fase kematian Sebagian besar populasi bakteri mulai mengalami kematian karena nutrien habis dan ada zat racun Fase adaptasi Fase stasioner Fase eksponensial Fasa kematian Gambar 2. alkohol (bahan pemucat).

dan lebih baik dalam penyaringan Setelah sentrifugasi akan diperoleh larutan bening (supernatan) dan residu atau endapan (Scopes. yaitu (Wirahadikusumah. 2004) Hal ini bertujuan untuk memisahkan protein enzim protease dengan protein lainnya Penambahan garam elektrolit mengakibatkan terjadinya pengurangan kelarutan protein (salting out) Pada proses salting out terjadi kompetisi antara molekul-molekul protein dan kation garam dalam menarik air Kepolaran ion-ion garam lebih besar sehingga kemampuannya mengikat air lebih besar yang menyebabkan protein kekurangan air dan akhirnya mengendap (Collowick. berat jenis. 2005) Umumnya membran yang digunakan untuk proses dialisis ini adalah membran selofan Membran selofan ini memiliki sifat semipermeabel yaitu dapat dilewati molekul kecil tetapi akan menahan molekul ukuran besar (Pierce. 1989) Faktor-faktor yang mempengaruhi dalam penentuan aktivitas enzim. 1982) 2. Bugg.8. 2005) 2.8. dan bentuk akan mengendap dengan gaya pada kecepatan yang berbeda Teknik sentrifugasi banyak dipakai dalam isolasi enzim karena pelaksanaanya mudah. medium cair dimasukan ke dalam tabung sentrifugasi yang ditempatkan pada rotor berputar Partikel yang berbeda ukuran.2 Pemurnian Enzim Pemurnian enzim dapat dilakukan dengan cara fraksinasi Fraksinasi dilakukan untuk memurnikan enzim secara bertingkat dengan menggunakan garam amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan yang berbeda (Dennison. 1999) 2.8.8 Isolasi dan Pemurnian Enzim 2. 1982) Pemisahan enzim dilakukan dengan proses sentrifugasi yang dilakukan berdasarkan adanya gaya sentrifugal pada partikel Metode sentrifugasi merupakan cara pemisahan enzim dari partikel-partikel lain yang tidak dikehendaki berdasarkan ukuran partikel yang dipisahkan.3 Dialisis Amonium sulfat yang terlarut setelah proses fraksinasi dipisahkan dengan cara dialisis Prinsip dialisis adalah pemisahan partikel protein yang bermolekul besar dengan partikel amonium sulfat dengan berat molekul kecil melalui membran semi permeabel atas dasar sifat difusi karena perbedaan konsentrasi di dalam dan di luar membran (Pierce. 2002.9 Unit Aktivitas dan Aktivitas Spesifik Enzim Satu unit aktivitas enzim adalah aktivitas enzim yang menyebabkan transformasi sejumlah substrat pada kondisi optimum Sedangkan aktivitas spesifik adalah unit aktivitas enzim per milligram protein (Wirahadikusumah.2. 1989): 1) Persamaan reaksi yang dikatalisis oleh enzim tersebut 2) Pengaruh konsentrasi substrat 3) pH optimum dan suhu optimum 4) Analisis penentuan berkurangnya substrat atau bertambahnya produk .1 Isolasi Enzim Isolasi enzim pada umumnya dilakukan dengan pemisahan sel melalui sentrifugasi Isolasi enzim diperlukan karena enzim yang terpisah dari sumbernya dan murni lebih besar manfaatnya dalam bidang industri maupun kesehatan (Scopes. cepat.

1999) seperti disajikan dalam gambar 29 dan dianalisis dengan spektrofotometer UV-Vis Gambar 2.11 Spektrofotometer Ultraviolet Cahaya Tampak (UV-VIS) Spektrofotometer merupakan alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer.9 Reaksi Pembentukan Kompleks dalam Metode Lowry (Pierce. 2005) 2. 2002) Spektrofotometer UV-Vis bekerja pada panjang gelombang 200-800 nm Semua molekul dapat menyerap radiasi dalam daerah UV-Vis karena mengandung elektron yang dapat dieksitasikan ke tingkat energi yang lebih tinggi Jika suatu molekul mengandung sebuah atom yang mempunyai pasangan elektron bebas. 1994) Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode Lowry berdasarkan kurva standar larutan BSA Prinsipnya dalam penentuan kadar protein adalah reaksi pembentukan kompleks ikatan peptida dengan ion-ion Cu2+ pada suasana basa dan reduksi asam fosfomolibdat fosfotungstat pada reagen Folin ciocaltaeu oleh rantai samping asam amino menjadi heteropolimolibdenum berwarna biru (Collowick. sebuah elektron tak terikat (non-bonding) dapat dieksitasikan ke tingkat energi yang lebih tinggi Bila konsentrasi materi yang dilewati cahaya bertambah. direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang (Khopkar. maka cahaya akan lebih banyak diserap Jadi. digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan.2. 1998) Hubungan antara absorbansi A dan konsentrasi zat pengabsorbsi c adalah linier A=a bC Keterangan: A : Absorbansi a : absorptivitas b : tebal medium penyerap C : Konsentrasi . absorbansi berbanding lurus dengan ketebalan b dan konsentrasi c (Underwood.10 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry Kadar protein digunakan untuk menentukan aktivitas spesifik enzim (Lehninger.

Aktivitas protease dengan penambahan NaCl pada berbagai pH 3. Aktivitas protease 2. kapas. KH2PO4 pa. akuades. lampu spirtus.2. Variabel bebas : 1. reagen Lowry. kasein (Merck) . glukosa (Merck). artificial sea water (ASW). penentuan aktivitas dan aktivitas spesifik enzim Dilanjutkan dengan penentuan pengaruh penambahan NaCl terhadap aktivitas protease pada berbagai pH Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokimia jurusan kimia F MIPA UNDIP Semarang 3. alkohol- aseton (Merck). labu ukur. timbangan analitik. Volume Enzim 4. alkohol 70 % (Merck). penangas air. Sampel Koloni tunggal isolat bakteri halofilik 2. pengaduk gelas. Bahan Bahan–bahan yang dibutuhkan pada penelitian ini antara lain : tripton (Conda). gelas ukur. reagen gram’s Iodin (Merck). inkas. kertas label. NaCl (Merck). Konsentrasi Substrat (Azokasein) 2.228). glisin (Merck). fraksinasi. dialisis.1. botol semprot. Aktivitas protease pada berbagai pH 3. (Shimadzu) dan peralatan gelas lainnya 3. micropipette secorex (Swiss made). erlenmeyer. spektrofotometer UV-Vis. autoklaf (Napco model 8000-DSE autoclave). pH meter (Orion 420 A) autoklaf (Clinical Autoclave Prestige Medical series 2100). KH2PO4 (Merck). aluminium foil. ekstrak ragi (Conda).1.1 Alat-alat Peralatan yang digunakan antara lain: tabung reaksi. bufer fosfat (Merck). shaker waterbath incubator (Memmert). Waktu inkubasi 3. Derajat keasaman (pH) larutan buffer 2. magnetik stirer (Nuova). Volume Substrat (Azokasein) 3. botol semprot. TCA/ Tri Cloroacetic Acid (Merck). larutan kristal ungu (Merck). Variabel yang dikonstankan : 1.1 Variabel Penelitian 3. mikroskop beserta slide mikroskop. BAB III METODE PENELITIAN Untuk mencapai tujuan penelitian dilakukan isolasi dan pemurnian protease bakteri halofilik isolat bittern tambak garam Madura yang meliputi beberapa tahap yaitu sentrifugasi.3.1. NaOH (Merck). sentrifugator (Centrific. shaker inkubator TIT (TS-330 A). inkubator (Memmert). lemari pendingin (Sanyo SR-LV 239 N).2 Bahan-bahan 1. BSA (Bovine Serum Albumin). Variabel yang diukur : 1. safranin (Merck).1. Suhu 5.2.2. Konsentrasi NaCl 3.2 Alat dan Bahan 3. Azokasein (Sigma) .

3. kemudian dilewatkan di atas api dan didinginkan pada suhu kamar Setelah itu 2-3 tetes kultur bakteri dari media EHB diletakan di atas slide steril dan dikeringkan dengan cara melewatkan slide di atas api dan mengangin-anginkan slide sehingga diperoleh preparat. kemudian di atas preparat ditambahkan 2-3 tetes larutan kristal ungu dan didiamkan selama 1 menit Kemudian dicuci dengan aquades dan diangin- anginkan sampai kering Kemudian ditambahkan setetes reagen gram iodin. kemudian diinkubasi dalam shaker inkubator pada temperatur 37 0C selama 24 jam dengan kecepatan 250 rpm Pengadaptasian bakteri dari media EHB ke dalam media HSB dilakukan secara bertahap dengan mengatur komposisi bittern dan ASW sampai semua bittern digantikan oleh ASW Perbandingan Komposisi (%) Sampel Bittern ASW B Halofil 100 0 B Halofil 80 20 B Halofil 60 40 B Halofil 40 60 B Halofil 20 80 B Halofil 0 100 Aquades steril 0 100 3.1 Pengadaptasian bakteri pada Halophile Synthetic Broth Media (HSBM) Isolat bakteri sebanyak 10 μL dari stok media Enrichment halophile Broth (EHB) diinokulasikan ke dalam 100 mL media HSB dengan pengaturan komposisi bittern dan ASW (Artificial Sea Water).3.3 Cara Kerja 3. 2001) 3. kemudian diinkubasi dalam orbital . dan didiamkan selama 1 menit Setelah itu slide dicuci dengan aquades dan dikeringkan Larutan alkohol aseton ditambahkan sebanyak 2 tetes dan diamkan selama 30 detik Kemudian ditambahkan safranin 2-3 tetes dan didiamkan selama 2 menit Pengamatan morfologi dan pewarnaan gram dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 1500X Hal ini dilakukan juga pada kultur bakteri dari media HSB (Carman.3 Kurva Pertumbuhan bakteri Sebanyak 10 μL kultur hasil dari peremajaan (sebagai starter) diinokulasikan pada 100 mL media HSB dan diinkubasi dalam shaker inkubator pada suhu 370C selama 48 jam dengan kecepatan 250 rpm dan diukur absorbansinya tiap 4 jam sekali 3.2 Uji Morfologi dan Pewarnaan Gram Slide mikroskop disterilkan dengan alkohol.3.3.4 Peremajaan bakteri pada media Halophile Synthetic Broth (HSB) Isolat bakteri dari stok media Halophile Synthetic Broth (HSB).3. dapat diremajakan kembali dengan menginokulasikan 10 μL isolat bakteri kedalam 100 mL media Halophile Synthetic Broth (HSB).

2 Fraksinasi dengan garam amonium sulfat Fraksinasi dilakukan untuk memurnikan enzim secara bertingkat dengan menggunakan garam amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan yang berbeda (Dennison. diinokulasikan pada 1 liter media HSB dan diinkubasi dalam orbital shaker inkubator pada suhu 37 0C selama waktu optimum berdasarkan kurva pertumbuhan 3. 2004) 3.3. fraksi 80- 100% (F5) (Dennison. fraksi 20-40% (F2). fraksi 60-80% (F4).0 Filtrat yang dihasilkan dijadikan untuk fraksi 2 dengan penambahan amonium sulfat kembali sesuai dengan kadar pada fraksi 2 dan dilakukan penambahan reagen seperti perlakuan sebelumnya Hal ini dilakukan sampai terdapat fraksi-fraksi berikutnya.6.3.3. 60-80% dan 80- 100% (Bugg. 0 shaker inkubator pada suhu 37 C selama waktu optimum sesuai kurva pertumbuhan 3. disentrifus dengan kecepatan 6000 rpm selama 30 menit Kemudian dipisahkan antara supernatan dan endapan Supernatan (enzim ekstrak kasar) yang diperoleh selanjutnya disimpan pada suhu dingin (Bugg. fraksi 40-60% (F3). 2002. setengah bagian supernatan pada bagian bawah disentrifugasi kembali dengan menggunakan mikrosentrifus dengan kecepatan 14000 rpm selama 15 menit sehingga akan diperoleh endapan dan supernatan Endapan dipisahkan kemudian disuspensikan dengan Bufer fosfat 0.0005M pada pH 7. 2002) .05 M pH 7.3. campuran yang terbentuk dibiarkan selama 2 jam dalam keadaan dingin.6 Isolasi Enzim Protease 3.40%. 2004) 3. 40-60%. kemudian diikat kedua ujungnya Selofan yang berisi enzim yang tersuspensi dalam buffer pospat 0. 2004) Amonium sulfat ditimbang sesuai dengan jumlah yang dibutuhkan pada setiap tingkat fraksinasi Amonium sulfat yang sudah ditimbang untuk fraksi 0-20 % dimasukan ke dalam larutan enzim sedikit demi sedikit sambil diaduk Pengadukan dilakukan dengan menggunakan pengaduk magnetik stirer dalam penangas dingin Setelah itu. kemudian disentrifus dengan kecepatan 6000 rpm selama 15 menit sehingga akan diperoleh endapan dalam fraksi 0-20 % dan filtratnya Untuk mendapatkan protein enzim yang lebih banyak.0 tersebut direndam dalam larutan Bufer fosfat 0. yaitu didapatkan fraksi dengan tingkat kejenuhan 20.6.0 Dalam keadaan dingin Bufer diaduk dengan magnetik stirer dan setiap 2 jam diuji kandungan amonium sulfatnya dengan penambahan BaCl2 Dialisis dihentikan jika hasil pengujian tidak terbentuk endapan putih Hasil dari dialisis diperoleh beberapa fraksi yaitu fraksi 0-20% (F1).5 Produksi Enzim Protease Isolat bakteri hasil starter diambil 100 µL.05 M pada pH 7.3 Dialisis Dialisis dilakukan dengan menggunakan selofan yang telah direbus dalam aquades selama 30 menit Selofan dibuat bentuk kantong dan diisi dengan larutan enzim hasil fraksinasi. Bugg.6.1 Ekstraksi (pemisahan enzim ekstraseluler dari bakteri) Isolat bakteri yang dihasilkan dengan volume 1 liter kultur produksi enzim.3.

8 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum BSA Larutan alkalin Natrium karbonat (2 g/ml Na2CO3 dalam 0.0 (lampiran B) ditambah dengan aquades 0.5 g/ml CuSO45H2O dalam 1 g/ml Natrium. 2005) 3.5 ml larutan BSA berbagai konsentrasi (0.5 g/ml CuSO45H2O dalam 1 g/ml Natrium.0 (lampiran B) ditambah dengan aquades 0. 1979) 3.125 mL larutan azokasein 2 %.5 mL larutan enzim yang telah dipanaskan Campuran dikocok dan diinkubasi didalam air es sesaat Larutan blanko dan larutan sampel disentrifus pada 6000 rpm selama 30 menit Masing-masing supernatan diukur absorbansinya pada 440 nm (Kanlayakrit etal.1 mol/L NaOH) (larutan 1) Larutan CuSO4 – Natrium. Kalium tartat) (larutan 2) Kedua larutan dicampurkan dengan perbandingan larutan 1: larutan 2 = 50 : 1 Campuran ini disebut dengan larutan alkalin 7.2 mg/ml) Larutan dikocok dan di inkubasi pada suhu kamar selama 10 menit.5 larutan alkalin ditambahkan dalam 1.25 mL bufer fosfat 0.9 Penentuan Kurva Standar BSA Larutan alkalin Natrium karbonat (2 g/ml Na2CO3 dalam 0.1 mol/L NaOH) (larutan 1) Larutan CuSO4 – Natrium.3.5 ml larutan enzim Larutan dikocok dan di inkubasi pada suhu kamar selama 10 menit.75 ml reagen folin Larutan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar kemudian ditentukan absorbansinya pada panjang gelombang maksimum BSA dengan spektrofotometer UV-Vis (Plummer.Kalium tartat) (larutan 2) Kedua larutan dicampurkan dengan perbandingan larutan 1: larutan 2 = 50 : 1 Campuran ini disebut dengan larutan alkalin Sebanyak 7. Kalium tartat (0.75 ml reagen folin Larutan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar kemudian ditentukan absorbansinya pada berbagai panjang gelombang dengan spektrofotometer UV-Vis (Plummer.75 ml reagen folin Larutan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar . dan diinkubasi kembali pada kondisi optimum yaitu 37 0C selama 30 menit dalam shaker water bath inkubator Setelah itu ditambahkan 1. kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 5 menit dalam shaker water bath incubator Selanjutnya ditambahkan 0.125 mL larutan azokasein 2%.3. setelah itu ditambahkan 1.625 mL dicampurkan dengan 0. 1979) 3.5 larutan alkalin ditambahkan dalam 1. kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 30 menit dalam shaker water bath inkubator. Kalium tartat) (larutan 2) Kedua larutan dicampurkan dengan perbandingan larutan 1: larutan 2 = 50 : 1 Campuran ini disebut dengan larutan alkalin 7.5 mL larutan enzim.5 mL larutan TCA 10 % Campuran dikocok dan diinkubasi didalam air es sesaat Untuk larutan blanko (t0).5 mL TCA 10 % dan 0.3.5 ml larutan BSA (0.0 mg/mL) Larutan dikocok dan di inkubasi pada suhu kamar selama 10 menit.1 mol/L NaOH) (larutan 1) Larutan CuSO4 – Natrium.5 g/ml CuSO 45H2O dalam 1 g/ml Natrium.7 Uji Aktivitas Enzim Aktivitas protease ditentukan berdasarkan kemampuan protease menghidrolisis ikatan peptida pada substrat azokasein 2 % (b/v) selama 30 menit Untuk larutan sampel. sebanyak 2. 2002 dan Kamelia dkk.25 mL Bufer fosfat 0. kemudian ditambah dengan 0.3. Kalium tartat (0.10 Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry Larutan alkalin Natrium karbonat (2 g/ml Na2CO3 dalam 0.625 mL dicampurkan dengan 0.05 M pH 7. kemudian ditambah dengan 0.3.05 M pH 7. kemudian ditambah dengan 0. Kalium tartat (0.5 mL larutan alkalin ditambahkan dalam 1.02 hingga 2. sebanyak 2.

9. 7.12 Penentuan Pengaruh penambahan NaCl pada berbagai pH Larutan sampel. 8.0.5 mL larutan TCA 10 % Untuk larutan blanko (t0).6. kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 5 menit dalam shaker water bath incubator Selanjutnya ditambahkan 0.125 mL dan 0.5 ml enzim yang sudah dipanaskan Campuran dikocok dan diinkubasi dalam air es sesaat Larutan sampel dan blanko disentrifus pada 6000 rpm selama 30 menit Masing-masing supernatan diukur absorbansinya pada 440 nm Hal yang sama dilakukan pada sampel protease non halofil yaitu akstrak daun pepaya yang mengandung papain (Kanlayakrit etal. 10.6. 2002 dan Kamelia dkk.6.0. 7.25 ml buffer 0.125 mL larutan azokasein 2 %.0. 10.6.6 BAB IV .0. dan diinkubasi kembali pada kondisi optimum yaitu 37 0C selama 30 menit dalam shaker water bath inkubator Kemudian ditambahkan 1.6. dicampurkan dengan 0.0. 9.6) (lampiran B) ditambah dengan aquades 0.5 mL larutan enzim. 7.0.0. 8  bufer glisin NaOH untuk pH 8.125 mL larutan azokasein 2 %. sebanyak 2.25 M.0.8.0. 9.125 mL larutan azokasein 2 % Larutan diinkubasi pada suhu 37OC selama 30 menit Kemudian ditambahkan 1. 7. dicampurkan dengan 0.6) (lampiran B) ditambah dengan aquades 0.05 M (Variasi pH : 6. 9.0. 9. 2005) Keterangan:  bufer fosfat untuk pH 6. 7.6) (lampiran B) ditambah dengan aquades 0.05 M (Variasi pH : 6.5 ml larutan TCA 10 % dan 0.3.5 mL larutan enzim.5 mL NaCl 0.0. 7. 9.6) (lampiran B) ditambah dengan aquades 0.8.kemudian ditentukan absorbansinya pada panjang gelombang maksimum BSA dengan spektrofotometer UV-Vis (Plummer.125 mL dan 0.8.0.0.05 M (Variasi pH : 6.625 mL.3.6.125 mL larutan azokasein 2 % Larutan diinkubasi pada suhu 37OC selama 30 menit Kemudian ditambahkan 1.8. dicampurkan dengan 0. 2002 dan Kamelia dkk. sebanyak 2. 2005) 3.625 mL. dicampurkan dengan 0. 9. 9. 9. 8. 10. Campuran dikocok dan diinkubasi dalam air es sesaat Untuk larutan blanko (t0). 7. 8.5 ml enzim yang sudah dipanaskan Campuran dikocok dan diinkubasi dalam air es sesaat larutan sampel dan blanko disentrifus pada 6000 rpm selama 30 menit Masing-masing supernatan diukur absorbansinya pada 440 nm Hal yang sama dilakukan pada sampel protease non halofil yaitu akstrak daun pepaya yang mengandung papain (Kanlayakrit etal.6. 7.6. 8.5 mL NaCl 0. 8.6.25 ml buffer 0. 8.11 Penentuan pH Optimum Aktivitas protease ditentukan berdasarkan kemampuan protease menghidrolisis ikatan peptida pada substrat azokasein 2 % (b/v) selama 30 menit Untuk larutan sampel. 7.25 mL bufer 0.5 ml larutan TCA 10 % dan 0.0. kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 5 menit dalam shaker water bath incubator Selanjutnya ditambahkan 0. 10.6.0.0. 8. sebanyak 2. 1979) 3. sebanyak 2.25 mL bufer 0. 10.05 M (Variasi pH : 6.25 M. dan diinkubasi kembali pada kondisi optimum yaitu 37 0C selama 30 menit dalam shaker water bath inkubator Setelah itu ditambahkan 1.5 mL larutan TCA 10 %. 7. 8. 9.8.

asam nukleat Akuades digunakan sebagai pelarut dan NaCl digunakan untuk mengatur tekanan osmotik dalam sel Larutan bittern digunakan untuk pengkondisian lingkungan yang sebenarnya sehingga bakteri dapat beradaptasi pada lingkungan yang baru sehingga kelangsungan hidupnya tetap terjaga Kultur bakteri halofil hasil peremajaan selanjutnya ditumbuhkan pada media Halophile synthetic broth (HSB) secara bertahap agar bekteri mampu beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang baru Komponen penyusun media HSB hampir sama dengan media EHB Pada media EHB menggunakan bittern untuk pengkondisian lingkungan yang sebenarnya sedangkan pada media HSB menggunakan air laut buatan (artificial sea water) Tujuan penggantian bittern dengan artificial sea water adalah agar bakteri dapat ditumbuhkan kapan dan dimana saja tanpa tergantung pada sumber alaminya (bittern) Proses penggantian bittern dengan artificial sea water dilakukan secara bertahap Sebanyak 10mL bittern dalam media diganti dengan artificial sea water dengan perbandingan tertentu. penentuan pengaruh penambahan NaCl terhadap aktivitas protease pada berbagai pH 4.1 Pengadaptasian Bakteri pada Halophile Synthetic Broth Media Koloni tunggal bakteri halofilik dari pekatan sisa dalam proses pembuatan garam (bittern) Madura telah berhasil diisolasi dengan menggunakan media Enrichment Halophile broth (EHB) Sebagai langkah awal dilakukan peremajaan bakteri dengan menumbuhkan pada media EHB agar diperoleh kultur bakteri pada kondisi yang aktif Komponen penyusun media EHB antar lain glukosa. penentuan unit aktivitas dan aktivitas spesifik enzim protease. ekstrak ragi sebagai sumber karbon dan nitrogen organik (Suhartono.1 Hasil Pengadaptasian bakteri pada Halophile Synthetic Broth Media . ekstrak ragi. PEMBAHASAN Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk memperoleh protease dari bakteri halofil. KH2PO4. menentukan pengaruh penambahan NaCl terhadap aktivitas protease ekstraseluler bakteri halolofilik pada berbagai pH Untuk memperoleh hasil tersebut maka pada penelitian ini dilakukan beberapa tahap yaitu isolasi dan pemurnian enzim protease dari bakteri halofilik. 2002) Fungsi inkubasi dalam shaker inkubator adalah proses aerasi untuk mencukupi kebutuhan oksigen yang dibutuhkan bakteri halofil Proses inkubasi dalam shaker inkubator dilakukan selama 24 jam. tripton. bittern dan akuades Glukosa digunakan sebagai sumber karbon. 1989) Tripton sebagai sumber protein kompleks. NaCl 10%. seperti disajikan dalam Tabel 41 Larutan media kemudian diinkubasi dalam shaker inkubator pada temperatur ± 370 C dengan kecepatan 250 rpm karena bakteri halofil tumbuh optimum pada temperatur 370 C (Kanlayakrit et al.1) Tabel 4. Kekeruhan pada media cair selama inkubasi menunjukkan keberadaan bakteri pada media Hal ini didukung dengan kontrol negatif yang menunjukkan tidak adanya perubahan kekeruhan sebelum dan sesudah inkubasi Proses adaptasi dilakukan sampai semua bittern dalam media diganti dengan artificial sea water Proses adaptasi menunjukan bakteri halofil dapat tumbuh pada media HSB (Tabel 4. KH2PO4 sebagai sumber phosphor yang dibutuhkan sebagai komponen penyusun ATP.

penambahan kristal ungu dan iodin dapat menghasilkan kompleks ungu-iodin yang terbentuk di antara membran luar dan plasma yang dapat terekstraksi oleh penambahan alkohol- aseton Membran luar bakteri gram negatif yang tersusun atas LPS (lipopolisakarida).dan stok Halophile synthetic broth media (b) Pada gambar 4.1 di atas terlihat bahwa bakteri yang ditumbuhkan dalam media EHB dan HSB merupakan bakteri yang sama Hal ini terlihat dari hasil morfologi berbentuk bulat (coccus) dan sama-sama mempunyai sifat gram negatif Hal ini dibuktikan dengan terbentuknya warna merah pada bakteri setelah penambahan safranin Pada bakteri gram negatif. protein larut dan lapisan tipis peptidoglikan Lapisan peptidoglikan yang tipis membuat kompleks ungu-iodin yang terbentuk antara . selanjutnya diamati morfologi dan sifat gramnya untuk membuktikan bahwa bakteri yang ditumbuhkan dalam media EHB dan HSB sama morfologi dan sifat gramnya Pengamatan dan uji yang telah dilakukan terhadap isolat bakteri memperoleh hasil seperti pada gambar 41 (a) (b) Gambar 4.1 Morfologi bakteri halofil dari stok Erichment Halophile broth medi (a).2 Pengamatan Morfologi dan Pewarnaan Gram Bakteri Bakteri koloni tunggal yang ditumbuhkan dalam media EHB dan HSB. Perbandingan Komposisi (%) Sampel Hasil Keterangan Bittern ASW B Halofil 100 0 Kuning keruh Tumbuh B Halofil 80 20 Kuning keruh Tumbuh B Halofil 60 40 Kuning keruh Tumbuh B Halofil 40 60 Kuning keruh Tumbuh B Halofil 20 80 Kuning keruh Tumbuh B Halofil 0 100 Kuning keruh Tumbuh Aquades steril 0 100 Kuning jernih Tidak tumbuh Tumbuhnya bakteri halofil ditandai dengan kekeruhan pada media yang semua komponen bitternnya diganti dengan artificial sea water 4.

3 Kurva Pertumbuhan Bakteri Kurva pertumbuhan bakteri adalah kurva yang memberikan informasi mengenai fase-fase pertumbuhan yang terjadi pada bakteri Kekeruhan dari kultur bakteri diukur berdasarkan nilai transmitansi setiap 4 jam selama 48 jam dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 520 nm Kekeruhan yang dihasilkan sebanding dengan konsentrasi sel bakteri (Brock. 1989) Inkubasi 24 jam sampai 36 jam merupakan fase logaritmik. 2001) Hal ini menyebabkan pori-pori dinding sel menutup dan mencegah lepasnya kompleks ungu-iodin yang terbentuk (Brock.2 Kurva pertumbuhan bakteri halofil (a)fase lag (b)fase log (c)fase stasioner 4. 1979) Dari penelitian diperoleh profil kurva pertumbuhan seperti disajikan pada gambar 43 Kurva pertumbuhan menunjukan bakteri mengalami fase lag (adaptasi) setelah inkubasi 0 sampai 24 jam Pada fase ini. lapisan peptidoglikan yang dimiliki lebih tebal sehingga dengan penambahan alkohol-aseton hanya menyebabkan lapisan peptidoglikan terdehidrasi (Inglis. 2001). kultur bakteri memasuki fase stasioner dan fase kematian kecepatan pertumbuhan bakteri mulai menurun karena bakteri mulai kekurangan nutrisi untuk membelah diri dan adanya metabolit sekunder yang bersifat racun terhadap bakteri c waktu pemanenan protease halofil b a waktu penambahan induser Gambar 4. yaitu jumlah bakteri yang tumbuh mencapai maksimum Pada fase ini bakteri membelah dengan sangat cepat Setelah Inkubasi 40 jam. 1999. 1979.4 Peremajaan Isolat Bakteri pada Halophile Synthetic Broth Media . 2004) 4. Todar. bakteri menyesuaikan dengan kondisi lingkungan baru di sekelilingnya sehingga kecepatan pertumbuhannya masih minimum (Suhartono. sehingga dengan penambahan safranin akan menimbulkan warna merah pada dinding sel Sedangkan pada bakteri gram positif.membran luar dan plasma menjadi tidak stabil karena tidak mampu menahan alkohol-aseton (Beveridge. McClelland.

didapatkan protease ekstraseluler yang dihasilkan oleh bakteri 4. 2002. Bugg. 2004) Hal ini bertujuan untuk memisahkan protein enzim protease dengan protein lainnya Cara ini dilakukan berdasarkan pengaruh dari jumlah penambahan garam amonium sulfat yang berbeda terhadap kelarutan protein Pengendapan dengan garam amonium sulfat akan terjadi karena kompetisi antara amonium sulfat dan protein dalam memperebutkan air Amonium sulfat akan mengikat air. ketahanan sebagian besar protein terhadap garam amonium sulfat. Bugg. 1982. Bugg. terjadi penurunan kelarutan protein akibat naiknya konsentrasi garam amonium sulfat dalam larutan.2 Fraksinasi Amonium Sulfat Bertingkat Enzim Ekstrak kasar yang diperoleh merupakan campuran protein enzim dan protein non enzim. Peremajaan bakteri pada media HSB bertujuan untuk memperoleh bakteri yang aktif setelah cukup lama disimpan Pada penelitian ini waktu inkubasi yang digunakan untuk peremajaan bakteri halofil pada media HSB adalah 32 jam sesuai dengan waktu optimum pada kurva pertumbuhan pada proses ini dilakukan penambahan inducer kasein untuk menginduksi sintesis protease Kasein ditambahkan pada awal fase logaritma (inkubasi 24 jam) 4.3 Dialisis .6 Isolasi Enzim Protease 4. berat dan bentuk yang berbeda akan mengendap pada kecepatan yang berbeda Pada tahap isolasi didapatkan endapan dan supernatan Endapan merupakan sisa komponen- komponen media dan organel sel bakteri. sehingga perlu dilakukan pemurnian Fraksinasi dilakukan untuk memurnikan enzim secara bertingkat dengan menggunakan garam amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan yang berbeda (Dennison. 2004) Partikel dengan ukuran. Bugg. 2004) Pada tahap fraksinasi amonium sulfat bertingkat diperoleh fraksi-fraksi enzim dengan tingkat kejenuhan F1 (0-20%).1 Pemisahan enzim ekstraseluler dari sel bakteri Pemisahan enzim ekstraseluler dari sel bakteri bertujuan untuk memisahkan enzim dari komponen media dan organel sel bakteri Proses pemisahan dilakukan dengan sentrifus 6000 rpm selama 30 menit Setrifugasi bertujuan untuk memisahkan komponen-komponen sel yang masih ikut terlarut Sentrifugasi dilakukan berdasarkan pada perbedaan ukuran dan berat partikel yang tersuspensi (Scopes. daya pengendap yang cukup besar dan mempunyai efek penstabilan terhadap protein (Dennison. 2002. 2002. 2004) Pemilihan garam amonium sulfat pada fraksinasi didasarkan pada kelarutannya dalam air. F3 (40-60%).6. sehingga protein akan mengendap Pada proses fraksinasi.6. F2 (20-40%). F5 (80-100%) Fraksi-fraksi enzim yang diperoleh kemudian dimurnikan lebih lanjut melalui proses dialisis 4. sedangkan supernatan merupakan enzim ekstrak kasar (crude enzyme) Enzim ekstrak kasar yang diperoleh kemudian dimurnikan melalui proses fraksinasi bertingkat 4. peristiwa ini disebut salting out (Dennison. F4 (60-80%).6.5 Produksi Enzim Protease Produksi protease dilakukan dengan menumbuhkan isolat bakteri hasil peremajaan pada media Halophile synthetic broth media yang ditambah dengan kasein Inducer kasein berfungsi untuk menginduksi sintesis protease Kasein ditambahkan pada awal fase logaritma (inkubasi 24 jam) dan pemanenan protease dilakukan 32 jam yang merupakan waktu optimum pertumbuhan bakteri halofil sesuai dengan kurva pertumbuhan Pada tahap produksi enzim.

2005) Aktivitas spesifik adalah unit enzim per miligram protein (Lehninger. 1995) Nilai aktivitas spesifik ini dapat digunakan sebagai ukuran besarnya kemurnian enzim hasil isolasi (Lehninger.05 M) dan di luar membran (0. sedangkan molekul protein enzim yang memiliki ukuran lebih besar akan tertahan di dalam membran Amonium sulfat yang telah terbebaskan dapat menyebabkan kesetimbangan di dalam dan di luar membran Apabila telah dicapai kesetimbangan. Dialisis merupakan proses pemurnian lanjutan terhadap protein enzim (Bugg. 2004) Garam amonium sulfat dari proses fraksinasi dipisahkan dengan cara dialisis Protein-protein enzim dapat dipisahkan dari molekul-molekul kecil (molekul-molekul garam ammonium sulfat) dengan cara dialisis melalui membran semipermeabel (Dennison. 1994) Kadar protein dapat ditentukan dengan metode Lowry yaitu analisa kuantitatif berdasarkan pembentukan kompleks warna biru hasil reaksi antara Cu2+ dengan nitrogen dari rantai peptida dalam suasana basa dan reduksi fosfomolibdat fosfotungstat pada reagen Folin- Ciocaltaeu oleh rantai samping asam amino tirosin dan triptopan menjadi heteropolimolibdenum berwarna biru (Collowick. buffer diganti secara kontinyu agar proses difusi amonium sulfat lebih cepat Protein enzim yang didapatkan dari proses dialisis merupakan protein enzim yang terbebas dari amonium sulfat Adanya ion-ion sulfat pada larutan buffer di luar membran setelah proses dialisis dapat diidentifikasi dengan menggunakan larutan BaCl2 Jika masih terdapat ion-ion sulfat pada bufer maka akan terbentuk endapan putih BaSO 4 dan jika tidak terbentuk endapan putih berarti protein enzim telah terbebas dari ion sulfat (Norberg.0005 M) Membran selofan adalah membran semipermeabel sehingga yang dapat keluar dari membran hanyalah molekul-molekul yang mempunyai ukuran lebih kecil dari protein enzim Ion-ion garam amonium sulfat yang memiliki ukuran lebih kecil dari protein enzim dapat keluar dari membran. 2004) Dialisis pada dasarnya merupakan proses difusi. dan bufer fosfat 0. maka proses difusi dihentikan sehingga amonium sulfat tidak dapat keluar dari dalam membran Oleh karena itu. 1999) Warna biru yang dihasilkan kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang optimum BSA yaitu 790 nm (lampiran F) Absorbansi yang diperoleh kemudian diolah dengan bantuan kurva standar BSA. Bugg. 1969) 4. sehingga didapatkan kadar protein .7 Penentuan Unit Aktivitas dan Aktivitas Spesifik Enzim Protease Penentuan aktivitas protease dalam penelitian ini dilakukan melalui penentuan jumlah produk azopeptida hasil hidrolisis azokasein dengan katalis protease yang menyerap pada panjang gelombang 440 nm (lampiran E) Azokasein berfungsi sebagai substrat dari protease.05 M berfungsi untuk mempertahankan pH lingkungan Inkubasi larutan pada suhu 37 0C berfungsi untuk mengoptimalisasi reaksi antara enzim dengan substrat Sedangkan penambahan TCA (Triclorid acetic acid) ke dalam larutan uji adalah untuk menginaktifkan reaksi enzimatis yang sedang berlangsung setelah 30 menit Dalam penelitian ini 1 Unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai besarnya aktivitas protease yang menyebabkan perubahan absorbansi 1% per mL pada panjang gelombang 440 nm pada kondisi percobaan(modifikasi dari Kamelia dkk. 2002. yaitu karena adanya perbedaan konsentrasi larutan bufer fosfat di dalam (0.

1 menunjukkan bahwa protease halofil memiliki aktivitas spesifik tertinggi pada fraksi F1 (0-20 %).024 220.3 0.73 F5 4.83 3.25 1.00 F1 5.41 0. 1984) Hasil penentuan pH optimum protease halofil ini menunjukkan bahwa pH optimum untuk protease adalah pH 8 Pada kondisi pH tersebut aktivitas enzim protease halofil sebesar 2. Price.071 88.3 0. yaitu besarnya aktivitas enzim dan kadar protein total pada fraksi tersebut Hasil penentuan aktivitas dan aktivitas spesifik disajikan pada Tabel 41 Tabel 4. 1994.105 44.61 F3 4.080 56.32 1.76 0.2 Hasil Penentuan Aktivitas dan Aktivitas Spesifik protease halofil Fraksi Aktivitas Enzim Kadar Protein Aktivitas Spesifik Kemurnian Enzim (Unit/1mL) (mg/1mL) (Unit/mg protein) EK 4.79 F4 4.069 63. yaitu 220.099 41.83 Unit/mg protein Hal ini menunjukan pada F1 komposisi protease lebih tinggi dibandingkan fraksi yang lain 4.72 F2 6.7 0.8 Penentuan pH Optimum Definisi pH optimum adalah pH dimana aktivitas enzim paling tinggi dalam mengkatalisis suatu reaksi (Poedjiadi.5 0.11 Tabel 4. Penentuan aktivitas dan aktivitas spesifik terhadap enzim protease halofil dilakukan pada EK.73 1.3 0. F2.1 0.2 unit Penyimpangan dari keadaan optimum mengakibatkan berkurangnya aktivitas enzim dengan nyata Pada pH 6 aktivitas enzim paling kecil kemudian mengalami peningkatan hingga mencapai pH optimum dimana aktivitas enzim paling besar Hasil pengukuran pH optimum protease halofil disajikan pada gambar 43 Gambar 4. dan F5 yang diperoleh Besarnya aktivitas enzim pada suatu fraksi bergantung pada jumlah enzim yang akan berinteraksi dengan substrat yang spesifik Sedangkan besar kadar proteinnya merupakan jumlah protein total pada fraksi tersebut Aktivitas spesifik pada enzim kasar dan setiap fraksi dipengaruhi oleh dua faktor. F3. F4. F1.3 Grafik Penentuan pH optimum protease halofil .

(Bugg. akibatnya protease dalam keadaan kation (gambar 44 a) Protease dalam keadaan ini disebut mengalami protonasi Dalam suasana basa. antara lain protease dari Halobacillus sp. terbentuk hidrofobik komplek Enzim-substrat (a) (b) . Bugg. sehingga gugus NH2 pada protease akan menangkap H+ membentuk NH3+. 2004) Berdasarkan studi literatur sebagian besar protease yang diisolasi dari bakteri halofilik termasuk dalam golongan serin protease. H+ Pada suasana asam. Stryer. Halobacterium salinarum dan Haloferax Mediterranei (Oren. akibatnya protease dalam keadaan anion (gambar 44 b) Protease dalam keadaan ini disebut mengalamai deprotonasi (Frey dan Hegeman. histidin pada posisi 57 (His 57) dan serin pada posisi 195 (Ser 195) Mekanisme reaksi hidrolisis protein disajikan dalam gambar 4. terdapat kelebihan H+ dalam lingkungan.5: Polipeptida substrat Polipeptida substrat berikatan Transfer H+ dari serin 195 ke nitrogen non kovalen dengan bagian pada gugus imidazol His 57.4 Ilustrasi muatan permukaan protease pada suasana asam dan basa (a)basa (b)optimum (c)asam (+) NH3+ (-) COO. 2004. OH. terdapat kelebihan OH . 2007. 2003) sehingga soal no 16 pembahasan mekanisme reaksi berdasarkan struktur pada sisi aktif dari serin protease Sisi aktif dari protease serin antara lain asam aspartat pada posisi 102 (Asp 102). 2002) Protonasi dan deprotonasi dapat menyebabkan denaturasi karena dapat mengubah struktur enzim terutama pada sisi aktifnya sehingga mengakibatkan menurunnya aktivitas protease (a) (b) (c) Gambar 4.dalam lingkungan sehingga protease akan melepaskan ion H+ yang terdapat pada gugus COOH.

gugus ditransfer kembali dari His 57 ke Ser OH molekul air terikat pada subtrat 195 (e) (f) Gambar 4. dihasilkan peptide bebas (c) (d) Enzim bebas Transfer proton dari molekul air ke Terbentuknya Enzim bebas. H+ Nitrogen pada imidazol His 57. Terbentuk ikatan hydrogen antara H+ pada Molekul air terikat pada enzim Nitrogen His 57 dengan Nitrogen pada C terminal.5 Mekanisme Reaksi Hidrolisis protein oleh protease serin Mekanisme reaksi menunjukkan gugus hidroksil (OH-) pada serin 195 berperan sebagai nukleofilik yang menyerang gugus karbonil dalam rantai polipeptida substrat (gambar 45 a dan b) .

Berdasarkan penelitian. Norberg dan Hofsten. Edwards.sendiri juga merupakan nukleofil yang dapat berinteraksi dengan substrat Jika ion OH.dari lingkungan yang bereaksi substrat maka produk yang diharapkan tidak terbentuk 4. 1990) Sebagian besar aktivitas enzim dari bakteri halofil meningkat dengan penambahan garam (Oren. yaitu asam amino yang memiliki rantai samping gugus asam karboksilat (COOH). 1969) Hasil penelitian menunjukan aktivitas protease halofil meningkat dengan penambahan NaCl 0.125 M terhadap aktivitas protease halofil pada berbagai pH Enzim bakteri halofil dapat bertahan pada lingkungan dengan kadar garam tinggi Hal ini dikarenakan sebagian besar asam amino yang menyusun protein dalam sel bakteri halofil merupakan asam amino yang bersifat asam. mekanisme reaksi tersebut dapat terjadi pada kondisi pH optimum yaitu 8 Pada kondisi dibawah pH optimum. suasana lingkungan enzim berubah lebih asam. suasana lingkunan enzim akan semakin basa Banyaknya ion OH. ion OH.125 M pada berbagai pH (a) unit aktivitas dengan NaCl (b)unit aktivitas tanpa NaCl . ion OH .dari lingkungan yang bereaksi dengan substrat maka produk yang diharapkan tidak terbentuk Perubahan pH juga berpengaruh pada proses hidrolisis (gambar 45 d) Pada kondisi pH dibawah pH optimum.125 M Kurva aktivitas protease halofil dengan penambahan NaCl pada berbagai pH memiliki profil yang sama dengan kurva aktivitas protease halofil tanpa NaCl. selain dapat menyebabkan molekul air menjadi bersifat nukleofil. suasana lingkungan enzim menjadi sedikit lebih asam dan H+ dari gugus hidroksil pada sisi aktif serin 195 akan lebih sukar lepas Sehingga pada kondisi ini komplek enzim substrat tidak terbentuk Pada kondisi pH di atas pH optimum. selain dapat menyebabkan sisi aktif enzim menjadi bersifat nukleofil.dalam lingkungan semakin banyak Banyaknya ion OH. sehingga jumlah ion OH. 1990.sendiri juga merupakan nukleofil yang dapat berinteraksi dengan substrat Jika ion OH.6 Grafik pengaruh penambahan NaCl 0.dapat mengganggu reaksi enzimatis. misalnya asam glutamat dan asam aspartat (Edwards. suasana lingkungan enzim akan semakin basa. seperti disajikan pada gambar 46 a b Gambar 4. 2003.dapat mengganggu proses hidrolisis.9 Pengaruh penambahan NaCl 0. H2O akan cenderung berikatan dengan H+ dari lingkungan membentuk H3O+ sehingga sifat nukleofiliknya berkurang dan komplek enzim substrat tidak akan terbentuk Pada kondisi pH diatas pH optimum.

gaya tolak menolak antar muatan negatif (COO-) yang berdekatan berkurang sehingga konformasi protease menjadi lebih stabil Pada kondisi di atas pH optimum suasana lingkungan menjadi lebih basa.Penambahan NaCl akan menetralkan muatan negatif (COO-) pada asam amino.lebih banyak daripada H+ Pada penambahan NaCl. Dari gambar 46 terlihat bahwa penambahan NaCl meningkatkan unit aktivitas protease halofil Penambahan NaCl akan menstabilkan konformasi protease dengan menetralkan muatan-muatan yang terjadi karena perubahan pH lingkungan Adanya perubahan pH lingkungan akan mempengaruhi gugus-gugus terutama pada rantai samping asam – asam amino penyusun protease Pada kondisi pH optimum (pH = 8) suasana sedikit basa. asam dan basa disajikan dalam gambar 47 Asam Optimum Basa (A) Asam Optimum . karena gugus OH dari lingkungan (gambar 47) Demikian pula gugus NH2 dari rantai samping asam amino akan menarik H+ dari lingkungan membentuk gugus NH3+ Gugus COO. gaya tolak menolak antar muatan negatif dari asam amino yang berdekatan berkurang sehingga konformasi protease menjadi lebih stabil pada saat terjadi perubahan pH lingkungan menjadi lebih basa Ilustrasi muatan permukaan protease halofil dengan penambahan NaCl pada pH optimum. maka gugus asam karboksilat (COOH) yang ada pada rantai samping asam amino penyusun protease akan melepaskan H+ menjadi COO-. gugus asam karboksilat (COOH) yang ada pada rantai samping asam amino penyusun protease akan melepaskan H+ karena ditarik oleh gugus OH.lebih banyak daripada gugus NH3+ karena jumlah OH. sehingga menjadi gugus COO. ion Na+ akan menetralkan muatan negatif (COO-).dari lingkungan.

misalnya perubahan pH.dari lingkungan membuat Na+ cenderung berikatan dengan OH- membentuk NaOH Penambahan NaCl selain berperan dalam menetralkan muatan-muatan negatif protease juga berperan dalam memberikan efek shielding Efek shielding merupakan kemampuan garam untuk melindungi enzim dari pengaruh luar.terganggu Kelebihan OH. Na+ dalam menetralkan COO.125 M diatas pH optimum lebih kecil dibandingkan aktivitas relatif pada pH dibawah pH optimum Hal ini disebabkan suasana yang lebih basa. perubahan temperature Keberadaan NaCl yang meruah akan melingkupi permukaan protease Illustrasi permukaan protease dengan adanya efek shielding disajikan pada gambar 48 .Basa (B) Gambar 4.8 Grafik aktivitas relatif protease halofil dengan penambahan NaCl Aktivitas relatif pada penambahan NaCl 0.125 M relatif terhadap aktivitas protease tanpa penambahan garam Gambar 48 menunjukan aktivitas relatif protease halofil pada pH dibawah kondisi optimum lebih besar (± 180%) daripada aktivitas relatif protease halofil pada pH diatas kondisi optimum (± 110%) Gambar 4.7 Ilustrasi muatan permukaan protease pada berbagai pH (A)tanpa penambahan garam (B)dengan panambahan garam Aktivitas relatif merupakan besarnya perubahan aktivitas protease dengan penambahan NaCl 0.

Hasil penelitian menunjukan aktivitas papain menurun karena penambahan NaCl 0.9 Ilustrasi permukaan protease dengan efek shielding (a) Tanpa efek shielding (b)Dengan efek shielding Ikatan protease dengan garam lebih kuat sehingga tidak mudah untuk menangkap H+ dan OH.dari lingkungan karena perubahan pH H+ dan OH- lingkungan tidak langsung berinteraksi dengan enzim karena enzim dilingkupi oleh kation (Na+ ) sehingga proses protonasi tidak seekstrim pada protease tanpa efek shielding Pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas papain dengan penambahan NaCl 0.10 Aktivitas relatif protease halofil dan papain dengan penambahan NaCl (a)Protease halofil (b) papain Gambar 4.125M pada papain menyebabkan aktivitasnya menurun sedangkan pada protease halofil aktivitasnya mengalami peningkatan.125M Besarnya aktivitas relatif papain disajikan pada gambar 49 Aktivitas relatif (%) pH Gambar 4.125M pada berbagai pH Hal ini bertujuan untuk menentukan pengaruh penambahan NaCl terhadap aktivitas protease non halofil. Hal ini membuktikan ketahanan protease halofil terhadap kadar garam lebih tinggi daripada protease non halofil (papain) . (a) (b) Gambar 4.9 menunjukan aktivitas relatif papain di bawah 100% sedangkan aktivitas relatif protease halofil berada diatas 100% Hal ini menunjukan penambahan NaCl 0.

Telah diperoleh protease dari bakteri halofilik isolat bittern tambak garam Madura Aktivitas tertinggi pada kondisi optimum diperoleh pada F1 (0-20 %) yaitu 220. pH optimum protease halofil yang diperoleh adalah pH 8 3. BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Dari hasil penelitian yang telah dilakukan. Penambahan NaCl pada uji aktivitas protease halofil yang telah diperoleh dapat meningkatkan aktivitas protease halofil 5.83 unit/ mg protein 2.2 Saran Pada penelitian selanjutnya perlu dilakukan penentuan pengaruh penambahan garam yang lain pada berbagai pH untuk mengetahui pengaruh penambahan garam tersebut dalam uji aktivitas protease halofil . maka dapat disimpulkan sebagai berikut: 1.

2002. 2004. New York. T D. page 423 Beveridge. page 6. 2006. “Biology of Microorganisms”. T D H. 87 Dassarma. R M. RH. P. Oxford. Joshi. page 181. and Kaplan. “Structure of Gram-Negative Cell Wall and Their Derived Membrane Vesicles”.”Characterization and Stability of Extracelluler Alkaline Proteases from Halophlilic and Alkaliphilic Bacteria Isolated from Saline Habitat of Coastral Gujarat India”. 3ed ed. C. UK Carman. 1993. 2001. 3rd ed. 11-23 Collowick. patel. 1999. DAFTAR PUSTAKA Atlas. Blackwell Publishing Ltd. N O. S dan Arora. Californi. SP. 1979. RK and Singh. New Jersey Bugg. “Microbial Ecology: Fundamental and Application”. B. 1999. T J. The Benjamin Cummings Publishing Company Inc. 4725-4733 Brock. Brazilian Journal of Microbiology Vol 37: 276-282 . J Bacteriol. page 51-58. D R. Prenctice-Hal Inc. page 50-104 Dodia M S. Academic Press Inc. Encyclopedia of life sciences Dennison. and Richard. Micro. S P. “Introduction to enzyme and coenzyme chemistry”. “Methods in Enzymology”.2th edition. Kluwer academic publisher. “Bacterial Characteristics: Introduction to Bacteriology”. “Halophiles”. “A guide to protein isolation”. 2001.