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3B-2

GUÍA DE PRÁCTICAS

Unidad académica:
Escuela Académico Profesional de Obstetricia

Nombre de la asignatura:
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

Autor (es):
Mg. Marco Antonio Mesía Guevara

F-CV3-3B-2 Rev. 3 – Mar. 2013


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INTRODUCCIÓN

El laboratorio constituye el lugar trabajo, tanto para la enseñanza como para la investigación y es
preciso conocer los diferentes materiales, instrumentos, reactivos y equipos con los que cuenta.
El laboratorio de microbiología representa, a diferencia de otras ramas de la Biología, prerrequisito
imprescindible para su desarrollo como ciencia, inventos como: el microscopio, los medios de cultivo,
tinciones, pruebas y recuentos entre otros han sido pilares en el desarrollo de la microbiología, es por
esta razón que los estudiantes deben comprender los procedimientos básicos en la técnica del manejo
de los microorganismos para lograr un buen aprendizaje de la microbiología.
Es importante que al final de la práctica, los estudiantes comprendan el uso de los instrumentos y
equipos que se usan y la importancia de tener una manipulación adecuada del material. El concepto
de asepsia y de trabajo ordenado ayuda al desarrollo de la práctica.
El trabajo de laboratorio representa uno de los aspectos fundamentales que contribuye en la definición
de la vocación tecnológica y científica del ser humano y en especial de los jóvenes por estar en un
periodo de formación intelectual, ya que ello permite que la teoría sea comparada con la práctica.
Es tarea fundamental de los docentes motivar la participación activa de los estudiantes en el desarrollo
de prácticas de laboratorio y de campo, con el fin de que se mejoren sus habilidades y destrezas en
cuanto al manejo de materiales y reactivos, con lo cual están en posibilidades de lograr un cambio o
transformación del entorno en donde vive, así como la de su propia realidad.

Por esta razón, creí conveniente la elaboración de esta guía de prácticas, cuyo contenido tiene como
finalidad brindar al estudiante un material ordenado y de fácil acceso al trabajo de laboratorio en la
asignatura de microbiología.

La presente guía consta de trece experiencias, las cuales se desarrollaron en varias etapas
mediante la recopilación de prácticas. Cada práctica inicia con el título en la parte central, el cual
se seleccionó de acuerdo a la dosificación del programa por semana. La competencia hace
referencia al aspecto significativo que logran los alumnos al final del experimento. El
fundamento teórico de cada una de las prácticas, fue elaborado en base a diversas referencias
bibliográficas. En la parte experimental, el procedimiento fue desarrollado consultando diversos
manuales de Educación Superior. El cuestionario en el que el alumno demuestra su
aprovechamiento logrado al final de la secuencia de aprendizaje, se elaboró basado en el aspecto
introductorio y resultados experimentales que se esperan de cada práctica.
Finalmente, agradezco anticipadamente a sus lectores por hacerlos de su conocimiento.

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RECOMENDACIONES GENERALES

1. El estudiante deberá asistir a las clases prácticas correctamente uniformado de blanco y llevando
consigo mandil blanco, gorro, mascarilla y guantes descartables. Además plumón indeleble
para escritura en vidrio y lápices de colores.
2. El alumno que incumpla el ítem anterior no podrá ingresar a sala de prácticas.
3. Está prohibido comer, beber y fumar en sala de prácticas.
4. Sobre la mesa de trabajo sólo colocará materiales, guía práctica y libreta de apuntes.
5. Antes y después de cada práctica el estudiante desinfectará la mesa de trabajo, para lo cual
deberá contar siempre con un frasco de alcohol yodado, algodón y gasa.
6. Finalizada la práctica el estudiante eliminará los materiales de desecho al depósito
correspondiente.
7. Las láminas preparadas deberán ser colocadas en una caja para su archivo.
8. Todas las placas y tubos con medios de cultivo ya usados serán colocadas en las canastillas
para su autoclavado y desecho.
9. Las láminas coloreadas a desecharse deberán ser colocadas en recipientes con boca ancha
conteniendo desinfectante.
10. Los cultivos a incubarse deberán rotularse con los siguientes datos:
a. Nombre o iniciales del estudiante.
b. Nombre del microorganismo, número de mesa, sección y fecha.
c. Las placas se colocarán en forma invertida, salvo indicación contraria del docente. d. Los
tubos deberán estar bien tapados y colocados en gradillas.
e. Los alumnos son responsables de colocar los cultivos en las estufas a temperatura y tiempo
adecuados.
f. Los alumnos son responsables de la observación macroscópica tras la incubación.
11. Al finalizar la práctica, el estudiante se responsabiliza de:
a. Limpiar los objetivos y platina del microscopio con algodón y alcohol isopropílico.
b. Ubicar el objetivo de menor aumento frente al condensador y verificar que no queden láminas
sobre la platina.
c. Desinfectar la mesa de trabajo. d.
Cerrar la válvula de gas.
e. Lavarse las manos con jabón carbólico.
12. El protocolo será controlado por el docente al final de cada práctica.

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PRÁCTICA Nº 01

BIOSEGURIDAD. ESTERILIZACIÓN. MECANISMOS DE TRANSMISIÓN DE LAS


ENFERMEDADES INFECCIOSAS.

1.1 FUNDAMENTO TEÓRICO

Contaminantes biológicos

Las condiciones de trabajo pueden resultar negativas si se realizan en presencia de contaminantes


biológicos. Estos contaminantes son aquellos agentes biológicos que cuando se introducen en el cuerpo
humano ocasionan enfermedades de tipo infeccioso o parasitario.

Mecanismos de transmisión de las enfermedades infecciosas: Son las formas como se transmiten los
agentes biológicos de un lugar a otro. Intervienen en ello: el hombre, los animales y el medio ambiente,
dependiendo del tipo de microorganismo

Vías de penetración en el organismo

Las principales vías de penetración en el cuerpo humano son:

Vía respiratoria: a través de la inhalación. Las sustancias tóxicas que penetran por esta vía
normalmente se encuentran en el ambiente difundidas o en suspensión (gases, vapores o
aerosoles). Es la vía mayoritaria de penetración de sustancias tóxicas.
Vía dérmica: por contacto con la piel, en muchas ocasiones sin causar erupciones ni
alteraciones notables.
Vía digestiva: a través de la boca, esófago, estómago y los intestinos, generalmente cuando
existe el hábito de ingerir alimentos, bebidas o fumar en el puesto de trabajo.
Vía parenteral: por contacto con heridas que no han sido protegidas debidamente.

Cuando la sustancia tóxica pasa a la sangre, ésta la difunde por todo el organismo con una rapidez que
depende de la vía de entrada y de su incorporación a la sangre.

Cuando las condiciones de trabajo puedan ocasionar que se introduzcan en el cuerpo humano, los
contaminantes biológicos pueden provocar en el mismo un daño de forma inmediata o a largo plazo
generando una intoxicación aguda, o una enfermedad profesional al cabo de los años.

Las tres condiciones que deben cumplirse para favorecer la actividad de los contaminantes biológicos son
la presencia de nutrientes, humedad y temperatura.

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Bioseguridad: Se refiere a un conjunto de acciones o medidas preventivas que protegen la salud y la
seguridad de las personas frente a riesgos asociados con la presencia de agentes biológicos, químicos
y físicos en sus centros de trabajo.

Durante el trabajo diario de la sección de microbiología, se dan situaciones de potenciales riesgos que
varían según el agente infeccioso y los procedimientos utilizados. Las Normas de Bioseguridad pretenden
reducir a un nivel aceptable el riesgo inherente a la manipulación de material peligroso.

El trabajo en el laboratorio de microbiología es, como en la mayoría de las otras secciones del Laboratorio
Clínico, un trabajo de grupo. La actitud ante las prácticas seguras de cada uno de los integrantes del
equipo, determinan su propia seguridad, así como la de sus compañeros y la de la colectividad del
Laboratorio.

Por otra parte, el equipamiento y el diseño del Laboratorio de Microbiología es parte fundamental
en el esfuerzo de protección de los empleados en el ejercicio de sus labores; sin embargo, las
características especiales del trabajo en la sección de Microbiología, hacen imperante un Manual que
sirva de guía a los trabajadores de la salud y particularmente a los microbiólogos en su trabajo diario. La
formación es pues clave en la eficacia de los programas de seguridad y ésta debe ser facilitada a todas
las personas que están expuestas a los riesgos del laboratorio.

Un programa de seguridad gestionado por profesionales bien entrenados, con un alto grado de
participación por parte de los trabajadores, puede llevar no sólo a una disminución del número de
lesiones y enfermedades, sino también a un incremento de la satisfacción del trabajador y de su
productividad.

El propósito de la presente práctica es entre otras cosas describir la metodología a seguir en un programa
de Bioseguridad en microbiología, de tal manera que sea una guía para el trabajo seguro en el laboratorio
que envuelve microorganismos potencialmente peligrosos.

La peligrosidad de un agente está directamente relacionada con el tipo de microorganismo y la


manipulación a la que es sometido. Por ello es básico:

1. Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el laboratorio.

2. Conocer la metodología de trabajo del laboratorio.

3. Conocer el equipamiento del laboratorio.

4. Conocer las medidas a tomar en caso de emergencia.

5. Conocer las leyes relacionadas con la seguridad biológica.

6. Respetar y hacer cumplir todo lo anterior.

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Para que se produzca un accidente por agente biológico deben concurrir básicamente cuatro
elementos:

a. Un huésped susceptible b.
Un agente infeccioso
c. Una concentración suficiente de éste d.
Una ruta de transmisión apropiada.

Las siguientes medidas son de obligado cumplimiento en cualquier área del laboratorio:

El acceso al laboratorio estará limitado al personal autorizado.


No deben entrar en el mismo, familiares ni amigos.
El personal del laboratorio debe implicarse en el cumplimiento de las normas de
seguridad.
Todas las áreas estarán debidamente marcadas con la señal de riesgo biológico y su nivel de
contención.
Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas para mantener la adecuada contención biológica.
Todas las superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán diariamente y siempre que se produzca
un derrame. Los residuos y muestras peligrosas que van a ser incinerados fuera del laboratorio
deben ser transportados en contenedores cerrados, resistentes e impermeables siguiendo las normas
específicas para cada tipo de residuo.
El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado y no es aconsejable utilizar los pasillos como
almacén. Siempre debe quedar un espacio libre no inferior a 120 cm para poder evacuar el laboratorio
en caso de emergencia.

El transporte de las muestras dentro o entre laboratorios se realizará de tal manera que, en caso de
caída, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo en cajas herméticas o neveras
transportables. Estas cajas o neveras deberán ser rígidas y resistentes a los golpes, contar con
materiales absorbentes en su interior y de fácil desinfección. Se etiquetarán o identificarán de forma
oportuna y no podrán ser utilizadas para otros fines. Bajo ningún concepto se deben transportar las
muestras a mano.
La ropa protectora, fácilmente ajustable y confortable, así como guantes, gafas, etc. debe estar
disponible en todo momento. La ropa protectora de las áreas con nivel de contención 3 (batas) nunca
debe ser usada fuera del área de trabajo y si se quita debe de ser desechada automáticamente en una
bolsa de material contaminado. Jamás debe volver a ser usada.
Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con materiales
potencialmente infecciosos. Con este fin deben usarse guantes cuando se manipulen muestras o
cultivos que contengan posibles patógenos. Los guantes siempre serán desechados antes de salir del
área de trabajo. Jamás se saldrá de la misma con los guantes puestos, ni con ellos se cogerá el
teléfono, se tocarán las hojas de examen, maniguetas de las puertas, etc.
Tras quitarse los guantes, se realizará un lavado de manos.
Se usarán gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de salpicaduras y/o
aerosoles.
Se pondrá extremo cuidado en minimizar el riesgo de autoinoculación y de generación de
aerosoles.
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Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al profesor. y hacerse constar
por escrito.
Está rigurosamente prohibido pipetear con la boca. Se realizará pipeteo automático con material
adecuado y cada trabajador será instruido para manejarlo debidamente.
En la zona de trabajo no debe colocarse material de escritorio ni libros ya que el papel
contaminado es de muy difícil esterilización.
No deberán usarse lentes de contacto.
El personal con el cabello largo debe llevarlo recogido.
Comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos está formalmente prohibido en el área de trabajo del
laboratorio, así como el almacenamiento de comida o bebida.
El personal debe lavarse las manos frecuentemente durante las actividades rutinarias, tras acabar la
jornada laboral y siempre antes de abandonar el laboratorio (almorzar). Se usará un jabón antiséptico
y el secado se realizará con papel.
Las heridas y cortes en las manos, si se han producido en el Laboratorio, serán comunicados al
responsable de la Sección correspondiente, así como al profesor que lo registrará haciendo
constar todas las circunstancias. Las heridas y cortes deben ser convenientemente vendados y
después es imprescindible ponerse guantes.

CLASIFICACIÓN DE LOS AGENTES BIOLÓGICOS POR GRUPO DERIESGO:

Los agentes biológicos se clasifican en grupos, según su diferente índice de riesgo de infección. Para
protegerse de los agentes biológicos se utilizan sistemas de protección física para que imposibiliten el paso
del agente biológico patógeno al organismo humano.

Según sea la virulencia del agente biológico patógeno que se encuentre en el puesto de trabajo existen
varios niveles de contención que corresponden a los niveles de bioseguridad que se deben alcanzar en
locales e instalaciones en las que se trabaje con agentes biológicos de los diferentes grupos de riesgo

El Centro de control y la prevención de enfermedades de Estados Unidos (CDC) categorizan varias


enfermedades en niveles de riesgo, 1 que es riesgo mínimo y nivel 4 que es riesgo extremo. En España
estos niveles se establecen en el Real Decreto 664/1997.

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Nivel 1: Varias clases de bacterias incluyendo Bacillus subtilis, Hepatitis canina, E. coli, varicela,
así como algunos cultivos de célula y bacterias no-infecciosas. A este nivel las precauciones
contra los materiales biopeligrosos son guantes de participación mínimos, más probable y una
cierta clase de protección facial. Generalmente, los materiales contaminados se depositan
separadamente en receptáculos para residuos. Los procedimientos de descontaminación para
este nivel son similares en la mayoría de los casos a las precauciones modernas contra los virus
habituales (p.ej.: lavándose las manos con jabón antibacteriano, lavando todas las superficies
expuestas del laboratorio con los desinfectantes, etc.). En ambiente de laboratorio, todos los
materiales usados para en cultivos celulares y/o cultivos de bacterias son descontaminados
en el autoclave.
Nivel 2: Hepatitis B, hepatitis C, gripe, Enfermedad de Lyme, salmonelas, VIH.
Nivel 3: Ántrax, paperas, Virus del Nilo Occidental, SRAS, viruela, tuberculosis, tifus, Fiebre
amarilla, Hanta, Dengue.
Nivel 4: Fiebre hemorrágica boliviana, Fiebre Hemorrágica Argentina, Ébola, Virus de Lassa, y
otras enfermedades hemorrágicas (sobre todo las africanas). Al manipular peligros biológicos de
este nivel, el uso de traje hazmat (traje de protección de materiales peligrosos) y una fuente
de respiración autónoma con oxígeno es obligatoria. La entrada y la salida de un laboratorio del
nivel cuatro contendrán duchas múltiples, un cuarto de vacío, cuarto de luz ultravioleta, y otras
medidas de seguridad diseñadas para destruir todos los rastros del microorganismo.

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1.2 COMPETENCIAS

Reconoce las medidas de bioseguridad a tener en cuenta en el laboratorio de


microbiología
Explica los mecanismos de transmisión de las enfermedades infecciosas a través
del desarrollo de un cuadro sinóptico.
Identifica y describe los diferentes materiales de laboratorio.

1.3 MATERIALES Y EQUIPOS


Microscopio. Asa de siembra.
Autoclave. Algodón.

Baño maría. Papel Kraft.


Láminas y laminillas. Frasco con solución
Frasco con solución sulfocrómica.
desinfectante Aceite de cedro.

Envase para descarte de Torundas.


agujas Hisopos.
Tubos de prueba. Guantes.
Placas Petri. Mascarilla.

Pipetas. Gorro.
Baguetas. Guardapolvo.
Mechero.

1.4 PROCEDIMIENTO

2. Señale la vía y mecanismo de contaminación de los siguientes microorganismos:

Microorganismo Vía Mecanismo de contaminación

Mycobacterium tuberculosis
Salmonella typhi
Entamoeba histolytica
Bacillus anthracis

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3. Utilizar la siguiente cartilla de bioseguridad y marcar según corresponda:

N° REQUISITOS SI NO
01 Uso de mascarilla
02 Uso de mandil de manga larga
03 Uso de guantes
04 Se lava la mano después de las prácticas
05 Sólo coloca su guía de práctica sobre la mesa de trabajo
06 Está vacunado contra la hepatitis B, tétanos
07 El laboratorio cuenta con extinguidores
08 En la puerta del laboratorio debe haber una señal de
bioseguridad
09 Se trabaja en cubículo
10 Uso de gorro si tiene cabello largo
11 Uso de collares, anillo, brazaletes
12 Uso de zapato alto
13 Comer , fumar dentro del laboratorio
14 Coloca la mano en la nariz, boca ojos durante la práctica
15 El área de trabajo se desinfecta antes y después de la
práctica

4. Indique el nivel de bioseguridad alcanzado por la mesa de trabajo

Nivel de 10% Nivel mayor a 50% Nivel de 100%

1.5 CUESTIONARIO

2. ¿Cuántas veces deben ser usados los guantes luego de atender a una paciente?
3. ¿Qué desinfectante se utiliza con frecuencia en el laboratorio de microbiología?
4. ¿Qué método de esterilización se emplea con las pinzas y tijeras?
5. Cite 3 medidas de bioseguridad
1.6 FUENTES DE INFORMACIÓN

Murray, P.R. Microbiología médica. 6ta. Edición. 2009. Elsevier


Tortora, G. Introducción a la microbiología. 9na. Ed. Editorial médica Panamericana.
2007
Jawetz, E. Microbiologia Médica. 23a ed. México: El Manual Moderno; 2005.
Brooks, G. Microbiología y Parasitología. 23 a ed. México: El Manual Moderno; 2005

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PRÁCTICA N° 02
EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y MATERIALES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

2.1 MARCO TEÓRICO

MICROSCOPIO
El microscopio es indispensable en el Laboratorio de Microbiología para el estudio de la morfología
y estructura de los microorganismos, así como su reacción a diferentes colorantes, lo cual junto con otros
criterios, permitirá su identificación, por lo tanto, es importante conocer su adecuado manejo. Antonio van
Leeuwenhoek, en 1676, gran apasionado en pulir lentes que utilizaba para examinar gran variedad de
materiales, fue el primero en observar bacterias y protozoarios en agua de lluvia, en infusiones diversas y
en su sarro dental.
La máxima amplificación que logró Leeuwenhoek en los diversos microscopios que construyó fue de 300
diámetros.
La perfección del moderno microscopio compuesto facilita intensamente el estudio de la morfología de
microorganismos y por lo menos de algunas de las grandes estructuras de la célula bacteriana.
A finales del siglo XIX surgieron avances importantes en Microscopía, período de gran progreso en
Microbiología.

MÉTODOS DE MICROSCOPIA
Examen de organismos vivos.
La forma más simple de examinar las bacterias y otros microorganismos vivos es suspenderlos en agua u
otro líquido, colocar una gota de esta suspensión en un portaobjetos ordinario y encima un cubreobjetos,
utilizando para su observación al microscopio los objetivos seco débil y seco fuerte. Existen otros métodos
como son el de gota pendiente y el microcultivo.
Examen de bacterias teñidas.
La forma y estructura de las bacterias se revelan con más claridad cuando son desecadas sobre un
portaobjetos y son coloreadas o examinadas contra un fondo teñido. Existen diversas técnicas de tinción.
Para la observación microscópica proceda según el siguiente orden:
La elección de la iluminación depende de la fuente de luz, aumentos empleados y otros
factores.
Enfoque de preferencia con el objetivo de menor aumento, que por lo común tiene un
tope inferior que impide la ruptura de las láminas a observar.
Una vez enfocado el objeto, haga rotar el revólver y utilice el objetivo deseado.
Al usar el de inmersión, coloque previamente una gota de aceite de cedro sobre la
preparación. Al colocarse el objetivo en posición debe existir una continuidad entre ellas.
Para el enfoque preciso, use tornillo micrométrico.

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 Mantener los ojos
abiertos, aunque el microscopio sea monocular.
Al terminar la observación limpie le objetivo con papel especial para lente, algodón
o un lienzo fino, embebido con alcohol isopropílico o xilol en pequeña cantidad y secar.
Las láminas ya observadas, se depositarán en un recipiente de boca ancha con
solución sulfocrómica.

CUIDADO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO


Para transportar el microscopio a la mesa de trabajo deberá tomarse del brazo con la mano
derecha y de la base con la mano izquierda y en posición vertical.
Antes de usarlo, limpiar perfectamente la fuente de luz del microscopio, parte superior del
condensador, ocular y objetivo con papel lente y no con el pañuelo u otro tipo de papel, porque
los raya. Utilice Xilol o alcohol isopropílico.
No encender la fuente de luz, sino hasta que se vaya a usar.
Colocar la muestra sobre la platina y girar el objetivo que se va a usar colocándolo en la posición
correcta mientras que se observa el material.
Ver por el ocular y controlar la cantidad de luz adecuada, moviendo el condensador y
diafragma.
Para enfocar, bajar el objetivo que se va a usar con ayuda del tornillo macrométrico hasta que
dicha lente se encuentre a medio centímetro del objeto, luego enfocar primero con el tornillo
macrométrico y una vez que se ha localizado el campo, usar el tornillo micrométrico para aclarar
la imagen.
Con respecto al objetivo de inmersión, hay que tener mucho cuidado, ya que la distancia focal es
muy corta y habrá que emplear únicamente el tornillo micrométrico y no el macrométrico debido
a que se puede dañar la preparación y la lente del objetivo, para su utilización es recomendable:
Levantar el tubo óptico del microscopio, antes de poner el objetivo en posición.
Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación. No usar aceite en exceso,
ya que daña el cemento de las lentes.
Viendo por fuera del microscopio, como ya se insistió anteriormente, bajar el objetivo
con el macrométrico hasta que toque la gota de aceite. A partir de ese momento el
objetivo estará prácticamente dentro de su distancia focal.
Enfocar la preparación con movimientos del tornillo micrométrico.
Evitar girar el revólver de los objetivos sin antes levantar el tubo óptico del
microscopio.
Recordar que el objetivo 45X es más largo que el de 10X y más todavía que el de
inmersión, por lo que deberá tenerse cuidado, pues si llegan a rozar, la platina los
inutiliza permanentemente.
Cuando se vaya a utilizar el objetivo seco fuerte (45X), hacer primero el enfoque de la
preparación con el objetivo seco débil, luego, girar el revólver de tal

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manera que el siguiente objetivo sea el seco fuerte, cuidando que la lente no tope con
la preparación.
Ajustar el enfoque usando el tornillo micrométrico.
Mantener el microscopio retirado de la orilla de la mesa.

AUTOCLAVE
HORNO (Horno Pasteur o Poupinel)
ESTUFA O INCUBADORA
REFRIGERADOR O NEVERA
CENTRÍFUGA
BALANZA BAÑO MARÍA
AGITADOR MECÁNICO
POTENCIÓMETRO
CONTADOR DE COLONIAS

MATERIALES DE VIDRIO
Materiales que deben ser de buena calidad, resistir acciones mecánicas y cambios bruscos de
temperatura, tener bajo coeficiente de dilatación y una mínima cantidad de álcali libre.
PLACA PETRI
TUBOS DE PRUEBA (Tubos de ensayo).
MATRACES Y BALONES
PIPETAS
PROBETA
FIOLAS
MATRAZ DE PRECIPITADO
LÁMINAS PORTA Y CUBREOBJETOS

OTROS MATERIALES
MANGOS DE KOLLE
ESPÁTULAS DE METAL
TRÍPODE
PIZETA O FRASCO LAVADOR
MECHERO BUNSEN

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2.2 COMPETENCIAS
Identifica y reconoce los principales equipos, instrumentos y materiales utilizados en el
Laboratorio de Microbiología.
Maneja de manera adecuada los equipos, instrumentos y materiales usados en las diversas
prácticas de microbiología.

2.4 MATERIALES Y EQUIPOS


Placas Petri Rejilla metálica
Probetas Mechero

Pipetas Tubos de prueba


Matraz Erlenmeyer Asas de siembra
Beaker Microscopios
Baguetas Gradillas

Trípode Pesetas

2.5 PROCEDIMIENTO
Reconozca y dibuje a escala cada uno de los materiales de laboratorio, colocando el nombre
respectivo y su uso.

2.3 CUESTIONARIO
1. Dibuje los diferentes equipos y materiales de laboratorio estudiados.
2. Describa y esquematice el modo de usar una pipeta y una placa Petri.
3. ¿Qué material de laboratorio utilizaría para medir volúmenes pequeños y exactos?
4. ¿Qué equipo de laboratorio utilizaría para esterilizar medios de cultivo?
5. ¿Qué volumen cree usted más exacto, el medido con una pipeta aforada o el medido con una
graduada?
6. ¿Qué implementos volumétricos miden vaciando?
7. ¿Para qué se usan los implementos que se le entregaron en esta sesión de laboratorio?
8. ¿Cuál es el objetivo de usar la rejilla de asbesto?

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PRÁCTICA N°03
COLORANTES Y COLORACIONES BACTERIANAS

3.1 MARCO TEÒRICO


PARED CELULAR
Debajo de las sustancias extracelulares tales como las cápsulas o capas mucosas y externas a la
membrana citoplasmática está la pared celular que es una estructura muy rígida y que da forma a la
célula. El espesor de la pared celular oscila entre 10 y 35 nm, sin embargo algunas paredes celulares son
considerablemente más gruesas.
Las paredes celulares bacterianas son esenciales para el crecimiento y la división. Todas las
bacterias poseen paredes celulares rígidas que protegen a la célula de explotar en medios de baja
presión osmótica.
Composición química de las paredes celulares.- El péptidoglucano proporciona a la pared celular una
estructura rígida. Estos grandes polímeros, están compuestos de tres clases de bloques estructurales:
N- Acetil-Glucosamina, Ácido N- Acetil-Murámico y un péptido que consta de cuatro o cinco aminoácidos
que son: L- alanina, D-Alanina, _D-Ácido Glutámico y Lisina. Además contiene proteínas con
polisacáridos, lipoproteínas y lipopolisacáridos.
Propiedades y Funciones:
Brinda protección y resistencia a la bacteria frente a los posibles cambios de presión osmótica
del medio en el que se encuentra y a la acción de ciertos agentes externos.
Presenta Poros que actúan como filtros, permitiendo el pasaje de agua y metabolitos
esenciales.
Presenta antígenos de tipo y grupo específicos.
Participa en la división (multiplicación) bacteriana (se invagina junto con la membrana
plasmática).
En las bacterias Gram .negativas tiene poder patógeno debido a que presenta
endotoxinas (Lípido A).
Es el sustrato donde actúan los Beta Lactámicos y otros antimicrobianos.
COLORANTE: Sustancia química de origen natural o sintético que otorga color. Por su
naturaleza, se clasifican en colorantes naturales y artificiales.
Naturales: Son de origen animal y vegetal. Ejemplo: El Carmín es obtenido de la
cochinilla, la hematoxilina y el tornasol que son obtenidas de las plantas.
Artificiales o Sintéticos: Obtenidos como derivados del carbón de piedra o hulla. Son
conocidos como anilinas. Ejemplo: azul de etileno, safranina, violeta de genciana, etc.
Por su afinidad tintorial, es decir de acuerdo al comportamiento químico del colorante, se clasifica
en:
a) Colorantes Ácidos
b) Colorantes Básicos. c)
Colorantes Neutros.

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a) Colorantes Ácidos: Se dice que un colorante es ácido o aniónico, cuando la parte básica o catiónica
es incolora y la parte ácida o aniónica es coloreada, teniendo afinidad por el citoplasma. Ejemplo:
Ácido pícrico, Eosina, Fucsina ácida, etc.
b) Colorantes Básicos: Son los colorantes que tienen la parte básica o catiónica coloreada y la
parte ácida o aniónica incolora. Tienen afinidad por el núcleo. Ejemplo: Violeta de genciana, Fucsina
básica, Tionina, etc.
c) Colorantes Neutros: Son los colorantes que tienen la parte ácido y básica coloreada y tiñen al núcleo
de un color y al citoplasma de otro. Ejemplo: Leishman, Giemsa, Wright, Eosinato azul de metileno, etc.
COLORACIÓN O TINCIÓN
Proceso en el que se produce un intercambio de iones entre los colorantes y los sitios activos de la
superficie o del interior de la célula.
Las coloraciones según el número de colorantes pueden ser: A)
Simples
B) Diferenciales
C) Especiales
A) COLORACIONES SIMPLES.
Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para la observación de la morfología de los
microorganismos. Ejemplos: Coloración de azul de metileno, Tinta china y la de azul de lactofenol.
B) COLORACIONES DIFERENCIALES.
Son aquellas coloraciones que utilizan más de un colorante. Generalmente al primer colorante se le
denomina Colorante Primario, mientras que al segundo se le denomina Colorante Secundario o de
Contraste. Permiten observar diferencias entre células bacterianas o partes de la estructura bacterianas.
Ejemplos: Coloración Gram y Coloración de Ziehl Neelsen (también llamada ácido alcohol resistente).
C) COLORACIONES ESPECIALES.
Cuando se utilizan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares. Ejemplo: Giemsa,
Wrigth, Leishman, Vago, etc.
PASOS GENERALES DE UNA COLORACIÓN:
a) Extensión: Consiste en colocar la muestra sobre una lámina portaobjetos, extendiéndola
uniformemente.
b) Fijación: Fijar la muestra sobre la lámina portaobjeto utilizando alcohol, éter o flameado suavemente
sobre el mechero o simplemente dejarlo al medio ambiente.
c) Tinción: Se utiliza el colorante requerido cubriendo la muestra en su totalidad por un tiempo
determinado.
d) Lavado: Enjuagar usando un chorro suave de agua. e)
Secado: Dejar secar la lámina al calor del mechero.
f) Observación: Observar con el objetivo de inmersión usando el aceite de cedro.

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COLORACIÓN GRAM
A pesar de que fue desarrollada en el siglo XIX la tinción de Gram es la más utilizada en el diagnóstico
microbiológico. La tinción de Gram es una tinción diferencial que permite distinguir dos grandes grupos
bacterianos: las Gram (+) y las Gram (-).
Tinción empleada en microbiología para la visualización de bacterias en muestras clínicas. También se
emplea como primer paso en la diferenciación bacteriana. El examen con microscopio óptico de
preparación con tinción de Gram se emplea de rutina para determinar la forma de las bacterias. Las
formas comunes son cocos (esféricas), bacilos (alargadas) y formas espiraladas Las bacterias pueden
diferenciarse con esta tinción en dos grupos. Los microorganismos Grampositivos se tiñen de azul,
mientras que aproximadamente un tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los organismos
espira lados se tiñen de rojo y se dice que son Gramnegativos.
Las aplicaciones más comunes de la coloración de Gram son las siguientes:
La presencia de cocos Grampositivos agrupados sugiere estafilococos; en cadenas sugiere
estreptococos; en forma de lanceta a los diplococos.
La presencia de diplococos gramnegativos es característica de especies de
Neisseria.
Los bacilos Grampositivos grandes sugieren especies de Bacillus o Clostridium
Los bacilos Grampositivos pequeños sugieren especies de Listeria o una de las
corineiformes (difteroides).
Los bacilos Gramnegativos son las bacterias más comunes halladas en los laboratorios clínicos e
incluyen a Enterobacteriaceae, bacilos no fermentadores y especies de Haemophilus.
El valor diagnóstico de esta tinción es variable; normalmente permite una buena orientación al
microbiólogo para seleccionar las técnicas de cultivo más adecuadas y también tiene valor en orientar
hacia un diagnóstico etiológico, en especial para instaurar un tratamiento inicial.
La tinción de Gram requiere cuatro soluciones:
Primer colorante: El cristal violeta es un colorante básico que en contacto con las células
bacterianas cargadas negativamente, reaccionan con ellas coloreándolas.
Solución mordiente: El Lugol que fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante
y las células. El ingrediente activo de este compuesto es el I 2; El KI simplemente hace soluble el
I 2 en el agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal
violeta. Hasta este momento las células Gram (+) como Gram (-) se encuentran teñidas de color
violeta.
Agente decolorante: El alcohol acetona es un solvente orgánico que disuelve la
membrana externa de las Gram (-) facilitando la salida del complejo colorante- mordiente.
Debemos tomar en cuenta la delgada capa de mureína incapaz de retener este complejo en las
Gram (-).

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Luego de este tratamiento las bacterias Gram (+) mantienen el color violeta y las Gram
(-) quedan decoloradas.
Colorante de contraste: Es un colorante básico de distinto color que el primer colorante, como la
safranina ola fucsina básica.
Los dos grupos bacterianos que distingue esta técnica difieren en el color con el que finalmente aparecen.
Las bacterias Gram (+) se tiñen de azul-violeta por el cristal violeta y no perderán esta coloración durante
los pasos sucesivos. Las bacterias Gram (-) perderán la coloración inicial del cristal violeta en los
siguientes pasos y se teñirán de rosa debido al colorante de contraste.
La diferencia está determinada por la composición de su pared celular. Las bacterias Gram (+)
poseen una gruesa malla de péptidoglucano en su parte más externa, mientras que, las Gram (-
), recubriendo una capa fina de péptidoglucano, presentan una membrana lipídica externa que envuelve
toda la célula.

COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN

También es una tinción diferencial. Se denomina tinción ácido-alcohol resistente y es específica para una
serie de bacterias con estructura de pared particular, las micobacterias. La pared de las micobacterias no
está basada en péptidoglicano como las bacterias Gram positivas y Gram negativas, sino en ácidos
micólicos. Esta particularidad las hace resistentes a la decoloración con ácido y alcohol que no se
produce en casi ningún otro tipo bacteriano.

Mycobacterium tuberculosis

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La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción rápida y económica, para la identificación
de microorganismos patógenos, por ejemplo M. tuberculosis.
Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl, un bacteriólogo y Friedrich
Neelsen, un patólogo.

FUNDAMENTO
La tinción de Ziehl-Neelsen utiliza tres reactivos. El colorante primario es la fucsina que tiñe toda la
preparación de rojo brillante. Como mordiente se utiliza flameado de la preparación con el colorante. La
solución decolorante elimina el colorante primario excepto en los bacilos ácido alcohol resistentes.
(BAAR). Por último el azul de metileno tiñe de azul el resto de la preparación.
Esta tinción es útil en la detección de bacterias del género Mycobacterium en muestras de esputo. La
presencia de bacilos rojos sobre fondo azul constituye un diagnóstico casi definitivo de tuberculosis.
Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos
micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la
decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan
ácido-alcohol resistente. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos
como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido- alcohol resistencia. La coloración
clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que
contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de
los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el
calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su
entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y la que no se ven de
color azul, ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste.

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3.2 COMPETENCIAS
Identifica y reconoce los colorantes y las principales técnicas de coloración utilizadas en
Bacteriología.
Identifica y reconocerla estructura y morfología bacterianas.

3.3 MATERIALES Y EQUIPOS


Asa de siembra Batería para tinción de Ziehl
Microscopio Neelsen
Porta y cubre objetos Azul de metileno

Aceite de inmersión Puentes para tinción


Piseta con agua destilada Mondadientes
Solución salina Guantes
Mechero Bunsen Gorro
Fósforo Mascarilla

Batería para tinción Gram

3.4 PROCEDIMIENTO

COLORACION CON AZUL DE METILENO


1. Prepara un frotis con la muestra bacteriana y fijar al calor.
2. Cubrir el frotis con 3 gotas del colorante azul de metileno y dejar actuar por 3 – 5 minutos.
3. Lavar con chorro tenue de agua y dejar secar.
4. Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de cedro.

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COLORACIÓN GRAM
1. Dividir la lámina en 3 partes: 1/3 para rotular y 2/3 para la preparación del frotis.
2. Con el asa bacteriológica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en el centro de
la lámina portaobjeto, extendiéndola en espiral del centro a la periferia, para obtener una preparación en
capa fina.
3. Fijar la muestra, mediante el secado completo del frotis por flameado con la ayuda del mechero.
4. Colocar la lámina sobre la varilla o puente de coloración.
5. Cubrir el frotis con 03 gotas de Cristal Violeta (colorante primario), dejar actuar por 2 minutos.
6. Lavar con agua corriente (evitar la caída directa del chorro sobre el frotis).
7. Cubrir con Lugol durante 1 – 2 minutos.
8. Lavar con agua.
9. Decolorar el frotis con la solución de Alcohol Acetona (inclinar la lámina y decolorar hasta que no arrastre
colorante), máximo por 30 segundos.
10. Lavar con agua.
11. Cubrir con 03 gotas del colorante de contraste Safranina durante 2 minutos.
12. Lavar con agua.
13. Secar a temperatura ambiente o con la ayuda de la llama del mechero.
14. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.

COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEL


TÉCNICA
Esta técnica puede realizarse tanto en muestras histológicas como citológicas.
Variante clásica o "en caliente"

Ésta y la siguiente variantes son para preparaciones citológicas.

1. Hacer un frotis de la muestra.


1. La fijación al calor asegurará de que el frotis quede adherido al portaobjetos. Un frotis
muy delgado puede darle resultados falsamente negativos y un frotis muy grueso puede
desprenderse del portaobjetos durante la tinción.
2. Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de tinción con los extendidos
hacia arriba. Nunca tiña más de 12 portaobjetos a la vez.
2. Dejar el frotis sobre el puente de tinción.
3. Aplicar fucsina-fenicada.
1. Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5 minutos.
Mantenga el calor durante este período.
4. Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos).
1. Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre y tiña la pared
celular de la bacteria. No deje que hierva o se seque el colorante.

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2. Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente fría hasta
que toda la tinción libre quede lavada. Lave suavemente de manera que el extendido no
se barra del portaobjetos. Retire el exceso de agua.
5. Decolorar con alcohol-ácido.
1. Cubra cada portaobjetos con la solución decolorante, tal como alcohol ácido y
manténgalo sobre el portaobjetos durante 7 minutos. Si no se decolora suficientemente,
el contenido del esputo que no son bacilos TBC puede permanecer teñido. Enjuague
con agua una vez más los portaobjetos y quite el exceso de agua. Si los portaobjetos
aún están rosa, aplique una cantidad adicional de la solución decolorante de 1 a 3
minutos.
6. Aplicar azul de metileno (1 minuto).
1. Aplique la solución de contraste, azul de metileno, durante 1 minuto.
7. Enjuagar con agua
1. Vuelva a enjuagar con un leve chorro de agua e incline cada portaobjetos hasta drenar el
exceso de agua. Finalmente, coloque cada portaobjetos en una gradilla a que
sequen al aire.
8. Ahora coloque una pequeña gota de aceite de inmersión y haga la observación al
microscopio con el objetivo húmedo.

Algunos microorganismos ácido-alcohol resistentes

Mycobacterium: fuertemente ácido-alcohol resistentes.


Nocardia y Actinomices: débilmente ácido-alcohol resistentes.
Parásitos coccídeos (Cryptosporidium) de muestras [fecales].

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3.5 RESULTADOS
CON AZUL DE METILENO:
Los microorganismos se observan de color azul intenso
PROTOCOLO

COLORACION SIMPLE MORFOLOGÍA DEL ESQUEMA DE LA


MICROORGANISMO OBSERVACIÓN

AZUL DE METILENO

TINCIÓN GRAM
Las Bacterias Grampositivas se colorean de violeta y las Bacterias Gramnegativas de color rojo grosella o
rosado.

PROTOCOLO

CATEGORÍA BACTERIANA MORFOLOGÍA ESQUEMA DE LA


BACTERIANA OBSERVACIÓN

GRAMPOSITIVAS

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GRAMNEGATIVAS

TINCIÓN ZIEHL NEELSEN


Las bacterias ácido alcohol resistentes se tiñen de color rojo y las no ácido alcohol resistente se tiñen de
color azul.

PROTOCOLO

LÁMINA MORFOLOGÍA DEL ESQUEMA DE LA


MICROORGANISMO OBSERVACIÓN

COLORACIÓN DE ZIEHL
NEELSEN

3.6 CUESTIONARIO
1. ¿Qué tipo de colorantes son el azul de metileno, tinta china y el azul de lactofenol?
2. ¿Cuáles son los componentes del azul de metileno?
3. ¿Qué estructura de la bacteria se colorea con el azul de metileno?
4. ¿A qué se debe que las bacterias Gram negativas no retengan el complejo cristal violeta- yodo?
5. ¿A qué se debe que los colorantes básicos tiñan el núcleo de la célula?
6. ¿Con qué clase de colorante teñiría el protoplasma de la célula?
7. ¿Para qué clase de microorganismos es recomendable la coloración ácido alcohol resistente?
8. ¿Cuál es la función de la fucsina fenicada?
9. ¿A qué se denomina colorante primario y colorante de contraste?

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3.7 FUENTES DE INFORMACIÓN

Murray, P.R. Microbiología médica. 6ta. Edición. 2009. Elsevier


Tortora, G. Introducción a la microbiología. 9na. Ed. Editorial médica Panamericana.
2007
Jawetz, E. Microbiologia Médica. 23a ed. México: El Manual Moderno; 2005.
Brooks, G. Microbiología y Parasitología. 23 a ed. México: El Manual Moderno; 2005

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PRÁCTICA N° 04
MEDIOS DE CULTIVO

4.1 MARCO TEÓRICO

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su


crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en
el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es
el Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno
adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los
nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo
contaminante. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en
composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo
es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes. El Agar
es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. En los
diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de
carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de carbono se adicionan por dos motivos
fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación
de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para
promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

Por su aspecto físico los medios de cultivo pueden ser clasificados en: Líquidos, Semisólidos, Sólidos. Y
por su uso en: Medios de cultivos básicos, Medios de cultivos especiales, tales como: mejorados,
selectivos, diferenciales, de transporte.

Los medios de cultivo permiten:


Crecimiento y desarrollo de microorganismos.
Aislamiento e identificación de los microorganismos.
Clasificación de los microorganismos.
Obtención de productos microbianos.
Obtención de cepas microbianas para la fabricación de vacunas.
Obtención de toxinas para la síntesis de antitoxinas
Para su crecimiento los microorganismos deben tomar del ambiente que lo rodea, todas las sustancias
que requiere para la síntesis de sus materiales celulares y energía. A estas sustancias se les denomina
nutrientes y un medio de cultivo debe tener la concentración adecuada de los mismos acorde a los
requerimientos específicos de los microorganismos para los que han sido preparados. Y siendo los
microorganismos extraordinariamente diversos, los medios de cultivo son también muy diversos en cuanto
a número y características nutricias.

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AGUA
Para la preparación de medios de cultivo y reactivos diversos, sólo debe utilizarse agua destilada
o agua desmineralizada, libres de metales disueltos y compuestos bactericidas o bacteriostáticos.
EXTRACTO DE CARNE
Se puede usar cualquier marca de extracto de carne siempre y cuando produzca resultados positivos,
lo que no se debe usar es la infusión de carne.
PEPTONA
Es una proteína degradada para su fácil asimilación por los microorganismos. Se puede utilizar cualquier
peptona que previas pruebas conduzcan a resultados satisfactorios en el crecimiento de
microorganismos.
AZÚCARES
Todos los azúcares usados para la preparación de medios de cultivo deben ser químicamente puros y
adecuados para propósitos bacteriológicos.
AGAR
Agente gelatinoso obtenido de algas marinas y que se emplea de forma granular o
fragmentado para la preparación de medios de cultivo.

REACTIVOS GENERALES
Todos los reactivos generales utilizados como ingredientes en los medios de cultivo deben ser de grado
ACS o de calidad analítica.

COLORANTES
Para la preparación de los medios de cultivo sólo deben emplearse colorantes certificados.
A partir de estos ingredientes es posible preparar un medio de cultivo capaz de permitir el
crecimiento y desarrollo de diversos microorganismos heterótrofos.

TIPOS DE MEDIO DE CULTIVO


A los medios de cultivo se les puede clasificar de las siguientes maneras:

I. SEGÚN SU ESTADO FÍSICO


1. MEDIOS LIQUIDOS: Son los que se presentan en este estado. Se les denomina
Caldos.
2. MEDIO SÓLIDOS: Se preparan a partir de los medios líquidos, a los cuales se les adiciona
un agente gelificante, el Agar agar. Se les denomina Agares.
3. MEDIOS SEMISÓLIDOS: Se les prepara a partir de los medios líquidos y a los que se les
adiciona un agente gelificante pero en menor proporción que para los sólidos.

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II. SEGÚN LA FUNCIÓN QUE CUMPLEN:

1. MEDIOS COMUNES: Son aquellos que poseen los componentes esenciales mínimos para permitir el
crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. Ejemplos: Agua peptonada, Agar
Nutritivo, Agar TSA (Agar Tripticasa Soja), Agar Gelatina, Caldo Nutritivo, etc.
2. MEDIOS ESPECIALES: Son aquellos que se formar a partir de un medio común al cual se le adiciona
diversas sustancias de acuerdo a la finalidad deseada. Pueden ser:
2.1. MEDIOS ENRIQUECIDOS: Cuando se les adiciona sustancias de mayor poder nutritivo como
huevos, extracto de levadura, sangre, vitaminas, etc. Sirven para cultivar microorganismos exigentes en
sus necesidades nutricionales.
Ejemplos:
Agar Sangre: Cuando a un medio común se le adiciona entre 5 y 10% de sangre.
Permite el cultivo de bacterias patógenas.
Agar Ogawa o Lowenstein – Jensen: Medio enriquecido que permite el cultivo de
Mycobacterium tuberculosis (Bacilo de Koch).
Agar Chocolate: Se sintetiza al calentar el agar sangre a temperatura entre 60 –
80°C, tomando el color chocolate característico. Sirve para el crecimiento de
Neisseria meningitis (meningococo) y Neisseria gonorrhoeae (gonococo).
Caldo Cerebro – Corazón (Brain, Heart Infusión. BHI): Sirve para microorganismos
exigentes.
Caldo de Carne, Hemina y Vitamina K: Permite el crecimiento de microorganismos
anaerobios exigentes.

2.2. MEDIOS SELECTIVOS: Son medios de cultivo que tienen la finalidad de favorecer el crecimiento y
desarrollo de una bacteria y al mismo tiempo inhibir el desarrollo de otras. Para este fin se le adicionan
sustancias con efectos INHIBIDORES tales como sal, colorantes, antibióticos o sales biliares. A estos
medios también se les denomina Medios de Aislamiento. Ejemplos:
Agar Mac Conkey, para E. coli y otras Enterobacterias.
Agar Cetrimide, para Pseudomonas.
Agar Manitol Salado, para estafilococos.
Agar Mitis Salivarius, para estreptococos orales.
Agar Clindamicina, para Eikenella corrodens.
Agar GMC (Gelatina, Metronidazol y Cadmio), para el aislamiento de
Actynomices viscosus, Actynomices naeslundii y Actynomices
odontolyticus.
Agar TCBS, para Vibrio cholerae.
Agar Sabouraud, para hongos.

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2.3. MEDIOS DIFERENCIALES: Son los medios que permiten evidenciar las actividades
bioquímicas de un microorganismo frente a sustrato determinado, cambiando sus características
observables y permitiendo su identificación. Ejemplos:
Medio Ox – Ferm, para procesos de Oxidación y Fermentación.
Citrato de Simmons, para determinar el uso del citrato como fuente de carbono.
TSI (Triple Azúcar Hierro), para determinar el uso de Lactosa, Glucosa y
producción de H2S.
LIA (Lisina Agar), para determinar el metabolismo de la Lisina.
Agar Manitol Salado, para determinar la reacción con el Manitol.
Agar Urea.
Agar SIM.

2.4. MEDIOS DE TRANSPORTE: Medios especiales que mantienen viables a los microorganismos
y permiten su transporte desde el lugar de muestra hasta el laboratorio.
Ejemplos:
Medio Cary Blair.
Medio Stuart.
Medio Amies.
Caldo Hajna.
Caldo Tioglicolato.

A veces se combina las características de cada uno de estos medios y por lo tanto el medio resultante
será Enriquecido, Selectivo y Diferencial. Esta clasificación es flexible y se plantea con fines didácticos.

4.2 COMPETENCIAS
Identifica y reconocerlos medios de cultivo de uso frecuente en microbiología.
Conoce y describe los requerimientos nutricionales necesarios para el crecimiento de
microorganismos.
Prepara y autoclava medios de cultivo.

4.3 MATERIALES Y EQUIPOS


Agar común deshidratado.
Placas Petri.
Tubos de ensayo.
Mechero.
Algodón.
Gasa.
Papel Kraft.
Hilo pabilo.
Matraces o balones.
Cocina eléctrica.
Plumón marcador.

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4.4 PROCEDIMIENTO
Pesar los medios respectivos en relación con los volúmenes requeridos.
Disolver los medios en agua destilada y hervir en un matraz.
Esterilizar en autoclave a 121°C/15PSI por 15’.
Repartir en placas y tubos dentro del área de seguridad que brinda el mechero.
Se comprueba la esterilidad de los medios colocándolos en la estufa a 37°C por 24 horas.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

1.- Leer las instrucciones del fabricante para cada medio de cultivo y pesar la cantidad necesaria
según el volumen requerido.

2.- Colocar el medio en un vaso de precipitado que contenga el agua destilada en el volumen requerido,
agitar y calentar a ebullición para disolver el Agar. En el último paso se debe tener cuidado ya que el
recipiente se calienta en exceso y el producto tiende a hervir y proyectarse, lo cual puede producir serias
quemaduras. El Agar disuelto hace transparente al medio que originalmente estaba turbio. Puede
utilizarse un baño maría para aumentar la solubilidad.

3.- Si se va a envasar en cajas de Petri, es necesario conservar el medio en un matraz y esterilizarlo a


121°C durante 15 minutos. Al terminar, es conveniente mantener el mechero encendido para formar un
área de esterilidad al momento del vaciado en las cajas de Petri aproximadamente de 15 ml. a 20 ml
de agar por placa, procurando que no se forman burbujas. Tapar la placa inmediatamente

4.- Si se desea que el agar quede en tubos, entonces se esterilizará el agar directamente en ellos a
121°C durante 15 minutos tapados con algodón, gasa y papel estraza. Si desea que solidifiquen
inclinados, colocarlos en una superficie lisa inclinándolos en un ángulo de 20° a 30°
· sobre una varilla de vidrio.

5.-Para preparar el Agar base Sangre es necesario Adicionar en condiciones de asepsia sangre
desfibrinada estéril en concentración final de 15%. Después de la esterilización del Agar base Mezclar
cuidadosamente y poner en cajas Petri estériles.

6- Dejar Solidificar a temperatura ambiente. Las cajas de Petri colocarlas dentro de bolsas y guardarlas
en el refrigerador.

4.5 CUESTIONARIO
1. Investigue y señale la composición del Agar Nutritivo y Agar Sangre.
2. Indique 05 medios de cultivo selectivos y su importancia.

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3. Esquematice las precauciones que se debe tener en la preparación de los medios de cultivo:
pesado, preparado y autoclavado.
4. Esquematice y dibuje lo realizado.

4.6 FUENTES DE INFORMACIÓN

Murray, P.R. Microbiología médica. 6ta. Edición. 2009. Elsevier


Tortora, G. Introducción a la microbiología. 9na. Ed. Editorial médica Panamericana.
2007
Jawetz, E. Microbiologia Médica. 23a ed. México: El Manual Moderno; 2005.
Brooks, G. Microbiología y Parasitología. 23 a ed. México: El Manual Moderno; 2005.

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PRÁCTICA N°05
SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS – LECTURA E INTERPRETACIÓN DE
COLONIAS

5.1 MARCO TEÓRICO


SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS
Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un
incremento marcado del número de células. Algunas especies alcanzan una población máxima a las 24
horas y otras necesitan un periodo prolongado para alcanzar su m áximo desarrollo. Por esta razón la
siembra es uno de los pasos principales e iniciales del estudio completo de un microorganismo y es
indispensable ejecutarlo cumpliendo con las máximas condiciones de esterilidad, desde la toma de
muestra hasta la siembra, que debe ser efectuada a la brevedad posible.
Es necesario precisar algunos términos:
SIEMBRA: Es el procedimiento por el cual se pone en contacto un microorganismo con el medio de
cultivo. Si el medio es sólido se formarán colonias y si el medio es líquido se observará turbidez,
sedimento, película, etc.
RESIEMBRA O AISLAMIENTO: Consiste en extraer, con un asa o aguja de kölle, una fracción de colonia
y sembrarla en un medio líquido o sólido, logrando así la pureza del cultivo. TRANSPLANTE O
REPICAJE: Consiste en la separación primaria de la cepa a un medio de cultivo adecuado contenido en
un tubo. Conservándose la cepa pura y por seguidos trasplantes en medios especiales, se conocerá las
propiedades culturales y bioquímicas, lográndose su identificación específica de aquella. Los trasplantes
se pueden realizar:
a) De líquido a sólido. b)

De líquido a líquido. c)

De sólido a líquido. d) De

sólido a sólido.
COLONIA: Es el conjunto de microorganismos resultantes del crecimiento y multiplicación en
un medio de cultivo sólido, y que está constituido por un mismo tipo de microorganismos. CULTIVO
PURO: Cultivo que consta de una sola especie bacteriana a partir de la cual se estudia sus
características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas.
CEPA: Es un cultivo puro plenamente identificado y ubicado en su taxonomía correspondiente.
MUESTRA BIOLÓGICA: Es cualquier material biológico de origen humano susceptible de conservación
y que alberga microorganismos. Pueden ser: sangre, orina, esputo, heces, LCR, uñas, pelos, fluido
gingival, paca dental, saliva, abscesos, etc.
TÉCNICAS DE SIEMBRA
La técnica de siembra a utilizar varía según el medio de cultivo a usar, ya sea líquidos o sólidos.
Si es líquido la Siembra por Inoculación será la indicada; si el medio es sólido las técnicas a usar pueden
ser Estría Simple, Por Puntura, Por Incorporación o Por Dispersión o Agotamiento.

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SIEMBRA POR INOCULACIÓN
Con el asa de siembra previamente esterilizada, tomar una cantidad suficiente de inóculo y ponerla
en contacto con el medio líquido.

SIEMBRA POR ESTRÍA SIMPLE


Útil para estudio bioquímico y desarrollo bacteriano. Consiste en deslizar suavemente, en zigzag, el asa
de siembra sobre el medio de cultivo sólido contenido en una placa Petri o tubo.

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SIEMBRA POR PUNTURA O PICADURA
Sirve para estudio bioquímico bacteriano. Con la aguja de kölle, tomar una pequeña cantidad

B
A

de muestra y sembrar introduciendo la aguja hasta cerca del fondo del tubo que contiene medio sólido(a);
después al momento de retirar la aguja de abajo hacia arriba hacer una estría simple(b).
SIEMBRA POR INCORPORACIÓN
Técnica que sirve para el recuento de bacterias y determinar si son anaeróbicas facultativas o
microaerófilas. Consiste en diluir la muestra y añadir el medio de cultivo licuado y enfriado a
45°C, luego repartir la mezcla en placas Petri, dejar enfriar e incubar.

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SIEMBRA POR DISPERSION O
AGOTAMIENTO
Técnica utilizada para obtener colonias aisladas y consiste en repartir el inóculo sobre la superficie del
medio sólido en zigzag en 4 o 5 campos de la placa o también por estría simple
en toda la placa.

Giro de la placa

45°
45°

45°
45°

5.2 COMPETENCIAS
Identifica las diferentes técnicas de siembra y aislamiento de muestras microbianas en medios
de cultivo.

Conoce e identifica los tipos y características de crecimiento bacteriano en medios de


cultivo para su identificación final.

5.3 MATERIALES Y EQUIPOS


Agar TSA en placas y tubos. Cultivos en placa Petri, sembradas por
Caldo nutritivo. técnicas diversas.

Mechero. Cultivos en medio diferenciales de


diferentes microorganismos.
Asas de siembra.
Set de coloración Gram.
Aguja de kölle.
Lápices.
Hisopos.
Gradilla.
Solución salina fisiológica.
Microscopio.
Tubos de ensayo
Aceite de cedro.
Láminas portaobjetos.

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5.4 PROCEDIMIENTO
o Identificar la técnica adecuada para la siembra y proceder a realizarla ya sea en un
medio líquido o sólido. Siempre con el asa o aguja de siembra esterilizada antes y
después de su uso.

o La boca de los tubos se flamean al destaparlos y antes de volver a tapar.

o Las manipulaciones de siembra se deben realizar en el área de seguridad que brinda el


mechero.
o Una vez realizada la siembra y rotuladas las placas y tubos, proceder a incubar en la
estufa a 37°C por 24 horas, al cabo de las cuales se hace la lectura correspondiente.

5.5 RESULTADOS
LECTURA E INTERPRETACIÓN DE COLONIAS
Si se han seguido correctamente las técnicas de siembra y cultivo, sobre algunos planos del medio, se
podrá visualizar masas microbianas definidas y separadas entre sí, llamadas colonias en medio
sólido; y turbidez, sedimento, película o flóculos en medio líquido.
Cada colonia es el resultado de la multiplicación logarítmica de una bacteria depositada en un punto del
medio sólido, que en condiciones óptimas de crecimiento forman una progenie con sus características de
especie o de grupo, las cuales nos permitirán su identificación.
Las principales características morfológicas que presentan las colonias son:
FORMA: Circular, elíptica, puntiforme y filamentosa.
ELEVACIÓN: Plana, convexa, acuminada, umbilicada.
BORDE: Entera, ondulado, dentado, filamentoso.
SUPERFICIE: Lisa, rugosa, granulada.
TAMAÑO: Diámetro en milímetros. CONSISTENCIA: Cremosa,
membranosa, mucosa. CROMOGÉNENESIS: Pigmentación verde,
amarilla, roja, etc. GRADO DE TRANSPARENCIA: Transparente,
translúcido, opaco.

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5.6 CUESTIONARIO
1. ¿En qué consiste cultivar una bacteria?
2. ¿Cuáles son los componentes básicos los medios de cultivo?
3. Define:
Medio de cultivo simple
Medio de cultivo selectivo
Medio de cultivo diferencial

4. ¿Con qué sustancias puede enriquecerse un medio de cultivo? Mencione por lo menos 4.
5. ¿Qué es un medio de transporte y para qué sirve? De 2 ejemplos.
6. ¿Cómo pueden incubarse los microorganismos anaerobios estrictos?

5.7 FUENTES DE INFORMACIÓN

Murray, P.R. Microbiología médica. 6ta. Edición. 2009. Elsevier


Tortora, G. Introducción a la microbiología. 9na. Ed. Editorial médica Panamericana.
2007
Jawetz, E. Microbiologia Médica. 23a ed. México: El Manual Moderno; 2005.
Brooks, G. Microbiología y Parasitología. 23 a ed. México: El Manual Moderno; 2005

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PRÁCTICA N°06
METABOLISMO BACTERIANO

6.1 MARCO TEÓRICO


La identificación bacteriana en forma inicial pude realizarse mediante la determinación de las
características de las colonias y a través de las diferentes tinciones; sin embargo para identificar
una bacteria desconocida a nivel de género y especie, no basta con un aislamiento, sino que deben
llevarse a cabo ciertos estudios de los sistemas enzimáticos que son únicos para cada género y especie y
sirvan como marcadores de identificación.
A nivel de laboratorio, estos sistemas enzimáticos se van a identificar sembrando una porción de colonia
bacteriana aislada en los diferentes medios de cultivos que contienen sustrato e indicadores químicos
específicos que nos permiten detectar cambios de pH o la presencia de subproductos específicos,
características que nos permitirán la identificación bacteriana.

REACCIONES DE OXIDACIÓN – FERMENTACIÓN DE AZÚCARES MEDIO

TSI (Triple Sugar Iron)


Este medio de cultivo fue diseñado para la diferenciación de bacilos Gramnegativos, basándose
en la capacidad de estas bacterias para fermentar azúcares, producir sulfuro de hidrogeno (H2S) y
producir Gas.
El medio contiene tres carbohidratos: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de 1:10:10
respectivamente, y para detectar los productos ácidos generados, se emplea u indicador de pH, el rojo
fenol, cuyo rango de viraje está entre pH 8.4 (rojo) y pH 6.8 (amarillo). Los patrones de fermentación de
los bacilos Gramnegativos ante los azúcares presentes en el medio, pueden ser fundamentalmente tres:
a) Fermentación de glucosa únicamente.
b) Fermentación de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos carbohidratos. c) No
fermentación de carbohidratos.

Como producto de fermentación de los azúcares, se puede formar Gas, que se detecta por la presencia
de burbujas, grietas o desplazamientos del medio de cultivo en el tubo.

De igual manera al medio se le ha adicionado Tiosulfato de Sodio como fuente de azufre para generar
H2S, y sales de hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitado de color negro insoluble
denominado Sulfuro ferroso (FeS).
PRUEBA DE LA CATALASA
La Catalasa es una enzima que posee la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas y
que va a convertir el peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno, de
acuerdo a la siguiente reacción:
2H2O2 2 H2O + O2

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El peróxido de hidrógeno es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo de los
carbohidratos y si se acumula es letal para el microorganismo.
Esta prueba es vital para la diferenciación de los estreptococos (catalasa negativa) y los
estafilococos (catalasa positiva)
PRUEBA DE LA CITOCROMO OXIDASA

Los Citocromos son hemoproteínas que actúan como último eslabón de la cadena respiratoria aerobia,
transfiriendo electrones (H) al oxigeno con formación de agua. Este sistema de citocromos se
encuentra en los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos, permitiéndonos identificar a los
microorganismos que carecen de la enzima y los anaerobios estrictos.
En laboratorio se hace reaccionar a la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil o tetrametil - p –
fenilendiamina (Reactivo de Kovacs), y que se presenta en solución, discos o tiras llamados
comúnmente oxidasa.
PRUEBA DEL MANITOL

Para esta prueba se utiliza el agar manitol salado, medio de cultivo selectivo y diferencial que permite el
crecimiento de estafilococos, y que en su composición cuenta con el sustrato Manitol, el cual tras
su fermentación libera ácidos que serán detectados por el indicador rojo fenol el cual hará viraje a color
amarillo.
Esta prueba permite diferenciar Staphylococcus aureus del Staphylococcus epidermidis y otras
especies perteneciente a este género bacteriano.
PRUEBA DE LAS HEMOLOSINAS
Algunos microorganismos tienen la capacidad de producir enzimas y toxinas que pueden ser detectadas
al sembrar los microorganismos en placas con Agar Sangre, produciendo la lisis de los eritrocitos. Esta
capacidad de los microorganismos se relaciona directamente con su virulencia y patogenicidad.
Ahora, según el tipo de lisis que producen se pueden clasificar en Hemolisinas Alfa, que producen una
lisis parcial o incompleta de eritrocitos; y Hemolisinas Beta, productoras de una lisis total o completa.
PRUEBA DE LA COAGULASA
La coagulasa es una proteína producida por varios microorganismos que permite la conversión del
fibrinógeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distinguir entre diferentes tipos de
Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo indica que la muestra contiene S. aureus. La
coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se llama
staphylothrombina, y permite que la enzima proteasa convierta el fibrinógeno en fibrina. Esto hace que
se coagule la sangre.
La coagulasa está estrechamente relacionada con la superficie de la bacteria S. aureus y
puede revestir su superficie con fibrina al entrar en contacto con la sangre. Se cree que está cubierta de
fibrina del Staphylococcus es capaz de resistir la fagocitosis haciendo que esta bacteria tenga un factor
de virulencia mayor.

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6.2 COMPETENCIAS
Reconoce e identifica los diferentes sistemas enzimáticos usados en el metabolismo
bacteriano.
Utiliza las características metabólicas para el aislamiento e identificación bacteriana.

6.3 MATERIAL ES Y EQUIPOS


Tubos con TSI en plano inclinado.
Placas Petri con agar manitol salado
Placas con agar sangre
Tubos con plasma sanguíneo
Cepas control: Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella typhi.
Cepas control: S. aureus y Streptococcus o Enterococcus.
Cepa control: sembrada previamente en agar nutritivo.
Reactivo de oxidasa
Solución de peróxido de hidrógeno (H2O2) al 3%.
Láminas portaobjeto.
Asa de siembra
Goteros

6.4 PROCEDIMIENTO EN
AGAR TSI
Con el asa de kölle, haga una siembra por puntura en el tubo con TSI.
Rotular e incubar a 37°C por 24 horas.
PRUEBA DE LA CATALASA
Con el asa de siembra estéril, transferir parte el inóculo a una lámina portaobjeto.
Añadir 1 o 2 gotas de H2O2 al 3%.
Observar si se forman burbujas o no inmediatamente después de añadir las gotas de H2O2 al 3%.
Descartar la lámina en un recipiente con desinfectante.
Precauciones: La prueba debe realizarse en cultivos hasta de 24 horas, cultivos más viejos pueden
perder su actividad catalasa dando un falso negativo. Además evitar el contacto de peróxido de hidrogeno
con la piel.
PRUEBA DE LA CITOCROMO OXIDASA
Método Directo: Se añade directamente a las placas sobre las colonias bacterianas 02 ó 03 gotas del
reactivo oxidasa.
PRUEBA DEL MANITOL
- Realizar siembra por estría simple de ambas cepas bacterianas.
- Rotular e incubar a 37°C por 24 horas.
PRUEBA DE LAS HEMOLISINAS
- Con el asa de kölle realizar una siembra por estría simple en una placa con agar sangre.
- Incubar a 37°C por 24 horas.

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PRUEBA DE LA COAGULASA
- Con el asa de kölle, realizar una siembra por inoculación en los tubos de plasma sanguíneo.
- Incubar a 37°C por 4 horas.

6.5 RESULTADOS

FERMENTACIÓN DE AZÚCARES EN AGAR TSI


Alcalina/alcalina: Lactosa y Sacarosa (-), Glucosa (-) (K/K): Rojo/rojo o anaranjado
Ejemplo: Pseudomonas
Acida/Acida: Lactosa y Sacarosa (+) y Glucosa (+) (A/A): Amarillo/ amarillo
Ejemplo: E. coli, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, etc.
Alcalina/Acida: Lactosa y Sacarosa (-) y Glucosa (+) (K/A): Rojo/amarillo
Ejemplo: Salmonella (H2S+), Shigella (H2S -), Yersinia.

2. PRODUCCIÓN DE H2S
- Producción de pigmento negro en fondo de tubo: H2S (+)
- No pigmento negro en fondo de tubo: H2S (-)

3. PRODUCCIÓN DE GAS
- Presencia de burbujas, grietas o desplazamiento en medio : Gas (+)
- No burbujas, no grietas, no desplazamientos: Gas (-)

PRUEBA DE LA CATALASA
- Formación de burbujas o efervescencia: Catalasa Positiva.
- No formación de burbujas y efervescencia: Catalasa Negativa.
Nota: Algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la catalasa que descomponen el H2O2 dando
pocas burbujas diminutas durante 20 – 30´, estas no son Catalasa positiva.

PRUEBA DE LA CITOCROMO OXIDASA


Colonias bacterianas con actividad citocromo oxidasa viran a color lavanda : Oxidasa Positivo
- Colonias bacterianas sin actividad citocromo oxidasa no viran de color : Oxidasa Negativo

PRUEBA DEL MANITOL


A la observación macroscópica de las colonias bacterianas en agar manitol salado:
- Presencia de colonias amarillas y medio con halos de color amarillo : Manitol Positivo
- Presencia de colonias blancas o cremas con medio sin cambio de color: Manitol Negativo

PRUEBA DE LAS HEMOLISINAS


- Hemólisis Parcial ------- Presencia de halos verduzcos grisáceos -------- Hemólisis Alfa
- Hemólisis Total ------- Presencia de halos transparentes -------- Hemólisis Beta
- No hemólisis ------- No presencia de halos -------- Hemólisis Gamma

En la hemolisis alfa, el enverdecimiento del medio se debe a la salida de un derivado del tipo de la
metahemoglobina, que al ser oxidado se convierte en un compuesto del tipo de la biliverdina.

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PRUEBA DE LA COAGULASA
- Si hay coagulación de plasma ------- Coagulasa Positivo
- No hay coagulación de plasma ------- Coagulasa Negativo

PROTOCOLO

PRUEBA MEDIO DE REACTIVO O LECTURA


BIOQUIMICA CULTIVO INDICADOR
TSI:
a) Glucosa:
b) Lactosa:
c) H2S
d) Gas

CATALASA

CITOCROMO
OXIDASA

MANITOL

HEMOLISINAS

COAGULASA

6.6 CUESTIONARIO
Esquematice y grafique los resultados obtenidos en la lectura de las pruebas bioquímicas
anteriormente realizadas.
6.7 FUENTES DE INFORMACIÓN

Murray, P.R. Microbiología médica. 6ta. Edición. 2009. Elsevier


Tortora, G. Introducción a la microbiología. 9na. Ed. Editorial médica Panamericana.
2007
Jawetz, E. Microbiologia Médica. 23a ed. México: El Manual Moderno; 2005.
Brooks, G. Microbiología y Parasitología. 23 a ed. México: El Manual Moderno; 2005

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PRÁCTICA Nº 07

ACCIÓN DE AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO

7.1 MARCO TEÓRICO


En todo laboratorio de microbiología es fundamental tener en cuenta los diferentes métodos de
esterilización así como el uso adecuado de desinfectantes que garanticen un alto nivel de desinfección,
todo ello con la finalidad de evitar el riesgo de contaminación con microorganismos que pueden resultar
perjudiciales para la salud.
La esterilización es el proceso mediante el cual se destruye todos los gérmenes empleando ya sea calor
seco o húmedo, radiaciones, etc. Por medio del calor seco las bacterias mueren por deshidratación, el
equipo empleado frecuentemente es el horno a una temperatura de 180 °C por una hora.
La Autoclave y el Baño María son empleados para eliminar a las bacterias por medio del calor húmedo,
sin embargo, por medio del autoclave se puede eliminar tanto las formas vegetativas como las
esporuladas, lo que no se consigue con el Baño María. La autoclave se utiliza a
121°C por 15 minutos y alcanzando las 15 libras de presión.
Las soluciones empleadas en los métodos químicos son: Formol, Fenol, Hipoclorito de Sodio, Solución
Sulfocrómica, Cresol, etc.

7.2 COMPETENCIA
Identifica los agentes físicos y químicos antibacterianos, aplicando e interpretando los
resultados en la prevención de las enfermedades.

7.3 MATERIALES Y EQUIPOS


Asa de siembra en aro merthiolate, listerine, fenol,
Tubos con 0.5 de Escala de solución sulfocrómica
Mac Farland Hisopos estériles

Cultivo bacteriano Gram Bocales con desinfectante


positivo y Gram negativo. Pinzas
Placas Petri con agar nutritivo. Incubadora
Mechero Bunsen Gorro, mandil, guantes,
Frascos con papel filtro mascarilla

estériles Regla milimetrada


Soluciones de alcohol, alcohol
yodado, cristal violeta,

7.4 PROCEDIMIENTO
Acción de los agentes físicos:
1. Flamear el asa de siembra antes y después de tomar las muestras microbianas.

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2. Con la ayuda del asa de siembra en aro tomar un inóculo de cultivo y sembrarlo en el medio en placa
por la técnica dispersión agotamiento.
3. Rotular acción de los agentes físicos.
4. Llevar a incubación a 37°C por 24 horas.
5. Con la ayuda del asa de siembra en aro tomar otro inóculo de cultivo y flamear
directamente a la llama, dejar enfriar y realizar recién la siembra en el medio en placa por la técnica de
dispersión agotamiento.
6. Rotular acción de los agentes físicos luego del flameado.
7. Llevar a incubación a 37°C por 24 horas.
8. Realizar la lectura de ambas placas.
9. Para esterilizar un material este debe estar limpio y libre de impurezas, luego hay que
prepararlos: corte tiras de papel Kraft de 2 cm de ancho y coloque alrededor de las pipetas. Corte
pedazos de papel Kraft y cubra toda la superficie de las placas Petri y doble en los extremos.
10. Haga tapones de algodón bien compactos y tapone los tubos.
11. Preparar la espátula de Aire y el hisopo con papel Kraft.
12. Luego se lleva todo el material de vidrio debidamente preparado al horno a 180 ºC por 1 hora
(esterilización por acción del calor seco).

Acción de los agentes químicos:


1. Con la ayuda de un hisopo estéril, sembrar el cultivo bacteriano (estandarizado con 0,5 de
Mac Farland) en tapete sobre el medio de cultivo en placa. Dejar en reposo 5 minutos.
2. Con la ayuda de una pinza recoger el papel de filtro estéril presente en los frascos y embeberlo
en la solución de yodo, colocarlo luego sobre la placa Petri con medio de cultivo. Dejar en reposo.
3. Repetir la misma operación para alcohol yodado, listerine, merthiolate, cristal violeta, fenol, solución
sulfocrómica.
4. Llevar a incubación a 37°C por 24 horas.
5. Observe la presencia de un halo de inhibición que indica sensibilidad de la bacteria frente a la
sustancia química.

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7.5 RESULTADOS

El asa de siembra en aro que contenía inóculo y que fue sembrada directamente en el medio de
cultivo presentó desarrollo microbiano.
El asa de siembra en aro que fue flameada luego de tomar el inóculo y que
posteriormente fue sembrado no presentó desarrollo microbiano; lo que evidencia el correcto
uso de la llama directa como agente físico antimicrobiano.
Los materiales de vidrio que fueron correctamente preparados y sometidos a acción del calor
seco (Horno) fueron correctamente esterilizados.
Merthiolate, Violeta de genciana y alcohol yodado presentaron halo de inhibición para
Gram positivos.
Fenol, hipoclorito de sodio presentaron halos de inhibición para Grampositivos y gran
negativos.
Listerine y otros enjuagues bucales presentaron halos de inhibición para
Grampositivos.
Registre sus resultados:

Agente físico Desarrollo


microbiano

Inóculo sembrado sin flameado de asa de


siembra en aro

Inóculo sembrado previo flameado del asa de


siembra en aro

7.6 CUESTIONARIO
1. ¿Qué método de esterilización utilizaría Ud. para el asa de siembra?
2. ¿Qué desinfectante se utiliza con frecuencia en el laboratorio de Microbiología?
3. Definir: Agente esterilizante, desinfectante, agentes antisépticos,
quimioterápicos.
4. ¿Cómo podemos saber que un microorganismo está “muerto”?

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7.7 FUENTES DE INFORMACIÓN

Murray, P.R. Microbiología médica. 6ta. Edición. 2009. Elsevier


Tortora, G. Introducción a la microbiología. 9na. Ed. Editorial médica Panamericana.
2007
Jawetz, E. Microbiologia Médica. 23a ed. México: El Manual Moderno; 2005.
Brooks, G. Microbiología y Parasitología. 23 a ed. México: El Manual Moderno; 2005

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PRÁCTICA Nº 08

BACTERIAS GRAMPOSITIVAS

8.1 MARCO TEÓRICO

En microbiología, se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se tiñen de azul
oscuro o violeta por la tinción de Gram: de aquí el nombre de "Gram-positivas" o también
"Grampositivas". Esta característica está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular por lo
que refleja un tipo natural de organización bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias, y
cuando se tratan como taxón se utiliza también el nombre de Posibacteria. Las restantes son las
bacterias Gram negativas.

Estructura

Bacterias Gram-positivas Bacillus anthracis (bastones púrpuras) en una muestra de fluido


cerebroespinal. Las otras células son leucocitos.

La célula bacteriana está rodeada por una envoltura que, observada al microscopio electrónico, se
presenta como una capa gruesa y homogénea, denominada pared celular. Luego en sección
(corte) se observa una estructura semejante a dos líneas paralelas separando una capa menos
densa; esto corresponde a la membrana plasmática. Entre la membrana plasmática y la pared
celular se encuentra el periplasma o espacio periplasmático. En el interior de la membrana plasmática se
encuentra el citoplasma que está constituido por una disolución acuosa, el citosol, en el cual se
encuentran ribosomas y otros agregados de macromoléculas, y en el centro se ubica la zona menos
densa llamada nucleoide, que contiene una madeja de hebras difícil de resolver (distinguir) y cuyo
principal componente es el ADN.

La pared externa de la envoltura celular de una bacteria Gram positiva tiene como base química
fundamental el péptidoglicano, que es un polímero de N-acetil-2-D-glucosamina, unido en orientación ß-
1,4 con N-acetil murámico, a éste se agregan por el grupo lactilo cuatro o más aminoácidos. Esta
molécula se polimeriza gran cantidad de veces, de modo que se forma una malla especial, llamada
sáculo de mureína. Dicho compuesto es de vital importancia para

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conservar la forma y darle rigidez a la
célula bacteriana (si este compuesto no existiese, la célula reventaría debido a su gran potencial
osmótico).

Las siguientes características están presentes generalmente en una bacteria Gram-positiva:

Membrana citoplasmática.
Capa gruesa de péptidoglicano.
Ácidos teicoicos y lipoteicoicos, que sirven como agentes quelantes y en ciertos tipos de
adherencia.
Polisacáridos de la cápsula.
Si algún flagelo está presente, este contiene dos anillos como soporte en oposición a los cuatro
que existen en bacterias Gram-negativas porque las bacterias Gram- positivas tienen solamente
una capa membranal.

Tanto las bacterias Gram-positivas como las Gram-negativas pueden presentar una capa superficial
cristalina denominada capa S. En las bacterias Gram-negativas, la capa S está unida directamente a
la membrana externa. En las bacterias Gram-positivas, la capa S está unida a la capa de péptidoglicano.
Es única a las bacterias Gram-positivas la presencia de ácidos teicoicos en la pared celular. Algunos
ácidos teicoicos particulares, los ácidos lipoteicoicos, tienen un componente lipídico y pueden asistir en el
anclaje del péptidoglicano, en
tanto el componente lipídico sea integrado en la membrana.

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http://www.pomif.com/pages/practicas/ba cteriologia/tinciones/gram

8.2 COMPETENCIAS

Reconoce y describe la estructura de las bacterias Gram-positivas, así como la


importancia de estas en la salud humana.
Reconoce y describe la forma que adoptan las bacterias Gram-positivas.

8.3 MATERIALES

Cultivo de bacterias Gram- Mechero Bunsen


positivas: Streptococcus y Batería de tinción Gram
Staphylococcus Láminas portaobjeto

Láminas fijadas de bacterias Gram- Laminillas


positivas Guantes
Microscopios Gorra

Aceite de inmersión Mascarilla


Asa bacteriológica

8.4PROCEDIMIENTO
Realizar la tinción de Gram correspondiente a cada una de las muestras
Hacer la observación microscópica y determinar:
- Forma
- Configuración espacial
- Género
- Especies importantes
- Patologías
- Hábitat

8.5 CUESTIONARIO

1. Esquematice la pared celular de una bacteria Grampositivas

2. Mencione 04 bacterias Grampositivas que sean patógenas para el hombre. Explique

8.6 FUENTES DE INFORMACIÒN

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Tortora, G. Introducción a la microbiología. 9na. Ed. Editorial médica Panamericana.
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6. ESTRUCTURA

PRÁCTICA Nº 09

BACTERIAS GRAMNEGATIVAS

9.1 MARCO TEÓRICO

En microbiología, se denominan bacterias Gram negativas a aquellas bacterias que no se tiñen de


azul oscuro o violeta por la tinción de Gram, y lo hacen de un color rosado tenue: de ahí el nombre
de "Gram-negativas" o también "Gramnegativas". Esta característica está íntimamente ligada a la
estructura de la envoltura celular, por lo que refleja un tipo natural de organización bacteriana. Son
uno de los principales grupos de bacterias y cuando se tratan como taxón se utiliza también el
nombre de Negibacteria. Las restantes son las bacterias Gram positivas.

Las bacterias Gram-negativas presentan dos membranas lipídicas entre las que se localiza una fina
pared celular de péptidoglicano, mientras que las bacterias Gram-positivas presentan sólo una
membrana lipídica y la pared de péptidoglicano es mucho más gruesa. Al ser la pared fina, no retiene
el colorante durante la tinción de Gram.

La envoltura celular de las bacterias Gram-negativas está compuesta por una membrana
citoplasmática (membrana interna), una pared celular delgada de péptidoglicano, que rodea a la
anterior, y una membrana externa que recubre la
4
pared celular de estas bacterias. Entre la membrana citoplasmática interna y la membrana
externa se localiza el espacio periplásmico relleno de una sustancia denominada periplasma, la cual
contiene enzimas importantes para la nutrición en estas bacterias.

La membrana externa contiene diversas proteínas, siendo una de ellas las porinas o canales
proteicos que permiten el paso de ciertas sustancias. También presenta unas estructuras llamadas
lipopolisacáridos (LPS), formadas por tres regiones: el polisacárido O (antígeno O), una estructura
polisacárida central (KDO) y el lípido A (endotoxina).
Las bacterias Gram-negativas pueden presentar una capa S que se apoya directamente sobre la
membrana externa, en lugar de sobre la pared de péptidoglicano como sucede en las Gram-
positivas. Si presentan flagelos, estos tienen cuatro anillos de apoyo en lugar de los dos de las
bacterias Gram-positivas porque tienen dos membranas. No presentan ácidos teicoicos ni ácidos
lipoteicoicos, típicos de las bacterias Gram-positivas. Las lipoproteínas se unen al núcleo de
polisacáridos, mientras que en las bacterias Gram - positivas estos no presentan lipoproteínas.

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9.2 COMPETENCIA

Reconoce y describe la estructura de las bacterias Gram-negativas, así como la


importancia de estas en la salud humana.
Reconoce y describe la forma que adoptan las bacterias Gram-negativas.

9.3 MATERIALES Y EQUIPOS

Cultivo de bacterias Gram- Mechero Bunsen


negativas: Neisseria, E. coli, Batería de tinción Gram
Salmonella, Pseudomona Láminas portaobjeto

Láminas fijadas de bacterias Gram- Laminillas


negativas Guantes
Microscopios Gorra
Aceite de inmersión Mascarilla

Asa bacteriológica

9.4 PROCEDIMIENTO
Realizar la tinción de Gram correspondiente a cada una de las muestras
Hacer la observación microscópica y determinar:
- Forma
- Género
- Especies importantes
- Patologías
- Hábitat

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9.5 RESULTADOS
Anote los resultados en la siguiente tabla:

GÉNERO BACTERIANO MORFOLOGÍA BACTERIANA

9.5 CUESTIONARIO
1. Mencione las diferentes enfermedades que puede producir E. coli
2. ¿Con qué enfermedades se relacionan los siguientes microorganismos?
- Salmonella
- Neisseria
- Pseudomona

9.6 FUENTES DE INFORMACIÓN


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Jawetz, E. Microbiologia Médica. 23a ed. México: El Manual Moderno; 2005.
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PRÁCTICA Nº 10

ANTIBIOGRAMA

10.1 MARCO TEÓRICO


Se entiende por antibiograma el estudio de la sensibilidad "in vitro" de las bacterias a los antibióticos. Por
extensión, se suele incluir el estudio de la sensibilidad a las sulfamidas y otros quimioterápicos.
Utilidad: La razón por la cual es conveniente el estudio del antibiograma de una bacteria determinada
radica en el hecho de la diferente sensibilidad a los antibióticos de las distintas especies bacterianas y,
más aún, en el hecho de que en numerosas especies existen grandes diferencias de sensibilidad a
un determinado antibiótico entre unas y otras cepas. El antibiograma es un
método de diagnóstico rápido y preciso Con ayuda del antibiograma se puede escoger
el antibiótico más adecuado para el tratamiento de una enfermedad.

Método de la difusión en medio sólido:

Se siembra, con el germen a estudiar, una placa de un medio de cultivo adecuado. Sobre la superficie
del medio se colocan discos de papel impregnados con el antibiótico o quimioterápico a
ensayar. Si el germen estudiado es sensible, en torno al disco se observará un halo, en el cual no hay
proliferación de bacterias. Si el germen es resistente al antibiótico, crecerá uniformemente y no habrá
ningún halo de inhibición en torno al disco de papel.

Preparación de los discos impregnados de antibiótico para realizar un antibiograma.

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En las casas de productos de laboratorio pueden adquirirse los discos que se emplean para hacer un
antibiograma.

Medios de cultivo.
Los distintos microorganismos tienen distintas exigencias tanto en los que se refiere al medio nutritivo en sí
como a la temperatura de incubación ya las condiciones atmosféricas. Casi todos los microorganismos
pueden cultivarse en medios nutritivos inertes. Hay medios de cultivo líquidos y sólidos; de hecho los
sólidos son medios de cultivo líquidos a los que se adicionan
diferentes sustancias, las más utilizadas son el agar y la gelatina.

Agar ordinario
Peptona 15 gr/l
NaCl 5gr/l
Agar 12gr/l
Agar nutritivo
Agar nutritivo

Agar ordinario más 10 gr/1 de glucosa

Los medios de cultivo deben estar ajustados a un pH adecuado. El Agar ordinario y el Agar nutritivo a un
pH = 7,2. El ajuste se realiza con NaOH y/o HCl en soluciones 1 N y 1/10N. Se acostumbra a hacer
antes de la esterilización, aunque, a veces, debe hacerse después. La esterilización de los medios de
cultivo se hace generalmente calentándolos en una autoclave a
121 ° C ya una atmósfera de presión de vapor, durante 15-30 minutos. Alternativamente puede utilizarse
una olla a presión adecuada.

Lectura del antibiograma.


Una vez sembrada una placa de un medio de cultivo adecuado y colocados los distintos discos
impregnados de antibiótico y una vez colocada a incubación en la estufa durante unas horas, se
procede a la lectura de los resultados, que puede hacerse a intervalos periódicos, basada en la
medición del halo de inhibición. Según la amplitud de este halo los gérmenes se clasifican en:

- RESISTENTES
- SENSIBLES
- MUY SENSIBLES

Debe tenerse presente que el diámetro del halo de inhibición depende también de la difusibilidad del
antibiótico y, por tanto, no es una medida absoluta de la eficacia.

Los datos que proporciona el antibiograma son muy valiosos pero su aplicación no es tan

sencilla. Para la prescripción correcta de los antibióticos hay que tener en cuenta siempre la

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naturaleza del proceso infeccioso, la historia clínica del paciente, el mecanismo de acción del antibiótico,
la toxicidad, las posibles sensibilizaciones del paciente, la vía de administración, etc.

Esta técnica, denominada de disco-difusión es fácil de realizar, barata, aceptada por los
organismos de estandarización y abierta en el sentido que permite analizar cualquier microorganismo y
cualquier antibiótico. Incluso puede aplicarse directamente sobre muestras clínicas en infecciones graves
como la meningitis.

Los discos con antibiótico deben conservarse en frió. El inóculo para sembrar las placas suele ajustarse
por turbidez y debe corresponder con el nivel 0,5 en la escala arbitraria de Mc Farland. Tras la
incubación se miden los diámetros de los halos de inhibición y se interpretan los resultados con ayuda
de los puntos de corte establecidos internacionalmente para cada microorganismo y para cada
antibiótico.

El principal inconveniente es su carácter sólo cualitativo y su limitación en bacterias anaerobias y de


crecimiento lento. También presenta problemas con antibióticos molecularmente grandes que difunden
poco sobre el Agar.

El sistema Epsilon-Test es un ingenioso método de antibiograma por difusión que en lugar de discos
utiliza tiras de papel graduadas con valores de CMI e impregnadas con un antibiótico en forma de
gradiente de concentración. La intersección del halo de inhibición con la tira de papel indica la CMI del
microorganismo para dicho antibiótico.

Antibiograma de microorganismos exigentes

Anaerobios
Pueden utilizarse técnicas de dilución (microdilución) y de difusión (Epsilon-Test). Sólo se realizan en
aislamientos valorables clínicamente en los no existe intervención de microorganismos aerobios. Se
utilizan medios de cultivo específicos muy enriquecidos porque suele tratarse de microorganismos
exigentes. Se testan los antibióticos más eficaces frente a estos agentes. Por supuesto todos los
métodos deben realizarse asegurando la ausencia de oxígeno.

Micobacterias
Las micobacterias crecen muy lentamente, lo que dificulta enormemente las técnicas de
antibiograma y las limita a laboratorios de referencia. Existen varios sistemas pero ninguno de ellos esta
estandarizado, de modo que hay que tomar los resultados con precaución. El más utilizado es el
método de las proporciones que compara crecimiento en tubos con y sin antibiótico. El aumento en
los últimos años del número de casos de tuberculosis hace que se trabaje cada vez más en la resistencia
antibiótica de M. tuberculosis.

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Hongos
Sólo se dispone de métodos estandarizados para levaduras. Aun no para hongos filamentosos. Son
sistemas de microdilución en los que el crecimiento de la levadura se detecta por turbidez. Las técnicas de
difusión tienen dificultades porque los antifúngicos difunden mal por el Agar.

10.2 COMPETENCIA
Determina la sensibilidad in vitro de las bacterias frente a los quimioterápicos.

10.3 MATERIALES
Placas de Petri con Agar Mueller Hisopos estériles
H inton Bocales con desinfectante
Frascos con discos de antibióticos Pinzas
Cultivo bacteriano Incubadora

Mechero Bunsen Regla milimetrada


Pinza de metal con punta Mascarilla, gorro, guante, mandil
Asa de siembra en aro Estufa
Cultivo bacteriano bacilos y cocos Gradillas
Espátula de Driglasky

10.4 PROCEDIMIENTO
1. Con la ayuda de un hisopo sembrar el cultivo bacteriano (estandarizado con 0,5 de Mac Farland)
en tapete sobre el medio de cultivo en placa. Dejar en reposo 5 minutos.
2. Con la ayuda de una pinza recoger los discos de antibióticos presentes en los frascos y
depositarlos sobre la placa Petri con medio de cultivo. Dejar en reposo.
3. Repetir la misma operación para cada antimicrobiano.
4. Llevar a incubación a 37°C por 24 horas.
5. Realizar las lecturas con ayuda de una regla milimetrada. ( diámetro de inhibición)
6. Compararlo con la hoja que proporciona el proveedor donde se encuentran los valores en diámetro
para cada antibiótico vs cepas ATCC para determinar si el antibiótico es INTERMEDIO, SENSIBLE O
RESISTENTE.

10.5 RESULTADOS

1. Las lecturas de los halos de inhibición fueron comparadas con una tabla patrón dado por el proveedor
de los antimicrobianos. Obtuvimos que para los Grampositivos resultaron sensibles la dicloxacilina,
teraciclinas, ciprofloxacina.
2. Para los gramnegativos resultaron sensibles la gentamicina, nitrofurantoína, cefotaxima. Completar
el cuadro de resultados:

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SENSIBLE INTERMEDIO RESISTENTE

10.6 CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es la utilidad del antibiograma?


2. ¿Cuál fue el resultado de la práctica?
3. ¿A qué antibióticos es resistente la bacteria problema?
4. ¿A qué antibióticos es sensible la bacteria problema?

10.7 FUENTES DE INFORMACIÓN

Murray, P.R. Microbiología médica. 6ta. Edición. 2009. Elsevier


Tortora, G. Introducción a la microbiología. 9na. Ed. Editorial médica Panamericana. 2007
Jawetz, E. Microbiologia Médica. 23a ed. México: El Manual Moderno; 2005.
Brooks, G. Microbiología y Parasitología. 23 a ed. México: El Manual Moderno; 2005

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PRÁCTICA Nº 11

OBSERVACIÓN DE PARÁSITOS: PROTOZOOS

11.1 MARCO TEÓRICO


Un parásito es un organismo, que sobrevive habitando dentro de otro organismo,
generalmente más grande (el huésped).
El parasitismo suele ser una asociación biológica en donde uno de los participantes
(Parásito) vive a expensas de la otra especie (Huésped). Desde el punto de vista biológico un parásito
se considera más adaptado a su huésped, cuando le produce menor daño. Los menos adaptados son los que
producen lesión o muerte del huésped que los alberga. En un inicio los parásitos probablemente fueron
organismos de vida libre, que al evolucionar han sufrido transformaciones morfológicas y fisiológicas, para poder
adaptarse a su vida parasitaria.
La clasificación de los parásitos suele ser variada. Endoparásitos y ectoparásitos según habiten en el interior o
exterior del huésped respectivamente. Permanentes y temporales según el tiempo de permanencia en el
huésped y según la capacidad de producir lesión o enfermedad en el hombre, pueden dividirse en patógenos y
no patógenos.

AMEBIOSIS
ESPECIE: Entamoeba histolytica (quiste): Es la forma infecciosa y presenta las siguientes características:
oTamaño: 10 – 20 m, esféricos.
o Núcleo: Hay cuatro en los quistes maduros. Puede haber menos de cuatro en los quistes
inmaduros. La cromatina es delicada y está distribuida uniformemente, a modo de
“cuentas”, a lo largo de la membrana nuclear. Cariosoma diminuto, compacto y, por lo
general, de ubicación central, aunque puede variar de posición.
o Citoplasma: El 10 % de los quistes pueden tener barras cromatoideas, con extremos
redondeados y lisos. Es posible observar vacuolas de glucógeno en los prequistes temprano.

La infección se produce por la ingestión de un quiste maduro. El desenquistamiento ocurre en la última


porción del intestino delgado y se multiplica por fisión binaria para dar origen a 8 pequeñas amebas; estas
penetran en el intestino grueso y pueden:

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1.- Invadir los tejidos del huésped.
2.- Vivir en la luz del intestino grueso sin invasión.
3.- Enquistarse.

Cuando los trofozoitos se van transformar en formas quísticas de resistencia expulsan todo el material
ingerido y se redondean, a esta forma se le denomina forma prequística, puede reconocerse por la presencia de
un único núcleo redondeado, ausencia de material fagocitado y la ausencia de pared quística.

La invasión de los trofozoitos provoca hemorragias, deterioro del revestimiento epitelial del intestino grueso,
debido a la producción de enzimas proteolíticas que puede ser superficial (mucosa) o generando ulceras “en
redoma” en la submucosa y en ocasiones la invasión a otros órganos extraintestinales como el hígado,
pulmón, por vía circulatoria (metástasis).

Los eritrocitos recién fagocitados aparecen como cuerpos de color gris pálido (H. férrica) y de color cereza
(Tricrómica modificada).

Diagnóstico
La amebiasis se diagnostica en el laboratorio examinando las heces de un individuo infectado; para establecer
el diagnóstico suele ser necesario analizar entre 3 y 6 muestras. Para observar el interior del recto y obtener una
muestra de tejido de cualquier úlcera que se encuentre puede utilizarse un rectoscopio (tubo flexible de
visualización).
Los enfermos con un absceso hepático casi siempre tienen en la sangre valores elevados de
anticuerpos contra el parásito. Sin embargo, como estos anticuerpos pueden permanecer en el flujo sanguíneo
durante meses o años, el hallazgo de valores elevados de anticuerpos no necesariamente indica que exista un
absceso. En consecuencia, si el médico piensa que se ha formado un absceso, puede prescribir un fármaco
que elimine las amebas (un amebicida). Si el fármaco resulta eficaz, se da por sentado que la amebiasis era el
diagnóstico correcto.

GIARDIASIS
ESPECIE: Giardia lamblia es el agente etiológico de la giardiosis.
El trofozoito de este protozoo presenta las siguientes características:
oTamaño: 9 - 21 m de largo y 5 – 15 m de ancho, simetría bilateral; forma de “pera”,
con extremos ahusados.

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o Motilidad: Direccional, activa como “hojas cayendo”; posee 4 pares de flagelos
(posterior, anterior, ventral, lateral).
oNúcleo: Dos, de ubicación lateral. No tiene cromatina periférica, con cariosomas pequeños
compactos y centrales.
o Citoplasma: Uniforme y finamente granular. Dos cuerpos mediales que parecen bigotes
sobre el axostilo, a la mitad de la superficie ventral se encuentra las ventosas.
Giardia lambia (quiste): Presenta las siguientes características:
oTamaño: 8 - 12 m de longitud 7 – 10 m de ancho, ovales.
oNúcleo: Cuatro. Los cariosomas son más pequeños que las de los trofozoitos y tienden a ubicarse
de manera excéntrica. No hay cromatina periférica sobre la membrana nuclear.

o
oCitoplasma: Espacio claro entre la pared del quiste y el citoplasma, produce el efecto de halo y
presenta cuatro cuerpos mediales.

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Giardia lamblia en
vellosidades intestinales

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Diagnóstico

Los síntomas orientan hacia el diagnóstico. Éste se confirma mediante los análisis de laboratorio que revelan la
presencia del parásito en las heces o en las secreciones del duodeno. Debido a que las personas que han sido
infectadas durante mucho tiempo tienden a excretar los parásitos a intervalos impredecibles, puede ser
necesario realizar exámenes seriados de las heces.

PALUDISMO (MALARIA)
ESPECIE: Plasmodium Vivax

ASPECTO DE ERITROCITOS: Agrandados y pálidos; puntos de Schuffner usualmente prominentes. La


duración del ciclo asexual (ciclo febril) es de 48 horas (“terciana benigna”). Estar alerta sobre la posibilidad de
infecciones mixtas cuando se identifican formas de P. vivax.

TROPOZOÍTOS:

Temprano: Anillo relativamente grande (un tercio del tamaño del glóbulo rojo). Pueden verse anillos con
dos núcleos o células con dos o tres anillos.
Maduro: ameboide, con delicados seudópodos que fluyen llenando por completo el hematíe.

ESQUIZONTES: 12-24 segmentos (merozoitos); pigmento fino y poco llamativo.

GAMETOCITOS: Redondos u ovales. Cuando maduran, llenan casi por completo la célula roja. Masas
grandes de cromatina. El pigmento es grueso y distribuido de manera uniforme.

ESPECIE: Plasmodium falciparum.

ASPECTO DE ERITROCITOS: Tamaño normal; rara vez se observan puntos de Maurer o hendiduras.
La relación células infectadas / células normales es alta. Por lo común, no se observan formas en anillo
intermedias o esquizontes en sangre periférica. La duración del ciclo asexual es de
48 horas (“terciana maligna”).

TROPOZOÍTOS: Formas en anillo en extremo pequeña, que ocupan no más de un quinto del hematíe. Son
comunes los núcleos dobles y las células rojas con múltiples anillos. Las formas en aplique adheridas a la
membrana del hematíe son virtualmente diagnósticas.

ESQUIZONTES: No se observan normalmente, excepto en la enfermedad fulminante; de manera característica,


tiene 24 segmentos o más.

GAMETOCITOS: Las formas características en medialuna o banana son prácticamente diagnósticas. Los
microgametocitos se tiñen de azul más claro que los macrogametocitos.

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Plasmodium vivax en estadio de Anillo

Plasmodium vivax en estadio de Trofozoito.

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Plasmodium vivax en estadio de Trofozoito y Esquizonte

Plasmodium vivax en estadio de Esquizonte

Plasmodium vivax en estadio de Esquizonte y Gametocito

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Plasmodium vivax en estadio de Esquizonte y Gametocito

Plasmodium vivax en estadio de Anillo

Plasmodium falciparum en estadio de Trofozoito

Plasmodium falciparum en estadio de Trofozoito

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Plasmodium falciparum en estadio de Esquizonte

Plasmodium falciparum en estadio de Gametocito.

Plasmodium falciparum en estadio de Gametocito.

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Diagnóstico
Se sospecha que un individuo presenta malaria cuando éste tiene ataques periódicos de escalofríos y fiebre sin
causa aparente. La sospecha es mayor si durante el año anterior la persona visitó alguna zona en la cual el
paludismo es frecuente y además si su bazo ha aumentado de tamaño. El hecho de identificar el parásito en una
muestra de sangre confirma el diagnóstico. Es posible que se necesite más de una muestra para establecer el
diagnóstico porque el valor de parásitos en sangre varía con el paso del tiempo. El informe del laboratorio
identifica la especie de Plasmodium encontrado en la sangre, porque el tratamiento, las complicaciones y el
pronóstico varían según la especie.

ESPECIE: Tripanosoma cruzi.

ARTRÓPODO VECTOR: Insecto triatomino. Los tripomastigotes metacíclicos en las heces del insecto son
las formas infectantes para el hombre.

LUGAR DE LA INFECCIÓN: Al principio de la infección, los tripanosomas se encuentran circulando en la


sangre. La forma crónica de la enfermedad se caracteriza por formas de leishmanias en las células
reticuloendoteliales o en el músculo cardiaco. Estas formas no circulan en la sangre y sólo pueden verse en
secciones hísticas teñidas.

FORMAS DIAGNÓSTICAS: Los microorganismos tripanosómicos circulantes son semejantes a los de T.


gambiense y T. rhodosiense. Las características formas de “C” no son comunes y rara vez son diagnósticas. Las
formas de leishmanias en los tejidos tienen morfología semejante a L. donovani.

Triatoma infestans Rhodnius prolixus

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Amastigotes Triatoma dimidiata

Tripomastigotes de Tripanosoma cruzi

Mosquito Lutzomya spp Amastigotes fagocitados por un PMN

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Amastigotes fagocitados por un Monocito y Macrófago

Promastigotes de Leishmania spp

TOXOPLASMOSIS

La toxoplasmosis es una infección causada por el Toxoplasma gondii, un parásito unicelular.


La reproducción sexual del parásito tiene lugar sólo en las células que revisten el intestino de los gatos.
Los huevos (oocistos) se encuentran en las heces de los gatos. Las personas se infectan comiendo
alimentos crudos o mal cocidos que contengan la forma inactiva (quiste) del parásito o bien tras
exponerse en terrenos que contengan oocistos de heces de gatos. Si una mujer embarazada se infecta,
la infección puede ser transmitida a su feto a través de la placenta.
En consecuencia, puede sufrir un aborto o el bebé puede nacer muerto o con toxoplasmosis congénita.

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h t t p s : / / w w w . yo u t u b e . c o m / wa t c h ? v = SI J h R SM f S 7 s

Diagnóstico
El diagnóstico de toxoplasmosis suele establecerse mediante un análisis de sangre que revele la
presencia de anticuerpos contra el parásito.
Sin embargo, si el sistema inmunológico del enfermo está debilitado, el profesional puede basarse en
una tomografía computadorizada (TC) y resonancia magnética (RM) del cerebro para establecer el
diagnóstico.

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PROTOZOARIOS DE TRANSMISIÓN SEXUAL

FUNDAMENTO TEÓRICO

Trichomonas vaginalis es un protozoo patógeno flagelado perteneciente al orden


Trichomonadida que parasita el tracto tanto de hombres como de mujeres, pero únicamente en
humanos. Produce una patología denominada tricomoniasis urogenital. Fue descrito por primera vez
por Donné en 1836. Años más tarde, en 1916, Hoehne demostró que este parásito era el responsable de
un tipo de infección vaginal específica.

Carece de mitocondrias y posee en su lugar unos orgánulos denominados cuerpos


paracostales (por estar cerca de la costa) y paraxostilares (por estar cerca del axostilo) que son
hidrogenosomas, cuya función es producir energía (ATP) en condiciones anaeróbicas.
El trofozoito es la forma vegetativa que se alimenta, se reproduce e infecta.
Alimentación por fagocitosis y pinocitosis de bacterias, descamaciones celulares y
leucocitos, pudiendo producir leucopenia.
Reproducción por división binaria longitudinal, pudiendo alcanzar millones de individuos en poco
tiempo. No presentan reproducción sexual.

ESPECIE: Trichomona vaginalis (trofozoito): Es la forma patógena que habita en un medio con pH
ácido y abundancia de bacterias.
oTamaño: 5 – 25 m de longitud y 5 – 8 m de ancho; con forma de “lágrima”.

o Motilidad: Posee 5 flagelos: cuatro son anteriores y libres, y el quinto se dirige hacia la
parte posterior del cuerpo celular asociado a la superficie celular formando una
membrana ondulante que no tiene porción libre del flagelo.

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Paralelo a dicha membrana se dispone,
en el interior de la célula, un haz de microtúbulos denominado costa.
o Núcleo: Único, anterior. Cariosoma pequeño y central. Distribución no uniforme de la
cromatina sobre la membrana nuclear.
o Citoplasma: Axostilo longitudinal, central. Hay una impresión longitudinal (costa),
en la unión de la membrana ondulante, que es más corta (muy. rotatorio), que se
extiende hasta la mitad del cuerpo.

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11.2 COMPETENCIA
Reconoce microscópicamente los protozoos parásitos que se relacionan con
enfermedades en el ser humano.

11.3 MATERIALES Y EQUIPOS


Microscopios
Láminas fijadas de protozoos parásitos: Giardia, Trichomonas, Trypanosoma

11.4 PROCEDIMIENTO
Hacer el montaje de las láminas correspondientes
Realizar el enfoque y visualizar con los objetivos secos y el objetivo húmedo
Observar la morfología de los diferentes parásitos
Esquematizar sus observaciones

11.4 CUEST ION AR IO


1. Esquem atice el ciclo biológico de los siguientes prot o zoarios parásit
os:
- Enta mo eba histo lytica
- Giardia lamb lia
- Toxoplas ma g on dii
- Plas mod iu m vivax
- Trypanosom a cru zi
- Trichomo na va gin alis

11.5 FU ENT ES DE INF ORM ACIÓN


Murray, P.R. Microbiología médica. 6ta. Edición. 2009. Elsevier
Tortora, G. Introducción a la microbiología. 9na. Ed. Editorial médica Panamericana.
2007
Jawetz, E. Microbiologia Médica. 23a ed. México: El Manual Moderno; 2005.
Brooks, G. Microbiología y Parasitología. 23 a ed. México: El Manual Moderno; 2005

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PRÁCTICA Nº 12

OBSERVACIÓN DE PARÁSITOS: HELMINTOS

12.1 MARCO TEÓRICO


Las infecciones parasitarias son frecuentes en las zonas rurales de África, Asia y Sudamérica, pero son
poco frecuentes en los países desarrollados. Sin embargo, quienes viven en países desarrollados y
visitan otros en vías de desarrollo pueden resultar infectados por parásitos y regresar a su país sin
saber que portan la enfermedad, donde puede resultar difícil de diagnosticar debido a que es muy
poco frecuente.
Los gusanos suelen entrar en el organismo a través de la boca, a pesar de que algunos lo hacen por la
piel. Los que infectan el intestino pueden permanecer allí o bien penetrar por la pared intestinal e infectar
otros órganos. Los gusanos que atraviesan la piel suelen hacerlo a través de las plantas de los pies o
bien penetran en el cuerpo cuando la persona nada en aguas infectadas.
Si se sospecha que un individuo pudiera tener una infección parasitaria, puede obtener muestras
de sangre, heces u orina para analizarlas en el laboratorio. Así mismo, también toma una muestra de
líquido de un órgano o tejido que pudiese estar infectado. Por lo general es necesario hacer varios análisis
para descubrir los parásitos en dichas muestras.
Los parásitos suelen reproducirse en el huésped al que infectan, por lo que en ocasiones deja sus
huevos dentro de éste. Si los parásitos se reproducen en el tracto digestivo, los huevos pueden aparecer
en las heces. Para hacer el diagnóstico de una infección parasitaria, se suele tomar tres muestras de
heces con intervalos de uno a dos días. En ciertos casos las muestras de heces se obtienen mediante un
sigmoidoscopio (un tubo flexible de visualización que se utiliza para examinar la parte inferior del intestino
grueso). Las personas que han de someterse a un examen de una muestra de heces no deben tomar
antibióticos, laxantes ni antiácidos, porque estos fármacos pueden reducir el número de parásitos y
dificultar aún más su detección en el laboratorio.
Por otro lado, para establecer el diagnóstico, a veces se extrae líquido del duodeno (la parte superior del
intestino delgado) o bien se toma una muestra del contenido intestinal usando un cordel de nylon
introducido por la boca.

TRICURIASIS
La trichuriasis es una infección causada por Trichuris trichiura, un gusano nematodo intestinal. Este
parásito se encuentra principalmente en los trópicos y subtrópicos, donde la falta de medidas
sanitarias y el clima cálido y húmedo brindan las condiciones necesarias para que los huevos incuben en
la tierra.

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La infección se produce cuando alguien ingiere alimentos que contienen huevos que se han incubado en
la tierra durante 2 a 3 semanas. Las larvas maduran en el intestino delgado, migran al intestino
grueso y entierran sus cabezas en el revestimiento mucoso. Cada larva crece aproximadamente
hasta 12 centímetros de largo. Las hembras maduras producen alrededor de 5 000 huevos al día,
que se transmiten a través de la heces.

Síntomas y diagnóstico
Sólo una gran infección provoca síntomas tales como dolor abdominal y diarrea. Las muy graves pueden
provocar hemorragias intestinales, anemia, pérdida de peso y apendicitis. Ocasionalmente, el recto
puede protruir por el ano (una condición llamada prolapso rectal), especialmente en los niños o las
mujeres durante el trabajo de parto.
Los huevos con forma de barril suelen ser visibles en las muestras de heces examinadas al microscopio.

ASCARIASIS
La ascariasis es una infección causada por Ascaris lumbricoides, un gusano nematodo intestinal.
La infección se produce en todo el mundo, pero es más frecuente en zonas cálidas con deficientes
condiciones sanitarias, en donde persiste largo tiempo debido a la defecación incontrolada de los
niños.
El ciclo vital del parásito Ascaris se parece al del parásito que produce trichuriasis, a excepción de que las
larvas también migran hacia los pulmones. Una vez que ha madurado, migra por la pared del intestino
delgado y es transportada por los vasos linfáticos y el flujo sanguíneo hasta los pulmones. De allí pasa a
los sacos aéreos (alvéolos), asciende por el tracto respiratorio y es tragada. La larva madura en el
intestino delgado, donde permanece como gusano adulto. Los gusanos adultos oscilan entre 15 y 50
centímetros de largo y de 2,5 a 5 milímetros de diámetro. La sintomatología puede producirse debido a la
migración de las larvas a través de intestino y por la presencia del gusano adulto en el intestino.

Síntomas y diagnóstico
La migración de las larvas a través de los pulmones puede provocar fiebre, tos y respiración jadeante.
Una infección intestinal grave puede causar retortijones abdominales y en ocasiones obstrucción
intestinal. La deficiente absorción de nutrientes puede estar causada por una gran concentración de
gusanos. Los adultos en ocasiones obstruyen el apéndice, el tracto biliar o el conducto pancreático.
La infección con gusano adulto suele ser diagnosticada cuando se identifican huevos en una muestra de
heces. En ciertos casos, las pruebas de laboratorio revelan la presencia de los mismos en las heces o el
vómito o larvas en el esputo. Pueden aumentar en la sangre el número de eosinófilos, que son una
variedad de glóbulos blancos. En una radiografía de tórax se pueden observar signos de la migración
larvaria.

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ANQUILOSTOMIASIS
La anquilostomiasis es causada por un gusano intestinal ya sea Ancylostoma duodenale o
Necator americanus.
Alrededor de una cuarta parte de la población mundial está infectada con estos gusanos con ganchos. La
infección es frecuente en las zonas cálidas y húmedas en las que las condiciones sanitarias son
deficientes. El Ancylostoma duodenale se encuentra en la zona del Mediterráneo, India, China
y Japón; Necator americanus es típico de las zonas tropicales de África, Asia y el continente americano.

En el ciclo vital de cada gusano, los huevos se descargan en las heces y maduran en la tierra tras haber
incubado durante uno o dos días. Pocos días después, las larvas nacen y viven en la tierra. Un individuo
puede infectarse al caminar descalzo por una zona contaminada por heces humanas ya que las larvas
atraviesan la piel. Éstas llegan a los pulmones a través de los vasos linfáticos y el flujo sanguíneo. Luego
suben por el tracto respiratorio y son deglutidas. Alrededor de una semana después de haber atravesado
la piel, llegan al intestino. Se adhieren por medio de su boca al revestimiento mucoso del intestino
delgado superior y succionan sangre.

Síntomas y diagnóstico

En el punto en el que las larvas atravesaron la piel puede formarse una erupción cutánea aplanada y
algo sobre elevada que produce mucha picazón (prurito anquilostomiásico). La migración de las larvas a
través de los pulmones provoca en ciertas ocasiones fiebre, tos y respiración jadeante. Los gusanos
adultos suelen producir dolor en la parte superior del abdomen. El sangrado intestinal conduce a
una anemia por deficiencia de hierro y bajos valores de proteína en sangre. En los niños, la
importante pérdida de sangre de forma crónica puede generar retraso del crecimiento, insuficiencia
cardíaca y tumefacción generalizada de los tejidos.
Si la infección produce síntomas, los huevos suelen resultar visibles en una muestra de heces. Si ésta no
se examina durante varias horas, los mismos pueden madurar y liberar las larvas.

TAENIASIS por Taenia saginata

Esta enfermedad es una infección intestinal causada por el gusano (céstodo) Taenia saginata. La infección
es particularmente frecuente en África, Oriente Medio, Europa Oriental, México y América del Sur.
El gusano adulto vive en el intestino humano y puede llegar a medir entre 5 y 10 metros de largo. Las
secciones del gusano que contienen los huevos (proglótides) se eliminan por las heces y son ingeridas
por el ganado vacuno. Los huevos maduran en el ganado y atraviesan la

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pared intestinal. Luego son
transportados por el flujo sanguíneo hasta los músculos, donde forman quistes (cisticercos). Las
personas se infectan al comer los quistes en la carne de vacuno cruda o poco hecha.

Síntomas y diagnóstico
A pesar de que la infección no suele causar síntomas, algunas personas tienen dolor en la parte
superior del abdomen y diarrea, y pierden peso. En ciertos casos, una persona infectada puede sentir que
una parte del gusano sale por el ano. Por lo general, el diagnóstico se hace cuando se encuentra un
trozo de gusano en las heces. El médico puede enganchar una cinta de celofán en el margen que rodea
el ano y luego la coloca sobre una placa de cristal para examinarla al microscopio en busca de huevos de
este parásito.

TAENIASIS por Taenia solium


Esta enfermedades una infección intestinal causada por el gusano adulto Taenia solium. La infección
causada por el estado larval del gusano provoca cisticercosis.
Las infecciones provocadas por el gusano del cerdo son frecuentes en Asia, la antigua Unión Soviética,
Europa Oriental y América Latina. Esta infección es muy poco frecuente en los países
desarrollados, excepto entre los inmigrantes y turistas provenientes de zonas de alto riesgo.
El gusano adulto mide de 2,5 a 3,5 metros de largo. Está formado por una cabeza armada con varios
ganchos diminutos y un cuerpo compuesto de 1 000 anillos que contienen huevos (proglótides). Su ciclo
de vida es similar al del gusano de la carne de vaca, excepto que los cerdos, a diferencia del ganado
vacuno, actúan como huéspedes intermediarios. Los humanos también pueden actuar como huéspedes
intermediarios; los huevos llegan al estómago al tragarlos o bien cuando las proglótides son regurgitadas
desde el intestino hasta el estómago,

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donde se liberan los embriones. Luego atraviesan la pared intestinal y llegan a los músculos, órganos
internos, cerebro y el tejido de debajo de la piel, donde forman quistes. Los quistes vivos sólo provocan
una ligera reacción en los tejidos, mientras que los muertos desencadenan una reacción violenta.

Síntomas y diagnóstico
La infección provocada por el gusano adulto no suele causar ningún síntoma. Las grandes infecciones
producidas por quistes pueden causar dolor muscular, debilidad y fiebre. Si la infección llega al cerebro y
las membranas que lo recubren, éstas pueden inflamarse. También pueden producirse convulsiones.
En las infecciones causadas por gusanos adultos, es posible ver huevos alrededor del ano o en las heces.
Para distinguir el gusano de la carne de cerdo de otros gusanos es necesario encontrar un proglótide o
bien la cabeza del gusano en las heces y examinarlas al microscopio.

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Los quistes vivos localizados en tejidos
como el cerebral se visualizan mejor mediante una tomografía computadorizada (TC) o una resonancia
magnética (RM). En ocasiones es posible encontrar quistes al examinar al microscopio una muestra de
tejido tomada de un nódulo cutáneo. También existe la posibilidad de realizar análisis de sangre en busca
de anticuerpos contra el parásito.

12.2 COMPETENCIA
Reconoce macroscópica y microscópicamente los parásitos que se relacionan con
enfermedades en el ser humano.

12.3 MATERIALES Y EQUIPOS


Microscopios
Muestras de helmintos parásitos: Ascaris, Taenia y Fasciola
Láminas fijadas de proglótidos inmaduros, maduros y grávidos de Taenia solium y
Taenia saginata

Láminas fijadas con huevos de Taenia


Aceite de inmersión
Alcohol isopropílico
Papel lente
12.4 PROCEDIMIENTO
Hacer el montaje de las láminas correspondientes
Realizar el enfoque y visualizar con los objetivos secos y el objetivo húmedo
Observar la morfología de los diferentes parásitos
Esquematizar sus observaciones
12.5 CUESTIONARIO
1. ¿Qué importancia tienen los parásitos?
2. Mencione las diferencias entre Taenia solium y Taenia saginata
3. Esquematice el ciclo biológico de:
- Taenia solium
- Trichuris trichiura
- Enterobius vermicularis
- Ascaris lumbricoides
12.6 FUENTES DE INFORMACIÓN
Murray, P.R. Microbiología médica. 6ta. Edición. 2009. Elsevier
Tortora, G. Introducción a la microbiología. 9na. Ed. Editorial médica Panamericana.
2007
Jawetz, E. Microbiologia Médica. 23a ed. México: El Manual Moderno; 2005.
Brooks, G. Microbiología y Parasitología. 23 a ed. México: El Manual Moderno; 2005

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PRACTICA N° 13

METODOS DE LABORATORIO PARA EL


ESTUDIO MICOLOGICO

13.1 FUNDAMENTO TEÓRICO


Los hongos son organismos eucariotas, sus paredes celulares están compuestas por carbohidratos
complejos tales como la quitina, glucano, manano, celulosa, etc.
Son heterótrofos, no realizan fotosíntesis por carecer de clorofila. Aproximadamente existen
50,000 especies de hongos, de ellos 300 más o menos son patógenos, otros son no patógenos y un gran
grupo son utilizados en diversas industrias (cervecería, panifación, vitivinícola, farmacéutica, etc.).
Desde el punto de vista celular los hongos pueden ser de dos clases: Unicelulares o
levaduriformes y miceliales o pluricelulares.

ESTRUCTURAS VEGETATIVAS: MOHOS

El talo o colonia de moho consiste en largos filamentos celulares agrupados. Estos filamentos se
llaman hifas. En la mayoría de los mohos las hifas contienen unos tabiques llamados
septos que dividen a las hifas en unidades diferenciadas, mononucleares, semejantes a
células. Este tipo de hifas se denominan hifas tabicadas, sin embargo, en algunas clases de
hongos la hifa no contiene tabiques y aparecen como largas células continuas con numerosos
núcleos. Estas se conocen como hifas cenocíticas. Las hifas del talo crecen alargándose por sus
extremos. Cada parte de una hifa es capaz de crecer y, cuando se separa un fragmento, puede
alargarse para formar una nueva hifa. Cuando las condiciones ambientales son apropiadas las hifas
crecen, se entrelazan y forman una masa llamada micelio. La parte del micelio implicada en la obtención
de nutrientes de llama micelio vegetativo y la relacionada con la reproducción micelio reproductor o
aéreo, llamado así
porque se proyecta sobre la superficie del medio en el que crece el hongo.

Levaduras

Son hongos unicelulares no filamentosos, con una morfología característica esférica u ovalada. La
mayoría de las levaduras forman colonias de organismos unicelulares y la colonia crece a medida que
aumenta el número de levaduras. Este aumento suele ocurrir por gemación. En la gemación, la célula
forma una protuberancia o yema sobre su superficie externa. Algunas especies de levaduras forman
yemas que no logran separarse y dan lugar a una corta cadena
de células llamada “Pseudohifa”.

Las levaduras son capaces de crecer como anaerobias facultativas. Si disponen de oxígeno, realizan la
respiración aeróbica para metabolizar azúcares hasta CO2 y H2O. Por el contrario,
si carecen de oxígeno, fermentan azúcares produciendo Etanol y CO2.

HONGOS DIMÓRFICOS

Algunos hongos y especialmente, las especies patógenas, muestran dimorfismo, es decir, dos formas de
crecimiento. Estos hongos pueden crecer como moho o como levadura. A menudo, este dimorfismo
depende de la temperatura de incubación: a 37ºC el hongo es levaduriforme mientras que a 25ºC es
filamentoso.

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Uno de los sistemas más importantes para la identificación de los microorganismos es observar
su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. Al conjunto de estas
soluciones líquidas o sólidas que contienen los nutrientes necesarios para el crecimiento de los
microorganismos se les conoce como medios de cultivo.
Los medios de cultivo según su finalidad se agrupan en:
a. Medios de aislamiento: Utilizados para el aislamiento de levaduras por la técnica
de agotamiento, han de ser sólidos. Ejemplo: Agar Sabouraud, Agar Lactrimel.
b. Medios selectivos: Son aquellos que permiten la recuperación de un hongo en
específico e inhiben el crecimiento de otro. Ejemplo: Agar Sabouraud con cicloheximida
(inhibe hongos contaminantes como Aspergillus, etc.).
c. Medios selectivos diferenciales: Son aquellos medios utilizados para recuperar o aislar
un hongo en específico, por ello, para diferenciar las distintas colonias, se les añade
sustancias que confieren un color diferente a las colonias según la distinta actividad
metabólica. Para este propósito se utilizan azúcares como el manitol, la lactosa,
sorbitol y otros, junto a un indicador de pH como rojo neutro, azul de bromotimol, etc.
d. Ejemplo: CHROM Agar Candida utilizado en la identificación de Candida albicans,
Candida krusei y Candida tropicalis
Los medios de cultivo utilizados en micología contienen nutrientes suficientes para asegurar el desarrollo
de los hongos (carbono, nitrógeno, vitaminas, oligoelementos, etc.).

El pH ligeramente ácido tiende a facilitar el crecimiento de los hongos e inhibir al mismo tiempo el
desarrollo de otros microorganismos.

A los medios de cultivo se le pueden añadir antibióticos antibacterianos para inhibir el crecimiento de las
bacterias saprofitas que suelen contaminar las muestras. Los más usados son el Cloranfenicol y la
Gentamicina. Se añade también actidiona (Cicloheximida) que inhibe el desarrollo de hongos
saprófitos ambientales. Los medios cuya composición contengan actidione no deben ser utilizados
para el aislamiento de Cryptococcus neoformans, ya que inhibe su crecimiento.

Entre los medios más empleados en Micología se encuentran:

Medio Sabouraud dextrosa (SAB):

Contiene un 2% de glucosa y es ligeramente ácido (pH= 6,9), se considera el medio estándar para
recuperar y mantener una amplia variedad de hongos que pueden aislarse en el laboratorio de
micología clínica. Es el medio estándar para observar la morfología típica de los hongos, pero no es
medio ideal de crecimiento o para estudiar la esporulación. Permite el crecimiento de actinomicetos
aerobios.

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Se utiliza indistintamente en tubo o en placa.

Medio Sabouraud con Cloranfenicol y Gentamicina:

Permite el crecimiento de casi todos los hongos filamentosos y levaduras al mismo tiempo que inhiben a
una gran mayoría de bacterias.

Se utiliza en tubo o en placa.

Agar Lactrimel de Borelli:

Se emplea para favorecer la producción de pigmentos y la esporulación de la mayoría de los


dermatofitos. Contiene harina de trigo, leche descremada en polvo, Agar, miel y antibiótico.

Los medios de cultivo pueden ser preparados en placa o en tubo. Los medios en placa tienen la ventaja
de ofrecer mayor superficie para el aislamiento pero, para soportar la deshidratación durante el largo
periodo de incubación a que van a ser sometidos, han de contener una gruesa capa de medio. Son m{as
peligrosos a la hora de su manipulación y fáciles de contaminar. Mientras que los medios en tubo tienen
una superficie de trabajo mucho más pequeña, pero ofrecen máxima seguridad en su manipulación y
buena resistencia a la deshidratación y a la contaminación.

HONGOS CONTAMINANTES

Los hongos filamentosos y levaduras son en su mayoría saprófitos, hallándose libres en la naturaleza,
especialmente en la materia orgánica en descomposición. Las condiciones necesarias para que un
hongo crezca en una superficie son: existencia de esporas, base de nutrientes, humedad y temperatura
entre 4 y 38º.

El crecimiento de hongos en sistemas de aire acondicionado puede producir en sus habitantes


determinadas patologías entre las que cabe destacar asma y alveolitis alérgica. La contaminación
ambiental por hongos en el medio ambiente y en el interior de edificios, es debida básicamente a hongos
filamentosos y levaduras.

13.2 COMPETENCIAS
Diagnostica las micosis en el laboratorio.
Reconoce las principales características macro/microscópicas de los hongos.
Identifica las diferentes especies de interés médico.
Conoce la técnica de microcultivo, utilidad y procedimiento
Realiza el aislamiento de hongos contaminantes del medio ambiente

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13.3 MATERIALES Y EQUIPOS

Placa Petri con Agar Sabouraud y otro con Agar Sangre


Hidróxido de potasio al 10% o 20% - Azul de lactofenol
Láminas montadas de hongos unicelulares, pluricelulares
Láminas cultivadas (microcultivos) – Cultivos de hongos
Microscopio binocular

13.4 PROCEDIMIENTO

TOMA DE MUESTRAS

Muestras de la Piel: se deben recoger abundantes escamas de la zona lesionada, preferiblemente de


los bordes o bien pasar un trozo de moqueta especial y estéril varias veces por la lesión.

Muestras de la Cabeza: recoger las escamas, los pelos (con raíz) o pasar la moqueta.

Muestras de las Uñas: tomar fragmentos pequeños de las uñas, o un raspado subungueal. Si hay un
exudado perungueal se recogerá la muestra con una torunda estéril.

Lesiones en pliegues (interdigitales, inguinales, submamarios, labiales,...): recoger escamas o


pasar la moqueta. Si la lesión es exudativa y no se pueden recoger escamas, la
muestra se tomará con una torunda o mediante pases de moqueta.

Lesiones en mucosas orales, balanoprepucial, etc., se recogerá un exudado mediante una torunda.
Se tomarán preferiblemente dos muestras, una para examen microscópico y otra para
la siembra en un medio de cultivo.

Es importante que si las lesiones tienen más de una localización, se realicen tomas separadas. Además,
en los volantes deberá aparecer la fecha de la toma de muestra, la localización de la lesión y tipo de
muestra que se ha tomado, junto con otros datos de interés personales.
PREPARACIÓN EN FRESCO

Permite identificar muchas de las especies de hongos más habituales. El mayor inconveniente de la
observación en fresco es que se puede alterar el ordenamiento característico de las esporas al presionar
con el cubreobjetos, por lo que este procedimiento no es válido en los casos en que es necesario
conocer la disposición de las esporas.

1. Seleccionar una colonia aislada


2. Esterilizar y enfriar el asa de siembra
3. Extraer un fragmento de la colonia que contenga además un poco de agar en la parte inferior.
4. Depositar el fragmento extraído sobre un portaobjetos en el cual, previamente, se ha
depositado una gota de azul de lactofenol.
5. Colocar el cubreobjetos y presionar suavemente para dispersar la colonia y el Agar.
6. Observar al microscopio

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HONGOS CONTAMINANTES
Las placas serán expuestas en diferentes ambientes (cerrados y externos) mediante dos
procedimientos:

a. Captura por sedimentación:


Rotular una placa Petri con el número de la mesa de trabajo, fecha y lugar.
Destapar la placa y dejarla abierta por 30 minutos.
Cerrar la placa e incubarla a temperatura ambiente hasta la siguiente práctica. b.
Captura por choque sobre la superficie de Agar:
Rotular una placa Petri con el número de la mesa de trabajo, fecha y lugar.
Destapar la tapa y agitarla 10 veces
Cerrar la placa e incubarla a temperatura ambiente hasta la siguiente práctica. Luego de
la incubación por una semana a temperatura ambiente, realizar el estudio macroscópico de
las colonias aisladas (a simple vista), anotando: Color o presencia de pigmento, textura, bordes
de la colonia.

Realizar también el estudio microscópico a través del reconocimiento de las especies por
medio de la morfología de las esporas.

Coloración y Microscopía:

Las muestras de micosis superficiales deben ser desqueratinizadas con hidróxido de potasio al
10 ó al 20%, luego se colorean con Azul de Lactofenol; dependiendo del tipo de hongos que se busca.

Los hongos unicelulares o levaduriformes se incuban a 37 °C por 72 horas, mientras que los
pluricelulares o miceliales se incuban a la temperatura ambiental de 5 a 7 días.
Métodos indirectos para diagnóstico de micosis o profundas.
A. Intradermo – reacciones:
- Histoplasmina

- Paracoccidiodomicotina
- Esporotriquina
- Candidina
B. Reacciones Serológicas:

- Aglutinación
- Precipitación
- Fijación de complemento
- Inmunodifusión

C. Pruebas anatómo – patológicas.

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DIAGNÓSTICO DE ALGUNAS MICOSIS SISTÉMICAS

1. Candidiasis
Muestras: Incluyen frotis y raspado de lesiones superficiales, sangre, líquido cefalorraquídeo,
biopsia de tejido, orina, exudados, material retirado del catéter intravenoso.
Microscopía: Buscando células en gemación y pseudohifas (lo que confirma la
presencia de Candida albicans).
Cultivo: En Sabouraud se observan las colonias cremosas y pequeñas. Se pueden hacer
algunas pruebas bioquímicas (fermentación de carbohidratos).
Serología: Estas pruebas tienen uso limitado, pudiendo usarse también Intradermo
reacciones como candidina.
2. Histoplasmosis
Muestras para cultivo: Esputo, orina, raspado de lesiones superficiales, aspirado de médula
ósea.
Coloración y Microscopía: Los cortes histológicos se colorean con Giemsa, se observan
levaduras en forma ovoides dentro de las células del tejido afectado.
Cultivo: En Sabouraud (a 25° ó 30 °C). También puede emplearse Agar sangre
glucosa cisteína 37 °C (la incubación se de cuatro semanas como mínimo).
Serología: Las pruebas se hacen positivas entre la segunda a quinta semana después de la
infección.
Intradermo – reacción: Esta prueba cutánea con histoplasmina se hace positiva
después de la infección y permanece positiva durante varios años.

3. Paracoccidiamicosis
Muestras Biológicas: Esputo, exudado de las lesiones bucales, biopsia.
Microscopía: En la microscopía directa de estas muestras, aparecen las levaduras.

Cultivo: Los cultivos en Agar Sabouraud o en Agar extracto de levaduras, se incuban a la


temperatura ambiental, observándose formas miceliales, se confirman su dimorfismo, cuando se
cultiva a 37°C observándose levaduriformes.
Serología: La prueba más rápida es Elisa.

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Rhizopus Penicillium Aspergillus

T. tonsurans T. rubrum T. mentagrophytes


HONGOS UNICELULARES

Paracoccidioides brasiliensis Candida albicans

Micosis bucales
Candidiasis bucal: Es un estado inflamatorio, infeccioso; caracterizado por la presencia de manchas
blancas con aspecto de leche coagulada localizadas en comisuras labiales, lengua, encía, paladar, al ser
removidos dejan una superficie sangrantes (agente causal: Cándida albicans).
Histoplasmosis: Micosis infecciosa inflamatoria afecta piel mucosas de la cavidad bucal,
ulcera granulada rodeada de decoloración purpurea (agente causal: Histoplasma capsulatum).
Paracoccidiomicosis: Pulmonar, mucosa nasal, mucosa bucal, son afectados por el hongo
Paracoccidioides brasiliensis, las lesiones que se observan son úlceras rojas con fondo
amarillento granular.

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13.4 CUESTIONARIO
1. Describir las características macroscópicas de un hongo filamentoso y de un hongo
levaduriforme en medio de cultivo preparado en tubo y en placa.
2. Describir las características microscópicas mediante la observación de láminas
preparadas en fresco, dibuje las estructuras observadas.

13.5 FUENTES DE INFORMACIÓN

http://www.slideshare.net/yotsabeth/practica-1-micologia
Murray, P.R. Microbiología médica. 6ta. Edición. 2009. Elsevier
Tortora, G. Introducción a la microbiología. 9na. Ed. Editorial médica Panamericana.
2007
Jawetz, E. Microbiologia Médica. 23a ed. México: El Manual Moderno; 2005.
Brooks, G. Microbiología y Parasitología. 23 a ed. México: El Manual Moderno; 2005

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