Thùc hµnh ho¸ häc thùc phÈm

bµi i: c¸c ph¬ng ph¸p kÕt tña protein.

A.C¬ së lý thuyÕt.
Ta ®· biÕt protein lµ c¸c plime ph©n tö lîng lín chñ yÕu bao gåm c¸c liªn kÕt L- axit amin kÕt hîp víi nhau ua liªn kÕt peptid. Protein cã khèi lîng ph©n tö rÊt lín vµ rÊt kh¸c nhau tõ 10.000 dalton cho ®Õn hµng triÖu dantol. Protein cã d¹ng h×nh cÇu hoÆc h×nh sîi ,dùa vµo cÊu tróc cña protein ngêi ta rót ra ®îc mét sè tÝnh chÊt quan träng cña protein sau. • Cã tÝnh lìng tÝnh: Protein lµ chÊt ®iÖn li lìng tÝnh do cã nhiÒu nhãm ph©n cùc ë m¹ch bªn - Khi axit ho¸ protein b»ng axit m¹nh nh HCl sÏ k×m h·m sù ph©n li cña –COOH lµm kh¶ n¨ng tÝch ®iÖn ©m gi¶m , s¶n phÈm t¹o thµnh lµ muèi clorua. - khi kiÒm ho¸ protein b»ng kiÒm m¹nh nh NaOH sÏ k×m h·m sù ph©n li cña - NH2 lµm kh¶ n¨ng tÝch ®iÖn d¬ng gi¶m s¶n phÈm t¹o thµnh natri protein. • TÝnh tan cña protein: Kh¶ n¨ng tan cña protein phô thuéc vµo nhiÒu yÕu tè : + CÊu t¹o ph©n tö ,thµnh phÇn vµ tr×nh tù s¾p xÕp c¸c axit amin + B¶n chÊt dung m«i + Sù cã mÆt cña c¸c ion cña mét sè muèi trung tÝnh + pH , nhiÖt ®é - Kh¶ n¨ng hoµ tan cña protein trong níc: PhÇn lín protein ta thêng gÆp trong tù nhiªn ®Òu cã kh¶ n¨ng kÕt hîp víi níc hay lµ kh¶ n¨ng hydrat ho¸ cao .Trong ph©n tö cña protein cã c¸c nhãm sau: + kþ níc ( gèc ankyl) +H¸o níc ( -COOH, - CO ,-NH ,- NH2 ,- OH ) - Kh¶ n¨ng hoµ tan cña protein rong dung m«i: + Víi nh÷ng chÊt lµm t¨ng h»ng sè ®iÖn m«i cña níc nh glycine th× sÏ t¨ng tÝnh tan.

+ Nh÷ng chÊt lµm gi¶m h»ng sè ®iÖn m«i cña níc nh rîu , axeton th× lµm gi¶m tÝnh tan.

TÝnh biÕn tÝnh cña protein
BiÕn tÝnh lµ hiÖn tîng thay ®æi thuËn nghÞch hoÆc kh«ng thuËn nghÞch cÊu tróc kh«ng gian ban ®Çu cña protein nhng kh«ng lµm biÕn ®æi c¸c liªn kÕt ho¸ trÞ trong ph©n tö ( trõ liªn kÕt disulfide ) .C¸c liªn kÕt bÞ ph¸ vì cã thÓ lµ cÇu hydro ,liªn kÕt kÞ níc hoÆc liªn kÕt ion Nguyªn nh©n g©y biÕn tÝnh cña protein cã thÓ do: + T¸c nh©n vËt lÝ: Tia cùc tÝm , sãng siªu ©m, nhiÖt ®é.... + T¸c nh©n ho¸ häc : pH, viÖc thªm c¸c dung m«i h÷u c¬,muèi cña kim lo¹i nÆng ( do lµm thay ®æi lùc ion) Hay thªm c¸c t¸c nh©n biÕn tÝnh. HiÖn tîng biÕn tÝnh xÈy ra khi cã mÆt c¸c t¸c nh©n g©y biÕn tÝnh vµ håi phôc l¹i ( mét phÇn hay hoµn toµn )c¸c tÝnh chÊt cña protein khi lo¹i bá t¸c nh©n nµy gäi lµ sù biÕn tÝnh thuËn nghÞch. BiÕn tÝnh kh«ng thuËn nghÞch ( kh«ng cã kh¶ n¨ng phôc håi l¹i c¸c tÝnh chÊt ion ban ®Çu ) thêng xÈy ra khi cÇu disulfide bÞ ph¸ vì. Khi protein bÞ biÕn tÝnh c¸c tÝnh chÊt cña chóng còng thay ®æi + MÊt tÝnh ho¹t ®éng sinh häc + MÊt tÝnh kh¶ n¨ng hoµ tan trong níc. + MÊt kh¶ n¨ng kÕt tinh vµ kh¶ n¨ng kh¸c ( ®é nhít .søc c¨ng) + BiÕn ®æi h×nh d¹ng vµ kÝch thíc cña protein + T¨ng cêng kh¶ n¨ng bÞ thuû ph©n bëi c¸c proteaza KÕt tña protein : KÕt tña lµ c¸c ph¶n øng tËp hîp nhng kÌm theo mÊt hoµn toµn mét phÇn kh¶ n¨ng hoµ tan .KÕt tô lµ c¸c ph¶n øng kh«ng trËt tù nhng protein kh«ng bÞ biÕn tÝnh .HiÖn tîng nµy xÈy ra do c¸c lùc ®Èy tÜnh ®iÖn g÷a c¸c m¹ch polipeptide bÞ triÖt tiªu. §«ng tô lµ ph¶n øng tËp hîp kh«ng trËt tù xÈy ra cïng víi sù biÕn tÝnh protein c¸c liªn kÕt protein – protein chiÕm u thÕ so víi liªn kÕt protein – dung m«i , t¹o thµnh c¸c khèi ®«ng tô cã kÝch thíc lín

Díi c¸c t¸c nh©n kh¸c nhau qóa tr×nh biÕn tÝnh xÈy ra kh¸c nhau , th«ng thêng protein bÞ vãn côc vµ kÕt tña thuËn nghÞch vµ kh«ng thuËn nghÞch: + KÕt tña thuËn nghÞch : Díi t¸c dông cña m«i trêng trung tÝnh : vd : Na2SO4, NaCl ,(NH4)2SO4.... + KÕt tña kh«ng thuËn nghÞch : Víi c¸c yÕu tè nhiÖt ®é cao ,kim lo¹i nÆng ( Fe ,Cu, Pb, Hg) axit triclo axetic. + KÕt tña ®¼ng ®iÖn: Mét protein hay mét protein enzym thêng hoµ tan Ýt nhÊt ë ®iÓm ®¼ng ®iÖn(pI) v× ë ®iÓm ®¼ng ®iÖn c¸c ph©n tö protein cã tæng ®iÖn tÝch b»ng kh«ng tøc lµ kh«ng cã lùc ®Èy tÜnh ®iÖn ,nªn c¸c ph©n tö protein sÏ kÕt hîp víi nhau t¹o ra kÕt tña + KÕt tña b»ng muèi trung tÝnh: §é hoµ tan cña mét protein t¨ng cïng víi lùc ion ( µ ) cña m«i trêng
µ = ∑ 1 Ci .Zi2 2

Trong ®ã : Ci : nång ®é cña lo¹i ion i. Zi : diÖn tÝch cña lo¹i ion ®ã Tuy nhiªn khi lùc µ vît qu¸ mét ngìng nµo ®ã th× ®é hoµ tan l¹i gi¶m nhanh vµ protein l¹i kÕt tña.. Nh vËy mçi mét protein sÏ cãmét kho¶ng nång ®é muèi mµ protein ®ã kÕt tña hoµn toµn, gäi lµ kho¶ng nång ®é muèi tÝch. kho¶ng nång ®é muèi tÝch cña c¸c protein thêng kh«ng gièng nhau + KÕt tña b»ng dung m«i h÷u c¬. Khi thªm dung m«i h÷u c¬ trung tÝnh trén lÉn ®îc vµo níc vµo dung dÞch protein, v× níc ph©n cùc mµ c¸c chÊt h÷u c¬ l¹i lµ nh÷ng chÊt kh«ng ph©n cùc nªn sÏ lamf gi¶m h»ng sè ®iÖn m«i cña dung dÞch. V× vËy lµm t¨ng lùc hót tÜnh ®iÖn gi÷a c¸c ph©n tö protein lµm cho ph©n tö protein liªn hîp l¹i t¹o thµnh kÕt tña . + KÕt tña b»ng c¸c polyme cã khèi lîng ph©n tö cao. C¸c chÊt nµy h¸o níc nªn sÏ lµm mÊt vá níc cña c¸c ph©n tö sinh häc dÉn ®Õn lµm thay ®æi h»ng sè ®iÖn m«i cña m«i trêng xung quanh do ®ã lµm ¶nh hëng ®Õn c¸c t¬ng t¸c kh«ng gian cña c¸c nhãm ho¸ níc cña c¸c ph©n tö protein

.ViÖc kÕt tña phô thuéc vµo nhiÒu yÕu tè nh nhiÖt ®é , pH , lùc ion , nång ®é protein.. Mét sè tÝnh chÊt kh¸c a. Ph¶n øng biure Trong m«i trêng kiÒm m¹nh CuSO4 c¶m øng víi ph¾c cã mµu tÝm ,tÝm ®á. b. Ph¶n øng lowly Ph¶n øng cã t¸c dông lµm t¨ng ®é nh¹y cña ph¶n øng biure Ph¶n øng v¬i thuèc thö hçn hîp cña axit phosphomolipdic vµ axit phosphocrofromic. Dùa vµo c¸c tÝnh chÊt nµy cña protein mµ ta cã thÓ dÔ dµng gi¶i thÝch ®îc c¸c hiÖn tîng xÈy ra trong qu¸ tr×nh thÝ nghiÖm ,®Ó tõ ®ã cã thÓ phÊt huy nh÷ng biÕn tÝnh cã lîi vµ h¹n chÕ c¸c biÕn tÝnh cã h¹i.
B. KÕt qu¶ vµ gi¶i thÝch c¸c hiÖn tîng thÝ nghiÖm.

I. KÕt tña thuËn nghÞch protein 1. KÕt tña b»ng muèi trung tÝnh LÊy 2 èng nghiÖm, cho vµo mçi èng 1m lßng tr¾ng trøng. Thªm vµo èng 1: 1ml (NH4)2SO4 b¶o hßa, l¾c nhÑ, xuÊt hiÖn c¸c thÓ vÈn tr¾ng globulin . Cho vµo èng 2 c¸c tinh thÓ (NH4 )2SO4 cho ®Õn khi dung dÞch trë thµnh b·o hoµ (NH4)2SO4 . So s¸nh khèi lîng kÕt tña cã trong 2 èng nghiÖm, kÕt luËn KÕt tña protein cã thÓ thay ®æi pH dung dÞch ®Õn pHi cña protein b»ng c¸ch thªm c¸c muèi trung hoµ,ë ®©y ta dïng(NH4)2SO4lµ muèi muèi trung hoµ võa lµm trung hoµ ®iÖn võa lo¹i bá ®îc líp vá hydrat ho¸ cña protein.Ta cã s¬ ®å minh ho¹ sù kÕt tña protein
Anion protein Thªm kiÒm T¨ng pH Thªm axit Protein ë pHi Gi¶m pH Cation protein

Lo¹i H2O

Lo¹i H2O

Lo¹i H2O

KÕt tña protein

Thªm níc cÊt vµo tõng èng nghiÖm, khuÊy nhÑ tõ tõ cho ®Õn khi kÕt tña tan hoµn toµn, t¹o thµnh dung dÞch protein trong suèt. Gi¶i thÝch kÕt qu¶: Qua s¬ ®å minh ho¹ ta thÊy qu¸ tr×nh t¹o kÕt tña do líp vá lôa protein bÞ lo¹i bá.Do ®ã khi thªm níc th× líp vá hydrat ho¸ l¹i t¸I t¹ol¹i vµ dung dÞch protein trong suèt ®îc h×nh thµnh. 2. KÕt tña protein b»ng dung m«i h÷u c¬ ë nhiÖt ®é thÊp Cho vµo èng nghiÖm 1ml lßng tr¾ng trøng vµ mét Ýt bét NaCl, khuÊy tõ tõ cho ®Õn tan. Thªm vµo ®ã 2ml cån 96o (hoÆc axeton), l¾c m¹nh trong 3ph, ®îc kÕt tña protein. Sau ®ã, g¹n bá dÞch trong, lÊy kÕt tña. Thªm vµo èng nghiÖm kho¶ng 2ml níc cÊt ®Ó lµm gi¶m nång ®é cån trong dung dÞch vµ hoµ tan hoµn toµn kÕt tña protein. Gi¶i thÝch kÕt qu¶: V× trong lßng tr¾ng trøng thµnh phÇn cña nã lµ Albumin vµ H2O, do vËy khi cho Ýt bét NaCl vµo th× NaCl sÏ tan ra ( NaCl cã t¸c dông võa lµm trung hoµ ®iÖn võa lo¹i bá líp vá hydrat cña protein) . Khi thªm 2ml cån 960 (hoÆc axeton ) ®©y lµ dung m«i h÷u c¬ h¸o níc nªn khi l¾c m¹nh trong 3phót sÏ ph¸ huû líp vá hydrat nhanh chãng lµm xuÊt hiÖn kÕt tña protein . Khi cho níc cÊt vµo nång ®é cßn gi¶m vµ líp vá hydrat cña protein t¸i t¹o lµm kÕt tña hoÇtn hoµn toµn

II. KÕt tña kh«ng thuËn nghÞch protein 1.KÕt tña protein ë nhiÖt ®é cao LÊy 5 èng nghiÖm, cho vµo mçi èng 0,5ml albumin trøng 1% vµ 0.5ml níc cÊt vµo tiÕp tôc theo thø tù c¸c èng nghiÖm, tiÕn hµnh nh sau: + §un nãng èng thø nhÊt + Thªm 2 giät CH3COOH 1% vµo èng 2, ®un nãng + Thªm 2 giät CH3COOH 10% vµo èng 3, ®un nãng (thËm chÝ ®Õn s«i) + Thªm 2 giät CH3COOH10% vµ 2 giät NaCl b·o hoµ vµo èng 4, ®un nãng +Thªm 1 giät NaOH 10%, ®un nãng (thËm chÝ ®Õn s«i) vµo èng 5 NhËn xÐt: Sau khi tiÕn hµnh thÝ nghiÖm ta thu ®îc kÕt qu¶ sau: èng 1: XuÊt hiÖn vÈn tr¾ng. èng 2: Còng xuÊt hiÖn vÈn tr¾ng nhng Ýt h¬n. èng 3: Cã vÈn tr¾ng nhng bÞ vãn côc l¹i. èng 4: KÕt tña tr¾ng nhiÒu . èng 5: XuÊt hiÖn kÕt tña mµu vµng. Qua ®©y ta thÊy protein còng bÞ biÕn tÝnh bëi nhiÖt ®é 2. KÕt tña protein b»ng axit v« c¬ ®Æc LÊy 3 èng nghiÖm, cho vµo mçi èng 0,5ml lßng tr¾ng trøng, sau ®ã nhá tõ tõ theo thµnh èng 1: 1ml HCl (®Æc); èng 2: 1ml HNO3 (®Æc); èng 3: 1ml H2SO4 (®Æc). Quan s¸t hiÖn tîng. Sau ®ã l¾c ®Òu, quan s¸t vµ gi¶i thÝch hiÖn tîng. Quan s¸t hiÖn tîng ta thÊy : C¶ 3 èng nghiÖm khi l¾c ®Òu vÈn ®ôc nh nhau Gi¶i thÝch: Do axit v« c¬ m¹nh còng h¸o níc nã hót níc lµm vá hydrat cña protein bÞ mÊt t¹o thµnh c¸c kÕt tña protein. LÊy 2 èng nghiÖm, cho vµo mçi èng 20 giät lßng tr¾ng trøng. Thªm vµo èng 1: 10 giät axit tricloaxetic (CCl3COOH) 10%; èng 2; 10 giät axit sunfosalisilic 10%, l¾c nhÑ, ®Ó yªn. So s¸nh lîng kÕt tña.

Gi¶i thÝch: C¶ hai èng nghiÖm ®Òu cã mµu tr¾ng s÷a nhng kÕt tña èng 2> kÕt tña èng1 Do axit sunfosalisilic h¸o níc h¬n v× vËy líp vá hydrat cña protein ( lßng tr¾ng trøng ) ë èng 2 bÞ ph¸ huû nhiÒu h¬n nªn lîng kÕt tña nhiÒu h¬n. 3. KÕt tña b»ng muèi kim lo¹i nÆng LÊy 3 èng nghiÖm, cho vµo mçi èng 1ml lßng tr¾ng trøng. Thªm vµo èng 1 tõng giät CuSO4 5%, quan s¸t sù t¹o thµnh kÕt tña. Sau ®ã tiÕp tôc thªm tõng giät CuSO4 5% cho ®Õn khi kÕt tña protein tan hoµn toµn. lÆp l¹i thÝ nghiÖm ë èng 2 víi FeCl3 5% vµ èng 3 víi (CH3COO)2Pb 5%. So s¸nh vµ gi¶i thÝch kÕt qu¶ trong 3 èng nghiÖm: KÕt qu¶: èng 1: Cã kÕt tña mµu xanh nh¹t , khi ta tiÕp tôc thªm CuSO4 ( 5% ) ®Õn khi kÕt tña hoµ tan hoµn toµn th× dung dÞch cã mµu xanh ®Ëm h¬n( mµu cña CuSO4 ) èng 2: Cho FeCl3 ( 5%) vµo th× dung dÞch protein tõ trong suèt t¹o kÕt tña sau ®ã tiÕp tôc thªm th× kÕt tña tan mét phÇn. èng 3: Cho (CH3COO)2Pb ( 5%) vµo ban ®Çu còng xuÊt hiÖn kÕt tña vÈn tr¾ng khi tiÕp tôc cho vµo th× kÕt tña tan mét phÇn. Quan s¸t 3 èng nghiÖm cho thÊy èng 1 tan nhiÒu nhÊt ®Õn èng 3 råi ®Õn èng 2. Gi¶i thÝch : Protein ph¶n øng víi c¸c cation kim lo¹i nÆng M( Cu ,Fe, Pb ) t¹o thµnh tinh thÓ muèi néi phøc ( do protein cÊu thµnh) Tõ c¸c axit amin
R CO NH2 Cu O NH2 CH2 O CO

Khi c¸c muèi nµy cho vµo th× sÏ t¸c dông víi c¸c néi phøc dÉn ®Õn kÕt tña protein tan ra.