Cinética de la fosfatasa alcalina

RESUMEN

Lafosfatasaalcalinaesunaenzimaquecatalizalahidrólisisdelenlace éster fosfórico entre un grupo orgánico y un grupo fosforiloa pH alcalino,loqueliberafosfatoalmedio.Enestaprácticasevanaestud iar algunosaspectosc inéticosdelafosfatasaalcalinacomercialdemucosa intestinalbovina.Paraellosevaaemplearunmétododeensa yodela actividaddeestaenzimaqueempleacomosustratounésterdefosfato artificial,el p-nitrofenilfosfato,cuyahidrólisisdalugarafosfatoya pnitrofenol.Ésteúltimoadquierecoloram arillo apHalcalinoporloquese puedecuantificarcolorimétricamentea405nm.Seobtendrálacurvade progresodelareaccióncatalizadaysedeterminarálavelocidadinicialy la concentración de enzima. Se comprobará la dependencia de la velocidaddereacciónconlaconcentracióndeenzimaysecalcula rá gráficamente la Km de la enzima.

Palabrasclave:EaddieHofstee,Linewea ver-Burk,UnidadesInternacionales deactividadenzimática,velocidadmáxima. Abreviaturas empleadas. PNPP: p -nitrofenilfosfato; PNP: p -nitrofenol; UI: UnidadesInternacionalesdeactividaden zimática.

1.INTRODUCCIÓNYOBJETIVOS 1.1.Cinéticaenzimática

LacinéticaenzimáticaeslapartedelaEnzimologíaqueseocupadel estudio de la velocidad de las re acciones catalizadas por enzimas y las causasdesuvariación.Losensayosenzimáticosseempleanrutinariamente en muchos laboratorios clínicos para el diagnóstico de numerosas enfermedades,bienobservandovelo cidadesdereacciónanormalesobien observando niveles enzimáticos inadecuadosenelplasmauotrostejidos. Unensayoenzimáticosebasaenlaactuacióndelaenzimasobreuna sustancia,llamadasustrato, catalizando su conversión en otra específica, conocidacomoproducto.Normalmentealgúnelementodelosqueintervienen enlareacciónabsorbeluzaunalongituddeondade terminada,conloquela reacciónpuedeseguirseporcolorimetría o espectrofotometría.

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Estápresenteenriñón. Esta enzima.Reacción enzimática 1.hiperparatiroidismosecundario. osteomalacia.yaqueelexce sodeeste productodelareaccióninh ibelaactividadenzimática.puedeser reconocidoporlaenzima.4.alposeerunrestoorgánicoconungrupo fosfatounido.(EC 3 .Fosfatasaalcalina Lafosfatasaalcalina(Ortofosfóricomonoésterfosfohidrolasa. el p-Nitrofenol.2.hígado. también se utiliza como control de la adecuada pasterizacióndelalecheycrema.3. 1. ‡Representacióndelacurvadeprogresodelareacción.talescomo: Efectodeltiempodereacciónenlaaparicióndeproducto. Efectodelaconcentracióndeenzimasobrelavelocidaddereacción.1) esunaenzimaampliamentedistribuidaquehidroliza (3 )elenlaceéster(1) fosfóricoentreungrupofosfatoyunradicalorgánicoapHbási co(pHóptimo entre9y10)liberandofosfatoinorgánico. Paradetenerlareacciónseañadiráfosfato. intestinoyhueso. 2 . El sustrato al ser hidrolizado origina un producto.Objetivos Comprobarlaaplicaciónprácticaenellaboratoriodelosprincipiosteóricos delaEnzimología.Ensayoenzimático Como sustrato de la fosfatasa alcalina utilizaremos un compuesto artificial:p-Nitrofenil-fosfatoque.1. compuestocoloreadoqueensoluciónalcalinaabsorbeaunalongitud de ondade405nm.3.Lamedidadenivelesanormalesdefosfatasaalcalinaenel sueroindicanlaexistenciadeenfermedadesóseasdegenerativas(raquitismo.dadoquelafosfatasaalcalinaseinacti va porcalentamiento. O HO P OH O + H2O + - Fosfatasa alcalina O O + HO P OH + + H + OH N O - N O - O O p-nitrofenil-fosfato p-nitrofenol Figura 1.osteosarcoma)obienda ños hepáticos.1.porloque suaparicióneneltranscursodelareacción (Figura 1) puede seguirse colorimétricamente. El aumento fisiológico de l os niveles plasmáticos de fosfatasa alcalinaseproduceenanimalesenfasedecrecimiento(seest áformando tejidoóseo)oenhembrasgestantes(fosfatasaalcalinadelapla centa). ‡Cálculodelaactividadenzimáticaapartirdelavelocidadinicialdela reacción(vi).

Efectodeltiempodereacciónenla aparicióndeproducto.1. Colorímetro ajustado a405nm(fototubonormal). Tubos especiales para medir en el colorímetro. ‡CálculodelaconstantedeMichaelis-Menten(Km)ydelavelocidad máxima (Vm) a partir de las citadasrepresentaciones. 3.3.1.2. 3. 3.2.3. 3.Equipamiento Bañotermostatizadoa30ºC.PROTOCOLOSAREALIZAR 3.2. PipetaautomáticaP-1000(puntas). Tubosdeensayodevidrio(1.1.Reactivos Tampóndeensayo.1.5x16cm)16enunagradilla.Material Pipetasdevidrio(5. Efecto de la concentración de e nzimasobrelavelocidaddereacción 3 .Efectodelaconcentracióndesustrato sobrelavelocidaddereacción: ‡RepresentacióndeEadie-Hofstee. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO 2. Cronómetro.Acontinuaciónsemidelaabsorbanciaalosdistintostubosa405nm usando el nº 1 como blanco.A5tubosdeensayoyseañadenlosreactivosquesedetallanenla Tabla1. se retira el tubo correspondientedelbañoa30 ºCyseleañadeinmediatamente1ml defosfatomezclandolassolu cionesparadetenerlareacción.Seagitansuavementeeincubanenbaño termostatizadoa 30ºClostiemposindicados. Enzima:fosfatasaalcalinademucosaintestinalbovina. 2. 2.1. Tubo (nº) Tampón (ml) Sustrato(ml) Enzima (ml) Tiempo (min) 1 2 3 4 5 1 1 1 20 2 1 1 1 1 1 1 1 --1 1 1 AGITAR SUAVEMENTE E INCUBAR A 30 ºC 5 5 10 15 3. Soluciónparadetenerlareacción.A medida que se cumplen estos tiempos.0ml). Propipeta. ‡Representación de Lineweaber-Burk. Tabla 1: Efecto del tiempo de reacción en la aparición de producto. Rotulador para vidrio. 2.1. Solución sustrato.

Tubo (nº) 1 2 3 4 5 Tampón (ml) 2.2.Aunaseriede5tubosdeensayo selesañadelosdistintosreactivos según se indica en la Tabla 2.0 Enzima (ml) 0. Efecto de la c oncentración de sus trato sobre la velocidad de la reacción.2 0. Tubo (nº) 1 2 3 4 5 6 Tampón (ml) 3.0 3.0 2.retirar lostubosdelbañoy añadirinmediatamente0.Alfinalizarlos10minutosdereacción.0 0.3 2. Efecto de la concentración deenzima sobre lavelocidad de la reacción.0 1.5mldefo sfatoacadauno deellosmezclandolassolucionesparadetenerla reacción.0 1.6 0.0 1. Tras agitar suavemente se incuban enbañotermostatizadoeltiempoindicado: Tabla 2.2.5 0.1.2.Determinaciónde KmYVm 3.Aunaseriedetubosdeensayoselesañadelosreactivosquese detallanenla Tabla3yseagitansuavemente.5 0.7 Sustrato(ml) 1.0 Enzima (ml) --0.5 2.4 0.1. 3.5 0.seretiranlostubos delbañoyselesañadeinmediatamente0.3. obteniéndose así concentraciones crecientes de enzima en los mismos.6 1.Medirlaabsorbanciaalosdisti ntostubosa405nm.3.5mldelasolucióndefosfatomezclando paradetenerlareacción.RESULTADOSESPERADOS 4.3. obteniendolacurvadeprog resodelareacción.0 --Sustrato(ml) 0.3.5 0.Ennuestro casorepresentaremoslaapari cióndeproductofrentealtiempo(Figura2).9 1.1 1.3.8 AGITAR SUAVEMENTE E INCUBAR A 30 ºC 10 minutos 3. Laactividaddeunaenzimasedeterminacono ciendolavelocidaddela reacciónquecatali za.3.7 2.3 0. Efecto de la concentración desustrato sobre lavelocidad de la reacción.Elcálculodelaconcentración 4 .Semidelaabsorbancia alosdis tintostubosa405nmusandoelnº 1 como blanco 3. Tabla 3.3.1.usandocomo blancoelnº1.2.obteniéndosedeesta maneraconcentracionescrecientesde sustratoenlosmismos.0 2.Lavelocidaddereacciónsedefinecomolacantidadde sustratoconsumidoodeproduc toformadoporunidaddet iempo.Efectodeltiempodereacciónenla aparicióndeproducto.0 1.0 1.Cuandosecumplanlos10minutosdereacción.5 0. 4.5 AGITAR SUAVEMENTE E INCUBAR A 30 ºC 10 minutos 3. 3.Se introducenlostubosenelbañot ermostatizadoa30ºCeltiempo indicadoparaquesedesarrollelareacción.2.4 2.

Representacióndelefectodeltiempodereacciónenla aparición deproducto. se trasladanlosdatosobtenidosdeloscálculos correspondientesdelaTabla4 Tabla 4. 0. 006 Figura2.943 [Producto] (mM) 0.deproducto(p-nitrofenol)sebasaenlaleydeLambert -Beer:A= .00 2 5 0.644 3 10 0. Cálculodelaconcentracióndeproducto R O F E N O L ] A = .1.teniendoencuentaqueI=1cmy =18.5 mM cm .en estecasol=1cmy -1 -1 (coeficientede extinci ón milimolar) es 18. Para representar la curva de prog reso de la reacción (Figura 3). C. Conociendo la v i se podrá determinar la actividad enzimática de la fosfatasaalcalinaenmU/ml.5mM-1cm-1.012 d [P] = dt v= i a b b a 0 0 5 10 15 20 M ) TIEMPO (min) 0.00 0.1. Apartirdeestacurvasecalculalavelocidadinicial(vi)delareaccióncomo la pendiente de la parte lineal de la curva de progreso.seobtienela concentraciónproductoformado en cada uno de ellos.Curvadeprogresodelareacción. 4.035 0.l.I Aplicandoestaecuaciónalasabsorbanciasobtenidasparacadaunode lostubos. Curvade progreso de la reacción Tubo Tiempo Absorbancia (min) (405 nm) (n)º 1 5 0.051 5 .C.I A C= . 024 0. 018 0.sabiendoque1UIdeactividadeslacantidadde enzimaquecatalizalaapariciónde1micromol de producto por minuto.

.Represent tiempo de reacci n i ndelprogresodereacci n:aparici ndeproducto frente al ¥£ £ ££ ££¤ ¡ ¤£ ¡   £ ¢¡   "      ©¨§¦ . l l l l i i i i l. .5 2 . 65 .0 3 5 =0 . omosedescri eenelapartado4.2 . Vi tg = a Aplicandolaecuaci n: Vi = = . 5 -0.1.0 0 3mMmin.1 10-5 a ## ! Fi . Cálculo de elocidad inicial: tg 6   Fi . . .

460 0.Asílavelocidaddereacción seráproporcional alaconcentracióntotaldeenzima.00240 0. 4.1).00410 Representación gráfica los datos de la Tabla 5.617 0.0330 5 0. Concentracióndefosfatasaalcalina=12mUI/ml 4.0 0. Determinación de la co ncentracióndeenzimaenmU/ml.1. Para determinar las mU/ml de fosfatasa alcalina utilizadas en la reacciónserealizanloscálculosapropiados(apartado 4.0410 Velocidad (mM/min) 0.4 0.0 0. 7 . Velocidad de reacción frentea concentración de enzima Tubo Enzima Absorbancia [producto] (nº) (ml) (405 nm) (mM) 1 0.0143 3 0. Paraelloenprimerlugarsehaceuncálculodelaconcentraciónde producto aparecido aplicando la misma expresión que en el apartado anterior:(A= C I) Acontinuaciónsecalculalavelocidaddelareacciónencadaunode lostubos(mM/min)porelaumentodeproductoenfuncióndeltiempode incubación: ²[P] V= t Trasladarlosdatosobtenidosdeloscorrespondientescálculosala Tabla 5: Tabla 5.00330 0.puesé stesueleencontrarseencondiciones desaturación.0240 4 0.3.2.264 0.Representación de la velocidad de la reacción frente a la cantidaddeenzimaañadida.4.0 2 0.6 0.2 0.0 0.8 0.1. Efecto de la concentración de enzima sobre la velocidad de la reacción.774 0.00143 0.porloqueelfactorlimitantedelareaccióneslacantidadde enzimapresenteenelensayo.2. Enlamayoríadelosexperimentoscinéti coslaconcentracióndeenzimaes muchomenorqueladesustrato.

Cuandolaconcentraci ndesustratoesmuyelevada. .Representaci n de Eadie-Hofstee 8 ) ) ) ( '&%$ l 0 '&%$ .tambiéncomotransformaci nlinealdelaecua ci n de Michaelis-Menten. Abajasconcentracionesdesustratola velocidadinicialesproporcionala dichaconcentraci n.Efectodelaconcentraci ndeenzimasobrelavelocidaddela reacci n.la velocidad de reacci n se aproxima a un límite superior conocido co mo m se denomina constante de velocidad máxima Vm . l mi i i m Vm. permitenobtener de manera fiable la Vmyla m. a representaci n de Eadie-Hofstee(Figura 6). como transformaci n linealdelaecuaci ndeMichaelis -MentenyladeLineweaver-Burkodelos doblesinversos(Figura7). .Fi .E i . Fi . El parámetro Michaelis-Menteny es la concentraci n de sustrato a la cual la enzima funciona a la mitad de su velocidad máxima. l l i Siserepresentalavelocidaddere acci nfrentealaconcentraci nde sustratoseobtieneunahipérbolarectangu larcuyaexpresi nmatemáticase conocecomoEcuaci ndeMichaelis-Menten.

0 0.039 0.0620 0.045 0.1.0 0.00038 0.0850 0. siendolapendiente -Km.006 9 V U S R Sustrato (ml) T l . i E i ) Se trasladan los datos experimentales obtenidos y los cálculos correspondientesefectuadosalaTabla6yserepresentagráficamentelos parámetrosadecuados(Figura8): V locidad/[ S] -1 (min ) 0.558 0.0038 0. 1 2 3 4 5 6 0.0170 0.2570 0.035 0.0048 0.889 1.0085 0.328 0.028 0.5 1.0 0. Tubo (nº) i l l i l i V/[S Absorbancia [Producto] V locidad [Sustrato] (405 nm) (m /min) (m ) (m ) Q @DC @ EIE 4 @DC @3 P G 4G EI @H4 @GCF E 4DC @B@3A @9 8 4 7 46 5 Fi 4321 7.Seobtieneasíunarectacuyocorteconelejede abcisasequivaleavale±1Kmyconelejedeordenadasa1/Vm i l l i l i /[S .0017 0.1710 0.0 3.0 0. .124 0.Enlarepresentaci ndeEadie-Hofsteesesepresentanlosvaloresdelas velocidadesenzimáticasobtenidasfrentealoscocientesdelasvelocidades entrelasrespectivasconcentracionesdesustratoyseobtieneunarectacu yo corte con el eje de abscisas corresponde a la Vm/Km y con el eje de ordenadasequivalealaVm.0489 0.024 .0300 0.0480 0. Enlarepresentaci ndeLineweaver -Burksepresentanlosinversosdelas velocidadesenzimáticasobtenidasfrentealosinversosdelasrespectivas concentracionesdesustrato.068 0.0 0.1 0.0 2.0 0.0 0.003 0. Representaci n de Lineweaver-Burk .

0300 0.558 0.84 3.889 0.2570 1.3 6 3.31 11. Lineweaver. Tabla 7.0 117.0017 588.0 0.representandoseg ráficamente losparámetrosadecuados(Figura9).00038 2631.0480 0.5 0.urk: Inversos de las velocidadesenzimáticasfrentealosinversosdelasconcentraci nesde sustrato. . Representaci n de Lineweaber. Representaci nde la 1/V rente a 1/[S] Tubo Sustrato [Sustrato] Absorbancia [Producto] Velocidad !/V (nº) (ml) (405 nm) (m /min) (min/m ) (m ) (m ) 1 0.0850 0.328 0.3 5 2.6 Fi ura 9.0085 0.0 2 0.0 0. 10 d d h c g b f X ` a Y W 1/[S] -1 (m ) 0.0 0.0 0.Fi ura8.0170 0.006 166. Se trasladan los valores experimentales obtenidos y los cálculos correspondientesefectuadosalaTabla7.76 23.124 0.Representaci ndeEadie-Hofstee:Velocidadfrente al cociente V/[S] resentaci n de 1/V rente a 1/[S] (Representaci n de 4.0 0.0620 0.068 0.0048 208.5 3 0.1 0.1710 0.0489 0.0 0.89 e . .003 333.0 0.0038 0.urk).76 5.0 0.2 4 1.

Cálculo de Km y Vm (Lineweaber y Burk) 5.3.lculodeVm mmediantelasrepresentacionesde EadieofsteeydeLineweaber.ofstee(Figura 10) o enabcisascorrespondealarelaci nVm/Km. 3. 11 i p Lineweaber. Cálculo de Km y Vm (Eadie-Hofstee) Fi ura 11. . IS Los resultados obtenidos. se fijan a los objeti vos planteados en el desarrollodelapráctica. Fi ura 10. o enordenadasdirectamenteindi ca laVmdelareacci n. La Km y Vm se determinan en ambas presentaciones por los puntos de corte de la recta: Eadie.urk.urk(Figura 11) o enabcisascorrespondea±1/Km o enordenadascorrespondea1/Vm SI Y E TARI S .

BIBLIOGRAFÍACOMENTADA Nelson DL.pp304-305.5ªed.unarelación(Figuras3y 4)entreeltiempoenquetranscurrelareacción conlaaparicióndeproducto.4 Tabla . p-nitrofenilfosfato Tampón de ensayo Soluciónparadetenerlareacción: K2HPO41M r q 0.TymoczkoJL(2003):³Bioquímica´.203 g 0. StryerL.4 0.4. ANEXO 1: MEDIOS.Comosepuede observar(Figuras10y11). oloqueeslomismoconladesaparicióndesustrato.Existe.BergJM. Cuandoseestudiaelprogresodelareacciónutilizandoconcentraciones variablesdeenzima.yladeLineweaberyBurkodelosdoblesinversostambiénco mo transformaciónlinealdelaecuacióndeMichaelisyMenten. 1mM ZnCl2 Tabla 8.3 mM Tabla .026 g Hasta 200 ml 12 .sepuedecomprobar(Figura5)comoéstaesfactor limitante de la velocidad.apartirdelacualsepuedede terminarlaconcentracióndelaenzima (mU/mL)necesariaparaquetranscurra lareacciónenesascondiciones. Sustrato.Edi torialReverté (Barcelona.4. siendo dicha velocidad proporcional a la concentracióndeenzimasiemprequeelsustratoseencuentre en condiciones de saturación tal y como ocurre en las condiciones de trabajo utilizadas.4 Tampón de ensayo: glicina 100 mM pH 10.pp577-580.507 g Agua destilada Hasta 1 litro Ajustar el pH con HCla 10. MgCl2 ZnCl 2 Tampón glicina 100 mMpH 10. Tampón de ensayo. 1mM MgC l 2. Anteladisyuntivadeseleccionarunmétodofiablepa raladeterminacióna partirdeunagráficadelaKmyVmdela reacciónsehanutilizadodos. 3ª ed.136 g Hasta 1 litro Solución sustrato:p-nitrofenil-fosfato 0.España).enamboscasoslosvaloresob tenidosparalaKm yVmsonmuysimilaresyporlotantolosdosmétodosson válidospara determinar estos parámetros. Tampón glicina 100 mM pH 10. Glicina 7.enlascondicionesdetrabajoempleadas.queindi calavi dela misma. SOLUCIONES Y MATERIAL BIOLÓGICO EMPLEADO Tampón glicina 100 mM pH 10. 6.España).lade Eadie ± Hofsteecomo transformación lineal de la e cuación de Michaelisy Menten. Cox MM (2001): ³Principios de Bioquímica´. Editorial Omega(Barcelona.

2 g Hasta 1 litro Solución enzimática: fosfatasa alcalina 10 µg/200 ml Tabla 11.x3H2O Agua destilada 228. Solución enzimática Fosfatasa alcalina 10 µg Tampón de ensayo Hasta 200 ml 13 . Solución de paro K2HPO4.Tabla 10.

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