You are on page 1of 9

Sulfat radikal menghasilkan prekusor non-enzimatik pada siklus

Krebs
Markus A. Keller1,2,3 , Domen Kampjut1 , Stuart A. Harrison1 and Markus Ralser1,4*
Asal usul evolusioner siklus Krebs (siklus asam tricarboxylic) tidak begitu jelas. Meski keberadaan katalisator non-
enzimatik sederhana siklus krebs dihilangkan beberapa tahun yang lalu sebagai 'appeal to magic’, sitrat dan zat
intermediate lainnya sejak saat itu telah ditemukan di meteorit berkarbon dan melakukan interkoneksi non-enzimatik.
Untuk mengidentifikasi metabolisme katalis siklus Krebs non-enzimatik, kami menggunakan kombinatorial, analisa
kuantitatif melalui metabolomik hingga secara sistematis layar besi dan senyawa sulfat dalam campuran reaksi yang
mengarahkan pada komponen khas endapan Archaean. Siklus Krebs intermediate ditemukan untuk stabil di air dan pada
sebagian besar spesies molekul, termasuk mineral sulfat besi sederhana. Namun, dengan adanya radikal sulfat yang
dihasilkan dari peroksidisulfat, intermediet mengalami 24 interkonversi reaksi. Reaksi non-enzimatik ini menutupi
topologi kritis siklus Krebs oksidatif, yaitu pelepasan glyoxylate dan jalur succinic-semialdehyde. Dirakit dalam jaringan
kimia, reaksi menghasilkan lebih dari 90% pemulihan karbon. Hasil kami menunjukkan bahwa prekursor non-enzimatik
siklus Krebs secara biologis masuk akal, efisien, dan terbentuk secara spontan dengan adanya radikal sulfat.

S
iklus asam tricarboxylic (TCA), atau siklus Krebs, dimungkinkan secara katalitis. Apalagi keberadaan pemersatu,
merupakan pusat jalur metabolisme, khususnya sebagai memebuat katalis sederhana menjadi masuk akal. Reaksi non-
oksidatif. Jalur metabolik ini menyediakan prekursor untuk enzimatik yang meniru dua jalur metabolisme lainnya, yaitu
biosintesis asam amino, dan memainkan peran penting dalam glikolisis dan jalur pentosa fosfat, mereka disatukan bersama
kerusakan asam lemak, respirasi seluler, dan metabolisme energi pada besi ferrous sebagai katalis dan co-substrat. Fe (ii)
dan redoks. Terjadinya kemunculan sekurang-kurangnya pada melimpah pada sedimen khas Archaean, menyiratkan bahwa
reaksi oksidatifnya menunjukkan bahwa setidaknya sebagian dari lingkungan kimia umum, lebih jarang pada kondisi khusus,
Siklus Krebs berasal dari tahap awal evolusi; mungkin kembali mungkin merupakan kunci untuk membentuk struktur jalur
ke asal usul kehidupan. Sebuah hipotesis yang sering dibahas metabolisme.
mengusulkan bahwa siklus Krebs memperoleh topologi Kami memilih strategi penyaringan yang sistematis dimana
strukturalnya dengan prinsip seleksi Darwin yang dimungkinkan 8.850 absolut. Percobaan kuantitatif dilakukan untuk menguji
oleh 'dunia asam ribonuklead (RNA)'. Asal post-genetic reaktivitas dari intermediet TCA terhadap unsur khas sedimen
mengimplikasikan bahwa jalur topologi tunduk pada perubahan Archaean, serta zat besi dan belerang. Kami menemukan bahwa
progresif, menyiratkan bahwa Siklus Krebs modern dapat zat antara TCA tidak reaktif terhadap adanya besi dan kombinasi
berbeda secara substansial dari prekursor awal. Namun, asal sulfat, termasuk mineral sederhana, ferrous sulfide (FeS).
mula post-genetic metabolisme berusaha untuk menjelaskan Namun, terhadap keberadaan donor peroksidisulfat radikal, kami
banyak, banyak enzim yang kompleks secara struktural masuk ke mendeteksi 24 non-enzimatik reaksi interkonversi. Reaksi ini
dalamnya awalnya; Enzim itu sendiri dibuat dari metabolisme menyerupai isomerisasi dan reaksi oksidatif dari siklus Krebs
produk dari siklus Krebs. Kedua, asal Darwinian topologi enzimatik, perpindahan glikoksilat dan jalur semialdehida
jaringan metabolik mengalami kesulitan dalam menjelaskan suksinik, sehingga topologi kritis mereka ditutupi. Sebuah
tingginya jumlah reaksi yang terjadi antara kerajaan meskipun jaringan kimia yang dirakit dari reaksi ini menghasilkani lebih
kurangnya konservasi urutan enzim. Sebuah hipotesis alternatif dari 90% perolehan kembali karbon, membentuk prekursor non-
mengusulkan bahwa setidaknya reaksi metabolik utama berasal enzymatic yang masuk akal untuk asal mula awal Siklus Krebs.
dari lingkungan kimia. Dalam konteks ini, katalisis anorganik
menentukan struktur dasar metabolisme. Hasil
Sebagai mekanisme enzimatik siklus Krebs memiliki Kami mengoptimalkan melalui beberapa kromatografi cairan
kemiripan yang terbatas untuk katalisis anorganik, gagasan asal metode pemantauan reaksi (LC-MRM) untuk memungkinkan
non-enzimatik itu diragukan oleh kebanyakan. Misalnya, Leslie kuantifikasi absolut TCA intermediate pada 6.100 sampel yang
Orgel, seorang pemimpin ilmuwan dalam membentuk hipotesis dihasilkan oleh penelitian ini. Kami selanjutnya menilai
dunia RNA, menolak kemungkinan tersebut bahwa katalis reaktivitas sitrat, cis-aconitate, isocitrate, α -ketoglutarat,
anorganik sederhana yang bisa menggantikan serangkaian reaksi suksinat, fumarat,
mirip TCA sebagai 'daya tarik terhadap sihir'. Namun, terlepas
dari kenyataan bahwa katalis sederhana memang hilang, ada
yang berpendapat beberapa metabolit siklus Krebs terbentuk
dalam reaksi kimia organik. Sementara itu, kehadiran
serangkaian intermediet TCA telah dikonfirmasi pada meteorit
berkarbon. Selanjutnya, sitrat dan intermediet TCA lainnya
mengalami reaksi interkonversi reduktif yang sangat efisien pada
partikel semikonduktor saat terpapar sinar ultraviolet yang kuat.
Prekursor non-enzimatik ke siklus Krebs Oleh karena itu siklus

Dilihat dari perspektif lain. Selanjutnya. karena memfasilitasi skenario bertahap malat dengan adanya peroksidisulfat dan besi sulfida. tingkat itu menurun menjadi hanya 0. isomerisasi). dan jalur semialdehida suksinik ditutupi Fe (ii) tergantung reaksi non-enzimatik yang menyerupai glikolisis oleh topologi sistem non-enzimatik ini (Gambar 3b. Setelah sumber zat besi mencerminkan besi. Sebagian besar reaksi kehidupan berasal dari heterotrofik atau autotrofik. Pendinginan radikal memiliki dampak yang lebih rendah substrat TCA dalam semua kemungkinan kombinasi (Gambar 2a). tujuh sumber besi dan lima Tambahan 5). yang keduanya biasanya dikatalisis oleh propanol diparut secara efisien radikal hidroksil dan sulfat (k (HO •) = enzim sulfur-cluster besi. kami menyelidiki efek hidrogen peroksida ketoglutarat-sejak ini bagian-bagiannya membentuk situs pengikat besi (H2O2). yang dengan adanya Fe (ii) menghasilkan radikal hidroksil (Gambar 1d). kobalt. Sekali pada beberapa reaksi. Dari 24 reaksi tersebut. Satu-satunya Pengecualian untuk suksinat adalah reaksi tercepat. jaringan prebiotically melimpah. Sedangkan sitrat terhadap suksinat adalahoksaloasetat. a Spektrum reaktivitas yang komprehensif produknya (Gambar 4d). Sedangkan 2- dan suksinat menjadi fumarat. Intermediet TCA stabil dan tidak secara spontan sulfida besi.0433 μ mol bereaksi untuk membentuk zat antara TCA lainnya atau produk lainnya min-1 dengan tidak adanya sulfida besi.3% adalah bagian dari jaringan metabolik. Di adanya jaringan kimia. dengan adanya peroksidisulfat mungkin eksklusif untuk lingkungan Logam transisi secara prebiotically berlimpah dan tetap ada katalis sederhana. kita mengeksploitasi sifat (Gambar 1d). untuk sebagian besar reaksi.atau dua elektron (25) dan ketoglutarat. struktur dilestarikan melintasi kerajaan. semialdehida sccinik. k (SO . logam jejak lainnya. Konversi Semialdehida suksinat (Gambar 1a. masing-masing.malat dan oksaloasetat bila dipanaskan dalam air dalam bentuk atmosfer 24 reaksi non-enzimatik terjadi pada tingkat rata-rata 0. Hanya 8. Peroksidisulfat dapat Archaean khas dan menemukan itu isocitrate bereaksi membentuk α . b dan Tambahan Gambar 1). Kami melanjutkan dengan layar yang menghilangkan sebagian besar reaktivitas (Gambar 4b. saat ini tidak ada kemungkinan skenario yang termasukkarbon dioksida (Gambar 3c). khususnya ferrous sulfide. Kami menguji M-1 s-1). dimana enzim tidak berurutan dilestarikan besi. nikel dan molibdenum konsentrasi sedimen digabungkan dengan peroksidisulfat (Gambar 3a). namun pemulungan sulfat Radikal oleh 2-propanol dan Gambar Tambahan 5 dan 6). ini termasuk jalur seperti Kami memperhatikan bahwa bila digabungkan dengan sumber zat glikolisis dan variannya. yang bisa dijelaskan dengan pemulungan yang lagi. ini Reaksi mengikuti profil pH yang jelas melalui Reaksi Fenton. pembentukannya radikal. pemulung diferensial dari 2-propanol dan tert-butanol. dan jalur pentosa fosfat (PPP) mengungkapkan hal itu jaringan reaksi Menimbang bahwa kondisi kami dioptimalkan untuk mendapatkan a seperti metabolisme bisa terbentuk secara sederhana dan katalis jumlah maksimum reaksi mirip TCA. c). kedua reaksi tersebut diaktifkan oleh Fe (ii) dengan jalur glikolisis dan pentosa fosfat. panel kiri) 33. Seperti TCA Reaksi tidak dicegah oleh tert- namun tidak mendeteksi adanya TCA reaksi (Tabel Tambahan 3 dan 4.2 × 107 M-1 s-1). Namun. Dalam analisis deret untuk asal enzim.1% metabolit non-TCA. asal jaringan dipercepat. Namun. daripada hidroksil radikal (k (HO •) = 5. dan α -ketoglutarat bereaksi memiliki potensi oksidatif tinggi karena adanya sumbangan radikal membentuk suksinat (Gambar 1c dan Tabel Tambahan 1). misalnya glukosa-6-fosfat dan 6-fosfogluconat.9% digerakkan oleh Archaean yang paling melimpah logam transisi adalah karbon ditemukan kembali dalam intermediet TCA.-) 4 = 8. yang membentuk piruvat melalui dekarboksilasi merupakan reaksi yang paling lambat (Gambar 3a dan Gambar (Gambar 1b dan Gambar Tambahan 2). Namun. Rendahnya jumlah reaksi mengesampingkan kemungkinan terjadinya kekhususannya adalah 83% lebih rendah dan laju reaksi kumulatif transisi katalisis cukup untuk memungkinkan siklus Krebs non-enzimatik 91. dan masing-masing terjadi pada tingkat 33. (Gambar 4b. bukan maksimal Hasilnya. serupa untuk Fe (ii) reaksi glikolisis-reaksi serupa. tert-butanol sebagai katalis dalam metabolisme prebiotik4. (kinetik) karakterisasi reaksi yang dimulai dari sitrat. dan oleh karena itu Mungkin tergantung pada α-hidroksil atau α -keto termolisis. Kami menguji logam transisi campuran yang lebih cepat daripada yang terbentuk.3 dan Supplementary Table mengandung besi seperti pirit. Siklus Krebs demikian kontras Tambahan 7). serta fotolisis dan 2). Setelah dua jam. glyoxylate shunt. c dan Tabel sistematis. Besi-sulfur mineral seperti pirit bisa bertindak 1. suksinat dan piruvat.7% pada lingkungan Fe (ii) (Supplementary Gambar 7 dan Tabel berfungsi sebagai kontrol penting karena mereka memastikan tidak Tambahan 1). 10 juga dimungkinkan (Tambahan Gambar 4). masuk akal yang membentuk prekursor glikolitik dan PPP. dimana 42. spektrum reaksi yang diaktifkan oleh Terkadang bingung dengan pertanyaan penting lainnya tentang apakah peroxydisulfate diubah secara substansial. reaksi kimia yang non-enzimatik ditemukan sangat tinggi efisien.5 x 105 mineral ini sedikit berbeda kimia katalisis metabolik. Dengan demikian tidak diketahui bagaimana glikolisis non-enzimatik bisa . Namun. Namun. untuk 100 μ M substrat dengan adanya peroxydisulfate dan pra-metabolisme). adanya dimungkinkan pada penambahan peroksidisulfat (Gambar 2b dan Tabel radikal sulfat sangat penting. α -ketoglutarat. tidak terjawab Pertama. Selanjutnya. dan secara substansial lebih cepat pada peroksidisulfat / secara spontan saling bertukar air. 91. cisonononon. menguji sepuluh belerang senyawa. bertindak melalui mekanisme satu (radikal) . zat antara yang terdeteksi secara eksklusif adanya enzimatik kontaminasi.9 × 109 M-1 s-1. dua pertanyaan kunci tetap TCA yang baru dibentuk metabolisme. mengorbankan tambahan metabolit TCA yang terbentuk (Supplementary Peningkatan jumlah eksperimen mengungkapkan bahwa intinya Bagian Table 1). fumarat dan lingkungan memang menarik. Sebuah teori yang menjelaskan asal metabolisme oleh kimia anorganik isocitrate. Tambahan 3). Selanjutnya.2 × 108 M-1 s-1) sulfida besi sebagai a mimetik sederhana dari mineral besi-belerang. tidak semua enzim yang waktu kuantitatif. karena mereka dikonversi ke produk hilir pada tingkat yang metabolik umum hari ini. Hipotesa bahwa Reaksi mirip TCA bergantung pada moieties yang ada secara khusus hadir dalam isocitrate dan α . tapi kimia permukaan kurang efisien dalam pemulungan radikal sulfat (k (SO4 • -) = 8.1% lebih rendah (Gambar 4a).280 μ mol nitrogen buatan (untuk mereplikasi konsentrasi oksigen rendah dari dunia min-1. Hambatan utama terjadi pada konversi sitrat ke isocitrate. kami mendeteksi Pembahasan hingga 13 metabolit TCA pembentukan reaksi (Gambar 2b dan Gambar Semua sel hidup memiliki jaringan metabolisme yang topologisnya Tambahan 5 dan 6). butanol. Dalam dua titik format penyaringan. sebagian besar campuran reaksi tidak berpengaruh pada intermediet tidak lengkap atau oleh aktivitas non-radikal peroksidisulfat dan TCA (Gambar 2b). sementara beberapa intermediet tidak lagi diobservasi dengan metabolisme ini tetap merupakan masalah yang belum terpecahkan. Nonenzymatic Reaktivitas seperti TCA lingkungan sulfida besi. suksinat. di mana beberapa intermediet (Gambar 1). Reaksi ini sulfat yang terbentuk pada aktivasi oleh zat besi dan sedimen yang bergantung pada Fe (ii) (Supplementary Fig. Grafik jaringan Rakitan dari reaksi ini fungsional unit Apalagi sistem kimia bisa diperbaiki secara bertahap menunjukkan bahwa proporsi yang tinggi siklus TCA (reaksi oksidatif dan mulai dari reaksi yang paling membatasi. Selain itu. oleh H2O2 (Gambar 4a dan Tabel Tambahan 5). Oleh karena itu kami melanjutkan dengan rinci dan kuantitatif struktural menyerupai reaksi kimia spontan dan nonenzimatik katalisis. kami mendeteksi 24 reaksi yang menginterpretasikan membentuk a Jalur perlu muncul bersamaan pada saat mencapai metabolit TCA (Gambar 3a).0 sangat bergantung pada memungkinkan kimia Selanjutnya eksperimen ini dan 34.

Campuran logam campuran Arsen seperti Archaean meningkatkan reaktivitas saat diperiksa dalam percobaan waktu kursus (0-300 min).3). Reaksi yang teridentifikasi pada c (panah merah) diproyeksikan ke skema siklus TCA. Kedua. pencarian sistematis kami untuk . b. Gambar 1 | intermediet TCA stabil di air namun menunjukkan reaktivitas dengan adanya logam transisi yang sering ditemukan pada sedimen archaean. melepaskan diri dari keseimbangan. kecuali untuk oksaloasetat. yang membentuk piruvat (panah merah. glikolisis . Krebs Siklus adalah contoh jalur dalam konsentrasi tinggi sebuah meteorit berkilau13-15. Dalam seperti itu. Skema reaksi siklus TCA. lihat Gambar Tambahan 2). d. intermediet TCA stabil dalam air pada suhu 70 ° C. c. α-Hidroksil dan α-keto yang memungkinkan interaksi spesifik dengan besi besi ditunjukkan dengan warna merah.dan reaksi mirip Yang menarik dari siklus Krebs adalah nonenzymatic pembentukan zat PPP tidak bisa jelaskan asal jalur lain yang bergantung pada yang berbeda antaranya telah berulang kali dijelaskan. glikoksilate shunt dan jalur semialdehida suksinat (SSA). Garis putus-putus Gray menunjukkan topologi siklus Krebs. sedangkan α-ketoglutarat diubah menjadi suksinat (Supplementary Fig. tanpa reaktivitas yang terdeteksi selama periode pemantauan lima jam. satu tanpa zat antara terfosforilasi. suksinat dan piruvat. termasuk kehadiran mereka kimia. Isositrat diubah menjadi α- ketoglutarat. a. termasuk topologi kanonik untuk siklus Krebs.

diilustrasikan dalam matriks panas. kanan.Gambar 2 | Peroksidisulfat memungkinkan interkonversi non-enzimatik intermediet tCa. 0 menit. b. dinyatakan sebagai hitungan per detik. Tabel Tambahan 3 dan Gambar Tambahan 5 dan 6). Untuk setiap kemungkinan reaksi. Kanan: sepuluh contoh reaksi signifikan yang terdeteksi untuk kombinasi peroksidisulfat dan sulfida besi. z> 1. Kiri: reaksi signifikan. Sebagian besar kondisi tidak mendukung reaktivitas yang signifikan (ambang signifikansi. . Penyaringan kondisi kombinatorial: lima intermediet TCA diinkubasi bersama selama 0 dan 300 menit dengan kombinasi tujuh sumber besi dan sepuluh belerang. 300 min. Kiri. akumulasi produk dan konsumsi substrat lebih dari 300 min dihitung dari sinyal SRM terpadu. a.6.

namun cukup rendah yang mungkin Untuk menempatkan hasil non-enzimatik ke dalam kompatibel dengan kehidupan. semiald. Kami hanya menyaring 90%). abu-abu). reaktivitas TCA Non-enzimatik (laju reaksi relatif. borate). kami mengecualikan kondisi kami temukan tergantung pada pembentukan radikal sulfat. biru). pembentukan intermediate TCA (red) dan kehilangan karbon (pembentukan zat antara non-TCA. secara substansial melebihi dari glikolisis in vitro dengan Meskipun intermediet siklus TCA sangat stabil secara keseluruhan. Singkatan: Succ. Skema siklus Krebs yang dikatalisis enzim (abu-abu). sementara rendah dan dikompromikan pada suhu (70 ° C) yang cukup tinggi untuk membentuk hampir tidak ada banyak termodinamika lainnya produk memudahkan pengukuran reaksi lambat. Diagram lingkaran menggambarkan efisiensi dalam hal pemulihan metabolisme TCA (pembentukan substrat. c. Gambar 3 | reaksi mirip siklus Krebs non-enzimatik dengan adanya peroksidisulfat dan peroksidisulfat / sulfida besi. dan kita Krebs. yang . Lingkaran dalam dan luar masing-masing mewakili peroksidisulfat dan kombinasi peroksidisulfat dan sulfida besi. Reaksi mirip TCA non enzimatik sangat efisien dan mereplikasi sebagian besar spektrum reaksi siklus TCA. menghindari kondisi niche dan logam yang hampir tidak memainkan membentuk jaringan reaksi kimiawi yang luar biasa hasil tinggi (> peran dalam metabolisme (titanium. * Perhatikan bahwa kuantifikasi sitrat menunjukkan variabilitas teknis yang lebih tinggi untuk kombinasi peroksidisulfat dan sulfida besi-lihat Metode untuk rinciannya. pirau glyoxylate dan jalur semialdehida suksinik (Gambar 2). piroklik glyoxylate dan jalur semialdehida suksinik. dinormalisasi untuk perbandingan) dengan adanya peroksidisulfat dan / atau sulfida besi. spesifitas tinggi ini Peroksidisulfat memungkinkan serangkaian reaksi mirip TCA. tekanan tinggi. Penjelasan untuk Layar high-throughput kami memang mengungkapkan satu pukulan. pirau glyoxylate (oranye) atau jalur semialdehid suksinik (merah). enzimatik reaksi ini meniru reaksi oksidatif dan isomerisasi dari siklus sinar ultraviolet. katalis siklus Krebs yang masuk akal. suhu di atas 100 ° C). Dengan kata lain. semialdehida succinik. dalam beberapa reaksi.. Lihat Tabel Tambahan Tambahan dan Gambar 7 untuk data tingkat. terbentuknya metabolit non- molekul Berdasarkan unsur penting untuk metabolisme yang sering TCA diabaikan (Gambar 3c). lainnya adalah seperti Gambar 2a. TCA metabolit yang terjadi komponen sedimen Archaean. menggunakan dimurnikan Enzim Escherichia coli. Reaksi non-enzimatik diwarnai menurut apakah mereka meniru siklus Krebs (hitam). b. a. perspektif. Memang. Non- kimiawi yang tidak dapat bertahan dalam batas-batas sel (khususnya. glikoksilat shunt (oranye) dan jalur semialdehida suksinik (merah). menggunakan kondisi oksigen secara khusus interkonverted antara intermediet TCA.

namun dengan penetrasi yang berbeda. a. lainnya adalah seperti Gambar 2a. baik siklus TCA dan perakitan gugus suksinat bisa terbentuk dari sitrat. Untuk reaksi. Efek 2-propanol dan tert-butanol pada tiga reaksi non-enzimatik yang representatif (titik hitam menunjukkan adanya pemulung yang sesuai. kunci reaksi co-factor-coupled? Untuk melengkapi siklus Krebs. Masih ada jejak tidak langsung dari kimia redoks sulfur disebabkan oleh dimensi spasial radikal sulfat yang lebih besar. semialdehida suksinik dan akhirnya suksinat. sulfat besi terjadi di mitochondira45. Data diberikan sebagai mean ± s. akonit. Reaksi cis-aconitate terhadap suksinat dan isositrat pada semialdehida suksinat terutama terjadi. d. dan juga kontradiktif dan terbentuk dalam siklus Krebs urutan reaksi yang dimulai dengan sitrat metabolit pengoksidasi. setidaknya untuk stabil akhir produk reaksi formasi mereka dalam pirit dan asal biotiknya44. dan bertahan beberapa detik43. Inset: total laju reaksi kumulatif absolut untuk hidrogen peroksida. C-C α -ketoglutarat. pada beberapa reaksi topologi seperti siklus TCA diperoleh.d . Ini kontras dengan multi langkah yang terdeteksi dengan pengaturan kami (Tabel glikolisis dan PPP. Perbandingan efek radikal sulfat dan hidroksil donor pada reaksi non-enzimatik TCA. yang bergantung pada Fe (ii) tapi tidak pada spesies Tambahan 6). Reaksi belerang16.d . Misalnya.1% lebih lambat. tert-butanol. sementara reaksi pembentukan piruvat radikal hidroksil yang waktu paruhnya dalam air hanya 10-9 s. c. Kiri: kapasitas pemulungan diferensial 2-propanol dan tert-butanol (seperti yang ditunjukkan oleh konstanta kesetimbangan masing-masing.dan tert-butanol untuk HO •). Properti ini adalah beberapa jejak awal kehidupan di Bumi. Selanjutnya radikal sulfat membawa yang negatif mengisi pada pH Fakta bahwa hampir semua reaksi bergantung pada Kehadiran fisiologis. isositrat ke α-ketoglutarat.. Gambar 4 | Peroksidisulfat memungkinkan reaktivitas seperti tCa dengan menyediakan radikal sulfat. Tingkat reaksi ditentukan dengan adanya hidrogen peroksida (H2O2) dan diberikan relatif terhadap tingkat masing-masing (garis putus-putus) dengan adanya peroksidisulfat ((NH4) S2O8). peroksidisulfat dan kontrol (air). Interaksi elektrostatik ini. Data diberikan sebagai mean ± s. Efek berbeda dari 2-propanol (merah) dan tert-butanol (hitam) mengkonfirmasi ketergantungan reaksi lebih besar pada radikal sulfat. bersamaan dengan hambatan sterik miliaran tahun.. piruvat sulfat adalah urutan yang lebih stabil. yang. Radikal lainnya dihambat oleh pemulung radikal Dengan demikian. 2-propanol. awal. yang kemudian diubah menjadi isocitrate. pembentukannya dari piruvat dari sitrat tampaknya tidak oleh sitrat sintase) diperlukan tapi ini hilang dari seri non-enzimatik. Pengamatan ini bisa memberi penerangan baru pada teori redoks oksidoreduktase seperti redoks dan dehidrasi. konsentrasi substrat awal adalah 100 μM. berperan dalam anabolisme dan mencakup diubah menjadi cisaconitate. n = 3. k) memungkinkan adanya diskriminasi antara reaktivitas yang dimediasi oleh radikal sulfat dan yang dimediasi oleh radikal hidroksil. b. seperti yang dijelaskan dalam c. diberikan oleh sifat fisikokimia radikal sulfat. kebanyakan spesies eukariotik. dan ditandai dengan batasi jumlah produk reaksi. Reaksi yang diamati meliputi dekarboksilasi. dipengaruhi oleh pemulung radikal sulfat. isocitrate dan α -ketoglutarat. 2-propanol. Singkatan: 2-PrOH. . Meski reaktif Radikal sendiri belum dipelihara selama TCA. kemungkinan terbentuk melalui lebih dari satu jalur reaksi. Nilai dihitung berdasarkan kemampuan pemulung untuk mengurangi reaktivitas non-enzimatik versus kontrol. Dibandingkan dengan tergantung pada spesies radikal. 2- propanol untuk SO4 • . H2O2 memungkinkan subset reaksi yang rata-rata 91. untuk semua tingkat kumulatif (panel a-c). Mikrofosil di batuan berumur 3. Reaksi ini menunjukkan hal serupa ketergantungan pada radikal sulfat Bagaimana serangkaian reaksi non-enzimatik memungkinkan dan perilaku pendinginan serupa. Ini menyiratkan bahwa suksinat terjadinya evolusi dari siklus Krebs.4 miliar tahun dari Australia Barat batasnya akses ke posisi reaktif pada intermediet TCA. reaksi pembentukan ikatan terhadap sitrat yang dihasilkan (dikatalisis Sebaliknya. t-BuOH. n = 3 (lihat Tabel Tambahan 5 untuk data tarif). Sementara glikolisis dan PPP biasanya sitoplasma. dan untuk endosymbiont. Kanan: reaktivitas yang dimediasi oleh peroksidisulfat dipadamkan oleh pemulung radikal sulfat. 2-propanol dan tert-butanol menyebabkan reduksi besar dan menengah pada laju reaksi. dan karenanya dipengaruhi oleh repulsif kekuatan antara radikal sulfat bisa menjadi indikasi lingkungan prebiotik di mana siklus dirinya dan kelompok karboksil yang dibebankan pada intermediet Krebs muncul.

Data spektrometri massa Tandem dianalisis dengan mengorbankan pengukuran tingkat reaksi yang tepat. 2-mercaptoethanol (Merck berarti itu Keuntungan yang signifikan bisa diraih dengan Millipore. yang dilakukan Penentuan laju reaksi. dan untuk menganalisa dan mengatur secara efisien digunakan untuk penentuan konsentrasi metabolit absolut. Model pas terbaik dipilih menurut transisi tertentu dengan MassHunter (Agilent) didukung oleh masing nilai koefisien determinasi (R2) dan telah dikonfirmasi dengan pemeriksaan manual tambahan puncak (lihat bagian metode LC-SRM). (2) model pertumbuhan dan kami merancang setup eksperimental alternatif dengan Interval yang nonlinier. Daerah puncak mentah diferensial data (Δ Xi = Xt = 300 . Penutupan Siklus TCA melalui reaktivitas sitrat-sintase (F408).8 μ m. Jaringan kimia yang dihasilkan asam asetat dan 10 mM tributylamine dalam air kelas UPLC mencakuptopologi bagian konservatif (oksidatif) dari siklus Krebs.5 ml min-1 diikuti oleh gradien elusi 'lingkungan' ini. Analisis statistik layar reaktivitas besi/sulfur. (3) tingkat pertumbuhan awal maksimum dalam rentang linier Kontrol kualitas dan outlier. Instrumen Untuk mengatasi ini Kami menyederhanakan dan mengoptimalkan parameter dan transisi metabolit untuk setiap fitur dioptimalkan dengan persiapan sampel.1 mm x 50 mm. dan karenanya mungkin bukan awal evolusi titik untuk siklus (A3412). Metabolit standar diperoleh dengan kemurnian tinggi. kami menggambarkan saling kompatibel. natrium sulfat Na2SO4 (Fischer Scientific. Reaksi bergantung pada fumarat (F1506). natrium α –ketoglutarat (K2010). Ukuran sampel. sesuai dengan kondisi gradien UPLC yang diberikan pada menunjukkan bahwa siklus Krebs bisa muncul dari prekursor non. Algoritma pemasangan tersebut.5- mencapai efisiensi karbon lebih dari 90%. serta efek lainnya sebagai stabilitas adalah biasanya diatur ke 0. Organics. suhu diaktifkan oleh radikal sulfat yang terbentuk pada kolom. 10219790). asam cis-aconitic biologis. efisien. untuk digunakan untuk produk retensi waktu dan sifat fragmentasi secara eksternal diukur secara dengan formasi dinamis / perilaku degradasi. 10.850 sampel bersamaan dengan 1. di R. Untuk setiap ulangan.Xt = 0) antara t = 300 menit dan t = 0 Bahan. Adanya nonenzymatic Metode LC-SRM untuk kuantifikasi metabolit TCA. asam l-malat (M6413). sebuah Agilent 1290 Infinity Binary LC dimenjelaskan asal mula glikolisis. menambahkan hanya satu langkah enzimatik. Sampel poin dalam percobaan time-course substrat. heterotrofik di alam. F1114).2% aktivasiperoxydisulfate. Pengenceran standar eksternal yang diukur berulang kali seri dan kekosongan. dl-etionin (E5139). natrium sulfit Na2SO3 (Fischer Ilmiah. Fe (ClO4) 2 (334081). Sebagai alternatif. Lebih lanjut kromatogram LC-SRM 65. siklus penuh atau reduktif hadir hanya dalam subset spesies natrium sitrat (71635). natrium piruvat (P2256). dan (4) dan eksponensial kimiawi murni standar. ini Metode menghasilkan waktu siklus antara 4. Ini memberikan kasus dimetilsulfoksida (D8418).Reaksi Eclipse Plus C18 Rapid Resolution (1. Puncak diidentifikasi dengan mencocokkan menggunakan model kuadrat terkecil. Untuk Reaksi piruvat karboksilase dapat menyatukan masalah utama kuantifikasi TCA intermediet. ferrocene enzimatik. spectrometer digunakan. Akibatnya.org). 2. lingkungan Reaksi itu tidak lantas memiliki kemiripan dengan Semua air diperoleh secara komersial dengan kemurnian yang sesuai metabolisme jalur14. metionin (M9375). Termasuk mencuci dan re-equilibration. produk dan co-produk.250 kontrol. siklus PPP dan Krebs. yang berbasis di sekitar pemersatu katalis sulfat.3. Krebs2. Setiap laju reaksi dihitung berdasarkan deret waktu bereksperimen dengan enam titik pengumpulan. kami menggunakan lebih banyak metode intensif lunak analisis QQQ-nya. amonium peroksidisulfat (Fischer Kemungkinan lain adalah itu versi pertama dari siklus Krebs bisa saja Scientific. standar eksternal diukur. sistein (30095). sodium isocitrate (I1252). yang merupakan bagian dari modul SSgompertz lebih sempit mengikuti reaksi ini. FeS (268704). Semua puncak yang terintegrasi secara sumber daya untuk optimal pemisahan kromatografi dan kuantifikasi otomatis adalah dikurasi secara manual untuk memastikan kualitas dan mutlak laju reaksi. pemantauan reaksi multipel atau selektif (MRM atau SRM). 10493372). 0. Kesederhanaan kondisi 2. 23214102). natrium suksinat (14160). Cat no. Pelarut A yang terkandung 5% metanol. NaHSO3 (Acros yang menarik untuk evolusi dari metabolisme enzim-dikatalisis. y = ae-b⋅c x. Supplementary Tabel 7-11. perhitungan tarif untuk satu reaksi di bawah kondisi yang berbeda digunakan untuk menjelaskan Berbagai mode tertentu terdiri dari 18 titik pengukuran. Suntikan 1. analisis dan pemasangan laju reaksi dilakukan di R (www. 60. Selanjutnya menggunakan Masshunter Workstation (Agilent) melalui perangkat Percobaan verifikasi. natrium yang diharapkan untuk reaksi non-enzimatik. perintah reaksi atau perubahan akibat reaksi terhadap menutup keduanya relatif cepat dan lambat reaksi.Namun. disebabkan oleh kimia yang berbeda sifat Sampel koleksi / titik akhir. 41944). y = a 2-bx + c. directionalitas oksidatif adalah hasil termodinamika semialdehida suksinik (Santa Cruz Bioteknologi. Puncak otomatis memetik dan mengintegrasikan model peluruhan. homokistik asam (69453). menggunakan standar yang tersedia secara komersial (Tabel Tambahan SRM) dan analisis statistik untuk skrining tujuan. penutupan awal siklus Krebs untuk kinerja ultra kromatografi cair (UPLC) dan spektrometri massa mungkin terjadi tidak diperlukan jika reaksi oksidatifnya diberi makan (Biosolve Chemicals.15. Ini dianggap sebagai spesialisasi katalisis (157740). Memang. Eksperimen mengeksplorasi kondisi gradien (Tabel Tambahan 7-11). tergantung pada Desain penelitian umum. dengan prekursor berasal dari bahan kimia 10070400). pembentukan produk. 805740). Untuk setiap injeksi jarum dicuci dengan enzimatik yang terbentuk secara spontan di adanya radikal sulfat. FeCl2 (372870). Jika tidak menit dihitung dari daerah puncak LC-SRM individu yang diekstraksi sebaliknya Diindikasikan. yang tersedia ruang reaksi kimia dibatasi oleh kombinatorik: jumlah Kuantifikasi spektrometri kuantitatif produk spesifik dilakukan di mode Sampel dikalikan dengan setiap kondisi tambahan yang akan diuji. Model yang digunakan adalah: (1) model linier terhadap piruvat adalah satu-satunya yang juga cepat untuk interval ini kuadrat terkecil untuk formasi produk kontinu. H3PO4 (P5811). nomor produk mengacu pada Sigma-Aldrich: menggunakan perangkat lunak Masshunter (Agilent) dan merupakan .R- project. kromatografi cair pemantauan reaksi selektif (LC. Hal ini memungkinkan kami untuk mengukur lebih konsistensi data yang tinggi dengan teratur standar kontrol kualitas yang dari 4. meninjau secara manual kurva plotted.000 yang sesuai. 30 ° C. asam kofaktor membalikkan arah di sistem hidup dan mencegah sistem oksaloasetat (O4126). Reaksi oksaloasetat lingkungan kimia. sistem dengan online digabungkan Agilent 6460 triple quadrupole mass Singkatnya. 30. seperti karboksilasi piruvat itu mengaktifkan kopling ke glikolisis awal. Fe (ClO4) 3 (309281). 120 dan 300 menit untuk menengah. besi asetat (339199). Agilent).5 μ l sampel ke kolom pada 0. FeCl3 mencapai kesetimbangan. dengan 12 dan 13).4 dan 16 menit. oleh yang lain reaksi seperti metabolisme. deret waktu yang setidaknya dalam tiga bereplikasi Tarif hanya dihitung untuk reaksi direkam digunakan untuk menentukan tingkat pembentukan produk yang menunjukkan signifikan akumulasi produk di ketiga ulangan (akumulasi waktu-tergantung produk reaksi). Replikasi dan deret waktu. air: asetonitril (2: 1) mengandung FlushPort untuk mencegah pengambilan contoh. Kami mengendalikan kontaminasi silang dan dibawa-bawa dengan pengukuran kosong berulang-ulang dan kontrol bebas-substrat.dan (Greyhound) dan Pelarut B 100% metanol (Greyhound). Pemisahan sampel dicapai pada kolom Zorbax nonenzimati katalisis yang interkonversi intermediet siklus TCA.

semua besi dan belerang ini Spesies digunakan pada 200 μ (200 μM FeCl2. fumarat Efek logam individual. Sampel dikumpulkan setelah 0. Sampelnya adalah kemudian dipindahkan ke piring 384-well (Greiner Campuran kemudian disegel dalam botol kaca yang dirancang untuk Bio-One. Untuk penyaringan spesies besi dan / menurut: σ = MAD (X) × 1. μM FeCl2. memiliki ketidakpastian Ketergantungan pada pH. FeCl3. Sebuah representasi grafis dan kontrol bebas besi) dan spesies sulfur anorganik atau organik (2- dari hasil dapat ditemukan pada Gambar 2b dan Gambar Tambahan 6 mercaptoethanol. α -ketoglutarat. lihat Supplementary Gambar 5): 252 sampel. sistein. Campuran reaksi terdiri dari 100 mengetahui potensi kontribusi Spesies radikal belerang terhadap μ M isocitrate (atau air sebagai kontrol) dan 200 μ M besi (ii) klorida reaktivitas non-enzimatik yang difasilitasi oleh peroksidisulfat. Na2SO4 dan kontrol bebas μ M) digabungkan dengan campuran logam kaya yang baru disiapkan belerang). varians. Selanjutnya. siklus vakum / N2 berulang di ruang anoxic (Coy Lab Products). isocitrate.6%) untuk metabolit ini karena mekanisme yang tidak balik.80 ° C untuk analisis LC-SRM digunakan untuk Fe (iii). Berdasarkan analisis statistik zat besi / belerang Hasil inkubasi. kami (Sigma-Aldrich. Penyiapan eksperimental yang sama seperti di atas Campuran disegel di bawah kondisi anoksik dan diinkubasi pada suhu diterapkan. 30. 10 nM MoO4. 8 dan 9. termasuk gila () dan pnorm (). Alih-alih menghentikan reaksi es. Fe (ClO4) 3. 30. 5182-0717 dan 5182. suksinat. cis-aconitate. menggunakan isocitrate dan α -ketoglutarat sebagai substrat 70 ° C dalam a pemandian air.4826. 5. menghasilkan 432 sampel ditambah kontrol. adalah 0 dan σ adalah 1: well.80 ° kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) (Agilent. sampel dikumpulkan setelah 0. melalui metode LC-SRM dengan menggunakan Kondisi gradien UPLC metabolit. 60. 70 ° C. Hal ini mengakibatkan total 1. ini katalitiknya. percobaan Penyiapan disesuaikan dengan format 96- (x) dimana rata-rata populasi. 781186) di bawah normoksi kondisi dan disimpan pada . 60180-P300). ditambah 56 kontrol. semua substrat. Jumlah produk pada timepoint t = 2 h dibagi dengan jumlah total langsung diikuti dengan inkubasi pada suhu 40 ° C pada autosampler metabolit TCA (substrate + produk) dihitung untuk mengetahui dari sistem HPLC Agilent 1290. 7. 10 nM MoO4 dan 100 μ M. Hal ini Non-enzimatik TCA kualitatif dan kuantitatif (kinetik) validasi mengakibatkan pengukuran 486 sampel ditambah kontrol. kami dengan 200 μ M peroxydisulfate dengan adanya ketiadaan dari 200 μ M menguji masing-masing penyusun simulasi sedimen Archaean untuk ferrous sulfide (FeS). f metabolit TCA. 400 nM NiCl2. Kami kemudian menghitung kapasitas penyangga buffer masing-masing. C untuk pengukuran LC-SRM berikutnya dengan menggunakan Kondisi 0716). 400 nM NiCl2. Substrat dan produk pada 113 sampel ditambah kontrol diukur diketahui / gangguan kimia (varians rata-rata untuk semua fitur lain. diukur dengan metode LC-SRM menggunakan kondisi gradien UPLC pada Tabel Tambahan 9. Na2SO3.5 μ l sitrat di hadapan peroxydisulfate (dan dengan itu tingkat pemulihan sampel ke kolom setiap 5 menit sampai 2. menggunakan kondisi gradien UPLC yang diberikan di Tabel Tambahan 8. 372870). Awal yang benar pH dikontrol dengan membandingkannya dengan radikal hidroksil yang dihasilkan dari . dan tingkat pemulihan tetap rendah: CV = 3. 10 nM CoCl2.80 ° C potensial kondisi dan diverifikasi mereka dalam percobaan deret waktu untuk pengukuran LC-SRM berikutnya dengan menggunakan Kondisi dengan tiga ulangan menggunakan metode kuantifikasi spektrometri gradien UPLC yang ditentukan pada Tabel Tambahan 7. Dengan asumsi distribusi normal. Substrat sitrat. FeS inbuilt standar. Substratnya (100 μM).Untuk pada Tabel Tambahan 8. Untuk dijelaskan dalam ref. Untuk mengetahui kontribusi masing-masing dan malat diencerkan sampai 100 μM di UPLC grade air dan dicampur logam Untuk memfasilitasi interkonversi metabolit TCA spesifik. disegel di bawah kondisi oksigen rendah dan juga dikemas dengan vakum untuk mencegah kemungkinan dilakukannya crosscontamination dengan baik. campuran reaksi dipindahkan ke 384-piring sumur (Greiner skrining. Perbandingan hidrogen peroksida dan peroksidisulfat sebagai 6. DL-etionin.48%). Percobaan sedimen Archaean yang kaya zat besi. 10. = Pemutaran senyawa besi / belerang untuk dampak katalitiknya dengan σ (X) didekati oleh median absolut penyimpangan (MAD) terhadap TCA peralihan siklus. sitrat. massa yang ditargetkan secara menyeluruh. dimetilsulfoksida. Substrat dan produk dalam 324 sampel selanjutnya kondisi gradien UPLC yang diberikan pada Tabel ditambah kontrolnya diukur melalui metode LC-SRM dengan Tambahan 11. Semialdehida suksinat. ferrous-iron-induced reaktivitas non-enzimatik. selain oksaloasetat. 120 dan 300 menit dengan pendinginan cepat di atas es. Nilai P dua ekor adalah kemudian atau belerang yang aktif meningkatkan reaktivitas non-enzimatik antara dihitung dari z-score dengan menggunakan fungsi distribusi normal. Ketiga ulangan untuk yang dihitung) terhambat olehvarians yang luar biasa tinggi (koefisien kondisi FeCl2 dan Kontrol bebas besi diukur dengan urutan bolak. 200 μM FeCl3. Sebagai analogi dengan eksperimen di atas. (NH4) 2S2O8. NaHSO3. dan mencampurnya dengan masing-masing logam secara terpisah (200 60. suksinat. persentase spesifik Produk TCA Perhatikan bahwa kuantifikasi absolut Sistem HPLC diprogram untuk secara otomatis menyuntikkan 1.indikasi akumulasi produk (nilai positif) atau pemindahan substrat (nilai pengukuran awal. 17. Kondisi normoksik pelat sumur dan disimpan pada . alasan teknis ini. 781186) dalam kondisi normoksik dan disimpan pada . Perhitungan pemulihan dan spesifisitas. 120 dan 300 menit dengan cepat pendinginan di atas es. Substrat dan produk dalam z-score (zi) (untuk representasi grafis. Sampel dipanaskan sampai 70 ° C dalam pemandian air untuk 0 dan M H3PO4) dalam atmosfer N2 rendah oksigen yang dihasilkan oleh tiga 300 min. kami memilih interkonversi non-enzimatik yang paling Bio-One. tingkat pemulihan dihitung untuk sitrat dan efisiensinya Reaksi yang dimulai dari sitrat. 10 nM CoCl2. Untuk gradien UPLC pada Tabel Tambahan 10. CV = 25. potensi. Untuk mengetahui pengaruh pH terhadap yang lebih tinggi untuk nilai CV ini. yang dipindahkan ke 384 100 μMH3PO4) dibawah kondisi oksigen rendah. percobaan interkonversi dilakukan dengan adanya buffering 5 mM natrium fosfat pada pH 3. dengan cara yang serupa dengan eksperimen yang donor radikal untuk reaksi mirip TCA non enzimatik. Setelah percobaan.320 sampel ditambah kontrol. μ. asam homocysteic. malat dan fumarat digunakan secara terpisah dan dicampur dengan semua kemungkinan kombinasi sumber besi Semua perhitungan dilakukan pada R dengan menggunakan fungsi (FeC2H3O2. FeCl2. ferrocene. Fe (ClO4) 2. Sampel disiapkan dilapisi kaca96 piring sumur (Thermo Scientific. dan diinkubasi pada suhu 70 ° C dalam rendaman air. Substrat TCA (100 metionin. cis- akonitat. dan tetap konstan sepanjang inkubasi melalui negatif). 10. Tingkat pemulihan dihitung Campuran reaksi yang mengandung oksaloasetat dihasilkan dengan melalui hasil bagi metabolit TCA masing-masing pada timepoint t = 0 menggabungkan oksaloasetat dengan FeCl2 pada konsentrasi yang sama dan totalnya jumlah konsentrasi diukur setelah 2 jam inkubasi pada suhu seperti yang disebutkan di atas tetapi di bawahmkondisi normoksik.5 jam.

isocitrate. cis-aconitate. 30. fumarat dan malat dengan hidrogen peroksida 200 μ M atau 200 μ M peroksidisulfat pada suhu 70 ° C di bawah kondisi anoksik dan sampel yang dikumpulkan setelah 0. 10. cis-aconitate. suksinat. kita diinkubasi 100 μM sitrat. Ketersediaan data. Data laju reaksi disediakan dalam table tambahan 1-5 dan data kuantifikasi mentah telah disimpan di gudang data Mendeley. 120 dan 300 menit (504 sampel ditambah kontrol) dan kemudian diukur dengan analisis LC-SRM kondisi gradien UPLC yang ditentukan dalam Tabel Tambahan 11. isocitrate. dipanaskan sampai 70 ° C dalam rendaman air dan diinkubasi selama 0. suksinat. Percobaan pemulungan radikal sulfida dan hidroksil. Radikal diferensial Sifat pemulungan 2-propanol dan ters-butanol dieksploitasi untuk diuji pentingnya sulfat di atas radikal hidroksil. 60.hidrogen peroksida. 60. Dalam percobaan ini. . alphaketoglutarat. 500 μ M tert-butanol atau air sebagai kontrol Sampel disegel di bawah kondisi anoksik. 10. 30. 120 dan 300 menit (378 sampel ditambah kontrol) dan mengukurnya melalui LC-SRM menggunakan kondisi gradien UPLC pada Tabel Tambahan 11. fumarat atau malat secara individu dan masing-masing Kombinasi diolah dengan 500 μM 2- propanol. Dalam tiga ulangan. 200 μM peroksidisulfat dicampur dengan 100 μM sitrat. α -ketoglutarat.