You are on page 1of 134

( r

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE
„CAROL DAVILA“

Mircea loan Popa M.D., Ph.D., M.P.H.
Conferenţiar universitar

e d i t u r a

BMedica
Bucureşti

( f i

VI

Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale CUPRINS
POPA, MIRCEA IO AN
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN MICROBIOLOGIE /
Mircea loan Popa - Bucureşti; Infomedica, 2004
Bibliogr.
Cuvânt înainte...................................................................................................................Vil
ISBN 973-7912-37-3

579.616.074 1. Elemente legate de controlul calităţii în laboratorul de bacteriologie/
microbiologie.................................................................................................................. .1
Mircea loan Pupa .

® 2004 - Infomedica s.r.l.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN MICROBIOLOGIE PARTEA GENERALĂ
MIRCEA IOAN POPA 2. Elemente legate de conduita în laboratorul de bacteriologie/microbiologie.
Norme de protecţie a muncii în laboratorul de microbiologie.........................................4
ISBN: 973-7912-37-3 Mircea loan Popa

Toate drepturile rezervate Editurii INFOMEDICA. 3. Date privind echipamentul şi aparatura utilizate în laboratorul de
Nici o parte din acest volum nu poate fi copiată; microbiologie................................................... 9
fără permisiunea scrisă a Editurii INFOMEDICAi Mircea h a n Popa
Drepturile de distribuţie în străinătate aparţin în exclusivitate editurii.
Copyright ©2004 by INFOMEDICA s.r.l. All rights reserved. 4. Metode de dezinfecţie şi sterilizare utilizate în laboratorul
de microbiologie............................................. i.................................................................. 12
APĂRUT 2004 Mircea loan Pupa
REFERENŢI ŞTIINŢIFICI:
ADRIAN STREINU-CERCEL M.D., Ph.D.
LUCIA DEBELEAC M.D.. Ph.D. 5. Schema generală a diagnosticului de laborator microbiologic........................................18
Conferenţiar universitar
Profesor universitar Mircea loan Popa, Gabriela Loredana Popa
UMF „Carol Davila" Bucureşti UMF „Carol Davila" Bucureşti
Director general al Institutului de Boli Infecţioase 6. Norme privind prelevarea şi transportul produselor patologice
„Praf. Dr. Matei Balş" în diagnosticul microbiologic direct.................................... ........................................... .22
GHEORGHE DIMACHE M.D., Ph.D. Mircea h a n Popa, Gabriela Loredana Popa
Cercetător ştiinţific principal gr. I 7. Preparate microscopice, frotiuri Şi principalele coloraţii utilizate
Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare în microbiologie.........................................................................................'.........................33
pentru Microbiologie şl Imunologie „Cantacuzlno"
Mircea loan Popa, Gabriela Loredana Popa
8 . Tehnica examenului microscopic în diagnosticul microbiologic....................................39
REDACTARE: Mircea loan Popa, Gabriela Loredana Popa
Mircea loan Popa
Gabriela Loredana Popa 9. Medii de cultură..............i........................................................................... .......................45
Gabriela Loredana Popa, Mircea loan Popa
10. Tehnici de cultivare.......................................................................................................... 52
Tehnoredactare computerizată: Editura Gabriela Loredana Popa, Mircea loan Popa
Tehnoredactare: Ing. Nicoleta Anghel 11. Examinarea caracterelor de cultură, metabolice precum şi a
Dr. Mircea loan Popa altor caractere fenotipice utile în identificarea microorganismelor.............................. 61
Bucureşti Gabriela Loredana Popa, Mircea loan Popa
Editura INFOMEDICA
Şos. Panduri 35, Bl. P1B, Sc. A, Ap. 33-34 12. Teste de identificare având la bază diferite caractere biochimice
Tel./Fax: 021/410.04.10; 410.53.08; Tel.: 410.61.63
ale bacteriilor şi fungilor..................................................................................................70
e-mail: redactla@infpmedica.ro
www.infomedica.ro Gabriela Loredana Popa, Mircea loan Popa
Tipar executat la Tipografia INFOMEDICA

Cuprins y

31. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme
din genul Salmonella. Hemocultura....................................................................£........ 172
Mircea loan Popa
32. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse microorganisme din
gen u I Klebsiella............................................ .................................... .................. ......... 179
Mircea loan Popa
33. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse microorganisme
din genul Proteus............................................................................................................ 181
Mircea loan Popa
34. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse microorganisme
din genul Yersinia................................................................. 184
Mircea loan Popa
35. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse microorganisme
din genu! Pseudomonas.................................................................................................. 186
Gabriela Loredana Popa, Mircea h a n Popa
36. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse microorganisme din
genul Vibrio.............................................. .......................................................................189
Gabriela Loredana Popa, Mircea h a n Popa
37. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse microorganisme
din genu! Haemophilus...................................................................................................191
Mircea loan Popa
38. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse microorganisme
din genul Bordetellci.........................................................................................................195
Mircea loan Popa
39. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse microorganisme
din genul Brucella............................... 198
Gabriela Loredana Popa, Mircea loan Popa
40. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de
Corynebacterium diphtherias........................................................................................ 202
Mircea loan Popa
41. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme
din genul Listeria ............................................................................................................ 205
Mircea loan Popa
42. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme
din genul Mycobacterium................... ...208
Gabriela Loredana Popa, Mircea loan Popa, Mireta Stefan
43. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Bacillus anthracis ...................... 211
Mircea h a n Popa, Gabriela Loredana Popa
44. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme
din genul Clostridium......................................................................................................214
M ircea h a n Popa

....... Mircea loan Popa tehnica examenului microscopic.. ... Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Escherichia coli..'45 Alte date suplimentare pot fi studiate şi aprofundate de către cei interesaţi în o Mircea loan Popa serie de manuale şi tratate de specialitate din literatura medicală românească şi 26....87 Mircea loan Popa CUVÂNT ÎNAINTE 14.............*33 tipice...................multe ori rapid şi de cele mai multe ori foarte precis....... pentru a putea îmbu­ 30........... medici rezidenţi sau din genul Neisseria.. ...... conduita în laboratorul de microbiologie Mircea h a n Popa (inclusiv norme de protecţia muncii)..................................... Reacţia de fixare a complementului...... Coprocultura.......... de mare 29............ în România.................... •...'0® Acest manual de lucrări practice apare la peste 2 decenii după manualul publicai Mircea loan Popa sub redacţia dlui.................................. Reacţii antigen-anticorp utilizate în microbiologie..... 123 varea şi transportul produselor patologice............ microbiologia reprezintă una dintre materiile Mircea hem Popa fa ţă de care interesul trebuie să fie sensibil mai ridicat comparativ cu ceea ce per­ 28....... 105 Mircea h a n Popa 16.................................. Teste de identificare rapide/moderne.............. ................... Diagnosticul de laborator în infecţiile produse microorganisme nătăţi conţinutul prezentului volum............ asistenţi medicali etc)................. Autorii ................................. Reacţia de aglutinare........ 156 cepem că se petrece în momentul actual.............. Testarea imunităţii de tip celular........................................A....... .. Mircea loan Popa După opinia noastră (formată în 14 ani de activitate teoretică şi practică în care 27............................ Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice................ dr....... Mărăşel Georgescu................................... După discutarea reacţiilor antigen-anticorp şi o trecere în revistă p a r t e a s p e c ia l a a principalelor produse biologice de uz uman am realizat trecerea către partea 23........... în special pe cele critice. ' Cele mai multe dintre datele prezentate reprezintă elemente de bază ale diag­ Mircea loan Popa nosticului microbiologic în infecţiile produse de bacterii sau levuri............. Biopreparate..... Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de enterobacterii.......................... Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme am colaborat cu studenţi la medicină sau colegii medicale................... *......... Diagnosticul de laborator în infecţiile produse Streptococcus pneumoniae..... Reacţia de neutralizare (seroneutralizare). 17... Introducere în diagnosticul de laborator microbiologic............. Acestea pot f i transmise prin email la adresa: din genul Shigella ............................. Mircea loan Popa.................................................. echipamentul şi aparatura necesare în labo­ 19.........................120 rator.........IV Diagnosticul de laborator în microbiologie 13....... prof............. Capitolul 52 realizează o sinteză a noţiunilor prezen­ 24........... 95 Mircea loan Popa 15..................... Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme tate în manual în timp ce ultimul capitol prezintă unele elemente privind importanţa din genul Staphylococcus...— specialişti.......142 diagnosticului microbiologic în cadrul sistemului de supraveghere al bolilor trans­ Gabriela Loredana Popa..... realizarea preparatelor microscopice...................................... Pornind de la 18................ ro......148 internaţională......... în capitolele următoare am prezentat modalităţile de Mircea h a n Popa identificare a tulpinilor bacteriene sau levurice prin metode fenotipice şi geno- 22..... principalele medii de cultură utilizate şi tehnicile 21................... Gabriela Loredana Popa unui diagnostic.. Reacţii în care componentele sunt marcate........................ la Bucureşti. de ..128 cultivare mai frecvent folosite. 25... ......................... Microbiologia aduce „uneltele “ necesare Mircea loan Popa........................... ......................... 162 ajutor pacientului..................... dezinfecţia şi sterilizarea am continuat cu schema generală a diagnosticului Mircea h a n Popa microbiologic prezentând în capitole separate principalele norme privind prele­ 20.............................. Urocultura... Gabriela Loredana Popa Aşteptăm sugestiile cititorilor.... .... 117 noţiuni privind controlul de calitate................................ Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme din genul Streptococcus............................................................................ ............................................ Reacţia de precipitare..... Mircea loan Popa....... Gabriela Loredana Popa popalore@ hades......... un capitol separat fiin d dedicat studiului sensibilităţii la medicamentele Mircea h a n Popa antimicrobiene............... 138 specială în care sunt abordate modalităţile diagnostice în infecţiile produse de Mircea h a n Popa principalele microorganisme............................. Mircea h a n Popa misibile.................... .....................

... inclusiv normele de protecţie a muncii şi normele de securitate microbiologică......................230 colaborare cu celelalte specialităţi medicale.. inclusiv recomandări privind modul de completare al formularelor • Un plan al laboratorului • O listă a analizelor care pot fi efectuate în laborator • Tehnicile de identificare a microorganismelor izolate... semnate Mircea loan Popa........................ fie sub forma unui dosar în care să fie incluse o nene de materiale.......... trebuie 53....... iar de rezultatele obţinute din genul C a n d id a ... Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme Atunci când este vorba de un laborator clinic de microbiologie...................... din literatura medicală din genul C h la m y d ia ....... Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme necesară stabilirea unor responsabilităţi....... testele uti- ........ conservare şi transport (pentru fiecare tip de produs în parte)..................................... incluzând sistemul de supraveghere al bolilor transmisibile........ în fiecare laborator trebuie să existe şi să fie accesibil oricărui membru al personalu­ lui de laborator un document scris. 241 1. din genul Borrelici............. în din familia Rickettsiacaae........ inclusiv în laboratorul de microbiologie al UMF „Carol Davila".......... 237 poate depinde evoluţia şi uneori chiar viaţa unui pacient............ I....... stagiu............ căilor respiratorii inferioare....................... care mai devreme sau mai târziu va trebui să înţeleagă importanţa 48...... Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme Recomandăm citirea şi altor materiale redactate pe această temă.............. 235 rezumă la o serie de demonstraţii şi prezentarea unor anumite aspecte pentru tinerii aflaţi în Mircea loan Popa ................ 49.... cu cât sunt înţelese mai de timpuriu. controlul intern de calitate intră Mircea loan Popa în responsabilitatea şefului de laborator............. care trebuie să supervizeze (direct sau prin delegare 52................. precum şi descrierea sarcinilor fiecărui membru al per­ sonalului de laborator • O listă cuprinzând toate formularele utilizate în laborator precum şi descrierea fiecărui formular în parte.............. verificate numai de către personalul medical cu pregătire medie etc................................ Cabriela Loreclana Popa indescifrabil..255 supervizarea menţionată mai sus............. 51..218 Miivea loan Popa 46.............. pornind de la normele de recoltare.................. 224 Cu toate că aceste noţiuni nu par a fi de utilitate imediată.. Cabriela Loreclana Popa tul că ele sunt incluse într-unul dintre cele mai importante capitole ale activităţii................. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme din genul Treponema.............. cu atât pot fi mai utile în dezvoltarea Mircea loan Popa viitoare a oricărui medic.......... Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme tip de laborator şi nu numai în laboratorul de microbiologie........ i........... ..................... date tehnice despre fiecare membru precum şi date care să permită contactarea unei anume persoane în caz de necesitate • Un regulament de ordine interioară.... Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme din genul Leptospira......... buletinele de analiză nesemnate............ Considerăm necesară parcurgerea acestor.............................................. Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile acute ale de responsabilitate) toate activităţile desfăşurate şi să contrasemneze buletinele de analiză........ Elemente privind importanţa diagnosticului microbiologic în să dispară şi să fie înlocuite de buletine de analiză redactate după toate rigorile....... în orice 47............. Mircea loan Popa ............... după cum urmează: ®Un tabel nominal al personalului................ noţiuni de către toţi colegii implicaţi în diferitele activităţi desfăşurate în sistemul sanitar...................................... ...... este 50............ 233 românească sau internaţională...........................în orice laborator..... ............... Mircea loan Popa 2 ............. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganisme laboratorului clinic în general şi respectiv a laboratorului de microbiologie în particular... Chiar şi în cazul în care activitatea practică se din genul Mycoplasma .................... ( ( Diagnosticul de laborator în microbiologie VI ELEMENTE LEGATE DE CONTROLUL CALITĂŢII ÎN • LABORATORUL DE BACTERI0L0GIE/MICR0BI0L0GIE 45.. fie sub forma unui manual tehnic.....227 De fapt.......... elementele legate de controlul calităţii nu trebuie să fie ignorate..... trebuie să avem în vederefap­ Mircea loan Popa....... ....... Am decis să introducem aceste elemente în Mircea loan Popa primul capitol al manualului de lucrări practice........ într-un sistem medical bine pus la punct...............

realizarea . atât în sistemul ca aceste probe să fie respinse şi să se solicite o nouă recoltare. Este datoria managerului instituţiei medicale ca. dar în în vederea stabilirii unei bune colaborări trebuie să existe o comunicare permanentă între colegii care îşi desfăşoară activitatea în clinică şi în laborator. care nu au cum să conducă la realizarea unui diagnostic microbiologic corespunzător în mod complementar. Trebuie desfiinţată modalitatea de lucru în care se acceptă pentru pozitiv şi respectiv a unui control negativ (spre exemplu în cazul testului susceptibilităţii la lucru în laborator orice probă. Identificarea unor modalităţi de lucru necorespunzătoare ar trebui să conducă la retra­ gerea autorizaţiei de funcţionare cu reacordarea acesteia numai după îndeplinirea tuturor cri­ teriilor necesare unei activităţi utile diagnosticului şi care să nu pună în pericol sănătatea sau viaţa pacienţiloî. care este cunoscut de laboratorul respectiv şi de către instituţia care că aceste noţiuni ar trebui cunoscute şi aplicate deopotrivă în sistemul public şi privat. particulară a unui anume pacient. Controlul intern şi extern de calitate trebuie să reprezinte o prioritate absolută pentru sis­ • periodic. iar în cazul persistenţei Suspiciunii unei se ocupă de coordonarea şi controlul activităţii desfăşurate în sistemul laboratoarelor de erori de laborator se poate solicita în cunoştinţă de cauză repetarea unei analize sau se poate microbiologie din România precum şi actele normative (recomandări. 3. controlul pozitiv va fi reprezentat de o tulpină de Streptococcus pyogenes. eventualele rezultate care par incorecte pot fi analizate şi corelate cu periodic şi să includă normele metodologice redactate şi transmise de către instituţia care situaţia concretă. care au devenit din ce în ce mai rare în ultimii 10-15 ani trebuie găsite cele mai bune soluţii 4 . cu relativ puţine referate alcătuite după materiale de specialitate apărute în literatura naţională sau inter­ excepţii. la 5. identificarea unor anumite erori. Cele menţionate mai sus sunt valabile pentru laboratoarele de microbiologie. un număr de probe. al căror rezultat va fi verificat (pentru examene bacteri­ temul naţional de sănătate iar elementele legate de acesta ar trebui să fie cunoscute încă din ologice. rezultatul corect fiind cunoscut numai de către cel care a pregătit niri periodice între colegi. controlul de calitate extern ar trebui să condiţioneze autoriza­ şi util pacientului care prezintă o infecţie de etiologie probabil microbiană. ( :( Diagnosticul de laborator în microbiologie î Elemente legate de controlul calităţii în laboratorul de bacteriologie/microbiologie lizate. compararea rezultatelor la nivel naţional. transportată şi bacitracină. astfel putându-se va­ ar trebui să menţioneze o serie de date strict necesare. periodic. primească: înainte de a încheia această destul de sumară prezentare. posibilitatea colaborării la nivel internaţional. în mod necesar. indiferent de modul în care a fost recoltată. creşterea încrederii tuturor partenerilor din sistemul sanitar. să faciliteze organizarea unor întâl­ la dispoziţie probe „oarbe". suficient în vedere interesul pacientului. care va efectua şi verificarea rezultatelor) realizării unor teste având împreună cu şeful laboratorului şi şefii secţiilor clinice. Sunt încă prea frecvente situaţiile în care solicitarea . organizează controlul extern de calitate. tate. Numai în acest caz rezultatele obţinute pot toarele din ţara noastră) ar trebui ca manualul (dosarul tehnic) să fie revizuit şi completat fi corect interpretate. perioada de pregătire de bază a oricărui medic. îndeplinirea recomandărilor menţionate mai sus va conduce implicit la protecţia pacien­ ţilor. ordine de ministru. corespunzătoare calitativ şi public cât şi în cel privat. legi etc) apărute în legătură cu activitatea de laborator. parte. iar con­ indiferent dacă este însoţită (sau nu) de un buletin care solicită o anumită examinare şi care trolul nşgativ va fi reprezentat de o tulpină de Streptococcus agalactiae). realiza prelevarea unui nou produs patologic sau a unei probe de sânge pentru obţinerea serului de cercetat. lista mediilor de cultură şi a reactivilor utilizaţi.0 modalitate obiectivă a controlului intern de calitate este reprezentată de solicitarea (de de comunicare colegială şi ştiinţifică. este notificată utilizarea unui control respingerea unor probe. în cadrul laboratorului trebuie organizate scurte întâlniri Trebuie să recunoaştem că din păcate buna colaborare şi comunicare între verigile sis­ care să permită schimbul de opinii între membrii personalului de laborator. se pot aplica oricărui tip de laborator clinic. • formulare standardizate pentru re-transmiterea rezultatelor obţinute. fiecare laborator ar trebui să cantitativ. continuând cu scrisorile metodologice naţională. către şeful de laborator. fără colegialitate şi fără a avea acestora. în loc să fie prelucrate probe fără cali­ lida rezultatele obţinute. în protocolul de lucru. ordonanţe de guvern. discutarea unor aspecte legislative legate de activitatea de . Pornind de la buletinul de analiză şi documentele tehnice care trebuie să fie disponibile atât pentru laborator cât şi pentru clinică. prezentarea unor temului de sănătate reprezintă încă un deziderat neatins în ţara noastră. inclusiv modul de preparare al unui examen de laborator este făcută fără responsabilitate. Atât personalul medical din laborator cât şi cel din în mod ideal (pentru că deocamdată aceste recomandări nu sunt aplicate în toate labora­ clinică trebuie să acţioneze în strânsă colaborare. Trebuie discutate şi agreate în mod colegial criteriile care pot conduce. este de preferat ţia eliberată pentru funcţionarea oricărui laborator de microbiologie clinică. pentru fiecare test în parte. spre exemplu. biolog sau asistent medical.laborator etc. Controlul calităţii la nivelul oricărui laborator va atinge eficienţa maximă cu condiţia unei colaborări între clinică şi laborator. Din punct de vedere operaţional. dorim să subliniem încă o dată • un număr de cod.unei standardizări în microbiologia clinică românească. proba respectivă şi respectiv de către şeful de laborator. micologice şi serologice).

• prelucrarea probelor în vederea cultivării. prin tehnici de cromatografie. matografie. sinteza de bacteriocine. vestiare. elementele tehnice legate de aceste structuri sunt prezentate în diferite manuale tehnice ®stabilirii faptului că bacteria izolată este implicată în procesul infecţios respectiv. care pot fi consultate de către cei interesaţi. în afară de cele menţionate mai sus. « stabilirii prezenţei sau dovedirii absenţei unor anumite bacterii la nivelul unui anumit • recoltarea probelor în laborator. curenţi de aer.. încăperile. o studierii bacteriilor izolate pentru identificarea genului. precum: logic. De fapt lucrurile sunt mult mai compli­ boratorul de mycobacteriologie). ELEMENTE LEGATE DE CONDUITA ÎN 2 • LABORATORUL DE BACTERIOLOGIE/MICROBIOLOGIE. trebuie să avem în vedere că în momentul efectuării oricărei tehnici de laborator. acest element este de maximă importanţă în la­ boală infecţioasâ de etiologie bacteriană/fungică. diagnosticul de laborator microbiologic corect devine imposibil. aţi macroscopic. identificării bacteriilor implicate etiologic. principii. studiul acizilor graşi prin tehnici de cro­ bile spre ex. speciei. în laboratorul de bacteriologie se vor efectua tehnicile necesare: • recepţionarea probelor recoltate în afara laboratorului. . în lipsa unei activităţi susţinute în perioada de pregătire care Fiecare încăpere a laboratorului de bacteriologie trebuie să aibă o destinaţie precisă iar pla­ durează mai mulţi ani şi de fapt continuă toata viaţa. sticlărie. este necesar să fie asigurată protecţia personalului de laborator precum şi prevenirea contaminării probelor de lucru. grupuri sanitare etc. substrat. sinteza unor enzime.). cate. să fie luminoasă şi în măsura posibilităţilor spaţiile Ţinta activităţii în laboratorul de bacteriologie/micologie ar putea fi definită foarte pe de lucru să fie orientate astfel încât să prevină incidenţa directă a razelor solare (având în scurt drept stabilirea tratamentului care trebuie urmat în cazul unui pacient care prezintă o vedere efectul bactericid al radiaţiilor UV. • pregătirea materialelor necesare în laborator. există anumite particularităţi în planificarea şi distribuirea spaţiilor funcţionale din labora­ o caracterele genetice etc. laboratorul de bacteriologie trebuie astfel conceput încât condiţiile de lucru să fie optime. ( Elemente legate de conduită în laboratorul de bacteriologie/microbiologie 5 ■ P A R T E A G E N E R A L Ă • identificării contaminării de laborator. tipului (de la • realizarea diferitelor tehnici imunologice utile în diagnosticul bacteriologic sau imuno- caz lâ caz) având la bază o serie de caractere ale bacteriilor. prin diferitele tehnici bacteriologice. • caracterele antigeriice (utilizând tehnici din domeniul imunologiei). în cazul aces- ales). capacitatea de a folosi un anumit substrat drept unică ❖ medii de cultură etc. • depozitarea materialelor necesare în laborator. pe cât posibil într-un sens unic în vederea prevenirii contaminării preparatelor de laborator şi respectiv prevenirea „întâl­ Ceea ce trebuie să fie însă foarte clar încă de la început este că. fără respectarea unor nirii" dintre materialele contaminate şi materialele sterile. nul laboratorului în ansamblu trebuie să prevadă un anumit „flux“. Toate elementele necesare trebuie să apară scrise manualul tehnic menţionat în cadrul capitolului precedent. grupului. • spălarea materialelor înainte de sterilizare etc. sinteza altor factori care pot fi evidenţi­ * alte instrumente de laborator. ÎN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE Pentru îndeplinirea obiectivelor. ele reprezintă o simplificare în raport cu complexitatea activităţii din laboratorul de bacteriologie. tinate activităţilor administrative (birouri). în laboratorul de bacteriologie mai există spaţii des­ • sensibilitatea faţă de bacteriofagi. datele de laborator nu pot fi interpretate în lipsa unei pregătiri serioase atât din punct de vedere teoretic cât şi practic. sursă de carbon etc). spaţiile. ®stabilirii sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice. o caracterele biochimice (pigmentogeneza. NORME DE PROTECŢIE A MUNCII • depistării purtătorilor de germeni etc. pre­ venirea expunerii la praf. Laboratorul de bacteriologie medicală include încăperi (spaţii) în vederea desfăşurării corespunzătoare a următoarelor activităţi: în vederea atingerii scopului. capacitatea de a fer­ reactivi. pe cât posibil. Chiar dacă cele menţionate mai sus par complicate. tor. o caracterele de patogenitate. • caractere legate de sinteza anumitor metaboliţi sau structuri moleculare identifica­ în cazul unor laboratoare specializate (de ex. menta un anumit substrat. Clădirea laboratorului de bacteriologie medicală trebuie să asigure. studiul caracteristicilor bacteriene prin tehnici de biologie moleculară etc. mobilierul din laboratorul de bacteriologie vor fi construite în aşa fel ®monitorizării evoluţiei sub tratament (dovedirea eficienţei tratamentului antibacterian încât să permită realizarea unei curăţenii şi dezinfecţii la cel mai înalt nivel. » caracterele de cultură. în condiţiile efectuării sau interpretării mecanice a unor teste etc. în plus.. » caracterele morfotinctoriale.

materii fecale. Se vor utiliza anse bacteriologice corect şi complet închise şi cu o buclă cu diametrul NORME DE PROTECŢIE A MUNCII ÎN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE mai mic de 3 milimetri pentru a se evita descărcarea spontană. înainte de începerea oricărui test sau a oricărei borator cu un nivel de competenţă inferior. cu precauţie. Recomandăm ca toate activităţile care pot fi efectuate în laborator să fie înscrise şi bilitatea ca un anumit laborator să primească spre identificare culturi: şi izolate de la un la­ detaliate în manualul tehnic al laboratorului. Este obligatorie purtatea echipamentului de protecţie. 915/2000. • prevenirii infecţiilor de laborator. atât bucla cât şi firul ansei (iar portansa Datele privind funcţionarea laboratoarelor care efectuează analize medicale sunt incluse se va flamba) înainte şi după folosire. pipete gradate etc) nu se vor decontamina ia medici vor accede în laborator şi vor participa la desfăşurarea lucrărilor practice numai după flacără. • structura prezentată pentru laboratorul de bacţeriologie nu diferă în mod esenţial de serviete. 11. 119/2004. flacon de sticlă etc) utilizate. în vederea sterilizării bucla ansei va fi introdusă iniţial „la baza flăcării11 sănătăţii şi familiei nr. pregătire teoretică şi Bunsen aprins. 4. lul minim acceptat. Activităţile se vor desfăşura în vecinătatea becului tar) spaţii în care să se poată desfăşura activităţi de învăţământ şi. Flaconul cu amestec dezinfectant este obligatoriu. 1 ■ dusul contaminant). . ' 8. Nu este permisă depozitarea obiectelor de uz personal pe masa de lucru (haine. practică. care se pot identifica în diferite produse patologice (ex. normativ aduce la zi Ordinul ministrului produs patologic. • prevenirii contaminării probelor de laborator. Tot în amestecul 3. pipetele şi manda utilizarea mănuşilor. menţionăm că: 9. măştii. Fumatul atenţia pentru ca laboratorul să fie organizat în vederea este interzis. pentru a preveni împroşcarea cu particule infecţioase. unde temperatura este mai scăzută. bonetei. 609/2002. trebuie să avem în minte toţi „paşii11pe care urmează să îi facem (conform proto­ Chiar dacă activitatea se desfăşoară într-un laborator dedicat lucrărilor practice şi colului de lucru) astfel încât să avem un control mental permanent al fiecărei manevre pe demonstraţiilor făcute sub supravegherea unui cadru didactic pentru studenţi sau tineri medici rezidenţi. halatul de protecţie reprezintă nive­ dezinfectant vor fi introduse cu aceleaşi precauţii lamele de sticlă folosite. Nu se vor purta mănuşi de latex în momentul manipulării becului Bunsen. Este interzisă introducerea în gură a oricărui obiect. Se vor flamba gurile tuturor recipientelor (tub. Toate celelalte obiecte contaminate (exceptând ansele bacteriologice. eprubetă. manipularea lentilelor de contact etc. există o serie de reguli care trebuie aplicate cu stricteţe în vederea elimi­ care urmează să o executăm. 12. genţi. Nu este permisă fuga şi nici mersul rapid prin laborator. ( ( j 6 Diagnosticul de laborator în microbiologie Elemente legate de conduită în laboratorul de bacferiologie/microbiologie tui tip de laboratoare se poate vorbi de necesitatea atingerii perfecţiunii. sânge. Se lamele) se vor introduce la finalul activităţii practice. spaţii în care ar putea avea loc şi diferite întâlniri tehnice între membrii per­ sonalului de laborator. • laboratorul trebuie să fie legat funcţional de clinică. dorim să. o recomandă ca echipamentul de protecţie să fie păstrat separat de hainele utilizate în exterior. 1. Va fi acordată toată 5. Atunci când s-a terminat lucrul cu ansa încărcată cu în Ordinul ministrului sănătăţii nr. Se interzice aplicarea de cosmetice. 6. Pipet. manevre. Atunci când se lucrează într-un laborator de analize se vor lua preacauţii suplimentare.area cu gura este strict interzisă. lăcuirea unghiilor. atât la deschidere cât şi la închidere. Nu se vor face mişcări bmşte în laboratorul de microbiologie se lucrează cu microorganisme potenţial patogene sau atunci când ansa este încărcată cu produs patologic. Tinerii medici sau viitori 16. Halatul trebuie să fie curat şi corect încheiat. încălţămintei de protecţie. • în structura laboratorului este de dorit să fie incluse (în măsura posibilităţilor şi în 10. 7. . şorţului. Este strict interzis accesul persoanelor străine în laborator. Se vor evita gesturile ample şi se va dovedite a fi patogene. Ansa bacteriologică se va steriliza „la roşu11. însămânţările se efectuează „ia flacără11. ologie. Toate produsele biologice vor fi considerate ca potenţial infectante. în orice instituţie medicală din România şi cu atât mai mult nu • realizării scopului menţionat mai sus prin tehnicile enumerate. în vederea pipetării se vor utiliza dispozitive de înainte de a încheia prezentarea principalelor încăperi (spaţii) din laboratorul de bacteri­ pipetare adecvate. Manipularea materialului contaminat se va realiza cu maximă precauţie pentru funcţie de nivelul laboratorului. caiete etc). menţine un permanent control asupra mişcărilor efectuate în laboratorul de microbiologie. de exemplu în cazul unui laborator de spital universi­ evitarea răspândirii microorganismelor. Mâncatul şi băutul sunt interzise în sala de lucrări practice de microbiologie. în anumite situaţii se va reco­ 17. este acceptat într-un laborator de microbiologie. Se recomandă ca hainele să fie lăsate la garderobă sau într-un spaţiu structura unui laborator de microbiologie în general. special amenajat. • prevenirii răspândirii germenilor în mediul ambiant.' f infectantă utilizată). cu capac) care va fi autoclavată. Pipetele contaminate (pipete Pasteur. Există şi posi­ 14. ochelarilor. 13. urină etc) sau au fost izolate în culturi la nivelul laboratorului. găleată din metal. purtarea de unghii false. ci vor fi introduse (evitând producerea de stropi potenţial infectanţi) în flaconul cu audierea şi însuşirea (dovedită prin semnătura pe un proces verbal pregătit în acest sens) re­ dezinfectant (lichidul dezinfectant trebuie să depăşească nivelul până Ia care a ajuns pro­ gulilor de protecţie a muncii. precedat de Ordinul ministrului sănătăţii nr. într-un recipient (ex. nării riscurilor de contaminare: 15. conform legii. unde vor fi menţinute pentru circa 24 ore (în funcţie de substanţa dez- 2. Aceste acte normative trebuie revizuite şi adaptate periodic.

diferite aparate. baia de apă.microscop optic (câmp luminos). tampoane de diferite dimensiuni. lame şi lamele. un frigiderele. containere pentru materialul contaminat. în cazul în care are loc accidental contaminarea unei suprafeţe cu produse patologice sau culturi.. care pot fi utilizate în cameră obscură (microscop cu fond întunecat. în primul rând trebuie anunţat fără întârziere asistentul responsabil cu echipamente. Pentru îndepărtarea obiectelor ascuţite de unică întrebuinţare recomandăm utilizarea de „cutii sigure" în care acestea să fie colectate.camere termostat. Cabinete de siguranţă biologică (incinte. microscop cu fluorescenţă) în situaţii particulare de diagnostic. Ziehl-Neelsen etc) şi speciale. eprubete. . . 28°C pentru fungi etc). centrifuga. nişe). elemente de birotică. . în încăperea unde are loc recepţionarea produselor patologice trebuie să contaminate după care se toarnă o soluţie dezinfectantă care se va menţine pe loc în funcţie existe registre sau un sistem computerizat de înregistrare a datelor (înregistrarea corectă a de recomandările producătorului. după integrarea Româ­ niei în EU respectarea acestora va deveni obligatorie. 19.lupă de mână şi lupă stereoscopică (pentru studierea morfologiei coloniilor). domeniul biosecurităţii trebuie să fie adoptate de către ţara noastră. pentru decomplementarea serurilor la 56°C). . vor fi în cele ce urmează vor fi enumerate o parte dintre ustensilele şi aparatele care se pol găsi prezentate unele noţiuni în capitolul al 3-lea. medicale indiferent de sistemul public sau privat). balanţa. 2. Se recomandă acoperirea cu o pânză a suprafeţei Spre exemplu. un incubator. boxe. . lupe şi truse de coloranţi. în afară de aceste măsuri. dar nu mai puţin de 30 minute. Respectarea acestor norme de protecţie este strict necesară. în cazul în care acest eveniment se datorează unui tânăr inedic sau viitor medic în diferitele încăperi (spaţii) ale laboratorului de microbiologie putem întâlni o serie de aflat în pregătire. Diagnosticul de laborator în microbiologie 8 DATE PRIVIND ECHIPAMENTUL SI APARATURA UTILIZATE ÎN LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE 18. etc. se vor avea în vedere toate cele necesare evitării oricărui ologic trebuie să existe la îndemână anse bacteriologice. un incubator la 37°C. microscopul. 1. aerul este atât admis cât şi evacuat prin filtre.băi de apă de diferite mărimi (ex. pense. în boxă nu se vor introduce surse de căl­ dură. . Se va restrânge pe cât posibil utilizarea obiectelor ascuţite. 3. lupa. microscop cu contrast de fază. manipulării diferitelor lemn. în care aerul curat antrenează aerosolii produşi dinspre persoana care lucrează şi care se află în laborator către mediul exterior. diferite pipete. boxe. pentru coagularea unor medii de cuitură/Loeffler etc). . în funcţie de profilul laboratorului şi a ger­ menilor studiaţi (ex. Ulterior se poate trece datelor în sistemul sanitar trebuie să reprezinte o prioritate pentru oricare dintre unităţile (după caz) la curăţirea locului.băi de nisip (ex. 20.cabinetul de clasă I. epru- aparate electrice etc.alte tipuri de microscop. în locul unde se desfăşoară diagnosticul microbi­ 22. flacoane 21. truse de colorare. . un frigider. este recircuiat prin filtre astfel încât suprafaţa de lucru vine în contact cu aer steril. 33-37°C pentru bacterii.truse pentru coloraţii uzuale (albastru de metilen. baghete de risc care ar putea rezulta în urma utilizării unor substanţe caustice.Termoslate şi băi de apă sau de nisip: . stative pentru tuburi. Trebuie să avem în vedere şi faptul că recomandările şi directivele Uniunii Europene în . Aceste cutii vor fi ulterior incinerate. nişe): .cabinetul de clasă if.termostate reglate la diferite temperaturi. Gram. tăietoare şi înţepătoare. becul Bunsen. medicul îşi introduce mâinile în zona de lucru prin mănuşi fixate etanş la aparat. plăci Petri. în laboratorul de microbiologie. La sfârşitului lucrului în laborator se vor spăla mâinile cu apă şi săpun. > .cabinetul de clasă ill este complet închis. în care aerul curat pătrunde filtrat. bere. în ceea ce priveşte utilizarea cabinetelor de siguranţă biologică (hote. pregătirea respectivei grupe de lucru. Microscoape. cabinetul de siguranţă biologică etc. printr-un filtru care reţine majoritatea particulelor periculoase.

stelaje de lemn sau metal.incinerator (de regulă. becuri Bunsen. în laboratoare specializate (ex. .plăci Petri. Aparate şi dispozitive pentru sterilizare şi dezinfecţie: .autoclav. f ( 10 Diagnosticul de laborator In microbiologie Date privind echipamentul şi aparatura utilizate în laboratorul de microbiologie 11 \ 4.exsicatoare.eprubete de diferite dimensiuni (ex. mycobacteriologie). .balanţe tehnice (pentru medii de cultură.70°C (pentru anumite laboratoare specializate). 12/120 mm. Berzelius). lizarea unui frigider separat de congelator. foarfeci.găleţi de metal cu capac. . . deoarece frigiderul se deschide mai frecvent şi . dispozitive de triturare a ţesuturilor. .balanţă analitică (pentru reactivi în cantităţi foarte mici).baghete de sticlă. 9. în vederea incinerării se încheie un contract de prestări servicii cu o firmă de profil). 5. . seringi. Aparate pentru distilarea şi demineralizarea apei. logice (cu buclă.baloane. indiferent de specialitate.containere pentru produsele patologice. i . lanţă. reactivi.saci rezistenţi la temperaturile atinse în autoclav. Fotometre sau colorimetre Fără a încerca să menţionăm toate dispozitivele.în mod curent sunt utilizate centrifugi cu viteza de 3000 x g.tuburi de centrifugă. . anse-fir.pahare (ex. zontal (pentru diminuarea cantităţii de aerosoli). anse bacterio­ 7. Inventar de material plastic şi cauciuc: . termometre etc. . de azbest. . Frigidere: . . 12.etuvă (pupinel. . bisturie. soluţii în volume mari).lame şi lamele pentru microscopie etc. echipamentele. 16/160 mm).centrifugi cu viteze superioare şi sistem de răcire (ex.frigidere de diferite dimensiuni.cilindrii gradaţi de diferite dimensiuni. biologul care lucrează în laborator cât şi pentru viitorul medic. pentru echilibrarea tuburilor. Containere pentru materialul contaminat: . tampoane diferite. Erlenmeyer). pense. site 6. Centrifugi şi balanţe: .filtre de diferite tipuri. tije cu tampon şi alte 8. 14. . 13. .pipete gradate de diferite dimensiuni. . cuptor Pasteur). Distribuitoare pentru medii de cultură. . instrumente pentru recoltarea produselor patologice.borcane cu soluţii dezinfectante etc. agitatoare. . . Mojare. biologie moleculară). . în apropierea centrifugii se va plasa o ba­ . .centrifugi cu viteze superioare.balanţă electronică (pentru biologie moleculară). alte soluţii în volume mici). .anse calibrate etc.congelatoare de . .dispozitive adaptate la pipete pentru a elimina pipetarea cu gura. Alte articole de laborator: trepiede.saci din material plastic. coşuri de sârmă. casolete. aparatele întâlnite într-un laborator de microbiologie am considerat că această listare este utilă atât pentru medicul sau 10. 11.plăci Petri.balanţe farmaceutice (pentru soluţii de coloranţi. .tuburi de Centrifugă.ţeava de sticlă pentru confecţionarea de pipete Pasteur. 15. sonde. Aparate pentru stabilirea pH-uiui.20°C şi de .camere frigorifice. cu temperatura interioară de + 4°C/este de preferat uti­ . / . preferabil cu rotor ori­ . Inventar de sticlărie: . din platină sau nichelină). . aceasta va influenţa temperatura din compartimentul congelator. .lămpi cu UV etc.flacoane (ex. .

ambalare în cazul materialelor curate. 1 . uscare. mopkilus). prin indicatorii fizici (ex. uscare. chimici (ex. indiferent dacă microbii sunt patogeni sau nepatogeni. Sterilizarea cu aer cald este indicată pentru obiecte de sticlă. de pe o suprafaţă sau dintr-un mediu (lichid sau solid). Metode de sterilizare prin căldură în cazul spitalelor. Metodele de sterilizare care utilizează radiaţiile (cu excepţia radiaţiilor ultraviolete) şi Sterilizarea prin căldură umedă este cea mai eficientă metodă de sterilizare şi are ca metodele chimice de sterilizare (ex. Se realizează cu ajutorul unor agenţi Pentru majoritatea materialelor care urmează a fi sterilizate. Vaporii de apă rea­ sterilizat: ' j lizează la 0. capac prevăzut cu un sistem special de închidere şi în interiorul căruia. Există mai multe tipuri de autoclave: mometru).la roşu“) reprezintă introducerea şi men­ ţinerea în flacăra becului Bunsen până la înroşire. Cu ajutorul unor rezistenţe electrice şi a unui termostat se lor de cultură. vată. Flambarea reprezintă trecerea prin flacără (de câteva ori) a unui obiect. Asepsia reprezintă ansamblul de metode prin care evităm contaminarea mediului ij? 2 / Sterilizarea cu aer cald se realizează în etuvă (pupinel. pulberi inerte şi termostabile. floare de sulf. instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul meta­ lic este de menţionat faptul câ repetarea sterilizării. după cum urmează: stntfejîfivind incinerarea._ pentru o durată de 1 oră. pentru ambalaje de dimensiuni mari). • autoclave cu perete simplu. astfel încât şi meto­ Incinerarea reprezintă arderea până la obţinerea de cenuşă. de multe ori sunt prevăzute incineratoare în structura unităţii sanitare respective. Metode chimice de sterilizare. obiectele de plastic. e spălare. Toate materialele utilizate în laboratorul de microbiologie trebuie să fie sterile înainte de bumbac. în vederea incinerării se încheie un contract de prestări servicii cu o « căldura uscată. în-unele situaţii timpul de sterilizare poate depăşi 60 de minute (ex. gunoi. ter­ comprimaţi la presiunea necesară în vederea sterilizării. SteriIizareamrin-mcăizkaJaJncandescentă (. flacon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur. Dezinfectia reprezintă distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori şi a sporilor) din anumite medii (lichide. l t î. mucoase sau din plăgi. alte materiale termolabile. Uniformizarea temperaturii în interiorul aparatului este realizată cu ajutorul unui sistem de ventilaţie. De regulă. necontaminate. Există o mare diversitate de materiale care trebuie sterilizate. tiouree) sau biologici (ex. incinerării materiale de unică folosinţă din plastic. -i ! I ( f WIETODE DE DEZINFECŢIE Şl STERILIZARE Metode de dezinfecfie şi sterilizare utilizate în laboratorul de microbiologie 13 UTILIZATE ÎN LABORATORUL DE IVIICROBIOLOGIE Sterilizarea prin căldură uscată Sterilizarea prin căldură uscată are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor bacteriene. pentru a preveni diferitele tipuri de poluare. care se închide etanş cu un • autoclavare.5 atmosfere o temperatură de 115°C. temperatura de incandescenţă. medicamentelor injectabile etc. la 1 atmosferă o temperatură de 121°C şi respectiv 134°G la 2 atmosfere. cuptor Pasteur). sticlă (tub. obţine şi menţine temperatura pentru sterilizare. solide) sau de pe suprafeţe. fără a se atinge Septic înseamnă contaminat cu microbi patogeni sau infectat (de exemplu infecţia unei plăgi). Din punctul de vedere al laboratorului de microbiologie ar putea fi supuse • căldura umedă. cada­ £%}Metode de sterilizare prin filtrare vrele animalelor de experienţă etc. • verticale. vaporii de apă sunt Există o serie de metode pentru a controla eficienţa sterilizării. eprubetă.. materiale contaminate din laborator. obiecte de porţelan. spori de Bacillus steamer. forme vegetative sau spori. cu oxid de etilenă) sunt utilizate rareori în laboratorul mecanism coagularea proteinelor si degradarea enzimelor. Există anumite reguli dele de sterilizare sunt destul de variate. spălare. pe toată lungimea. ^ M e to d e de sterilizare utilizând radiaţiile Sterilizarea prin căldură umedă. Autoclavul are ca piesă principală un cazan cu pereţi metalici. indiferent de sistemul public sau privat. Se realizează cu ajutorul substanţelor antiseptice. ambalare/în cazul materialelor contaminate refolosibile. cât şi pentru Sterilizarea va fi întotdeauna precedată de pregătirea materialului care urmează să fie unităţile sanitare în general. uleiuri anhidre. reziduuri organice solide. • orizontale. Antisepsia reprezintă înlăturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de pe tegumente. ___ de microbiologie. a obiectului care urmează Sterilizarea reprezintă distrugerea sau îndepărtarea tuturor microorganismelor patogene sau a fi sterilizat. Flambarea se aplică pentru portansă. obiectele de cauciuc. /(jy ’Autoclavarea este esenţială atât pentru laboratoarele de microbiologie. fibră sintetică. utilizare. temperatura din etuvă tre­ fizici sau cu ajutorul substanţelor dezinfectante. STERILIZAREA Nu se vor steriliza în etuvă soluţiile apoase. în timp. j l e f in iţ ii de bază 1. buie să atingă J80°C. medii­ cutie metalică cu pereţi dubli. nepatogene. conduce la decălirea oţelului) etc. firmă de profil. gâtul unui recipient de Aseptic înseamnă lipsit de microbi. Se poate aplica pentru ansa bacteriologică (cu buclă sau fir) sau pentru spatulă. Etuva este o ambiant cu germeni microbieni sau prin care putem menţine “sterilitatea” ţesuturilor.

sticlă poroasă. * deschidem robinetul pentru evacuarea aerului şi vaporilor (dacă rămâne aer în cazanul . dacă nivelul a scăzut. ® aşezăm pe suport obiectele şi materialele de sterilizat. valoarea dorită (de ex. dar rilizării se procedează astfel. Sterilizarea prin filtrare este utilizată pentru decontaminarea aerului. un recipient în care se va colecta lichidul sterilizat. â unor reactivi care sunt sensibili la tempe­ » lăsăm obiectele şi materialele să se răcească în autoclavul deschis. băi deschide şi permite evacuarea vaporilor atunci când. distanţă de 2-3 centimetri de suport. care evită depăşi lea'll ne i temperaturi de 100°C. exterior. Pasteurizarea şi fierberea nu reprezintă metode de sterilizare. Trecerea * închidem etanş capacul. vaporii de apă fiind mai uşori. o pompă de vid care va aspira lichidul din primiţi în » presiunea din cazan începe să crească şi . 100°C timp de 30-60 minutelfT jk n ă la 8 zile succesiv. respectiv poartă numele de sterilizare prin filtrare. formele vegetative iar cal. dar sunt utilizate în anu­ Cazanul de presiune este inclus într-un perete exterior solid care la partea inferioară are un mite situaţii. care se va menţine permanent mite evacuarea apei din cazan). e conectăm sursa de căldură. de apă fierbinţi aflaţi sub presiune.14 Microbiologie Metode de dezinfecfie şi sterilizare utilizate în laboratorul de microbiologie 15 e autoclave cu manta de aburi. iunie: do hidrogen. verti­ germinarea. montează etanş între cele 2 recipiente. Există şi. răcească până când presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice. « atunci când. oxidanta legăturilor duble ele. Prin autoclavare putem steriliza diferite substanţe în soluţie. * deschidem lent robinetul de vapori. Pentru pu­ vegetative rezultate din germinarea sporilor iar după răcire are loc germinarea sporilor care nerea în funcţiune a autoclavului. Astfel. ir . accidental. folosind sistemul special de etanşeizare cu care este dotat unui lichid pjrinlr-o substanţă prevăzută cu pori care va reţine microorganismele din lichidul autoclavul pe care îl avem Ia dispoziţie. după prima încălzire timp de 30-60 minute sunt distruse. este perforată permite trecerea vaporilor de apă produşi după încălzirea apei. pământ de infuzorO^ Actualmente se folosesc din ce în ce mai cu presiune eficienţa sterilizării va scădea considerabil. Cu o importanţă practică particulară ar fi de menţionat fil­ ® după trecerea celor 30 minute întrerupem sursa de căldură şi lăsăm autoclavul să se trele pentru sterilizarea aerului din cabinetele de siguranţă biologică (clasa 11 şi clasa 111). aparate de filtrat etc. materiale contaminate din laborator.025 ret. prin membrana filtrantă. în dotare există 2 robinete. frecvent. Radiaţiile neionizante (IJV) sau ionizante (X ele) au efecte bactericide prin ruperea legă- de cauciuc sau bumbac). ia care vaporii provin din apa aflată în cazanul de presiune şi ajung în camera de sterilizare după răcire are loc germinarea sporilor. care urmează a fi filtrat. drept exemplu. bere ele). autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite deschiderea capacului până când presiunea din interior nu o egalizează pe cea din. fiind mai greu. Timpul se înregistrează după ce apa a început să fiarbă. de metal perforată.. va rămâne în partea inferioară a cazanului). reglăm sursa de căldura în aşa clavare înainte de începerea filtrării. ^ jT in d a liz a rc a (sterilizarea l'racţionată) este o metodă de sterilizare prin căldură umedă o verticale. De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porţelan. . Toate aceste piese sunt sterilizate prin auto­ când presiunea atinge. se completează (recoman­ dabil se va utiliza apă distilată). instrumentar chirurgical (metalic. de 100°C). membrane filtrante din acerat de celuloză cu porozităţi între S şi 0. limita de siguranţă. 30 minute). it unor medii de cul­ » deschidem sistemul de etanşeizare şi capacul autoclavului. Presiunea din interiorul cazanului este înregistrată de un manometru.Filters}. utilizând medii care permit în continuare. care trebuie să fie până ia o acestei metode poate Fi crescută prin adăugarea de carbonat de sodiu 1-2%. în vederea ste­ Fierberea timp de 30 minute distruge bacteriile în formă vegetativă. 65°C). unele medii de cultură etc. tură (care nu se pot steriliza prin autoclavare). atunci al doilea recipient. Pe suport se aşează materialele care trebuie sterilizate iar faptul că placa Fierberea poate fi utilizată atunci când nu dispunem de alte metode eficiente de sterilizare. o pasteurizare medie f 15 miinite la 65-75IIC) şi ojxisteurizare întiltă (2-5 minute ia în partea inferioară a cazanului de presiune se află un suport pe care se aşează o placă 85-90°C). 1 atmosferă). alte variante tehnice. în ve­ vor încălzi în special partea superioară a cazanului în timp ce aerul. Pentru a evita accidentele există o supapă de siguranţă care se deschis robinetul de vapori (şi astfei nu se va depăşi în interior temperatura. în ziua următoare sunt distruse prin încălzire formele de jos în sus.azbest impregnat cu caolin. Există o pasteurizate joasă (30 minute la 56- spaţiu în.este urmărită cu ajutorul manometrului. / raturile atinse în cazul sterilizării prin căldură etc. sticlărie (cu excepţia pipetelor şi lamelor). care permite legătura între cazan şi mediul exterior) şi unul inferior (robinetul care per­ Din punct de vedere tehnic pot fi utilizate autoclave la. Substanţele de sterilizat se menţin la S£- • orizontale. fungii şi virusurile.'~Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile în formă vegetativă dar nu şi sporii. Eficienţa » verificăm nivelul apei din partea inferioară a cazanului. medii da cultură. care se află sursa de căldură.după evacuarea aerului şi apariţia unui jet continuu de vapori. vapori. în momentul de faţă pentru evitarea riscului de a veni în contact cu vapori Prin tindaiizare se pot steriliza alimente. unul superior (robinetul de aer şi nu au germinat în prima zi etc. o pâlnie care se * închidem robinetul . ambalate corespunzător Microorganismele pol fi reţinute mecanic şi electrostatic în porii unui filtru.temperatura ajunge iu circa 80°C putem scoate materialele sterilizate. presiunea vaporilor depăşeşte de apă sau băi de nisip. Pasteurizarea foloseşte căldura umedă şi are aplicaţii in conservarea pentru scurtă durată a unor alimente (lapte. care va atinge tem­ derea filtrării suni necesare o serie de piese precum: un recipient în care se introduce lichidul peraturi inferioare. nu şi sporii bacteriei». * iei încât această presiune să fie menţinută pentru toată durata sterilizării (de ex. vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu.

SH): expunere. o dublare a concentraţiei va reduce o efectul este diminuat considerabil în prezenţa substanţelor organice (în special pro­ la jumătate timpul necesar pentru sterilizare). * acest tip de sterilizare se utilizează pentru materiale care nu rezistă atunci când sunt e). glutaraldehidei. clorhexidina (cu efecte toxice mai reduse) etc. Antisepticele pot fi utilizate pe tegumente şi mucoase. ţinând cont de faptul că nu există nici un dezinfectant ideal. • cel mai frecvent este utilizată concentraţia de 2%. c) . . de exemplu rivanolul. medicamente. combinarea cu hidrocarburi fluorinate. SH): * au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă. "seringi de unică întrebuinţare etc). utilizarea producători de antiseptice şi dezinfectante. sărurile de argint. este etalonul faţă de care se măsoară Sterilizarea cu etilenoxid (CH2 CH2 O): activitatea antimicrobiană a antisepticelor şi dezinfectantelor (indicele fenolic). util în antiseptizarea mucoaselor. supuse acţiunii temperaturii sau radiaţiilor (ex. genului labil printr-o grupare hidroxietil (-CH2CH 2OH). Substanţe care blochează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu. itate datorită proprietăţilor caustice şi toxicităţii sale. unor spori bacterieni. protargol) cu efecte bactericide. unor virusuri (ex. teine). fenolii. • au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă. I2. este necesar un timp mai lung de expunere). neionici (de exemplu propilenglicolul). ideală pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate ce pot fi imersate o hipermanganatul de potasiu l%o. oxidului de etilen etc. temperatură. binarea cu CO 2 în camere de oţel speciale 3. exemplu acidul dodecilaminoacetic). • sunt substanţe care complexează iodul pe care îl eliberează în soluţii apoase. sporilor bacterifeni. HIV e inactivat de soluţia 0. Substanţe care alterează acizii nucleici:. acidul fenic are utilizări lim­ ®pot fi utilizaţi pentru dezinfecţia suprafeţelor. detergenţi.coloranţii bazici (violet de genţiană. bazele. crezolii. com­ Hipoclorijii: . lemn sau material plastic. detergenţilor. cloramine. Există numeroase substanţe şi numeroşi * etiienoxidul poate exploda. virusuri cu înveliş lîpidic). fenolii nu se folosesc de cultură. fucsină bazică etc). ■ r d). 1. * nu poate fi folosită pentru suprafeţe. 2. Lămpile cu UV sunt numite lămpigermicider * soluţiile fenolice se prepară periodic (pentru cel mult 24 ore). fungilor ( l 60 ppm în o oră). preparatele organomercuriale (exemplu merthiolat de fungiior. o ) Radiaţiile ionizante se pot utiliza în sterilizări industriale (pentru alimente. compuşi de argint coloidal (exemplu colargol. » sterilizarea este în principiu influenţată de. perioada mai mare de timp în containere menţinute închise. detergenţii anionici (săpunuri. amfolitici (de » sporii de Bacillus xiibtilis nu sunt distruşi. echipa­ ment electronic etc). ®concentraţia poate fi diferită în funcţie de scopul urmărit (de obicei este de 2-5%). variantele pentru evitarea exploziei includ.. virusurilor (200 ppm Î11 10 minute). • datorită faptului că nu corodează metalele (aşa cum se întâmplă în cazul substanţelor fa). de exemplu brotnocet). derivaţii de acridină. potenţialului carcinogenetic şi corozivităţii. • exercită activităţi bactericide prin aîkilarea acizilor nucleici şi prin înlocuirea hidro­ hexaclorofenul. Antisepticele şi dezinfectantele sunt substanţe cu acţiune antimicrobiană nesclectivă.5%). etilenoxidului în camere speciale care permit menţinerea unei presiuni negative 2. * sunt inactivaţi de substanţe organice (în special proteice). dezinfectantele pot fi utilizate numai • are efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă (în cazul mycobacteriiior pe suprafeţe şi structuri care nu sunt vii. albastru de metilen. folosit pentru antiseptizarea tegumentelor).Substanţe care lezează membranele celulare: ex. metale grele sărurile de mercur. Derivaţii fenolici: „ Radiaţiile UV sunt utile în sterilizarea suprafeţelor de lucru (pentru repartizarea mediilor ®datorită toxicităţii. la un pH alcalin. datorită vaporilor iritanţi şi timpului mare de b) . < cinogenetice. materiale din cauciuc.500 ppm plor « există o serie de inconveniente în ceea ce priveşte acest tip de sterilizare (efecte car- activ pentru dezinfectarea pipetelor contaminate). Substanţe care oxidează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu. Clasificare în funcţie de mecanismul de acţiune. . în continuare vom prezenta pe scurt câteva dintre substanţele dezinfectante. halogenii (CI2. umiditatea relativă şi timpul de expunere (spre ex. soluţii iodurate etc) în concentraţii corespunzătoare etc. plastic. concentraţia etiienoxidului. mase plastice. cationici (săruri cuaternare de amoniu. grupările alchil ale formaldehidei. « efectul este diminuat pe suprafeţele de cauciuc. fungiior. logică cu flux laminar. unor virusuri (ex. * i AAetode de dezinfecfie şi sterilizare utilizate în laboratorul de microbiologii 1<5 __________ ___________________________• Microbiologie NA*^*\AA^T»W ^ţ _ .d): acizii. alte manevre aseptice etc) în cazul în care nu există cabinete de siguranţă bio­ ca atare. • soluţiile de hipoclorit se prepară periodic (se inactivează după mai mult de 24 ore). virusurilor. fungiior. ®concentraţia în clor activ este diferită în funcţie de scopul urmărit (ex. peroxidul de hidrogen. Glutaraldehida: alterând structuri şi funcţii comune microorganismelor şi organismelor superioare. prezentate mai sus) se poate folosi şi la dezinfectarea suprafeţelor metalice. perlan etc). dezinfecţia pipetelor contaminate. ci sub forma derivaţilor fenolici. ®au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă. maselor plastice. utilizat în antiseptizarea plăgilor. Substanţe care denaturează proteinele (au în general . » indiferent de Varianta folosită trebuie respectate toate recomandările producătorului. Br2) şi derivaţii lor hcloforiţ— - (hipocloriţi.efect bacterici. alcoolii (de exemplu alcoolul etilic de 70°. sodiu). soluţie 3 % în apă. efecte ia nivelul sistemului nervos etc).

în cazul suspiciunii unei infecţii micotice sunt utile atât preparatele proaspete (de ex. de exemplu Klebsiella pneumoniae sau alte caractere prelevând un anumit produs patologic în funcţie de manifestarea clinică în cazul respectiv. defiip R . frotiurile cu coloraţii negative prepararea frotiurilor şi coloraţiilor. care se va identifica. continuând cu preparatul umed montat în soluţie de KOH-glicerol 10-20%). seroneutralizarea. solide-şTcare pot tTderiip S’jientru majoritatea bacteriilor studiate. cât mai rapid şi corect Cormebpcterium dinhteriaţ~Mvcobaclerium tuberculosis şi Bacillus a n th n ich rf pespectiv din punct de vedere al tehnicilor utilizate. utilizând anticorpi cunoscuţi pentru a iden­ aeruginosa etc). care pot fi foarte variate de la o specie de microbi la alta şi care cefato-rahidian în cazul suspiciunii unei meningite. constituind un îndrumar al activităţii din cursul şi a altor celule normale sau patologice. urină sau materii fecale. de: tip M în cazul bacteriilor capsulate. Spre exemplu. după caz. care se va examina între lamă şi lamelă în logic. Frotiurile se examinează . prezentarea princi­ (tuş de India. lichid fc)Caractere biochimice. Cultivarea se va realiza în aşa fel încât să se poată obţine colonii reacţiilor antigen-anticorp. scuame în cazul unei micoze cutanate pot fi foarte utile spre exemplu în cazul diferenţierii enterobacteriilor (mediile multitest). precum şi eventuala prezenţă a microbilor.5 ^Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se va face în funcţie de situaţie (mediile şi condiţiile de incubare se vor alege în funcţie de presupusul microorganism pe în partea de „imunologie". de în cmuI fungilor). fixare a complementului. prin reacţii de aglutinare pe lamă 2b.în cazul înainte ca pacientului să i 7e fi administrat antibiotice sau chimioterapice. Este de preferat să avem întotdeauna cel puţin încă un frotiu de re­ microorganism de a elabora anumite substanţe cu rol în patogenitate (exemplu coagulaza zervă. ex. fungilor (auxanograma) etc. date care pot fi deosebit de utile în vederea unui lucrărilor practice dar şi un suport pentru reţinerea acestor noţiuni din punct de vedere teo­ diagnostic corespunzător. Astfel. partea „generală" se va încheia cu testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice. funcţionalitatea tractului digestiv). aglutinare. există anticorpi specifici polivalenţi esenţială şi poate orienta paşii următori. în cazul materiilor fecale. / tţTfcaractere morfologice (se va face un frotiu din colonia izolată. palelor medii dc cultură şi a tehnicilor de cultivare. tehnica examenului microscopic. în cazul suspicionării unei infecţii urinare—se. atunci când se vor examina spre exemplu capacitatea unui (AM) si respectiv Gram. care se va colora Ziehl-Neelsen. nigrozinâ) precum şi frotiurile colorate May-Griinwald-Gieinsa sau Qjam. Vibrio etc. în contextul dat. Fiecare dintre etape vederea aprecierii prezenţei şi eventual a numărului de Ieucocite prezente pe câmp. care va fi interpretată cu precauţie. . izo­ puncţie-biopsie etc). retic. Diagnosticul de laborator bacteriologic/micologic^ vor evidenţia numai microorganisme care au formă şi tinctorialitate similară). materii fecale în cazul unei boli diareice. va obţine în continuare vor fi prezentate succint principalele etape ale diagnosticului microbio­ un sediment tirmarid u p ă centrifugarea urinei). după o discuţie succintă a noţiunilor de antigen. în această situaţie se A. în cazul suspicionării unei jnfectii mvcohactetiene^este necesară larea pneumococilor de Ia un pacient cu pneumonie după inocularea sputei la şoarecele alb. Atunci când produsul recoltat este reprezentat de sânge. . căutându-se în spe­ cial prezenţa leucoeitelor (dar şi a unor structuri care pot da anumite informaţii cu privire la menţionate. frotiu care se va colo­ ra oram sau Ziehl-Neelsen. anticorp şi a care dorim să-l izolăm). Diagnosticul de laborator bacteriologic/micologic are mai multe etape. după prezentarea metodelor de identifi­ care. ' ( dfearactere antigenice «jre vor fi examinate bazându-ne pe structura microorganismelor puroiul colorat albastru sau albastru verzui este sugestiv pentru o infecţie cu Pseudomonas şi pe specificitatea reacţiilor antigen-anticorp. ieucocite polimorfonucleare neutrofile). şi se va examina microscopic. tifica antigenele microbiene necunoscute. si se notează prezenţa diferitelor celule (eventual mo­ dificate faţă de normal). Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Capitolul 22 va fi dedicat preparatelor biologice pentru uz uman. Examinarea microscopică a produsului patologic reprezintă de multe ori o etapă se vor identifica antigenele genului Shigella. reacţiile în care reaclanţii sunt marcaţi precum şi utilizarea unor metode moderne în testarea imunităţii. Se vor realiza minim două frotiuri din produsul sau monovalenţi care vor fi utilizaţi de la caz la caz. • 2a) Examinarea macroscopică a produsului patologic poate fi uneori foarte utilă (ex. supgrficiale ele). vor fi prezentate succesiv reacţiile de precipitare. începând cu normele privind prelevarea şi transportul probelor. de izolate şi respectiv o cultură pură. regulă nu se realizează frotiuri fixate şi colorate. logic (direct). aureus) sau infecţia experimentală la animalul de laborator (de exemplu. prezenţa celulelor inflamatorii (dovada reacţiei organismului faţă de infecţie. patologic recoltat şi transportat corespunzător. 4. spre exemplu. produs recoltat prin produsă de S. realizarea unui frotiu suplimentar. un diagnostic imunologic (indirect) sau o combinaţie a celor două variante se va face o coprocitogramă. şi anume: |^b ) caractere de cultură (se-xpr examina coloniile izolate apărute pe mediilgjje cultură / f rŢ)Recoltarea şi transportul produsului patologic (se va face cât mat aproape de debutul bolii. care se vor colora cu albastru de meailga. un preparat proaspăt între lamă şi lamelă. pe o schemă care va fi urmată pe parcursul următoarelor capitole. precum va fi tratată din punct de vedere practic.'''7e)'«aractere de patogenitate. 5 Schema generală a diagnosticului de laborator microbiologic 19 SCHEMA GENERALĂ A DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR MICROBIOLOGIC la microscopul optic a i imersie. mai ales în cazul în care produsul patologic este „preţios" (LCR. de Diagnosticul de laborator în microbiologic poate fi un diagnostic bacteriologic sau mico. respectând toate normele de asepsie şi antisepsie. exemplu urină în cazul unei infecţii urinare.

în diagnosticul serologic ne bazăm pe specificitatea reacţiilor antigen-anticorp şi utilizând diferite tehnici trebuie să putem răspunde la minim trei întrebări esenţiale. însoţită de alte determinări.^Antibiograma şi -respectiv antifungigrama (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi zător. merită a fi înţelese şi aplicate corespun­ . g) caracterc-genetice care vor fi „examinate" prin tehnici de biologie moleculară. animalul va muri în 24-48 de ore. metode care utilizează tehnici de biologie moleculară etc).2. iar din sân­ gele lui se va izola o „cultură pură'1de pneumococi). dar în cazul unor infecţii grave trebuie să fie dezvoltată atât din punct de vedere teoretic cât şi practic. această analiză ne va permite să diferenţiem situaţia unei afecţiuni acute (titrul anticorpilor este mai crescut la a doua determinare. Tehnica intradcrmoreacţiei este folosită în mai multe scopuri şi trebuie să avem în vedere că în funcţie de scopul urmărit şi respectiv în funcţie de antigenul inoculat (şi de mecanismul implicat). Intradermoreacţia la tuberculină (PPD. această „schemă" de diagnostic este utilă şi este bine să fie reţinută şi aplicată pentru fiecare infecţie în parte. Spre exemplu pot fi necesare în cazul infecţiilor bacteriene determinarea concentraţiilor minime inhibitorii (CMI). multe dintre prin­ hî alte caractere utile în identificarea microorganismelor (bacterii. respectiv nivelul de eficienţă inhibitorie (NEI) şi nivelul de eficienţă bactericidă (NEB). utilizând antigene cunoscute. fungi).există anticorpi în serul pacientului investigat? r care este titrul anticorpilor? . . reprezintă exemple clasice în acest sens. * i i]C ■ $ • • ! Aşa cum am menţionat mai sus. îfr vederea stabilirii tratamentului) se va fi completată utilizând diferitele tratate medicale în domeniu dar şi experienţa personală realiza de obicei prin metode difuzimetrice.şi respectiv bactericide (CMB).f S. Există şi metode moderne pentru determinarea sensibilităţii la antibiotice. ( i ( 20 Diagnosticul de laborator în microbiologie ♦5 Schema generală a diagnosticului de laborator microbiologic 21 în cazul în care în sputâ există pneumococi. în mod clasic de 4 ori). indiferent de specialitatea aleasă. în cadrul diagnosticului de laborator imunobiologic se va studia de exemplu reac- tiVîîatgâ pacientului faţă de un anumit antigen inoculat. motiv pentru care se vor realiza minim două determinări diferite la un interval de 7-10 zile (pentru majoritatea infecţiilor care pot fi diagnosticate astfel). modul de citire al rezultatelor va fi diferit. Considerăm că pentru orice medic. (ex. cipiile de bază ale microbiologici sunt foarte utile. în anumite situaţii poate deveni necesară determinarea nivelului de eficienţă pentru antibioti­ cul utilizat. Iniţial vor fi studiate din punct de vedere practic noţiunile de bază (microbiologie gene­ f) lizotipiş. d ia g n o s tic u l de laborator imunologic (serologic şi/sau Imunobiologic) ' B. B. Fiecare dintre capitolele care urmează îşi găsesc locul într-un anume punct al schemei generale. de situaţia în care pacientul este deja în convalescenţă (titrul anticorpilor la a doua determinare va fi mai scăzut) sau de situaţia unui pacient cu o afecţiune cronică (titrul anticorpilor va fi asemănă­ tor sau foarte apropiat la cele două determinări succesive). urmărind maladiile produse de principalele microorganisme.cuin evoluează în dinamică (în timp) acest titru. şi anume: .l. o altă variantă de lucra ar fi determinarea anticorpilor specifici de tip IgM. în cadrul diagnosticului de laborator serologic se va determina prezenţa (sau se va doveăi absenţa) anticorpilor necunoscuţi. E test. rală şi imunologie) pentru ca în ultima parte să trecem la studierea diagnosticului ca atare. Pentru cei care se dedică microbiologici. în vederea identificării unei infecţii acute. în cursul microbiologici speciale. (sensibilitatea la un anumit bacteriofag specific). derivat proteic purificat) sau la candidată. în serul pacientului respectiv. aceste noţiuni reprezintă o bază care poate chimioterapice anti-bacteriene sau antî-fungice.

Utilizăm termenul de „produs patolo. De altfel această afirmaţie este perfect vala­ mediul de cultură fără antibiotic. imediat înainte de următoarea doză de antibiotic. 0 acest deziderat este îndeplit din ce în ce mai rar ceea ce crează multe probleme în ® ui) produs de la nivelul căilor de eliminare din organism (ex. de materii fecale. tratamentului pentru 24 . secreţie nazală sau faringiană de medic sau sub îndrumarea unui medic de specialitate. cu recoltarea p. urină Î11 infecţiile diagnosticul microbiologic „contribuind" şi la selectarea microorganismelor reziş®®^ tractului urinar. spre exemplu • în cazul în care evoluţia sub tratament antibiotic este nefavorabilă. prima săptămână de evoluţie).. ş!. cu posibile urinări nefaste pentru pacient sau apelarea (5 la „cocteil-ul" (asocieri) de antibiotice cu riscurile de rigoare. I Norme privind prelevarea şi transportul produselor patologice 23 NORME PRIVIND PRELEVAREA Şl TRANSPORTUL PRODUSELOR PATOLOGICE • oprirea. • în suspicîonarea unei tuberculoze pulmonare se recomandă recoltarea a câte unei « alternativele sunt reprezentate de „schimbarea" tratamentului în mod mai puţin *:■ probe de spută. fie uneia fungice. | | mite cazuri. Prelevarea şi transportul produsului patologic (p. pentru hemocultură. care poate duce la un diagnostic care ar putea salva viaţa pacien. ceea ce este ®chiar dacă boala este gravă iar tratamentul antibiotic „pare" urgent.'.) efectuate corespunzător va permită:® dar trebuie ales momentul cel mai potrivit (optim).p. pentru recoltarea p. V meningită. dacă este posibil.p. sânge. să fie făcută ®o secreţie de ia nivelul presupusei porţi de intrare (ex. vom accepta utilizarea acestor termeni ca ataie„r.|: de către pacientul investigat. poate influenţa rezultatul în anu­ prima doză de antibiotic sau chimioterapie.'*)' ®periodicitatea cu care se realizează recoltarea de . JjML prin biopsie de la nivelul ganglionilor limfatici). ţesut recoltat mioterapice. medic de altă specialitate). microorganismul implicat patogenic va putea fi identificat Î11cursul diagnosticului microbiologic.p. .p. adică de regulă recoltăm un anumit produs care este potenţial patolo-*. secreţie genitală în cazul unei boii veneriene etc). se microbiologic va permite (între timp) izolarea agentului etiologic şi stabilirea sen. în funcţie de boala suspectată se pot reco. • ceea ce a fost prelevat şi transmis pentru examinare trebuie să reprezinte cu adevărat p.p.s tulul sunt necesare numai câteva minute.p. cilor implicaţi (medic de familie. pe criterii de probabilitate. lichid cefalo-rahidian/LCR în • eforturile privind îndeplinirea lui trebuie să aparţină atât pacientului cât şi medi-. trei zile consecutiv. mai mare probabilitate ca agentul etiologic să se găsească în produs tice şi chimioterapice a microorganismului implicat patogenic în infecţia dovedită la miji • în funcţie de evoluţia bolii (de ex. cu în schema generală a diagnosticului microbiologic direct.. (acei produs care conţine cu mare probabi 1iltate microorganismul infectant).p. * prelevarea p. se poate administra. se recomanda efec- Reguli privind recoltarea produselor patologice tuarea hemoculturii în „accesul febril"). » un produs de Ia nivelul focarului infecţios (cx. şi ÎN DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC DIRECT începerea diagnosticului microbiologic. a tuturor datelor privitoare la tratamentul primit gic. coprocultura în febra tifoidă se va efectua „după" pacient anume („nu există boli. Pentru a simplifica modul de exprimare.p. după recoltarea p. fie că diagnosticul se adre­ sulfat de magneziu în cazul în care s-au administrat tetracicline). ci bolnavi"). trei zile consecutiv etc. în cursul diagnosticului de labora%. • *!%•••• o în funcţie de specificul fiziopatplogic al bolii respective (de ex. bilă şi în diagnosticul virusologie sau parazitologic. j* .p. ales „empiric". • în cazul în care este suspicionat diagnosticul de meningită şi a fost recoltat LCR. recoltarea (prelevarea) şi transportul pro­ • diluarea inoculului (mai ales dacă pacientul a primit un tratament bacteriostatic) în dusului patologic reprezintă o etapă esenţială.'. spută în pneumonie etc). '> v în difterie. în mediul de cultură (ex. precum şi în buletinul de analiză. trebuie reţinut că. evoluţiei şi elementelor clinice legate de bolile infecţioase. ®recoltarea şi transportul p. trebuie să aibă ioc înainte ca pacientul să fi primit antibiotice sau chi-^şv: » un produs de la nivelul căilor de răspândire în organism (ex. ştiinţific. diagnosticul ” ’ • în suspicîonarea unui sepsis (denumirea acceptată actual pentru septicemie).J r recomandă recoltarea a 2-3 probe de sânge în 24 ore. • recoltarea p. v sează unei infecţii bacteriene.- esenţial în căzui practicării cu adevărat a microbiologici clinice. culminând cu stabilirea sensibilităţii la antibio-?. raţional sau chiar iraţional.p. _giU‘ în relativ exces. pentru coprocultură. sibilităţii Ia antibiotice şi chimioterapice astfel încât „schimbarea" tratamentului se • în suspicîonarea unei boli diareice acute se recomandă recoltarea a câte unei probe va putea face în mod riguros.p.p. tor. materii fecale într-o boală diareică acută ele). faptul că este patologic îl vom dovedi (sau infirma). tente la medicamentele antimicrobiene. spre exemplu ■în cazul în care (dintr-un motiv sau altul) tratamentul cu antibiotice a fost început înainte de prezentarea la spital/laborator. trebuie să se realizeze cât mai aproape de debutul bolii.şi • notificarea în formularul în care se solicită analiza de laborator şi care însoţeşte p. respectiv momentul în care este cea realizarea etapelor următoare de diagnostic. •o • produsul patologic din câre estimăm că vom putea izola agentul eliologic al bolii sus- Se cunosc o serie de reguli care trebuie respectate cu stricteţe în cursul acestei etape: picionate va fi ales în funcţie de maladie şi va putea fi reprezentat spre exemplu de • este recomandabil ca recoltarea şi stabilirea modalităţii de transport a p. • în vederea alegerii produsului care urmează a fi recoltat este necesară cunoaşterea patogeniei. • încercarea de „antagonizare" a efectului antibioticului. în manda următoarele abordări: cazul în care meningita este de etiologie bacteriană sau fungică.48 ore.

natura p. ficare/vizualizare prin microscopie/cultivare şi izolare a microorganismului infectant.p. cel mai adesea venim în contact cu formulare incomplete/comple- • cantitatea de p. pacientului şi pentru prevenirea contaminării p. probă Z. examenul solicitat. recomandată doar recoltării şi transportului p. un grup de cifre şi litere care permit codificarea şi sanitare. data debutului e instrumentele pentru recoltare trebuie să fie nu numai sterile dar şi adecvate. Respingerea p. această modalitate de apreciere este com­ prin manevre invazive care şuntează căile naturale prin care sunt eliminate plet eronată. se recurge • se vor respecta precauţiunile universale privind prevenirea contaminării în unităţile la „număml unic de identificare".p. data începerii administrării. • formularul prin care se anunţă rezultatul analizei (buletinul de analiză). respectiv acele porţiuni în care sunt cele mai mari şanse de identi- care recoltarea produsului patologic se face în afara laboratorului). ino­ solicitării analizei cât şi buletinul de analiză microbiologică. rior în ioc de spută. secţia. vârsta pacientului (sau „numărul unic de identificare"). doze. diagnosticul microbiologic este imposibil etc. ar putea ti respins de la analiza microbiologică • recipientele pentru recoltare şi transport trebuie să fie întâi curăţate (dar prin clătire să fie eliminate orice substanţe chimice cu posibil efect antimicrobian) şi apoi sterilizate. pred frecvente şi ar trebui ca de fiecare dată să conducă la o discuţie fermă cu „expe­ ® pentru anumite microorganisme (ex. inclusiv de studenţii la medicină. după opinia noastră. tate indescifrabil/completate cu erori şi chiar dacă ar putea părea incredibil. se vor preleva şi utiliza în cursul diagnosticului microbiologic porţiunile cele • registrul unităţii sanitare/secţiei/clinicii care solicită analiza respectivă (în cazul în mai reprezentative. pentru prevenirea supra-infectării câteva unităţi sanitare în România unde sunt utilizate aceste metode. durată). contaminarea p. asocierea a câte unui astfel de număr fiecărui pacient în parte. recoltabil este mică. vată este total contraindicată. trebuie cunoscute de orice persoană implicată în actul medical. o pentru reducerea cantităţii de date şi respectiv asigurarea confidenţialităţii. există doar tru prevenirea contaminării celui care recoltează.p. . transportul p. cine şi cum a făcut recoltarea. data şi înainte de a încheia această parte a capitolului privind normele privind recoltarea şi locul recoltării (unitate sanitară.p.p. o este necesar să se recolteze o cantitate de p. dar există anumite motive care pot conduce la această decizie. prenume Y. în beneficiul pacienţilor. ceea ce se notează pe recipient trebuie trimite spre examinare salivă sau secreţii de la nivelul arborelului respirator supe­ să corespundă cu ceea ce a fost notat pe formularul de solicitare a respectivei analize. Bordetella pertussis) utilizarea tamponului cu ditorul" până când asemenea comportamente vor fi eliminate. data şi ora recepţionării în labora­ şi tegumentelor cu leziuni tor. înregistrarea datelor şi fluxul informaţiilor în sistemul sanitar sunt microorganismele/vezi recoltarea sputei prin lavaj bronhoalveolar). un singur formular poate include atât partea corespunzătoarea cului microbiologic (preparate proaspete.p. rugăm toată bateria de analize" sunt încă mult transferate pe frotiu. spre exemplu în cazul recoltării de materii fecale (suspiciune de boală diareică acută) se vor selecta porţiunile muco-purulente (eventual muco-sanguinolente) • registrul de lucru al laboratorului. formulări • microorganismele şi leucocitele „rămân" în proporţie mare pe vată şi nu pot fi uşor de genul „nume X. chiar dacă nu vor alege pentru viitor pre­ tor microbiologică gătirea în domeniul medicinei de laborator sau în domeniul bolilor infecţioase. ar trebui să reprezinte o excepţie în activitatea unui laborator de anali­ preferabil prin autoclavare. extrem de importante şi este necesar să fie depuse toate eforturile în vederea efec­ • se vor utiliza instrumente sterile şi recipiente (containere/recoitoare) sterile.p. • se va evita. se nu trebuie să fie neglijate. în diagnosticul microbiologic direct dorim să subliniem câteva aspecte care ®pentru facilitarea alegerii celei mai potrivite modalităţi pentru prelucrarea p. ce medicaţie antimicrobiană a fost administrată respectivului pacient (anti­ . prenumele. . foarte frecvent este utilizat tamponul de vată.p. închiderea recipientelor trebuie să fie perfectă. = secreţie de la suprafaţa mucoaselor ®în acelaşi sens se vor nota data şi ora recoltării. bolii. cu microorganisme care aparţin florei • cu toate că înregistrarea datelor pare pentru majoritatea celor implicaţi în actul rnicrobiene normale (spre ex. înainte de a preveni orice contaminare pe parcursul transportului. reluarea unor manevre în cazul că este necesar • o altă modalitate de simplificare ar putea fi reprezentată de înregistrarea „electro­ • recoltarea şi transportul p. cultivări pe medii de cultură.p. mediu de cultură. tuării lor în mod corespunzător (din păcate orele de studiu dedicate acestor aspecte sunt mult prea reduse atât pe parcursul studenţiei cât şi în cursul rezidenţiatului). după cum urmează: vor nota diagnosticul prezumtiv.. însă recoltarea cu tampon ar trebui să fie biotic sau asociere de antibiotice. culări la animale de experienţă. salonul). pentru a ze medicale.p. ( ( Norme privind prelevarea şi transportul produselor patologice 25 24 Diagnosticul de laborator în microbiologie • recipientele pentru recoltare şi transport trebuie să fie marcate corespunzător în aşa fel • în schimb. dacă în cazul în care este suspicionată tuberculoza pulmonară se vor încât să nu fie posibilă apariţia unor confuzii. • pentru identificarea produsului patologic care urmează a fi prelucrat se vor nota numele. pen­ nică" a datelor şi utilizarea metodelor moderne de transmitere a lor. pe cât posibil. suficientă pentru efectuarea diagnosti­ • pentru simplificare.. cum a fost asigurat transportul p.p. clinica. • subliniem faptul că. Motive pentru care un p. • datele de identificare şi alte date semnificatice vor fi trecute în următoarele documente • din p.p. * formularul prin care se solicită analiza microbiologică.p. trebuie să se realizeze în condiţii stricte de asepsie. frotiuri. ® vata poate conţine substanţe inhibitoare pentru microorganisme. prin tehnica de recoltare/vezi recoltarea urinei sau medical o „simplă" şi inutilă birocraţie. de ex. Regulile prezentate mai sus reprezintă elemente fundamentale în vederea obţinerii unui • elemente importante care trebuie notificate atunci când se solicită o analiză de labora­ diagnostic corect şi.

cu eliminarea rapidă a bulelor de aer şi „închiderea" • produse patologice pentru care este evidentă contaminarea (de ex. urină.p.p. o exsudat faringian. • în recipiente etanşe pe care se va lipi pietograma pentru „risc microbiologic". în cazul în care p. menţinut la +4°C) până în momentul (repetăm propoziţia de mai sus: p. exsudat nazal. dacă este duce la stabilirea identităţii p. prezenţa oxigenului.p.p. prezenţa substanţelor antimicrobiene. trebuie înţelese ca un • utilizarea mediilor de transport modifică aspectul citologie al p. se încearcă obţinerea datelor care pot fi la +4°C). posibil. datorită unui reci­ seringii cu ajutorul unui dop de cauciuc steril în care introducem imediat acul (atenţie la manevrarea acului de seringă în condiţiile recoltării unui produs pato­ pient de colectare necorespuzător) etc.p. spre exemplu în vederea identificării unui p.p. putea fi repetată şi urmată de trimiterea unui p. logic uman/risc de înţepare şi transmiterea altor infecţii ex. care a fost ®în anumite situaţii (rezistenţa microorganismului în mediul exterior este deosebit de recepţionat fără datele de identificare. recoltat chiar Ia nivelul laboratorului sunt recomandate ferm datorită următoarelor considerente. Atât laboratorul cât şi clinica au de îndeplinit funcţii foarte importante. precum şi prevenirea contaminării mediului în anumite situaţii.p. lichid în seringă. însă. se îndepărtează şi se va prelucra al doilea. solare în general. Haemophilus influenzae etc nu rezistă la aceste temperaturi. se poate accepta un timp de transport de 1-2 ore tativ. de menţionat că Neisseria meningitidis.p. Neisseria gonorhoeae.p.p.p. transportul şi ulterior prelucrarea p. care prezintă o anumită boală transmisibilă (infecţioasâ) nu există o subordonare ci o core­ • celelalte condiţii necesare supravieţuirii microorganismelor diferă în funcţie de lare a activităţilor. fiecare grup de microorganisme în parte (pH. gest normal atunci când anumite reguli de recoltare şi transport sunt neglijate. deshidratare.p./vezi capitolul 9) • spută recoltată pe parcursul a 24 de ore. în ceea ce priveşte transportul produselor patologice este semnificativă propoziţia urmă­ ® transportul către laborator se va realiza toare: produsele patologice trebuie să ajungă în laborator în cel mai scurt tim p posibil.. Stuart etc. împachetate în hârtie sterilă şi introduse într-o cutie Petri până la 48 de ore fără să necesite adăugarea de antibiotice). de această recomandare cu caracter general. în cazul în care poate recurge la „conservarea" acestuia după cum urmează nu este/posibiiă o nouă recoltare şi se estimează că prelucrarea p. desfăşoară într-un sistem în care există mai multe verigi care trebuie să funcţioneze perfect citologie etc) pentru a putea înregistra o „imagine" cât mai apropiată de ceea existen­ (fiecare în parte) iar între verigile sistemului ar trebui să existe o perfectă colaborare. regulă mai lesne decât microorganisţhele patogene). streptomicină şi cloramfenicol atunci când se urmăreşte o „spută11care de fapt conţine salivă şi secreţii din tractul respirator superior. Respingerea unui p. „la patul bolnavului" sau.p. respectiva probă nu trebuie prelucrată în laborator. chiar dacă sunt sesizate diferite disfuncţionalităţi în ceea ce priveşte extern sau a personalului care asigura recoltarea. nament atât din punct de vedere teoretic şi tehnic dar şi în ceea ce priveşte colaborarea din­ o microorganismele din flora asociată se pot miiltiplica în cursul transportului (de tre parteneri. Transportul cât mai raptd/sau prelucrarea imediată a unui p. corespunzător. • iar în cazul în care p. Iată câteva motive de respingere a unui produs patologic: • utilizarea unui mediu de transport (Cary Blair. a fost identificat dar este necorespunzător din punct de vedere cali­ • pentru foarte multe dintre p. tă la nivelul procesului infecţios în vederea stabilirii diagnosticului şi tratamentului corespunzător în cazul unui pacient • diferitele microorganisme au diferite temperaturi optime pentru supravieţuire. problemele pot fi rezolvate prin telefon sau o discuţie directă. de calitate. în cazul în care o nouă ®în cazul în care timpul de transport al p. • aspirarea p. trebuie expediat prin poştă se vor respecta normativele legale în vigoare precum şi recomandările speciale recunoscute la nivel inter­ naţional dintre care cele mai utilizate sunt elaborate de World Health Organization j . şi solicitarea de către laborator a recoltării unui nou p. materii fecale etc pentru care se solicită izolarea şi identificarea germenilor anâerobi. modul în care p.p. obţinute (cu rezervele de rigoare care vor fi menţionate în buletinul de analiză)..p.p. prelucrarea acestuia ar trebui temporizată (p.p.p. HIV) atunci când urmărim izolarea unei bacterii anaerobe care ar putea supravieţui în acest caz circa Transportul produselor patologice 30 de minute etc. radiaţii >UV sau radiaţii uneori decisive pentru viaţa pacientului. ®este necesară prevenirea contaminării p. Diagnosticul de laborator în microbiologie Norme privind prelevarea şi transportul produselor patologice 27 26 prezenta câteva exemple în acest sens dorim să subliniem faptul că activitatea medicală se « este necesară menţinerea condiţiei iniţiale a produsului patologic (conţinut microbian.. • adăugarea de penicilină.p. care să permită stabilirea diagnosticului microbiologic. în cazul în care această discuţie nu poate con­ redusă) se va recomanda recoltarea şi prelucrarea p. pacientul va fi invitat în laborator pentru recoltare. ar fi de discutat o serie de aspecte concrete. chiar necorespunzălor • menţinerea la temperatură scăzută (container izoterm cu gheaţă la 0°C sau frigider poate aduce vreun beneficiu pacientului examinat. nu poate respecta ceea ce este indicat se recoltare este posibilă primul p. spută. izolarea unui fung (agenţii etiologici ai micozelor cutanate superficiale pol rezista • urină recoltată cu mai mult de 60 de minute în urmă (care nu a fost menţinută la +4°C). a fost recoltat şi transportat către laborator.p. trebuie să ajungă în laborator în cel mai scurt timp în care se ia legătura cu medicul care a solicitat analiza şi se analizează dacă recoltarea ar posibil). Pentru ca în situaţiile „limită1*funcţionarea să fie perfectă este necesar un continuu antre­ fenomene de autoliză etc). Faţă • numai de către un curier instruit în acest scop.

circulară. iar în cazul în care acest lucru nu este posibil. cu faţa spre sursa de lumină şi gâtul în uşoară extensie de regulă. acceptabil în 1-2 ore). . lente. examinate la stereomicroscop (mărire 30). aspirat hipofaririgian. se realizează în câteva minute. aspirat pleural. • în diagnosticul microbiologic al infecţiilor acute ale căilor respiratorii inferioare (1ACRI) se pot examina Exemple de recoltare şi transport pentru câteva produse patologice ® prelevate care se pot contamina în cursul recoltării cu flora bacteriană normală: spută. recoltăm secreţia de la nivel faringian.p. » este de preferat utilizarea imediat a p. clătirea energică a gurii şi gargara cu apă (sau cu soluţie salină fiziologică). f 28 ___________ Diagnosticul de laborator în microbiologie Norme privind prelevarea şi transportul produselor patologice 29 (WHO). Fluidifierea (de ex. I ( t. cierea şi omogenizarea probei. tamponul va fi trimis către laborator în mediu de transport. probe citologie nesatisfăcătoare (sputa indusă ar putea fi utilă în izolarea ® ne aşezăm puţin lateral faţă de pacient pentru a evita contaminarea cu picături elimi­ Pneumocystis carinii). dar scade până la lucru nu este posibil. biopsie pulmonară pe torace ceva mai mici decât în cazul recoltării exsudatului faringian deschis. hemocukuri. apoi se examinează sedimentul.p. în cazul în care se presupune o infecţie mycobacteriană sau fungică este recomandată recoltarea şi prelucrarea a 3 produse. H. Menţinerea la o temperatură de » este de preferat utilizarea imediat a p. aspirat transtoracic. amigdalele pentru a sesiza care infectante prinsă în trama fibrinoasă a probei. Pacientul trebuie să înţeleagă diferenţa dintre „a expectora" şi „a tuşi şi scuipa". în 3 zile consecutive. conservă unii patogeni. bioptice se disecă mici fragmente suspecte cu volume de circa 1 mm care sunt apoi • 'un tampon va fi utilizat pentru însămânţare pe medii de cultură. sau în cel mult 1-3 ore. cu depozite.). trebuie să solicităm imediat prele­ « se recoltează preferabil dimineaţa înainte ca pacientul să mănânce şi fără să se fi spălat varea unei noi probe care să permită ulterior definitivarea diagnosticului. . Din probele ® un tampon va fi utilizat pentru examen microscopic direct. în majoritatea IACR1. aspirat bronhoscopie prin cateter protejat cu canule telesco- « utilizăm tampoane cu vată obişnuite uşor umezite cu soluţie salină fiziologică sterilă. ®pacientul stă pe scaun. influenzae. cu N-acetil-L-cis- sunt zonele inflamate (roşii. Center for Diseases Control and Prevention (CDC) sau National 3. Exsudate otice sau nazale recoltat prin bronhoscopie simplă etc şi/sau ®pacientul stă pe scaun. cu capac care permite o ®trebuie să evităm atingerea bazei limbii sau a palatului moale. în IACRi o pe dinţi. aspirat nazal/faringian. Ţesutul cazeos. 24 de ore). pate/lavaj bronhoalveolar. tamponul va fi trimis către laborator în mediu de transport. fără să fi utilizat gargarisme cu diferite soluţii (iar dacă aceste condiţii nu au probă mucopurulentă în volum de 2-3 ml ar putea fi suficientă. recoltarea se va face după minim 4 ore) • stimularea expectoraţiei prin inhalarea de aerosoli calzi cu soluţie salină (3%) oferă. patologic recoltat cel mai frecvent. N. pilierii. (îl rotim relativ ferm pe suprafeţele unde recomandabil să se recolteze prima spută eliminată matinal şi în nici un caz sputa din este prezent p. anulare şansa de izolarea a aitora (ex. probele fluide se concentrează prin cen­ ® utilizăm tampoane cu vată obişnuite trifugare 20 de minute la 3000 rot/min. fibros şi grăsimea ascund ®în cazul suspicionării difteriei se vor utiliza 3 tampoane. • înaintea prelevării se recomandă periajul simplu al dinţilor. în mod frecvent hifele iar tratarea cu KOH nu clarifică preparatul fiind necesară diso­ • solicităm pacientului să pronunţe „A“ şi printr-o mişcare de ştergere. fermă. nate în cursul unui eventual acces de tuse (de preferinţă vom purta mască şi ochelari). • spălarea sputei intens mucopurulente (în 3 băi succesive de soluţie salină izotonă) ® deprimăm baza limbii cu ajutorul unui apăsător de limbă steril şi în condiţii de ilu­ reduce contaminarea orofaringiană fără a influenţa semnificativ concentraţia bacteriei minare adecvată examinăm faringele posterior. • un tampon va fi utilizat pentru examen microscopic direct.. cu grijă înspre periferie şi recoltăm secreţia care există sub această structură). • cu toate că este contaminată cu flora normală orofaringiană. amigdalian insistând în zonele unde există • produsele patologice recoltate pentru diagnosticul microbiologic trebuie transmise ulceraţii. meningitidis). sunt etichetate şi expediate imediat la laborator pentru a fi examinate. cu faţa spre sursa de lumină (preferabil lumina naturală). produs 1. ulceraţii etc) şi eventualele depozite puru­ teină) permite omogenizarea produselor patologice. în cazul în care acest 4°C previne multiplicarea contaminanţilor.p. fost respectate. depozite (în căzui în care se remarcă prezenţa unei false membrane o detaşăm prompt către laborator (preferabil în maxim 1 oră. Exsudatul faringian i® clacă proba apare constituită în principal din salivă. biopsie transbronşicâ.p. Sputa Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) cu menţiunea că primele 2 pot fi obţinute în mod gratuit. Nu există modalităţi optime de conservare a probelor.. 2. sputa reprezintă produsul • un tampon va fi utilizat pentru însămânţare pe medii de cultură. ® prelevate care permit evitarea contaminării orofaringiane: aspirat transtraheal. • în cazul suspicionării unei infecţii fungice. închidere etanşă. • produsele recoltate într-un recoltor steril de 50-200 ml. corespunzătoare în momentul în care pacientul se prezintă în unitatea sanitară (este • tamponul trebuie încărcat cât mai bine cu p. tampon nazal/faringian. Se pot obţine probe calitativ ®în cazul suspicionării difteriei se vor utiliza 3 tampoane.

p. necesară o conservare prelungită. şi mai precis de numărarea leucocitelor polimor- retare sau. după exami­ al doilea pentru cultivare) sau. trebuie să înceapă „la patul bolnavului". cliiu. Sabouraud etc). Sângele (vezi capitolul 31) şi să revină în dimineaţa următoare. pneumoniae. * recoltarea p. atât fectate. în care nu avem o altă soluţie. atunci când este vorba de colecţii profunde. p.p. • un al motiv în favoarea unui transport şi o prelucrare foarte rapidă a LCR este • puroiul poate fi recoltat cu ansa bacteriologică. în materialul de faţă vom discuta doar o parte dintre acestea. 24 de ore dacă se utilizează mediul de transport pentru molicute. * în cazul în care nu se evidenţiază secreţie uretrală în mod spontan. rarea între clinică şi laborator trebuie să fie foarte bună. dintr-o colecţie profundă. competenţa de a executa această manevră (ex. U rina (vezi capitolul 29) titate prea mică. Lichidul cefalo-rahidian * sunt necesare tampoane de vată sterile (un tampon pentru examenul microscopic şi • se recoltează în cazul suspicionării prezenţei unui sindrom meningeal.p. îi vom recomanda să consume cât mai puţine lichide în restul zilei 7. izolarea M. recoltarea p. produsul • recomandăm recoltarea LCR în 2-3 tuburi sterile (2 tuburi vor fi centrifugate iar din al patologic poate fi conservat maxim 4 ore în lipsa unui mediu special şi până la maxim treilea tub se vor realiza testele biochimice şi alte teste utile pentru a sugera etiologia). i ( . abcese. prionice. dar în cazul recoltării jată de o mănuşă de latex. parazitare. există meningite infecţioase şi meningite neinfecţioase iar meningitele infecţioase pot * în acest scop sunt necesare tampoane de dimensiuni mai mici. în plus.putea fi recoltate în funcţie de manifestarea pregătiri speciale şi cel puţin utilizarea seringii care se „închide" cu dop (vezi mai sus). esenţiale pentru apreciare calităţii probei şi interpretarea rezultatelor citologice şi microbiologice astfel încât este de dorit recoltarea (la adult) a unei can­ sputoculturii. să nu uităm că intrauretrală cu tamponul (sau cu ansa). pentru elucidarea etiologiei nat de calciu (sau dacron în suspiciunea unei infecţii cu Chlamydia spp. flegmoane etc). cu mâna prote­ « tehnicile de asepsie trebuie să fie riguroase în toate situaţiile. alternativ o ansă bacteriologică sterilă. M ateriile fecale (vezi capitolul 28) respectată condiţia de mai sus iar după 2 ore de la micţionare secreţia este în can­ 6 . Diagnosticul de laborator în microbiologie & Norme privind prelevarea şi transportul produselor patologice 31 • utilizarea unui mediu de transport perturbă raportul dintre bacterii şi reperele citolo. sau la cei puţin 2 ore după aceasta. prin biopsiere. la bărbat o transportul către laborator se va realiza utilizând medii de transport sau containere spe­ ciale (pentru asigurarea anaerobiozei). înainte de micţiune. spre cutăm toate testele necesare fără a solicita repetarea puncţiei lombare. exemplu. medii 4. colabo­ minute după recoltare. Secreţii recoltate de la nivelul aparatului genital • atunci când suspicionăm o infecţie cu microorganisme anaerobe sunt necesare » există mai multe tipuri de secreţii care tu.p. în cazul în care ar fi dacă LCR este franc purulent. trebuie să se facă dimineaţa. stative pentru eprubete. • chiar dacă acest manual de lucrări practice se adresează numai infecţiilor bacteriene şi « dacă nici prin această manevră nu putem obţine p. exprimăm uretra utilizând degetul mare şi indexul şi LCR atenţia trebuie să fie şi mai sporită.p. p. cultivarea trebuie făcută cât mai rapid. Lowenstein. sau . fonucleare care încep să fie distruse în număr semnificativ încă din primele 30-60 • în special pentru situaţiile în care vom recolta p. este invazivă şi va trebui să fim în stare să exe­ mandat se poate utiliza mediul Stuart sau Amies. examenul microscopic direct se face fără centrifugare. neurologie. Puroiul de cultură diverse (agar-sânge. există germeni anaeobi care pot fi distruşi în câteva secunde de contact cu oxigenul. * se observă penisul şi . trebuie să privim lucrurile în ansamblul lor şi drept exemplu. în cazul în care se urmăreşte. trebuie să fie prelucrat în 1-2 ore. reprezentat de studiul citologic al p. • în cazul secreţiei uretrale. 8. unei meningite este necesară efectuarea unor examinări biochimice adiacente celor gice ale probei. vom recurge la recoltarea fungice.p. preferabil din algi- fi fungice. temperatură apropiată de temperatura corpului uman (în nici un caz la +4°C. virale. clinică.p. Haemophilus influenzae cât şi Neisseria meningitidis. transportul trebuie să se facă cât mai rapid şi la o tehnica de recoltare variază în funcţie de „originea" puroiului (arsuri şi plăgi suprain. dar în cazul în care se apreciază că se va depăşi timpul de transport reco­ tităţi de 5-10 ml LCR. medi­ cină internă etc) iar recoltarea se va face la patul bolnavului de către medicul care are * dacă există secreţie uretrală. recoltăm secreţia care apare. aceasta este recoltată cu tamponul (sau cu ansa). bacteriene. 9. este necesară utilizarea unei temperaturi de -70°C • în mod ideal. prin puncţie şi aspirare. înainte de micţiune. în cazul în care pacientul nu se prezintă dimineaţa şi nu este 5. prin puncţie lombară).meatul urinar precum şi dacă există secreţie uretrală • suspiciunea este ridicată de medicul de specialitate (boli infecţioase. agenţi etiologici recunoscuţi ai • este recomandat ca pentru recoltare să folosim tampoane cu vată sterile numai în cazul meningitelor bacteriene sunt distruşi prin refrigerare). pipeta Pasteur. cu alte cuvinte recoltarea şi procesarea (în nici un caz temperatura congelatorului obişnuit). LCR trebuie prelucrat imediat. • există numeroase condiţii clinice în care apar supuraţii (superficiale sau profunde) iar • dacă LCR urmează a fi transportai. recomandăm ca pe lângă trusa necesară manevrei de recoltare să avem la dispoziţie o spirtieră. semne de stază' mandabil ca ansa să aibă firul şi bucla de platină (sau ar putea fi o ansă bacterio­ logică de unică întrebuinţare) papilară). este reco­ narea fundului de ochi (verificăm presiunea în artera centrală a retinei.

=> . la .) se va utiliza • recoltăm p. păstrare în alcool 50%). LCR. • spre exemplu.•••nVm. este. aşa cum se întâmplă în cazul unor fungi dimorfij.p.. Recoltarea urinii.. r/'â-î microorganisme însă. • cel mai frecvent presăm uşor lamela pentru a elimina eventualele bule de aer. « atât scuamele cât şi alte structuri (fire de pâr. . produsului.p.. Există diferite tehnici prin care se poate pune în evidenţă prezenţa unor spp. p. în funcţie de localizare se pot recolta p. de ordinul micronilor. urină. tam­ Microorganismele studiate au dimensiuni foarte mici.p.. spălare. • dacă vrem să studiem spre exemplu mobilitatea microorganismelor care au format • se recomandă prelucrarea şi examinarea imediată (unii fungi sunt fragili. '■■■ ' . după introducerea blândă. • ’-.. Diferite p. t -ş. ) . încercat să dăm doar câteva exemple care sunt orientative.000. ■ ■c • în suspiciunea de gonoree se recomandă cultivarea imediat dupărecoltâre pe medi­ ul de cultură încălzit la 37°C. în funcţie de localizare India. al doilea tampon va fi inserat cu aproxima­ tiv 1 centimetru mai profund. 32 ______________________ Diagnosticul de laborator înmicrobiologie J PREPARATE MICROSCOPICE. astfel încât ponul cu p.. FROTIURI / • SI PRINCIPALELE COLORAŢII Mycoplasma spp. examinat etc.• colorate în funcţie de suspiciunea diagnostică. L. şi îl transmitem către laborator având grijă să prevenim deshidratarea ca atare. materii­ . ‘ . r '* vr .p. lucrare şi examinare în laborator (în maxitn 48 de ore). alteori are un rol orienta­ părtează secreţia de la nivelui colului extern.. i r \ ' . recoltate în suspiciunea unor infecţii fungice • este de preferat să folosim lame şi lamele noi supuse următoarelor proceduri succesive • în infecţiile fungice. Pentru cei interesaţi există ma­ nuale dedicate exclusiv recoltării şi transportului produselor patologice. . . lugol. între lamă şi lamelă) sau unor frotiuri fixate şi • în cazul secreţiilor cervicale. sediment urinar.p. Pentru trei dintre p. ţi. native.fu-.). după introducerea valVelor ginecologice şi exăminarelf vizuală a dusul patologic (etapa a 2-a) sau colonia apărută pe mediul de cultură (etapa a 4-a. • acoperim picătura cu o lamelă. i această temperatură depinde de fungul implicat şi poate varia de la ore la 2 /săp- _ fămâni.: > b. de micoză superficială. sau Mycoplasmaspp. va fi transmis laboratorului în mediu de transport (ex.âşnu. pentru Leptospira spp. î . • recoltarea se va face preferabil în 1primele-10 zile după ciclul menstruali pe masa în schema generală de diagnostic microbiologic (direct) vom examina microscopic pro­ ginecologică. pe lamă se va depune o picătură de soluţie lactofenol-albastru coton în care vom Aşa cum am menţionat. la femei Ai •. poate realiza. reţină şi • folosim 3 tampoane sterile introduse şi rotite uşor 1-2 centimetri în colul uterin (2 ulterior să aplice cele învăţate. f ii. ' • depunem pe lamă o picătură din produsul care urmează a fi studiat. în micozele cutanate superficiale • lamele se usucă (folosim o cârpă curată) apoi se degresează suplimentar prin Hambare (trecere de câteva ori prin flacăra becului Bunsen).p. cti ajutorul unor comprese'sterile se înde­ Uneori examenul microscopic este decisiv pentru diagnostic. streptomicină şi cloramfenicol pentru scop se va depune o picătură dintr-o soluţie. tru a putea înţelege care a fost situaţia in vivo). însă.. identificarea pe baza caracterelor morfotinctoriale). apă distilată sau bulion. de colonii pe un mediu solid vom descărca o ansă din colonie într-o picătură de soluţie dorit să putem evalua situaţia fungilor foarte aproape de momentul recoltării pen­ salină fiziologică. aşa cum vom discuta şi în capi­ cu cărbune activat pentru Neisseria gonorhoeae sau alte variante-pentru (j/xIdfiyciiq^ tolul următor.. 10-20% KOH-glicerol în care se va inhibarea multiplicării bacteriene şi menţinem pip. serozitate din şancru presupus sifilitic etc) va fi utilizat ca atare. punctul vaginului şi colului uterin. o dacă se remarcă o‘ secreţie purulerttă. Preparate microscopice proaspete (umede. dintre tampoane le vom Utiliza pentru frotiuri Gram şi Giemsa. tuş de • în micozele profunde. nigrozină etc. este recoltat într-o suspiciune. j «după antiseptizarea leziunii cu alcool medicinal (70°) raclăm tegumentul şi uti- I lizăm pentru examinare scuamele produse.. în microbiologic. ■ • dacă p.p. în cazul în care acest lucru nu se. între lamă şi lamelă) 10. chiar din al doilea an de studiu ar fi bine ca viitorii medici să înţeleagă. .« - tiv. .p.' " " l'" ' 1/ • dacă vrem să studiem aspectul fungilor filamentoşi (mucegaiuri) dintr-o colonie. foarte variate. Am descărca un fragment din periferia coloniei respective.. . penU-u o mai bună vizualizare putem adăuga albastru de metilen.»/. de mare utilitate este examenul microscopic care se poate adresa unor preparate microscopice proaspete (umede.t-. iar al treilea pentru cultivare procedând aşa Cum am menţionat mai sus).. indiferent de specialitatea pe care o vor urma. clătire. . ■■■ . lor fecale şi sângelui va fi discutată în partea specială. fragmente de unghie etc) se împa­ • dacă produsul patologic are consistenţă lichidiană (ex. . am ales o altă modalitate de prezentare. datele prezentate nu cuprind toate posibilităţile şi variantele.:k i . . • dacă cultura este realizată în mediu lichid (ex. •/■■■. mediul Amies pentru examinarea lor este necesară o mărire de circa 1..+4°C (supravieţuirea la descărca şi dispersa p. pe lama de micro­ • iar în caz contrar adăugăm penicilină. pe circa 2 centimetri lungime şi UTILIZATE ÎN MICR0BI0L0GIE rotirea intrauretral a primului tampon.. ma­ chetează în hârtie sterilă care se introduce într-o cutie Petri şi se trimite pentru pre­ terii fecale.. (imersare în amestec sulfo-cromic câteva zile.

cu consistenţă solidă sau din culturi microbiene Pentru colorarea frotiurilor obţinute din cultură vom folosi în special coloraţiile Gram.-w . Cei interesaţi . ' • în microscopia optică pe câmp luminos aşezăm preparatul pe platina microscopului şi . uscarea şi fixarea frotiului. încălzim uşor • Şupă ce am flambat lama. apoi cu obiectivul -20 sau4 0 (de regulă nu folosim v fluid de pe lamă. sau cultura este orientată în sus.p.anumită. coloranţi realizate în mediu de cultură l i c h i d ------. obiectivul de imersie).flambată în sus. o aşezăm cu partea. ./cultură şi depunem produsul în centrul lamei piciunea diagnostică şi p. "-ţ n. . clătire.utilizarea A. lamei.p. • frotiurile se pot realiza pornind de la produse patologice (recoltate de ja om sau de la • lama se poate aplica şi pe suprafaţa de secţiune a unor prelevate bioptice sau animale de experienţă) sau din cultura microbiană (în mediu lichid sau solid).Mlj.. recoltat într-o suspiciune de m icoză’superficială. cu o sensibilitate mai bună decât • în acest scop. . iar temperatura atinsă prin flambare nu trebuie să fie mai poziţie pentru studiu un bogat material teoretic iar după încheierea antrenamentului perso­ mare decât pe care o putem suporta.p. Loffier etc.: se pot folosi. o aşezăm cu partea flambată în sus Pentru colorarea frotiurilor din produs patologic folosim cel mai frecvent coloraţiile I • sterilizăm ansa bacteriologică şi aşteptăm să se răcească . obţinute prin necropsie. stativ de uscare). • albastru de metilen policrom pentru evidenţierea Bacillus anthracis în p. în strat cât mai subţire. Giemsa^ Gram şi după caz’.. însă cel mai frecvent folosim. .p. există metode chimice de fixare.şi alte tehnici microscopice. • cu ajutorul flaconului cu picurător sau. . având grijă să nu ne apropiem de mar­ coloraţia. u este de preferat să folosim lame şi lamele noi supuse următoarelor proceduri succesive (imersare în amestec sulfo-cromic câteva zile./fragmenţul de colonie îri picătura de fluid.au la. coloraţia Gimenez • întindem prin mişcări de „dute-vino" (de . • frotiul trebuie întins în strat cât mai subţire (preferabil în unistrat) : u • procedăm ca mai sus pentru uscarea şi fixarea frotiului. distrugând în acelaşi timp şi microorganismele (care pre­ corynebacterii sau înlocuind coloraţia de mai sus.Ţi iu tu. câte o p. apă distilată sau apă curentă pentru spălare. apă distilată..p.. fiecare va putea alege o variantă. . . ginile lamei/întinderea se poate face şi prin mişcări circulare.p. ca o modalitate de control. examinat se pot folosi şi alte coloraţii (de ex.p. experimental sau dusul prelevat. de 2-3 ori. . depunem în centrul iamei o picătură deşoluţie salină fiziologică sau.de situaţie. j nal în ceea ce priveşte realizarea de frotiuri şi coloraţii. ~~ . • procedăm ca mai sus pentru întinderea. realizate în mediu de cultură solid Ziehl-Neelsen şi alte coloraţii specifice. Ziehl-Neelsen. . . afinitate faţa de coloranţi.p. .M poate avea următoarele variante: treceri ale frotiului prin flacără) . pe deasupra 'flăcării becului Bunsen. -r— conform „reţetei" de colorare. vom utiliza această metodă. ' '•> • t *■•••» •• s . De ex. cu consistenţă fluidă sau din culturi microbiene în vederea colorării avem nevoie de o trusă pentru colorare (stativ de colorare. excentrice. C jP - • fixăm frotiul. • pfelpvăm aşeptic.haşurare“) pe axul lung al lamei pro­ pentru depistarea rickettsiilor pe amprente de organ de la animale infectate. zintă o afinitate tinctorială mai mare decât celulele vii)... . 1 ’ • Executarea frotiurilor din p. păstrare în alcool 50%) Colorarea frotiurilor ‘ 1 < • lamele se usucă (folosim o cârpă curată) apoi se degresează suplimentar prin flambate Există foarte numeroase metode de colorare a frotiurilor.cu ansa bacteriologică sterilizată şi.în cazul în care avem în dotare un dispozitiv • albastru de metilen Loffier pentru cele mai multe coloraţii simple sau ca un al doilea în care lama se poate aşeza şi usca la +70°C. jn funcţie de'sus­ « prelevăm aseptic p. . înainte de executarea frotiului) însă de această dată partea pe care am întins în cursul lucrărilor practice precum şi în manualul de faţă se va. permite examinarea şi diferenţierea bacteriilor sau fungilor în frotiuri. nu trebuie să mişcăm sau să presăm lamela. Dintre acestea vom prezenta (trecere.de câteva ori prin flacăra becului Bunsen) ' .'^‘albastru de toluidină pentru evidenţierea Pneumocystis cătinii). : preparatul prin trecere cu grijă. în cazul multora dintre coloraţiile uzuaie au fost realizate diferite modificări îp funcţie de • lăsăm lama să se usuce lângă becul de gaz (nu grăbim uscarea prin eventuale experienţa autorilor şi scopul urmărit. Structura peretelui microbian determină 9 ../un fragmenţ din colonie şj depunem produsul în picăţura de examinăm iniţial cu obiectivul 10. spori etc). . .R. capsulă.p.p. ' f ţ• • cu partea flambată atingem suprafaţa de secţiune a organului respectiv. după caz (coloraţii pentru cili. .răcită ®dacă vrem să studiem aspectul fungilor filamentoşi (mucegaiuri) dintr-o colonie. • sterilizăm ansa bacteriologică şi aşteptăm să se răcească. spălare.fyl. • Executarea frotiurilor din p. ■ doâr câteva dintre coloraţiile folosite mai frebveht.coloraţii folosite în microbiologie. pentru fixarea prin căldură. .'i cu albaştrii de metilen (A. * omogenizăm foarte Jbine p. discutamumai. trecem frotiul prin flacără (aşa cum am procedat şi pentru flambareji . coloraţia cti Ă. /• după ce am flambat lama. . atingem dosul variantă cu referire la principalele. ! % aplicabilă în funcţie. frotiuri şi principalele coloraţii utilizate în microbiologie 35 34 • în cazul p.p.. . • frotiijl fixat este gata pentru colorare. colorant în coloraţia Ziehl-Neelsen.dis- mâinii cu lama flambată. ... Diagnosticul de laborator în microbiologie Preparate microscopice. Frotiuri (preparate microscopice fixate şi colorate) u' ■ • Executarea amprentelor de organ/alte p. ceea ce • flambăm lama.. . • albastru de metilen (varianta Wayson) pentru p.

..întregime). 81 Ir. 11 : <du-.* 1.i.. o '. Timpul ele lucru este de 10 minute.■ o aşteptăm ca frotiul să se usuce şi examinăm cu un obiectiv intermediar.u • acoperim frotiul cu albastru de metilen. .t/i. notăm obsâfvaţiile/‘interpretăm.m vt$ • spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet.. ..nb'bmri lui. pentru 2-3 minute... ma.. . luni lorant lama în întregime). pentru J_-3 minute (nu are rost să acpperirtîcu CQlorantlamaîn. • examinăm la microscop. .•••(. • acoperim frotiul cu soluţie Giemsa.S'ţniMo * • punem frotiul uscat şi fixat pe un suport situat deasupra tăviţei.. fără a utiliza încălzirea în cursul r '-î/^ !.96°) pentar un timp foarte scurtj^-8 secunde. ‘ . .j—-n: ■i-v. ■■ \ (L Coloraţia Giemsa Mataugto -. —.ukswiiv»’ •. îwf»»*>{* t.r v .H-.i u. .de coitame. încă' 10 minute. plet şi aşteptăm 5 minute. pentru 10 minute.. 36 ■ Diagnosticul de laborator în microbiologie / Preparate microscopice.'i«y. G { O/ f Coloraţia Gram ) etapelor de colorare (coloraţie „la rece“).' •sou.până începe emiterea de fixarea frotiului nu se face „la cald“ ci chimic. V' . . 1 o acoperim frotiul cu soluţie May-Grtinwald^(diluată în părţi egale .' MV CVj. sugativă sau hârtie de. • îndepărtăm hârtia de filtru. . C oloraţia Kinyoun • f • examinăm la microscop/ notăm obseryaţiiIe.U*s i.i 7 . facilitând penetrarea colorantu­ cu sugativă sau hârtie de filtru... interpretăm.. <.u. • aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (Be preferat) sau grăbim uşparea prin ţaniponare cu sugativă sau hârtie de filtru.q /' :n«». rită complet cu fucsină. • recolorăm cu albastru de metilen.U.. • îndepărtăm lugoliil.q M -w C tu w v 'A V i .A Coloraţia Ziehl-Neelsen • spălăm cu apă distilată său apă de ld robinet. >.. . vărsăm • acoperim frotiul cu un amestec de alcooj-acetonăjl parte âcetonă/3 părţi alcool de amestecul decoloram şi repetăm operaţia pentru încă 30 secunde ■if. dacă colorarea • spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet. .:1 <• v.'iGaii. • şpălătn cu apă distilată sau apă de la robinet. •. interpretăm.: i'!n'.-interpretăm.rezistenţi (BAAR). . ®îndepărtăm colorantul.0. adăugăm colorant.>!> iofa. . fixator):pentru*£-3'minute.v/J vŢTÎămĂ uunliraiî U*:-*«wrfî / r • spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet. ■ 1 celulelor este mai slabă decât cea aşteptată acoperim din nou frotiul cu soluţie Giemsa. • adăugăm amestecul decolorant acid-alcool (3 ml acid clorhidric concentrat/97 ml « înclinăm lama şî scurgem soluţia colorantă (care are şi rol fixator).. . perioadă • scurgem lama şi aşteptăm evaporarea alcoolului metilic. notăm observaţiile. . pentru 3 minute. . " • spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet.. .iP. frotiuri şi principalele colora)ii uim-cuic m micr 37 ^Coloraţia cu albastru de metilen • examinăm la microscop. parte.xd » • acoperim complet lama cu fucsină bazică nediluată (fiiuutţt extemporaneu). 1 minut. ® spălăm insistent cu:ăpătdiStilată săti'apă'de lă'robineti ‘ vţri J jlfa.. 0^ . aşezăm frotiul în . 7 • spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet. în care repetăm dc^Hari operaţia de încălzire a lamei până lă emiterea de vapori. i. acoperim lama cu amestecul decoloram acid-alcool pentru circa 30 secunde.stativ pentru uscare.-li... i• ><• « examinăm la microscop. 1.-i. • acoperim frotiul cu soluţie de albastru de metilen. u v -><:î». • aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sad grăbim Usdarea prim tamponare şolubilizând peretele bacterian prin creşterea temperaturii. ţimp d e j ..(de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare • aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare ■: cu. şj.. alcool etilic 90-95°).*. fucsină)...c.. « acoperim frotiul cu lugol (mordant. pentru 1 minut (nu are rost să acoperim cu co­ • acoperimfrotiul cu fucsina diluată l/ld pentru' I m inut. interpretăm..cu tampon fosfat).. Este o coloraţie utilă în identificarea prezenţei de BAAR.. .. -j> i' jr /i m . cu sugativă sau hârtie de filtru. * examinăm la microscop.filtru. . 7. • spălăm cu tampon fosfat.. metilsau criştal yiolet (violet de genţiană din puncfcle..'.u. si. ’ . i f f O l liO f r i ( i .«:r ■ ou: . • acoperim lama complet cu o hârtie de filtru decupată în acest scop.. • ■> . • spălăm cu apă distilată sau apă de la robinet.x V^TTli. vedere • picurăm soluţie de fucsină fenicată Kinyoun până când hârtia de filtru se îmbibă com­ istoric). .r. B '. . ■) . . • aşezăm frotiul în stativ pentru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare < ri cu sugativă sau hârtie de filtru.n. • trecem becul de gaz aprins pe sub lama acoperită de fucsinăj.o.< -■■■ * wi. i. notăm observaţiile.. vapori (nu atingem temperatura de fierbere).' ._ .. . pentru -3-4 minute (nu are rost să ' ‘ acoperim cu colorant IamaBn întregime). în cazul în care lama nu mai este acope-l minut). ■■ Este o coloraţie utilă în identificarea prezenţei de barili acid-alcool.. '■ ! ' • spălăm cu tampon fosfat •> . j'/. notăm observaţiile. !<u:n<v<i u . . o diluăm într-un recipient fucsină (9 părţi apă distilată/!. .f . • acoperim frotiul cu violet de. w . ...'.{n«s synfiir. cii alcool meţiljc (de ex.

a se revedea capitolul 7). notăm observaţiile. pentru 6-9 secunde. pentru a putea fi văzute. Microscopul este un instrument absolut necesar în vederea stabilirii unui diagnostic bac­ • spălăm cu apă distilată. Microscopia electronică. lizate în cercetare. se disting pe fondul luminos fie prin opacitate. v. 2« simt • acoperim frotiul cu soluţia de fucsină fenicată preparată după reţeta Gimenez. în anumite situ­ • . logic indirect).. 38 Diagnosticul de laborator în microbiologie TEHNICA EXAMENULUI MICROSCOPIC Coloraţii fluorescente 0 # ÎN DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC Există mai multe variante. ■ i. microscopia cu contrast de fază sau la microscopia cu fluorescenţă. >.. razele cele mai îndepărtate de axă care mai pătrund încă în obiectiv. trachomatis sau Chlamydia spp.i. micrometrele sunt plăcuţe de sticlă pe care sunt marcate scale fin divizate.. incluziilor de Chlamydia şi răsturnate ale obiectului cu ajutorul unui sistem de lentile obiectiv şi de lentile ocular. Pentru a micşora • acoperim frotiul cu soluţie de verde malachit.oiw jsu i scopic utilizează microscopul optic (microscopia optică pe câmp luminos). Pot fi realizate şi măsurători cu ajutorul micrometrelor (utile mai mult în diagnosticul para- zitplogic). . 1.•> ■ .. • examinăm la microscop."prin preparat... _ Microscopul optic şi microscopia optică pe câmp luminos Coloraţia Gimenez ' . Este o coloraţie utilă în identificarea prezenţei deB Â A R !(sensibilitated-fescută). ■■■■?•• •<<:>. î .. pentru unde X reprezintă lungimea de undă a radiaţiei folosite. notăm observaţiile. alcool etilic. • examinăm la microscop.' aţii se poate recurge la microscopia cu fond negru. ... în care obiectele.r* . Distanţa minimă dintre două puncte ale unui obiect care mai pot fi văzute separat unul • acoperim iama cu xilol. în mod uzual examenul micro­ • spălăm cu a p ă 'd is til a tă .. pentru radiaţia ultra­ violetă se pot distinge obiecte cu dimensiuni de 0. de celalalt prin microscop este: • îndepărtăm xilolul.la robinet. inclusiv coloraţii în care se utilizează anticorpi marcaţi fluo­ rescent. ■. mărite infectate experimental sau în culturi precum şi pentru identificarea. . ppntru 2 ‘minute. . apă dis­ tilată). n sară o cameră obscură. după prezentarea microscopului optic (în câmp luminos). în aceste condiţii obţinându-se un câmp vizual puternic luminat. 0 .22A d = ----------- • îndepărtăm alcoolul. r j'V . n este indicele de refracţie al 1-2 minute.contracolorăm’v!cu soluţie de pertnangânat de potasiu. ! -tlhtfl • *» cu. pentru 2-3 minute. pentru 5 ‘rhinute. ' ' 1 !.'. interpretăm. r ..15 pm)./ •• . mera o serie de date privind structurile1care pot fi observatei’ . Microscopul formează imagini virtuale. de dimen­ siuni cunoscute. ii?. .-j în microscopia optică pe câmp luminos lumina este transmisă de-a lungul axului optic al instrumentului. iar u este unghiul dintre axa optică şi • spălăm insistent cu apă distilată sau apă de la robinet.' • mediul transparent dintre obiect şi obiectiv să aibă un indice de refracţie n cât mai în capitolul următor. ' < ■ .i teriologic direct (există tehnici de microscopie care pot fi utile şi în diagnosticul microbio­ • decolorăm c£t!amestec de1âcid-albbol..'fenol.!. • acoperim lama cu alcool etilic (96°).. Microscopul optic este un instrument care permite observarea obiectelor mai mici decât cele Este o coloraţie utilă în identificarea rickettsiilor pe amprente de organ de la animale care pot fi văzute cu ochiul liber (sau cu lupa). ' . . pentru 5 minute.tu. fucsină se picură pe frotiu printr-o pâlnie prevăzută cu o hârtie de filtru.. mediului străbătut de radiaţie între obiect şi ocular. . fie prin culoarea lor (în special după utilizarea unor tehnici de colorare .. !r. ® utilizarea unor radiaţii cu lungime de undă X cât mai mică (de ex. ' " • colorăm cu soluţie de atiramină O (amestec de ăuramină O.. • aşezăm frotiul în stativ pentru uscare. Există mai multe categorii de microscoape. de ex. în cazul utilizării ultimelor trei tipuri de microscop este nece­ • şpŞăm cu apăfdistilată sau apă de. această distanţă şi respectiv pentru a îmbunătăţi performanţele microsopului există mai multe metode dintre care vom menţiona două. vom enu­ mare (aşa cum se procedează în cazul microscopului cu imersie). l : ' r f ‘j" l : ' . interpretăm. Vom prezenta în continuare coloraţia fluorescentă cu auramină O. pentru 15 minute. microscopia protonică sau alte tehnici • aşezăm frotiul în stativ pepţru uscare (de preferat) sau grăbim uscarea prin tamponare sofisticate de microscopie nu fac obiectul materialului de faţă (aceste tehnici ar putea fi uti­ cu sugativă sau hârtie de filtru.Iis JJl ’ll ill 'li Ml. pentru a evidenţia inter-relaţia dintre bacterie şi bacteriofag). utilizate şi în studiul microbiologic: • spălăm insistent cti apă distilată sau apă de la robinet.. flhJi' ţi .-. a căror imagine se poate suprapune peste imaginea obiectului ele cercetat.

perm ite o. condesatorul se poate deplasa pe vertica­ dacă acestea sunt modificate. mai bună diferenţiere a detaliilor structuralei lamelă. granulaţii brune. microorganisme asociate. nucleu violaceu). se aşează pe platina microscopului şi se fixează cu ajutorul „cavalerilor**. în cazul bacteriilor capsulate. Obiec­ Centrăm zona pe care dorim să o examinăm. Cu ajutorul a 2 Trichomonas vaginalis etc. totală. V • neofornums. ■'/ (citoplasmă roz. în aşa fel încât se lizată cu grijă pentru a nu sparge frotiul. până prindem imaginea câmpului. Cryptococcus utilizăm în microbioiogie oculare cu puterea de mărire 10. Platina pre­ celule sanguine (leucocite. artroconidii. diafragrnul este semi deschîsi 'iâr fileicitoplasmă roz. foarte frecvent utilizate în microbioiogie.vinlet. ■ • j • frotiu colorat Giemsa/putqm vizualiza: hematii (roz-roşii). Frecvent late. cu blastoconidii).. .5 cm sub platină. aceasta se poate deplasa pe 2 direcţii perpendiculare. zintă un orificiu central care permite trecerea razelor luminoase şi orificii laterale în care epiteliali. un parte din razele trimise de obiect către lentila concavă se pierd prin fenomenul de reflexii: câmp în care sesizăm prezenţa leucocitelor). preparate umede realizate în Microscopul optic are urm ătoarele părţile componente: cazul suspicionării unei micoze cutanate superficiale etc 1. ' I Privim prin oculare şi rotim foarte încet macroviza ridicând foarte încet tubul micro­ 4. până atingem suprafaţa lamei realizând contactul şi cu uleiul de cedru. nucleu violaceu). . levuri (eventual înmugurite. aspectul zele de lumină. vezicale. leucocitari. Pierderea razelor de lumină datorită acestui fenomen se poate înlătura priit inter­ punerea între lamelă şi obiectiv a unei picături de ulei de cedru sau de alt lichid cu indice de Ridicăm tubul microscopului. Condensatorul contribuie în mod esenţial la luminozitatea imaginii. înainte de intrarea în condensator. Pe platina microscopului se aşeaza preparatul.’1care se pdt schimba uşor. poiimorfonucleare eozinofilq. Punem la punct imaginea cu âjutbriiî microVizei $ reglând carinii (nucleu roşu. uretrale etc). . Condensatorul este ridicat până sub platina microscopului şi are se petrece în cazul obiectivelor cu'imersie. situatîa capătul inferior al tubului. cilindrii urinari (hialini. sprijină platina microscopului. se acoperă' cir1'6 coloraţia cu A. ■'* • 'î "’ . în zona pe care refracţie/apropiat de cel al sticlei din care este făcută lentila frontală a obiectivului: aşa cum urmează să o examinăm. prezenţa leucocitelor şi tor deyine convergent. poate roti în jurul a două axe perpendiculare. Manevra trebuie rea­ lui.. este concentrată asupra obiectului. obiectivul. folosim macroviza şi coborâm obiectivul cu imersie (90x sau lOOx) Oglinda are rolul de a dirija razele de la sursa de lumină spre axul optic al microscopu. trebuie să putem deosebi un suport special care permite'montarea mâi multor obiective şi ihter-scliimbarea lor prin mişcarea reală de mişcarea browniană (oscilaţie pe loc a particulelor).M. diafragrnul deschis. Puterea separatoare ă microscopului este determinată de pu­ terea separatoare a obiectivului a cărui putere de mărire este cu atât mai mare cu cât distanţa © /EE xam inarea unui p rep arat fixat si colorat focală a acestuia este mat mîcă. prezintă o suprafaţă plană şi una concavă şi este fixată pe un suport. şi grosier cu ajutorul măcrovizei şi mai lent şi fin cu ajutorul microvizei. -1. urmărim rotire. prezenţa bacteriilor şi dispunerea acestora (ex. granular! etc). şuruburi ce se găsesc sub platformă. trec printr-un suport de filtre şi o diafragmă frotiurilor de sânge etc iris (diafragmă de apertură). formă. nucleu violaceu). intra sau extra- lă până când obiectul se gdseşfe în focarul fasciculului coriveigent care iese din condenbatof. obiectivul 40x este coborât până deaSupra lamelei (privind prin lateral).90x sau lQOx). suspensii de bacterii care se presupune că sunt mobile. • preparat montat în soluţie KOH/putem vizualiza: levuri (număr. examenul sedimentului urinar este foarte util.clară. sunt prinşi „cavalerii*1 cu ajutorul cărora preparatul este fixat pe platină. La capătulfstiperior • preparat colorat cu tuş de India (coloraţie „negativă“)/putem vizualiza: levuri capsu­ al tubulul se pot pune dcîtlarbcu diversb puteri de mărire. Privind din lateral. 3. Există obiective uscate (ex. alcătuit dintr-o masă metalică cu rol de susţinere. morfologia bacteriilor. Obiectivul 'este compus:dintr-un' sistein centrat de lentile aşŞizate într-uri tub metalic reperele aflate în vecinătatea microorganismelor etc. Cu-ajutorul microvizei punem lâ punct imaginea. alegem câmpul pe care îl vom examina ulterior cu obiectivul cu imersie (de ex. poiimorfonucleare neuţrp- Condensatorul este coborât circa 1. materii fecale provenind de la un pacient cu Părţile componente ale microscopului optic diaree. ex. 20x sau 40x) şi cu imersie (ex. fonne tioRce de Pneunwcysiis până apare câmpul microscopic.JOx. Tehnica examenului microscopic în diagnosticul microbiologic 41 40 Diagnosticul de laborator în microbioiogie Se pot examina astfel: sedimentul urinar.)/putem vizualiza: bacterii colorate în albas­ Examinarea folosind microscopul optic iîn câmp luminos tru închis. Tubul microscopului susţine ocularul şi. Procedăm ca mai sus utilizând obiectivul tivele uscate primesc fasciculul de lumină ce trebe prin preparat direct prin'aer. înconjurate de un halou clar pe fondul întunecat al preparatului. fasciculului paralel de raze de lumina care cade pe condensa­ Se pot examina: morfologia celulelor din produsul patologic. rotim foarte încet macroviza ridicând uşor tubul microscopului albastră. in. morfologia levurilor. morfologia unor paraziţi. dimensiuni). Histoplasma capsulai uni. hematii). eritrocitari. ii J într-o culoare albastru mai închis în timp ce citoplasmă apare Cu nuanţe de albastru. Piciorul microscopului. cristale urinare. granulaţii brune. celule diferite (în funcţie de sediul recoltării) şi celule inflamatorii pentru care nucleul apare . ■ Frotiul se aşează pe platina microscopului şi se fix’Saz îază cu ajutorul „cavalerilor**. Obiectivul se monteazăîn revolver. capsula va apărea ca un halou necolorat. Tubul poate fi deplasat mai rapid blastoconidii. pe care se • sediment urinar/putem_vizualiza: celule epiteliale (malpighiene. punem o picătură de ulei de cedru pe lamă. bacterii colorate în .'Ra­ leucocitar). Pe lamă se depil ne o picătură di n suspensia care Urmează a fi examinată. In citoplasmă lumina prin modificarea fantei condensatorului. astfel că o 40x. Exam inarea unui p re p a ra t proaspăti(între lamă. Revolverul este » în cazul în care se urmăreşte mobilitatea microorganismelor.M. citoplasmă albastră). • frotiu colorat cu albastru de metilen (A. pseudohife. Condensatorul este format din 2-3 lentile cu ajutorul cărora lumina reflectată de oglindă scopic. Dispozitivul de iluminare este format din oglindă şi condensator. 2. Pentru a obţine o imagine. limfocke şi macrofage (citoplasmă Privind prin oculare. care se înşurubează la revolver.şi temelă)kif.

Când obţinem imaginea numai bacili de culoare roşie. bacterii gram pozitive şi/sau gram nega­ platinei microscopului şi punem pe lentila condensatorului o picătură de glicerină. vom şterge lentila acestui obiec­ piese strict necesare.. cu mişcări de înşumbare şi flexie. întreţinerea microscopului Examinarea la microscopul cu fond negru este indicată în mod special pentru exami­ narea morfologiei şi mobilităţii pentru Treponema pallidum în serozitatea din şancrul sifili­ După terminarea examenului microscopic trebuie efectuate următoarele proceduri: tic sau pentru Leptospira spp. • acoperim microscopul cu o husă de plastic sau pânză. montată o placă de fază. .Ph“). spe­ Pentru acest tip de examinare este necesar să avem în dotarea microscopului o serie de cială. cu spire regulate. înainte ca obiectul să fie luminat. • scOatem lama (sau lama şi lamela) de pe platina microscopului. oculare de centrare. • preparatele fixate (pe care urmează să le păstrăm) se introduc într-un container cu xilol (1-2 minute) apoi. . re­ astfel încât să vină în contact cu glicerina de pe lentila condensatorului. foarte mobile. aceleaşi dimensiuni (excepţie Prbteus spp:). ■-J curgerii curentului de lichid ştim că am „prins" câmpul microscopic. o lampă din sticlă de cuarţ cu vapori de Hg care emite radiaţii ultraviolete). trebuie să înlocuim acest condensator cu condensatorul cardioid. tive. inelare. • în preparatul proaspăt care conţine leptospire putem vizualiza filamente luminoase. .2 milimetri). După centrarea diafragmei de câmp folosind obiectivul cu mărire 10x şi condensatorul • în cazul în care frotiul a fost realizat din produs patolojic putem vizualiza celule pentru câmp luminos. în produs patologic (ex. spi­ o preparatele proaspete le punem în borcanul cu amestec dezinfectant. în cazul colorării unui frotiu din cultură pură vom evidenţia suprafaţa lamelei. I cese. respectiv: un condensator special care include o serie de diafragme tiv cu un tifon foarte curat îmbibat în xilol). capete • coborâm condensatorul. apoi cu obiectivul 40x coborât până aproape de apar colorate albastru) etc. Lamele trebuie să aibă grosimea de 1 milimetru (distanţa focală a condensatorului fiind • frotiu colorat Gram. acesta este imer- (corpusculii reticulaţi apar albaştri. pătrund în obiectiv careapare luminos pe fondul întunecat al câmpului. • pentru a preveni efectul nedorit al multiplicării unor fungi asupra sistemului optic. grarb pozitive (colorate în violet)jjau gram negative (colorate în roşu). Se pot examina structuri citoplasmatice. lampă cu intensitate luminoasă mare. Condensatorul pentru câmp întunecat (fond negru) opreşte accesul spre obiectiv al razelor de lumină directe. Sunt cu o substanţă desicantă. pentru a o curăţa de uleiul de cedru (periodic. flexie. Astfel o pane dintre razele difractate şi reflectate de obiectul iluminat oblic radiaţii (de ex. Utilizând mai departe microviza punem la punct detaliile şi apoi înregistrăm ceea ce am examinat. fine. obiectivele de fază sunt gravate cu . corpusculii elementari apar roşii) etc. . spre exemplu silicagel. o anu­ Tehnica de examinare v . setul de filtre (caloric. • în cazul în care frotiul a fost realizat din cultură purăputem vizualiza micro-- organisme cu aceeaşi formă. condensatorul pentru fond întunecat. levurile se colorează în violet. 1 ! Pregătim preparatul proaspăt (între lamă şi lamelă) şi îl plasăm pe platina microscopului • frotiu colorat'Ziehl-Neelsen sau Kinyoun/putem vizualiza: bacili de culoareîoşie. fibrină şi levuri care se colorează în violet etc. pe fond negru. urină) sau din medii de cultură. ___ mită dispoziţie. '. ralate. putem vizualiza spirochete luminoase. pentru a-1 feri de praf. iar obiectul este ilu­ Microscopul cu fluorescenţă trebuie să fie dotat cu următoarele piese speciale: sursa de minat oblic. lungi. dar şi structuri bacteriene sau fungice. . • lichidul clar recoltat şi şancrul sifilitic trebuie examinat în maxim 20 minute după • ridicăm cu ajutorul macrovizei tubul microscopului. .• efilate. lativ fini (în cazul prezenţei BA'AR). sat într-o peliculă de lichid (lichid de imersie cu indice de refracţie mai ridicat. (o Folosind microscopia cu contrast de fază este posibilă observarea obiectelor transparente recomandare ar fi menţinerea microscopului într-un ambalaj de polietilenă împreună care prezintă variaţii de grosime sau variaţii ale indicelui de refracţie în structura lor. recoltare. de excitaţie. \ r » ~ < Q *> ( Diagnosticul de laborator în microbioiogie S Tehnica examenului microscopic în diagnosticul microbiologic celulelor fagocitare (levuri colorate în roşu). cu sau fără capsulă (halou necolorat). ex. Microscopul cu contrast de fază • ştergem lentila obiectivului cu imersie cu pulpa degetului sau cu o hârtie moale. Ridicăm condensatorul până la nivelul citoplasmă apar în diverse nuanţe de roşu. pe fond negru. incluziuni de Chlamydia trachomatis Pentru a evita reflexia totală a razelor. • închidem sursa de lumină. Faptul că aceste preparate nu sunt fixate şi co­ lorate permite examinarea unor caracteristici care ar putea fi alterate în cursul acestor pro­ Microscopul cu fond întunecat (negru). după evaporarea xilolului se pun într-o cutie. gliceri­ na). Pentru acest tip de examinare este utilizatun microscop optic obişnuit la care se adap­ tează o sursă de lumină cu intensitate mare şi un condensator cardioid (cu oglinzi sferice Microscopul cu fluorescentă concentrice). filtru verde. diferite (în funcţie de sediul recoltării) şi celule inflamatorii pentru care nucleul şi Condensatorul cardioid este cu diafragma închisă. alte bacterii (ne-AÂR) ' celule djferite (în funcţie de sediul recoltării) şi celule inflamatorii de culoare albastră (toate structurile ne-AAR Examinăm iniţial cu obiectivul 10x. Fixăm preparatul cu ajutorul „cavalerilor". cu mişcări de înşurubare. de baraj). cu posibilităţi de diafragmare a luminii. 1. c m: utilizate preparate microscopice proaspete. . punem la punct imaginea cu ajutorul microvizei. morfologia celulară. translaţie. obiective de fază (de fapt obiective obişnuite la care în planul focal superior a fost • curăţăm platina microscopului şi lentila condensatorului cu tifon curat îmbibat în xilol.

găină embrionate sau culturi de celule. Medii celulare (care includ celule vii) şi anume animale de laborator.'fii' :* *5?/ : î|î:Mî .. glicerina tamponată neutră) şi respectiv lame cu grosimea de ^milimetru.44 Diagnosticul de laborator în microbiologie Filtrele au următoarele roluri. . Clona reprezintă populaţia care rezultă dintr-o'singură celulă prin înmulţire Condensatorul măreşte contrastul imaginii mai bine decât un condensator obişnuit. Este chrofile sau termofile. ' ••• i • \ ) . Lumina vizibilă emisă rea unei populaţii microbiene suficiente cantitativ pentru investigaţiile propuse. : . Cultivarea lete absorb radiaţia excitantă.Utilizat. uti- 1izarea unui lichid‘de imersie care nu se usucă1uşor. mală" pierd energia acumulată emiţând radiaţii luminoase. . Mediile de cultură se pot clasifica după măi multe criterii.. microorganismele pot fi mezofile. intră în stare de excitaţie. Pentru fungi.(:%. j. după „iradiere" cu radiaţii ultravio­ pentru ca ulterior să i se poată studia caracterele fenotipice sau genotipice. acridin-oratij R sau tripaflavina.Alte exemple vor fi prezentate în cadrul capitolului 20.vşrf.. ' î • "••• . Cultivarea se realizează prin însămânţarea microorganismelor pe medii de cul­ tură. pre­ depinde de fluorocromul utilizat (spre exemplu culoarea este galbenă pentru auramina O.■ ii. temperatura optimă de dezvoltare este în jur de 28°C. . fluorescenţi).' (/: -jj: Există o foarte mare varietate de medii de cultură. t. fiecărei tulpini microbiene urmărite în cazul unui produs plurimicrobian în culturi Sun/de menţionat în mod special acele substanţe care se pot legă covalent de anticorpi. lumina emisă va avea culoare portocalie. v. Filtrele de excitaţie permit numai radiaţiilor cu lungime de undă mică (ex. Medii necelulare (artificiale. . Bacteriile studiate de microbiologia medicală sunt în imensa preferabilă utilizarea unui dispozitiv monocular. străin şi izolarea gaiben-portocalie pentru combinaţia de auramina O . tuberculozei sau al leprei. r :.• A'*. Filtrele de excitaţie şi de baraj sunt alese în funcţie de Populaţia = o multitudine de indivizi ai unei specii care habitează într-un anumit fluorocrcţinul.chimioterapice. ouă narea fiotiurilor colorate fluorescent sau imunofluorescent în diagnosticul bacteriologic al embrionate şi mai ales animale de experienţă folosim termenul „inoculare".ifi x»t :ţî<’«v-y..Fj Ţ . tivele acromate (cu menţiunea că obiectivul cu imersie trebuie să aibă diafragmă iris). venirea contaminării produsului cercetat cu un microorganism. '•*/ . Termenul „însămânţare" defineşte operaţia de introducere a unei cantităţi de ger­ Drept exemplu privind utilizarea microscopiei cu fluorescenţă vom menţiona exami­ meni într-un mediu de cultură artificială. Examinarea folosind microscopul cu fluorescentă Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecţii trebuie ca dintr-un produs Preparatele microscopice (care pot include bacterii) sunt tratate cu flurocromi (coloranţi recoltat de la pacient să obţinem mai întâi respectivul microorganism în cultură pură. de proprietatea de fluo­ în funcţie de temperatura de dezvoltare. iar dacă marcajul se realizează cu lisamin-rhodamină. şi•este lipsit. '■\ V. lor majoritate mezofile (au temperatura optimă 'de dezvoltare cuprinsă între 30- 37°C). tîfi' biotop. psi- rescentă (ex. f * *J: .rhodamină B etc). Nu există un mediu unic. ••• .. Totalitatea microor­ ganismelor acumulate prin multiplicarea într-un mediu de cultură poartă numele de cultură (bacteriană. Mediile solide sau lichide care asigură nutrienţii şi condiţiile fizico-chimice necesare creşterii şi multiplicării se numesc medii de cultură. Dintre fluorocromi ani putea Metodele de cultivare a bacteriilor sau fungilor urmăresc trei obiective: obţine­ aminti auramina O. M. monomicrobiene denumite „culturi pure". Filtrele de baraj sunt de fapt filtre de protecţie pentru că nu permit trecerea radiaţiilor de excitaţie nocive să treacă spre ocular şi respectiv spre ochiul examinatorului. ouă de . Tulpina = populaţia microbiană alcătuită din descendenţii unei singure Pentru examinarea În fluorescenţă mai suht. în primul rând. rhodamina B. Filtrul caloric absoarbe radiaţiile calorice emise de lampă MEDII DE CULTURA (sursa de radiaţii emite atât radiaţii ultraviolete cât şi radiaţii luminoase şi calorice). Fluorocrbmii sunt compuşi organici care. iar atunci când revin în „starea nor­ este esenţială şi pentru determinarea sensibilităţii la antibiotice şi. ultraviolete) su acceadă către preparatul microscopic. valabil pentru marcând astfel complexele antigen-anticorp care devin fluorescente. în funcţie de conţinutul în celule vii avem la dispoziţie: 1. ••• vegetativă.i. se realizează cu izotiocianat de fluoresceină lumina emisă va avea culoare verde. în timp ce pentru culturile celulare. Atunci când marcajul cultivarea oricărui microorganism.hecesare câteva elemente. respectiv obiec­ izolări în cultură pură. medii de f: i 2. fungică etc). în rocromi trece şi poate fi percepută. . Aceste radiaţii reprezintă radiaţii de excitaţie.

. Animalele de labora­ • linii celulare derivate din rinichi de maimuţă (Vero. HEp-2.să aibă un anumit pH (cel mai adesea între 7. BSC-1.. . Rickettsia spp. pentru 1 sau mai multe zile! Se poate utiliza această metodă pentru izolarea şi identificarea tulpinilor rickettsiene (utilizând .deM. găină embrionat se poate inocula intraembrionar (intramuscular. şobolanul.. în ‘condiţii de strictă asepsie puljde/ . laringe (HEp-2).să*!# sterile. nou-născuţi. H9 etc) etc. . spre exemplu în cazul Aşa cum. Klebsiella pneumoniae.. . este necesară uneori exacerbarea virulenţei.. Astfel se explică costurile ridi­ • linii celulare derivate din carcinom de col uterin (HeLa). în sacul alantoidian sau în sacul amniotic. metode imunologice. reacţia de microaglutinare).tip de „medii". prin pasaje repetate realizate pe gazde susceptibile.2-7. Oul inoculat se introduce în incubator. prezenţei unor eventuale modificări nedorite. tuberculosis varianta bovis). intrateşticuiar etc). adulţi) pe căi diferite de inoculare (per cutanat. HeLa. M edii artificiale (neceluiare) Shigella spp. ovar de hamster (CHO). Majoritatea bacteriilor. • lipii celulare limfoblastoide (MT-4. cai.alte condiţii. Pentru producerea de seruri imune sunt folosiţi. pentru Chlamydia pneumoniae se pot utilizat liniile celulare HeLa.6). cate în ceea ce priveşte acest. la 37°C în condiţii. spre exemplu. . 'Rickettsii. animale tinere. sate.. _ . . instilare la pentru Chlamydia psittaci se poate utiliza linia celulară McCoy etc. Având în vedere microorganismul inoculat... prin scarificare. Culturile primare derivă din dispersia enzimatică (de ex. Diagnosticul de laborator în microbiolcgie Medii de cultură 46 47 . subcutanat. cu tripsină-EDTA) a Gazdele vii (medii celulare) celulelor unui organ proaspăt recoltat şi pot fi menţinute in vitro pentru 3-5 pasaje. Liniile celulare continue (stabile) sunt Fie în situaţia microorganismelor care nu se dezvoltă pe medii artificiale. Oul de găină este întâi examinat la ovoscop pentru evaluarea embrionului şi j . 1!\ ■>' ' ■ r. McCoy.. Liniile celulare nivelul anumitor mucoase. cobaiul. se pot prepara mai uşor (folosind Chlamydia spp şi Candida spp. pot fi utile şi în vederea studierii efectului unor exotoxine. nu prezintă factori antimicrobi- eni în perioada în care se realizează în mod obişnuit inocularea (la 6-14 zile de . fungii Există posibilitatea utilizării unor culturi de organ sau a culturilor de celule disper­ şi unele protozoare se pot cultiva şi pe medii de cultură (necelulare. fie în populaţii celulare care derivă din ţesut normal sau malign şi pot fi subcultivate cazul în care se studiază caracterele de patogenitate. per os.să aibă o anumită presiune osmotică. Mediile de cultură artificiale sunt mai ieftine. în sens invers. Treponema pallidum. susceptibilitatea gazdei şi scopul Pentru Chlamydia trachomatis se pot utiliza liniile celulare BGMK. incubaţie). Tulpinile celulare reprezintă culturi cu un singur tip de celule (culturi omogene) şi Animalele de experienţă . intravenos. Are avantajul unui preţ mai scăzut. Acestea din urmă se pot clasifica în culturi primare. Au fost puse la punct foarte cia microbiană şi scopul urmărit: şoarecele alb. coli 0157:H7 şi respectiv de Shigella shiga se poate utiliza ce microorganismul este cultivat pe anumite medii de cultură (aspect dovedit şi prin linia celulară Vero în timp ce pentru toxinele produse de Vibrio cholerae şi E. . . să respecte o serie de şoarece (McCoy).să aibă umiditatea favorabilă multiplicării germenilor la nivelul membranei chorioalantoidiană. Există anumite microorganisme (ex. de bună ventilaţie a aeru­ Clasificarea mediilor de cultură artificiale lui şi umiditate corespunzătoare. ex . intramuscular.! . virulenţa Mycobacterium tuberculosis scade pe măsură toxinelor produse de E. coli obţinerea'tulpinii vaccinale BCG. .să fie nutritive (să conţină factorii de creştere necesari). sunt cel mai frecvent utilizate în practicat microbiologică. norme care să garanteze calitatea acestor gazde vii.. intracerebral. '!# entero-toxigen se poate utiliza linia celulară CHO.. . Chlamydii) care nu pot Culturi de celule fi cultivate decât pe substraturi care includ celule vii.. BGMK etc). Alte exemple pot fi discutate în raport cu Streptococcus pneumoniae. Mediile de cultură artificiale se pot clasifica după o serie de criterii. artificiale). se pot utiliza în funcţie de spe­ (respectând indicaţiile din protocol) în mod nelimitat. reţete foarte asemănătoare celor „de bucătărie" sau alte variante despre care vom Oul de găină embrionat discuta pe scurt în continuare) şi. < . tulpini celulare şi linii celulare.etc)/ . este în mod normal steril (în condiţiile pro­ Condiţii impuse mediilor de cultură artificiale: ducerii acestor „gazde vii“ în unităţi specializate). virusuri.s pot fi menţinute in vitro pentru 50-60 pasaje. hamsterul şi multe linii celulare spre exemplu: iepurele. fără a fi „ideale". urmărit se pot inocula animale cu vârste diferite (embrioni. tor necesită condiţii speciale de întreţinere iar biobaza trebuie.

Lowenstein. Stuart etc) t <■•. m ediile pot f i : : ••••:>••• r:. i ®simple (agar. ®lichide (apă peptonată alcalină. TSI (3 zaharuri şi fier).«. Funcţionează Descriere succintă pentru unele medii mai frecvent folosite concomitent ca mediu selectiv şi ca mediu electiv. Loffler. bulion Mueller-Hinton. • după scopul urmărit mediile de cultură artificiale pot f i i '' j. incubăm 2 plăci la -y 37°C timp de 48 de ore. Etapele generale pentru producerea unui mediu sunt asemă­ • semisolide (Cary-Blair. bulion simplu etc) • dizolvarea în apă distilată sau apă deionizată. laboratorul care le utilizează trebuie să le supună • selective (agar-sânge azid de sodiu. în general. situaţie în care este necesară doar adăugarea apei distilate. OCST etc) bilite conform reţetei. Agar-sânge plu un zahar) care poate fi sau nu metabolizat. mumv ■ • cântărirea ingredientelor. Pe câte o jumătate » există şi alte criterii de clasificare. Salmonella etc). OCST etc) V • diferenţiale (AABTL. agar-sânge. • solide (agar/geloză. Stuart etc) • sterilizarea (de regulă prin autoclavare). De exemplu. •■ nătoare: ® după com plexitatea ingredientelor. MIU. determinând modificarea pH-ului şi Include agar nutritiv bază care se dizolvă la temperatură ridicată şi prin agitare a culorii indicatorului sau modificarea aspectului culturii. alte medii) se păstrează în dulapuri. Gengou. bulion selenit. <.‘ • filtrarea. TCBS. mediile de cultură artificiale pot fi: pozitive (cum este E. mediul cu conservate la adăpost de lumina solară. ®de identificare (TSI. pentru a testa sterilitatea mediului agar-sânge. agarul cu în apă distilată. Mac Conkey. (" I Medii de cultura 49 1 48 Diagnosticul de laborator în microbiologie albastru de brom-timol lactozat (AABTL) permite diferenţierea bacteriilor lactozo- • după starea de agregare. ADCL. ®de transport (apă peptonată alcalină. ®cu umiditate obişnuită j o medii uscate (deshidratate) Există de asemenea medii gata pentru utilizare.î tulpină de colecţie Streptococcus pneumoniae. Tinsdale cu telurit de potasiu.. Indiferent de forma de condiţionare a mediilor de cultură precum şi indiferent de • Elective (Loffler etc) . cu ser coagulat de bou. Lowenstein. caracterele coloniilor şi respec­ te bacterii (de exemplu mediul Loffler. ■•■. "■■■•/ Mediul diferenţial conţine un indicator de pH şi un anumit substrat (de exeln. Alte exemple: ADCL (agar dezoxicolat citrat lactoză). mediile de cultură după producere şi până în momentul utilizării sunt tarea altor bacterii decât cea a cărei izolare se urmăreşte.! j întuneric şi temperatura camerei. De exemplu. La . toate mediile de cultură erau preparate în laborator. nu trebuie să apară modificări macroscopice. Pentru a testa o de îmbogăţire (apă peptonată alcalină. Sabouraud. agar-sânge. MIU. BSA. mediile pot fi: distilate şi demineralizate (conform recomandărilor producătorului). ii: . AABTL. Prin conţinutul său în substanţe antimicrbbiene. MIU. Mueller-Hinton etc) ' . Mueller-Hinton. din ingredientele sta­ sânge. în folie de plastic închisă ermetici telurit de potasiu pentru izolarea bacilului difteric sau medii îri care includem antibi­ Mediile pentru anaerobi (bulion tioglicolat. de placă vom cultiva o tulpină de colecţie de Streptococcus pyogenes şi respectiv o i. la otice (faţă de care bacteria care se doreşte a fi izolată este rezistentă). medii cu antibiotice etc) * . agar cu factori X şi V. autoclavăm (15 minute la 121°C) şi apoi răcim până la 50°C. coli) de bacteriile lactozo negative (Shigella.TSI etc) (mobilitate indol uree). bulion tioglicolat. controlului de calitate. 1 Spre exemplu. bulion nutritiv.: ■ :. pentru barilul difteric). inhibând dezvoltarea florei de asociaţie dintr-un produs patologic. Chapman. Bordet-Gengou. Chapman. modul de procurare al acestora. . mediul selectiv inhibă dezvol-. condiţionate în plăci Petri sau tuburi. Bordet-Gengou. • medii speciale: . flacoane etc. Mediul de îm bogăţire favorizează înmulţirea anumitor 'bacterii patogene. TCBS etc): performanţa mediului (eficienţa biologică) utilizăm o alta placă. selenit. Middlebrook 7H9. tiv caracterele hemolizei produse. o complexe (agar-sânge. Cary-Blair. . Sabouraud etc) • repartizarea în tuburi. condiţionarea şi sterilizarea prin autoclavare sau metoda recomandată pentru mediul respectiv. incubăm placa Petri pentru 18-24 Mediul electiv conţine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltării unei anumi­ ore la 35-37°C şi apoi analizăm dezvoltarea culturii.TSI. ADCL. MIU Loffler. +4°C. • de izolare (agar-sânge. Bordet- • verificarea pH-ului şi ajustarea la pH-ul corect. truse API etc) în momentul de faţă foarte frecvent se recurge la cumpărare de medii deshidra­ o de conservare (agar nutritiv în coloană etc) tate. bulion. geloză-chocolat. Iniţial. bulion. demineralizate sau • după conţinutul în apă.

sângele de om ar putea fi utilizat numai dacă nu Lowenstein-Jensen există o altă posibilitate. astfel eritrocitele vor elibera factorii nutritivi necesari dezvoltării unor.6-9. înainte de Bulion selenit /. Neisseria gonorrhoeae) şi o soluţie tamponată de săruri anorganice. Se poate conserva la temperatura frigiderului pentru nu mai mult de 4 săptămâni. care conţine deja mediul de cultură răcit şi însămânţat. conul cu mediu în baie de apă şi menţinem timp de 10 minute la 80°C. Datorită riscurilor acest ipediu nu va 1 tice (cloramfenicol. I de pH). Introducem fla­ ratura frigiderului câteva luni. dizolvate (prin încălzire şi agitare) în apă distilată. glicerofosfat de sodiu. . plăcile cu mediu Sabouraud pot fi stocate la temperatura frigiderului pen­ Este un mediu de îmbogăţire. După ajustarea pH-ului la 5. De multe ori acest mediu devine selectiv prin adăugare de antibio­ printre alte componente selenit acid de sodiu. Când temperatura revine la 50°C turnăm mediul în plăci Petri. hidrolizat de cazeină. săruri biliare. urmează fierberea şi filtrarea mediului. Distribuim mediul în condiţii aseptice. bacterii mâi pretenţioase din M ac Conkey punct de vedere nutritiv. Sterilizarea mediului turnat în tuburi se face în baia vom discuta în cadrul capitolelor 12 şi 28. până la utilizare. Este un mediu utilizat pentru transportul probelor în care se suspectează prezenţa Medii pentru fungi Vibrio cholerae.Ss . ■_ . răsturnată pe capacul propriu. ' . tioglicolat de sodiu. Acesta include glucoză. Poate fi menţinut la +4°C până la 4 săptămâni. . folosind de exemplu sânge care a depăşit limita de vala­ bilitate într-o bancă de sânge). Valabilitatea este de circa 6 dizolvă prin uşoară agitare. 121°C). Include i tru circa 2 luni. dizolvate în apă distilată şi autoclavate timp de 15 Amies minute la 121 °C. mediul de cultură Apă peptonată alcalină este incubat în vederea obţinerii coloniilor. berbec. roşu neutru (indicator . Apoi are loc repartizarea în plăci Petri sau în tuburi şi acestea se autoclavează timp de 15 minute la 12i°C.defibri nat (sânge de Cary-Blair este un mediu de transport în special pentru germeni gram negativi. talc. Mediul este coagulat în pantă. bacteriile pot supravieţui 1-3 zile. Nu conţine indicator redox. 2-8 săptămâni). principale: o soluţie de săruri şi amidon. lactozâ. lată. Se poate conserva la tem­ Stuart peratura frigiderului timp de 6 luni. clorură de calciu şi Cary-Blair albastru de metilen. Este sterilizat prin Există mai multe tehnici pentru a asigura condiţiile de anaerobioză.» . la 85°C şi după răcire se poate menţine la tempe­ Procedăm ca mai sus. până la obţinerea amestecului de agar-sânge. Este sterilizat prin autoclavare şi poate fi menţinut la +4°C timp de 2-3 luni. respectiv mediul distilată. cristal violet şi agar. / Include agar. utilizat pentru izolarea Salmonella spp. Diagnosticul de laborator în microbiologie Medii de cultură 50 51 această temperatură adaugăm în proporţie de 5% sângele .. de ex. Sterilizăm prin autoclavare (15 minute. de apă la temperatura de fierbere şi nu prin autoclavare. dizolvate prin încălzire la temperatura de fierbere în apă disti­ . digestie pancreatică de cazeină şi agar care se tuburi. frecvent se utilizează montarea plăcii Petri. Este un mediu slab selectivo-diferenţial care include hidrolizat de gelatină. în plăci Petri. poate fi conservat la temperatura frigiderului mai multe luni. tioglicolat de sodiu.0. Este sterilizat prin autoclavare şi Este un mediu de transport universal. Include 3 componente Poate fi menţinut la +4°C până la 4 şăptărrţâpi... Reprezintă mediul clasic utilizat în mycobacteriologie.. Relativ autoclavare şi poate fi menţinut la -f4°C timp de 12 luni. la cald. După solidificarea parafinei. j Include agar. cărbune farmaceutic neutru (pentru a facilita Medii pentru anaerobi supravieţuirea microorganismelor fragile. Mediul este repartizat în Sabouraud. gentamincină etc). Utilizăm parafină fonni de contaminare (ceea ce nu se realizează prin folosirea mediului Stuart). ţinând cont de timpul lung de incubare. utilizare. soluţia de verde malachit şi omogenizatul de ouă (proaspete şi bine antiseptizate). bou sau de iepure. tioglicolat de sodiu şi o soluţie tamponată de săruri anorganice. cal. /■: ■ • • încălzită pentru a etanşeiza placa. pe care se găseşte un pliculeţ care Este un mediu de transport care limitează şi multiplicarea unor eventuali coli- conţine amestec reducător (pirogalol. la cald. în apă distilată. Include peptonă şi clorură de sodiu dizolvate prin încălzire în apă Vom discuta pe scurt doar un mediu mai frecvent utilizat. cu ajustarea pH-ului la o valoare de 8. După filtrare produsul se repartizează în Agar-chocolat ! tuburi (cu capac înşurubat. clorură de sodiu. Include agar. .6 luni (la temperatura de 4°Q. carbonat de potasiu).inhaleze Despre mediile multitest TSI (triple sugar iron) şi MIU (mobilitate indol uree) sau înghită această substanţă. iar cei care îl produc vor avea grijă să nu. fi pregătit de femei însărcinate.

: cu ansa bacteriologică în capitolele următoare (11-13) vom pfezema o parte din elementele care defi­ însămânţarea „în pentagon deschis" a mediului solid aflat într.ee trebuie prescris unui . în vederea obţinerii de cultură pură.pipeta Pasteur. V:1. iar în capitolul 14 folosind ansa bacteriologică. în capitolul 6. Pentru a corela noţiunile pe care le vom prezenta cu ceea ce a fost prezentat în Este esenţial să se înţeleagă necesitatea obţinerii coloniilor izolate precum şi a capitolele anterioare. din ţara'noastră (capitolul 1). . . în • în capitolul 5 am discutat schema generală a diagnosticului microbiologic. şă permită compararea rezultatelor la nivel. pentru obţinerea de cplonii bacteriene izolate. bacteria izolată este sensibilă). Nu există un mediu unic. tehnicile de cultivare urm ăresc trei fi obiective: • obţinerea unei populaţii microbiene suficiente cantitativ pentru scopul propus. în capitolul 9.ansa bacteriologică. . la un produs patologic recoltat şi transportat către laborator într-o eprubetă/tub închis cu dop de vată include următoarele etape: unui diagnostic corect microbiologic. şi chimioterapice (antibacteriene sau antifungice) cu ajutorul cărora. . i încălzirea până la incandescenţă („la roşu") a buclei şi firului urmată de flambarea e substraturile pe care se poate realiza a treia şi respectiv a patra etapă (câteva portansei.-o placă Petri nesc complexitatea etapei de identificare ţ microorganismelor. >> pornind de la coloniile obţinute se vor face repicări pe medii de cultură neselective..alte tehnici de însămânţare. pe când celelalte ustensile pentru însămânţare vor fi sterilizate prin alte dintre caracterele examinate). • prima etapă a diagnosticului direct (bacteriologic sau micologic). O bţinerea de colonii bacteriene izolate dintr-un produs patologic se poate reali­ să realizeze protecţia pacienţilor.i) & (bacteria izolată de la un pacient cu o presupusă boală infecţioasă) precum şi la efec­ o conduita în laborator şi a nOnnelor de protecţie a muncii (capitolul 2). în capitolele următoare am discutat: . Toate acestea trebuie înţelese în contextul unei activităţi care să prevină erorile.tamponul de vată montat pe o tijă.bagheta de sticlă în form ă de „L“ . aceasta va fi utilizată în vederea identificării agentului etiologic • acest diagnostic nu poate fi realizat în lipsa cunoştinţelor privind . clinică românească şi să crească încrederea tuturor partenerilor din sistemul sanitar . să contribuie la realizarea unei standardizări în microbiologia •rii.. după încheierea de.(capitolul 4). putem stabili în mod ştiinţific tratamentul andmicrobian. ubhV. în capitolul de faţă vom avea în vedere o parte dintre tehnicile indispensabile diagnosticului microbiologic în general.. este necesar ca placa Petri cu mediu de cultură pe care dorim să facem cultivarea să fie menţi- . î • tuarea antibiogramei în vederea stabilirii tratamentului „ţintit" (antibioticul la care • echipamentul şi aparatura necesare (capitolul 3).. • utilizarea examenului microscopic în a doua şi respectiv în a patra etapă (de Ansa bacteriologică trebuie sterilizată înainte şi după fiecare utilizare a sa prin identificare) a diagnosticului direct (capitolele 7 şi 8). Pornind de la aceste noţiuni de bază.t 1 : fi . cazul în care coloniile izolate reprezintă o cultură pură (formată din acelaşi tip de f : microorganism). facem următoarele menţiuni: culturilor pure în diagnosticul de laborator bacteriologic şi micologic (direct). • dezinfecţiaşi sterilizarea. metode (vezi capitolul 4). .anumit pacient care prezintă o boală infec-. ® prevenirea contaminării produsului cercetat cu alte microorganisme şi • •i • izolarea fiecărei tulpini microbiene urmărite în cazul unui produs plurimicro- Tehnicile de cultivare se folosesc pentru obţinerea de colonii izolate prin însă- mânţareă produsului patologic pe medii solide şi pentru repicarea coloniilor izolate bian în culturi monomicrobiene denumite „culturi pure". / • atenţie: pe suprafaţa mediului de cultură poate'exista lichid de condens care ar putea facilita contaminarea culturii bacteriene. • atenţie: toate activităţile se desfăşoară în stricta vecinătate a becului de gaz! ţioasă de etiologic bacteriană sau fungică. precum şi în alte situaţii:1' rinh. A şa cum am m enţionat şi în capitolul 9. O Tehnici de cultivare 53 TEHNICI DE CULTIVARE v. în situaţia în care nu s-a reuşit obţinerea culturii pure. 1 1 . subliniind utilizarea acestora în a treia şi ă Obţinerea coloniilor izolate prin epuizarea inoculului patra etapă de diagnostic. pornind vom discuta o parte dintre modalităţile de stabilire a sensibilităţii la antibiotice. naţio­ #i za prin epuizarea inoculului pe m ediile de cultură folosind: ■) nal şi internaţional. . valabil pentru cultivarea oricărui microorganism.

!?'■!. a Tehnica descrisă este o tehnică de bază şi cu anumite modificări se poate utiliza şi în alte situaţii (spre exemplu atunci când produsul patologic este recoltat în alte mediului de lucru sau a celui care manipulează produsul patologic! •' / tipuri de recipiente).('.'-/î jj nisme inhibate datorită selectivităţii mediului. Diagnosticul de laborator în microbiologie 1 0 Tehnici de cultivare 55 54 nută în termostat.şi tipul produsului (tipuţ produsului ppaţe. ■. prin flacără de 2-3 ori). ■■ .-•îlltlj' . va duce la contaminarea dopului şi respectiv la o mare probabili­ tagonului deschis" se vor obţine colonii izolate..mon. : . o după ce eprubetă a fost aşezată în stativ. tate de contaminarea a celui care va utiliza ulterior eprubeta/tubul cu pro­ Dacă mediul de cultură pe care s-a realizat cultivarea „în pentagon deschis" este dus patologic! . p -vT. în cazul • se montează dopul la eprubetă printr-o mişcare de răsucire ce are ca scop ' în care cultura primară este obţinută pe un mediu selectiv. porţiuni cu aspect purulent).: mică. întredeschisă. după care ansa se va dreptaci. este obligatorie repicarea fixarea lui.. ■.v . . ' • se va proceda la fel ca mai sus şi pentru următoarele laturi având grijă să nu se • atenţie: să nu se scape dopuldin mână = pericol de contaminare'a mesei unească ultima latură cu prima latură delucru! ■ ■ ■ '■ . neînsămânţat.fi. : V 'liio : .. • se notează pe placa cu. pe prima latură se va obţine cea mai importantă canti- • se scoate ansa fără sa atingem pereţii sau gura eprubetei. microorganismului suspectat (pentru cele mai multe bacterii termostatul va fi ( reglat pentru o temperatură de 35-37°C... coloniile izolate obţinute pot fi utilizate în etapele ulterioare (identificare • se flambează gura eprubetei. 'i •/.. lângă peretele exterior al plăcii Petri). ansa • atenţie: dopul nu trebuie strâns îii podul pâlniei = pericol de cbntâniinare! este „reîncărcată" cu microorganisme. ® tot cu mâna stângă se va deschide placa iar cu ansa încărcată cu produs pato- . . . recoltând fragmente care ar putea include cu o mai mare probabilitate bacterii implicate în procesul infecţios (ex. prin diferite metode.eu produs patologic în.(în. mâna. j. bruşte cu ansa încărcată cu produs patologic. se răceşte bucla pe pereţii eprubetei în vecinătatea produsu­ nată (cu mediul în sus şi capacul în jos).în careTiind tagonului intersectând-o pe prima. pentru fungi la 28°C).de flambarea portansei (trecere • se închide placa Petri. sp scoate steriliza din nou.. răstur­ • se introduce ansa în eprubetă fără să se atingă gura sau pereţii acesteia în partea superioară. pe următoarele laturi se va • atenţie: contaminarea pereţilor eprubetei în porţiunea în care se va.. portansa se flambează. inclus. ansa bacteriologică este ţinută în mâna drgaptă.. numărul de identifi­ • se răceşte ansa (se poate încerca răcirea ei prin atingere pe suprafaţa mediului care . dopul eprubetei utilizând în acest scop degetele 4-5 de la . tot ca „linii paralele".v '■ "Jl! o în momentul intersectării cu ansa a laturii precedente a poligonului. cu mediul în sus. ' 1 incandescenţă a buclei şi firului ansei urmat . ca un „zig-zag“ densului! (fără a se ridica ansa de pe mediul de cultură) reprezentând o primă latură a '• se sterilizează ansa bacteriologică la flacăra becului de gaz prin aducerea la unui pentagon deschis.. la temperatura optimă multiplicării lui patologic şi se încarcă bucla ansei din profunzimea produsului patologic. disemi­ • se flambează gura eprubetei (trecere prin flacără de 2-3 ori. până ce se va ajunge la câteva celule microbiepe izolate care. • se introduce placa Petri pe care a fost realizată cultivarea în termostat. • după o perioadă de incubare de 18-24 ore (pentru cele mai multe dintre micro­ organismele studiate). i.. . coloniilor izolate deoarece coloniile izolate vizibile pot fi asociate cu microorga­ • atenţie: gura eprubetei poate fi fierbinte după flambare! -vrji.ifc..i * n i 'V. -i .cazul. mâna (jlreapţă.v ■■■ • ansa se sterilizează la flacără. pentru evaporarea con­ logic se vor trasa linii (striuri) aproximativ paralele între ele. remarca „scăderea cantitativă" a culturii iar cel puţin pe ultima latură a „pen­ ta“ dopul. mişcările bruşte şi'hecoritro| late pot determina contaminarea cu produs patologic a mesei de lucru. mediu de cultură data! inoculării. cate nu se văd cu ochiul liber sau cu lupa şi care se vor multiplica pe mediile de identificare făcând Imposibilă inter­ • atenţie: în toată această perioadă se contraindică efectuarea unor mişcărf pretarea rezultatelor. m âna stângă eliberată va lua o placă Petri pe care o va aşeza pe m asă cu capacul în jo s şi m ediul în sus. neselecti v. . ca un creion).printij-un simbol în solid steril.vi . >1. . dar în „cantitate" din ce în ce mai i. •. stângă . .. . .■'. numărul unic de identificare)...‘ i. • fără să se mai încarce ansa cu produs patologic se trasează a doua latură a pen­ • se iareprubeta... :• “ li. ‘ ym: •" nate pe placă vor da naştere la colonii microbiene izolate uşoara mişcare de rotire m ambple sensuri). •... tate de cultură (cultură microbiană confluentă).. imprimând o • „ . . testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapiqe).

-' •r. atingând mediul şi „urcând" prin • notăm pe placa cu mediu de cultură data inoculării..izolate prin răm ân valabile. plu vom înmulţi numărul de colonii cu 1000 dacă am utilizat pentru însă­ ® prelevăm cit ansa p. . m enţionate la tehnica Alte tehnici de cultivare (însămânţare) obţinerii coloniilor izolate prin epuizarea inocului cu ansa bacteriologică Am ales pentru o prezentare am ănunţită tehnica obţiiierii cploniilpr. pe toate feţele p e un cadran al plăcii. dintre care vom prezenta două). urm ând • respectând regulile lucrului aseptic. încă din al doilea an de studiu). epuizarea inoculului cu ansa bacteriologică (însăm ânţarea „în pentagon deschis") • scoatem tam ponul din tubul protector cu primele trei degete de la mâna deoarece considerăm că această reprezintă o tehnică esenţială. urm ând ca să • urina recoltată corespunzător (vezi capitolele 6 şi 29)' se omogenizează prin dispersăm produsul cu o baghetă de sticlă în „L“. scopuriîn. . celui de al doilea tub ş. de cultură pură. ® din motive economice putem să realizăm însămânţarea în mod asemănător a ® fără să încărcăm din nou ansa cu p.p. tru 0. r. în continuare vom prezenta alte tehnici de cultivare. pe toate feţele pe 6 rază. • flam băm gura tubului protector şi îl aşezam p e un stativ.pentru /cul­ o singură dată cu am estecul de m icroorganism e. încărcat cu produs patologic (există mai m ulte m odalităţi de descărcare a • putem utiliza anse de platină sau anse de unică folosinţă pentru: 0.>■/.. apoi epuizăm inoculul pe toată suprafaţa plăcii în striuri perpendi­ culare pe striul „de descărcare". .ţ. pentru econom ie. care poate fi reţinută dreaptă.t.urocultura şi în. aproximarea • tot cu m âna stângă deschidem placa iar cu dreapta descărcăm tam ponul numărului de microorganisme dezvoltate pe mediul de cultură este utilă. într-un şir de eprubete cu tivarea unui produs patologic (exsudat faringian etc).. numărul de identificare descrierea unor striu ri în zig-zag. • însămânţarea cu tamponul poate fi folosită şi pentru.d. -<■ s ‘* • cu m âna stângă luăm o placă Petri (caic nu mai prezintă lichid d e condens în s ă m â n ţa r e a cu a n s a c a lib ra tă interior) pe care o aşezăm pe m asă cu capacul în jo s şi m ediul în sus. o descărcăm în picătura de condens a urinei pe o jumătate sau chiar pe o pătrime de placă. . : .nu vom mai nota această etapă la prezentarea mânţăm num ai câteva celule m icrobiene. pe toată suprafaţa plăcii. « descărcăm tam ponul prin rulare. ® descărcăm tam ponul prin rulare. alte lucruri cu im portanţă generală. se • pe o placă Petri cu mediul de cultură se descarcă urina în striu. • constă în efectuarea unei serii de însăm ânţări cu ansa bacteriologică încărcată • vom prezenta în continuare vârianttr. de colonii izolate. înclinăm eprubetele pentru a „scălda" suprafaţa mediului • aceste tehnici se pot folosi atât pornind de la produs patologic (metodă prefe­ înclinat. ■■ .01 sau pen­ tam ponului. paralel pe suprafaţa urinei şi să prelevăm p. diametre. realizând în acest mod rată în unele laboratoare) cât şi de la colonii care sunt utilizate pentru obţinerea dispersia m icroorganism elor din picătura de inocul. în final.p. cu picătura respectivă de lichid de condens. ■ i! T e h n ic a d ilu ţiilo r succesive în lich id u l d e co n d en s al m e d iilo r solide • după incubare. răsturnarea de câteva ori a recipientului de recoltare (închis etanş).utilizează tamponul. prim ului tub. poatei utiliza pentru.-.. m etoda „pentagonului deschis" (după însuşirea tehnicii. cu mişcări de zig-zag. l ( t Diagnosticul de laborator în microbiologie Tehnici de cultivare 57 56 fiecare dată.a. pe unul dintre poate realiza cultivarea pe jum ătatea unei plăci). din care vor apărea după incubare următoarelor tehnici dar menţionăm acum faptul că este obligatdrie..p.iA::'. însămânţarea cu tamponul sau cu bagheta de sticlă în “L” ® după însăm ânţare. H ® însăm ânţăm pornind de la baza eprubetei.:-J> .. pe suprafaţa m ediului. în ziua următoare vom număra coloniile apărute şi spre exem­ • mediul de cultură este turnat în eprubete sau tuburi. ca în să putem să punem bucla ansei. presupunând că suntem geloză înclinată. ■ ::.alte. . a plăcii. fără a steriliza sau a reîncărca ansa bacteriologică p e parcurs dreptaci . utilizăm mai m ulte eprubete. sterilă.m . şi îl descărcăm în picătura de lichid de condens al mânţare ansa de 0.-. pentru fiecare eprubetă în parte şi tipul produsului (tipul produsului poate fi inclus printr-un simbol in nu­ o realizăm astfel o „epuizare" a conţinutului ansei.care.-. . ® se.j#■•. înclinăm recipientul de colectare în aşa fel încât ca să dispersăm produsul cu ansa bacteriologică în celelalte cadrane.. fără a epuiza toate variantele posibile. ajungând să însă­ mărul unic de identificare) .■. realizarea antibiogramei T e h n ic a ep u iz ă rii an sei p e m ed ii solide difuzimetrice. .001 ml.001 ml/calibrul anselor de platină trebuie verificat în fiecare lună.. .în: care se.

) se pot a pipetei). " fiecare eprubetă). lizării în m odul urm ător: rupem hârtia chiar la mijlocul pipetei. v ■.1 ml lichid din tubul 1 şi introducem ® pentru a preleva p. i . baie d e apă. seruri. a tulpinilor de colecţie. a tulpinilor de referinţă. iar tu­ fectantă. fără a se atinge Baza tu­ aceeaşi pipetă o cantitate constantă soluţie salină fiziologică (ex. schim băm pipeta şi în mediul lichid sau solid. cu capacul întredeschis. reco ltat în mod • toate pipetările se realizează cu ajutorul dispozitivului adaptat la pipeta. tie care se term ină cu un capăt răsucit liber (corespunde porţiunii superioare ® produsele lichide (în special sânge pentru hemocultură dar şi alte p. apoi se înclină în m o d 're p etat placa pentru însăm ânţarea uniform ă a suprafeţei m ediului. d u p ă caz) • cu o . MIU etc) etc. sau a unei anse cu. pentru • după încărcarea pipetei cu cultura pură.9 ml în bului. din recipientul de transport precum şi pentru însămânţare acest lichid în tubul 2. lungimea prin flacără. aşa cum am m enţionat mai sus. apoi punem pipeta se pune în o înainte de a folosi pipeta. Diagnosticul de laborator în microbiologic Tehnici de cultivare 58 5.p. 2. p rin „ in u n d a re " • utilizarea m ediilor selective sau a m ediilor de îm bogăţire. • excesul de inocul se aspiră cu pipeta Pasteur şi se descarcă în soluţia dezin­ o în funcţie de scopul urmărit există anumite variante ale acestei tehnici. • spre exemplu în cazul însămânţării mediului TSI •<••• ■■ '••••? Tehnica diiuţiilor succesive în medii lichide ® se utilizează tuburi de dimensiuni mici. aşa introducem inoculul în prim a eprubetă. • luăm o nouă pipetă cu care aspirăm 0. printr-o m işcare de răsucire în sens opus a celor două m âini. j corespunzător şi suspensionat în bulion V F (m ediu anaerob) din care se • pipeta va fi menţinută timp de 24 ore în amestecul sulfo-cromic. Metode chimice în s ă m â n ţa r e a cu p ip e ta . de câteva ori pentru om ogenizarea suspensiei.p. pentru verificarea sensibilităţii la bacteriofag (lizotipie) etc. ■>>•■■■■ • în acest scop folosim un şir de eprubete. • ulterior se însămânţează partea „înclinată** prin realizarea unor striuri în e pipetele gradate sterile şi îm pachetate în hârtie se desfac în m om entul uti­ zig-zag. un tub fiind de 3 ml.1 ml din cantitatea de suspensie m icrobiană şi e la deschiderea şi închiderea recipientelor flambăm gura fiecăruia în parte. aspirăm şi elim inăm lichidul din pipetă cum am prezentat mai sus. • metoda se poate utiliza pentru conservarea culturilor pure ale unor tulpini con­ siderate reprezentative. diferă (respectând protocolul de lucru corespunzător).. introducem pipeta în amestecul sulfo-cromic 1. o vom flamba prin tre­ am estec sulfocrom ic. tate a hârtiei fără a atinge partea efilată a pipetei şi astfel pipeta răm âne sterilă pentru lucru.o buclă mică’(după caz).p. 0. Metode fizice şi aspirăm soluţia dezinfectantă până aproape de dopul de vată al pipetei.7 ®după încheierea însămânţării eliminăm lichidul rămas eventual în pipetă în fla­ Câteva tehnici de izolare speciale conul cu amestec sulfo-cromic.1 ml p e care îi elim inăm în am estecul dezinfectant. deşi sterilizată în prealabil. scoatem a doua ju m ă­ însămânţa direct cu seringa cu care s-a făcut recoltarea. .(este contraindir repetăm m anevra p ân ă la ultimul tub. în toate eprubetele repartizăm cu « iniţial se însămânţează partea „dreaptă1*prin înţepare. de care vom ţine pipeta în tim pul lucrului. • se preferă utilizarea unei anse fir. ■ . fagi etc. j • încălzirea în. altă pipetă prelevăm 0. ■■i. cantitatea ele mediu utilizată pentru • poate fi folosită pentru diluare unor suspensii antigenice.9 în s ă m â n ţa r e a p r in în ţe p a r e a m e d iu lu i t u r n a t în tu b u ri sa u e p ru b e te • se poate fold?! pentru depunerea inocuiului în vederea realizării antibiogram ei difuzim etrice. inoculul se descarcă pe suprafaţa însămânţarea unor medii multitest (TSI. < a mediului solid din placa Petri. din ultim ul tub scoatem 0. în s ă m â n ţa r e a c u p ip e ta (P a s te u r sa u p ip e ta g r a d a tă . doreşte izolarea unor germ enii sporulaţi anaerobi. folosim un pipetor cât de simplu.. cere pe aproape toată. burile (eprubetele) utilizate au dimensiuni diferite §i o cantitate de mediu care • placa se lasă apoi lângă flacără pentru uscare. cată aspirarea cu gura). • reprezintă o variantă a tehnicii prezentate mâi sus.. tragem partea de hâr­ în s ă m â n ţa r e a cu se rin g a ■■■. tim p de 10 m inute la 8Q°C a p. atingând suprafaţa mediului.

germ enii însăm ânţaţi în suprafaţă produc colonii.--'' ‘fj" tem peratura optim ă de dezvoltarea în ju ra i a 28-30°C. ' .\\ . . şoarecele face o infecţie septicemică t u pneumococ. din sânge..:! :f| ţAi)' i U’ . I Definiţii şi alte aspecte teoretice A C o lo n ia izo lată «: Pe medii solide. .• 3. Pentru bacteriile care ? . tehnica însăm ânţării prin dispersie (cu ansa bacteriologică sau cu tam ponul).!.'s\i f'V '•' i. i. r. METABOLICE 1 1 • PRECUM SI A ALTOR CARACTERE FENOTIPICE « adăugarea la 1 ml de p. cord. au : Vv::y. .-s • [■y !. m odalităţi de identificare sau de ori­ entare în alegerea algoritm ului de identificare. produsul rezultat se însăm ânţează pe m edii anae­ robe... E. recoltat în mod corespunzător (şi suspensionat în bulion V F) a 1 m l de alcool etilic de >95° urm ată de agitarea tubului tim p de o îl UTILE ÎN IDENTIFICAREA MICROORGANISMELOR oră la tem peratura cam erei.■ discuta şi despre alte caractere microbiene. ■ I Diagnosticul de laborator în microbiologies ! 60 EXAMINAREA CARACTERELOR DE CULTURĂ. Pentru bacteriile strict anaerobe este '. • bacterii nepretenţioase (care se pot cultiva pe medii sim ple ex.. de exem plu pentru izolarea unor germ eni. jşi VlfbN. ficat etc. Coloniile izolate se pot obţine de exem plu prin . O li/Aiţ colonie este o clonă bacteriană..'h. h D ezvoltarea m icroorganism elor pe medii de cultură poate perm ite evaluarea '1 1 anum itor aspecte m acroscopice sau m icroscopice (ex.?«:• .. schem ă am încercat să „evoluăm ".ţr': : lv• M "■ .. scopic a coloniilor izolate). Metode biologice V '(* 'm u ' '< tu.. de patogenitate. aşa cum a fost prezentat în capitolul 10. în acest capitol vom continua discutarea celei de a 4-a etape a diagnosticului direct (care include şi verificarea din punct d e vedere m icro­ • se poate izola o cultură pură de pneumococ.. iar unele din­ izolate de la pacienţii cu boli transmisibile. îm preună cu o lum ânare aprinsă. . m etabolice. în condiţiile necesare pentru d ezvoltarea culturii. ■><<■'■ y f II m icrobiologic'1 şi pe această.»i •<*» } i: . ® necesităţile specifice în vederea cultivării.\ AmîV/. adăugând treptat O după 1-4 zile de la inoculare. m ai precis caracterele de cultură.. M ajoritatea speciilor bacteriene se dezvoltă şi ..splină. la şoarecele . coli) .ţ ■.p. strict necesară pentru identificarea m icroorganism elor A plicarea acestor tehnici va fi discutată în capitolelor urm ătoare. a inocularea sputei în care se suspectează .. . V■ . .. t i noi date teoretice şi practice. Aj... ■ .cadrul1lucrărilor If Iniţial vom relua câteva definiţii şi elem ente teoretice urm ând ca m ai departe să p ractice.) care pot reprezenta. în capitolul 5 am prezentat „Schem a generală a diagnosticului de laborator alb. Caracterele de cultură includ: M.■■it Incubarea constă în m enţinerea m ediilor de cultură însăm ânţate. pneumoniae.prezenţa S. câteva noţiuni privind carac­ terele biochim ice. Colonia este IJS totalitatea bacteriilor rezultate din m ultiplicarea unei singure celule bacteriene. în special levuri. după caz. duc la apariţia unei culturi în circa 18-24 de ore de incubare la tem peratura optimă i. 1.a ’‘ ' ■' i de dezvoltare asigurată în term ostat (de regulă 35-37°C).s a necesită o atm osferă de 3-5% CO 2 (carboxifile). în cursul lucrărilor practice se va J.u ■.î' . n . i ! ■' 'iH'ţ ii'1 a !>. yk v a *• *• î necesară incubarea în anaerobioză..sporulaţi. . O m are parte dintre fungi.:. il}VO• 5 prezentăm principalele caractere studiate în unele dintre sub-etapele acestui m om ent diagnostic. tre tehnici vor putea fi executate sau prezentate dertiohstrativ în . plăcile cultivate se vor pune în exsicator. coloniile produse de Myco­ plasma spp.

de peste 2 mm aşa cum se form ează în cu exam inarea făcută cu ajutorul unei lupe sau a unui stereom icroscop pentru a cazul Staphylococcus spp. pyogenes). pyogenes etc). » mediul este clar cu apariţia unui depozit floconos aderent la baza tubului (B. ■•■■ ■ i Diagnosticul de laborator în microbiologie 1 I Examinarea caracterelor de cultură. atenţie şi experienţă. Listeria monocytogenes. spre lor de dim ensiuni mici sau foarte mici. acum inat. papilat). 0 tem peratura optim ă de cultivare (20-30°C pentru. invadând mediul în valuri etc). * 24-48 ore pentru m ajoritatea fungilor. m icro.). suprafaţa mediului (de exem plu bacilul difteric sau bacilul. R“ pot lăsa mediul lim pede. etc şi foarte mici. cholerae în apă peptonată alcalină). iar ilu­ m inarea ţnediuiui care urm ează a fi „citit“ se va face cel puţin şi în incidenţă oblică. lobate. dendritică. filamentoasă.se. strict anaerobe (Clostridium spp. pneumoniae etc sau în cazul ievarilor.S“ tulbură om ogen m ediul (m ajoritatea bacteriilor) în tim p ce tulpinile care • reliefu l (plat. Aspectul co loniilor variază în funcţie de m icroorganism ul im plicat. prafaţa m ediului (ex. circulare. ■ : ‘ • mediul este clar. acoperite cu miceliu pufos. « 18-24 ore pentru m ajoritatea bacteriilor. la su­ aeroftle (Campylobacter spp. ia suprafaţă (ex. • aspectul.. iar la suprafaţă se dezvoltă o m em brană groasă. cu ajutorul ansei bacteriologice). uscată. ® mediul este clar. ondulate. . rugoasă. ® mediul este clar. ' / © c u lo a re a (pigm entate.. neregulată. um edă.. Haemophilus influenzae). Pentru a obţine cele mai entează spre alte testări necesare.. sau al mediului. în anum ite cazuri sugerează diagnosticul. întregi. adăugarea în m edii a unor factori de creştere ex. necesită tuturor caracterelor). neregulate. Vom prezenta câteva exem ple. B acteriile strict aerobe se dezvoltă preponderent la suprafaţa. © dezvoltarea culturii se realizează ca un „inel“ aderent de'pereţii tubului. în urm a dezvoltării m icroorganism elor în medii de cultură lichide se mai pot nepignientaţe. Pseudomonas aeruginosa) sau utilizând simţul de culoare din m ediu). 42°C pentru Campylobacter jejuni.. 3 5 -3 T C pentru m ajoritatea bacteriilor. lucioasă. i generaţie. lenticulară). m enţionând că există şi variaţii dc la regulă: . fără a perm ite diferenţieri de specie definitive (dar au utilitate în contextul studierii Exam inarea culturilor/coloniilor izolate este un proces foarte im portant. aureus. o consistenţa. exem plu în cazul Streptococcus viridanS. a altor caractere fenotipice 63 « bacterii pretenţioase (care necesită medii com plexe.. S. Aspectul culturilor pe medii solide » săptăm âni pentru Mycobacterium tuberculosis etc. © m ediul este clar cu dezvoltarea unei m em brane uscate. . un m iros de corn ars « o p a c ita te a (transparente. Bacillus subtilis). a d e re n ţa la mediu (examinate de ex. / • . granulară. in cazul closlridiilor). metabolice. circulară. . sau Ureaplasma Spp. burându-1. om bilicat. aerobe facultativ anaerobe (E.rin funcţie . tul. zim ţate.de tim pul de anthracis). plisată (M. m ici. S. opace)..). m ucoidă. coli). B acteriile şi fungii facultativ anaerobi se dezvoltă în toată m asa de lichid. bombat. m ată.m ediului. etc). îm bogăţite sau/şi • mediul este tulburat om ogen (ex. cu văl la suprafaţă (V. filamentoa. T re b u ie să e x a m in ă m u rm ă to a re le elem en te: Exam inarea se poate face cu ocfiiul liber (cel puţin iniţial) dar ar trebui com pletată • d im e n siu n e a (coloniile pot fi'm ari. | tuberculosis). Se acceptă că de obicei tulpinile care pe m ediile solide form ează colonii d e tip © fo rm a (punctiform ă. » bacterii strict aerobe (Bordetella pertussis). • intervalul de tim p pentru apariţia coloniilor izolate. cu depozit grunjos pe pereţi şi la baza tubului (ex. dar întotdeauna ori­ cunoaşterea teoriei. . * 28-30°C pentru unele levuri etc). „V ariantele » s u p r a f a ţa (netedă. aşa cum se întâm plă în cazul Mycoplasma A apnctui c u ltu rilo r p e m e d ii lich id e spp. tuberculos). bune rezultate este necesară o bună ilum inare (preferabil lum ina naturală). bacteriilor. de putea înregistra toate aspectele im portante şi pentru a putea sesiza apariţia colonii­ circa 1-2 mm pentru m ulte dintre bacteriile studiate. medii. care se pot exam i­ na cu ajutorul stereom icroscopului. form ează colonii de tip „R “ realizează o tulburare mai puţin om ogenă.. coli. pneumoniae etc). . carboxifile (S. olfactiv se. E. papilată. • m a rg in ile (regulate.). m ult exerciţiu. erodate. .. C ondiţiile de cu ltiv are şi aspectul culturii sunt caractere cheie în identificarea o m odificările apărute pe m ediu în vecinătatea coloniilor/culturii etc. S. form ând flocoane care se depun sau un strat (văl) ţâ zbârcită. acest caracter depinde de pigm enţii produşi sau/şi d e indicatori rem arca şi pigm entogeneza (ex.. convex. Staphylococcus spp. pigm entarea este la nivelul coloniei. sem itransparente. consistenţa şi aderenţa coloniilor/culturii. sub 1 m m . pufoasă etc). . poate constata apariţia unui miros caracteristic (ex. K. .

) la obţinerea în 24 ore a unei Aspergillus niger .colonii iniţial albe care devin albastre-verzui unui tub cu geloză înclinată incubat în poziţie verticală va conduce (în cazul sau albastre. a altor caractere fenotipice 65 ® a lte c a ra c te re . marginile E xistă num eroase teste care perm it investigarea acestor caractere ale m icroor­ sunt crenelate (zimţate). Stăietură antigenică nu este caracteristică. în cazul în care tulpinile im plicate aparţin genului Proteus. care se va dezvolta „în valuri suprapuse" până (a circumferinţă. p. în capitolul 11 vom m ai dis­ cuta şi despre câteva dintre testele care evidenţiază caractere d e patogenitate ale C olonia M (m ucoid) este m are. la 28-30°C după circa 7 zile. aspect care poate/fi caracteristic în cazul izolării unei tulpini de Bacillus anthracis. „căţărate". C. pyogenes. S. P ig m en to g en eza aparţine acestui gen la periferia unei plăci Petri cu mediu sim plu (agarizat V. berbec. în citoplasm ă). pigm entul galben-citrin la S. „dem arcaţie" cu dezvoltarea unei „pânze continue" de cultură ( I Aspergillus deflectus .'v1. colonii pufoase p ot apărea şi în cursul dez­ adesea aspect strălucitor.' se m ediile de cultură cu sânge.care în p. diphteriae). 1. Candida albicans etc). care vor fi prezentate în continuare. ■W: este difuzibil în mediu. va ( 64 Diagnosticul de laborator în microbiologie I s Examinarea caracterelor de cultură. sau de altă culoare nile se vor dezvolta invadând până la un punct în apropierea liniei de întâlnire. pro­ ducerea unor enzim e cu caracter de toxine etc). pe anum ite medii ■'v1: condiţiile de cultivare. o bacterie foarte mobilă. dacă tulpinile nu sunt diferite va avea loc „creşterea în valuri" fără au culoare albă. M ajoritatea bacteriilor studiate precum şi levurile form ea­ Caractere metabolice ză colonii de tip S (S. suprafaţa ei prezintă rugozităţi. Aspergillus • fenom enul de. bacteriile pot fi crom ofore (pigm entul este legat a fenom enul „liniei de dem arcaţie". de exem plu la Pseudomonas aeruginosa). tiosulfat de sodiu etc). ganism elor. iniţial albe. cultivarea unui produs patologic în lichidul de condens a) M ' :. dacă m ucos. de tip „R“. P ro d u c e re a u n o r hem o lizin e • apariţia coloniilor în „cap de m eduză"/„coam ă de leu".colonii iniţial albe care devin brun negre păstrând o culoare albă pe culturi pure de Proteus. Poate reprezenta un elem ent util pentru identificare (de selective. paracrom ofore (pigmentul este prezent în perete sau în stratul dem iologice. cu ajutorul unei lupe. coloniile de Coccidioides immitis dezvoltă un m iceliu aerian. reprezintă o variantă de izolare în cultură pură a uneţ tulpini de Proteus. G erm enii capsulaţi îşi'p ăstrează capsula. cresc şi acoperă în câteva zile suprafaţa m ediului. um edă. reprezintă un caracter de identificare prelim inară pen­ tru Proteus spp. • apariţia coloniilor pufoase. H em oliza are diferite aspecte în funcţie de m ecanism ul pot observa prelungiri ondulate care au dus la denum irile m enţionate m ai sus. discutate ar putea fi incluse atât în grupul caracterelor m etabolice cât şi în grupul A sp ecte p a r tic u la re caracterelor de patogenitate (ex.. m ucoasă. V i­ rulenţa este conservată. crom opare (pigm entul albastru. aureus. ’. E. fla m s . iar privite pe cealalaltă parte a plăcii sunt colorate în galben etc). de exem plu pigm entul auriu la S. Colonia R (rough) este plată. există o tulpină de Proteus spp. iar la periferia coloniei. galben-verzui. tolul 12 precum şi diferite capitole din partea specială). tulpi­ '’’■Jr saprophyticus).colonii cenuşii cu periferia roz sau cu pete galbene. anthracis.colonii galben verzui până la verde închis. E ste dată de bacteriilor sau fungilor. de la locul însăm ânţării cultura se „dezvoltă în valuri concentrice" (se întinde din aproape în aproape) pe toată suprafaţa m ediului. iar privite pe partea cealaltă a plăcii sunt roşii-brune.). partea superioară a m ediului de cultură. Aspergillus fumigatus .lv. G erm enii păstrează structura antigenipă şi nu aglutinează voltării în anaerobioză a unei tulpini de Clostridium (etani etc. . de acţiune şi specia de origine a hem atiilor (cal. C olonia S (sm ooth) are suprafaţă bom bată şi netedă. alb-cenuşii. reprezintă un caracter util în studii epi. invazia este inhibată şi se pot obţine colonii izolate (adăugăm la % exem plu pentru Pseudomonas aeruginosa sau pentru Staphylococcus spp. aureus. coloniile spnt U nele m icroorganism e produc enzim e (hem olizine) care lizează hem atiile din m ari.. spre exemplu pe m ediul Sabouraud. în continuare vom prezenta doar câteva dintre aceste teste (vezi şi capi­ V iralenţa nu este conservată (excepţii B. spre exemplu coloniile de Candida albicans lim etri). D upă localizarea pigm entului. uscată. Pigm entogeneza este caracteristică bacteriilor crom ogene şi este dependentă de 2% ). T ip u ri de colonii devin pufoase. N u păstrează capsula. în . coli. mată. M ucegaiurile produc o varietate mult mai mare de pigmenţi (ex. M . pe o placă cu mediu solid cultivăm 2 tulpini diferite. unde se va crea o „linie de dem arcaţie" între cele 2 tulpini (distanţă de 1-2 m i­ A Fungii pot produce o serie de pigmenţi. • fenom enul de „invazie". iepure etc). strălucitoare. m ediul de cultură acizi sau săruri biliare. C âteva exem ­ ple de hem olizine: L . m argini circulare şi devin în tim p galben-m aronii. tuberculosis. 1 -/ 2. v . dacă însăm ânţăm o tulpină care . metabolice. spontan cu soluţie salină fiziologică. iar privite pe cealalaltă parte a plăcii sunt colorate brun sau în alte culori. E ste de rem arcat faptul că unele dintre testele care vor fi exem plu de bacteriile care prezintă capsulă (exem plu Klebsiella pneumoniae). hem oliza în cazul anum itor m icroorganism e. în 2 puncte opuse. um edă.

a altor caractere fenotipice 67 1. inoculăm subcutanat. la 2 loturi de cobai Patogenitatea reprezintă capacitatea unui germen de a declanşa în organismul (un lo t neprotejat. • exotoxine (testul E LEK /vezi capitolul 16. .• Teste *s efectuate in vitro f 3. gonorrhoeae. diphteriae cultivat pe m ediu cu nare). V". în regiunea abdom inală câte 2-5 ml de cultură pentru fiecare anim al. producerii d e lecitinază. Pseudomonas aerugi­ şoareci albi. Streptococcus pyogenes. iepuri. „y-hemoliza“ • evidenţierea producerii unor toxine. © testarea toxigenezei unei tulpini de Corvnchactcrimn diphtenn&t obţinem o Caractere.j acelaşi tip de inoculare. cu aspect orientativ (exam i­ devine com pletă. In acest scop se utilizează anim ale de laborator sensibile faţă de infecţia experi­ o nitrat-reductază (ex..). în funcţie de specia m icrobiană pentru care se nosa.). metabolice. indică absenţa hemolizei. modificări locale. . Staphylococcus aureus) etc. dintre testele m enţionate este de luat în 5. pyo­ care animal. patogene. Bacillus anthracis. testul coagulazei. Clostridium peifringens). Streptococcus pneumoniae). N.la +4°G tim p . A lte c a ra c te re m etab o lice inoculare. câte 0. Bacillus cereus.-.). generale şi „functio laesa“. E ste un atribut al tulpinii m icrobiene im plicate. ex. zona având o culoare Patogenitatea este un atribut de specie şi este determ inată genetic. al doilea lot protejat cu câte 1000 UI de ser antidifteric pen- gazdă fenomene morbide. P ro d u c e re a a lto r enzim e lizat de Limulus polyphemus)._ . • efectuarea anum itor teste biochim ice/m etabplice. ferm entarea m anitâi. -y gene în form a „S “.2 zone“ în apropierea coloniei există un halou de hemoliza incompletă înconjurat de o zonă de hemoliza completă ’.. Streptococcus viridans. cholerae se multiplică la pH alcalin). . f testată în soluţie salină fiziologică şi injectăm subcutanat. Mycobacterium spp.1oaie. pneumoniae) sau Ia bacitracină (ex. Listeria monocytogenes. în cazul streptococilor. Virulenţa repre­ verzuie (ex. difteric şi tuberculos). prezenţa endotoxinei produce gelificarea unui 3. a-hemolizina produce liza hematiilor în 7. nu produce zone de hemoliză pe agar-sânge. A nim alele de laborator trebuie să fie sănătoase.. •> . 4. Pentru orice test se recom andă utilizarea unui Iot de anim ale pentru teiurit de K). Teste efectuate in vivo • lecitinază (ex..cald-rece“ (zone de hem oliză incom pletă la 37°C care... ex. zona de hempHză este clară (ex. testul plăcilor sem i-neutralizate etc). ® oxidază (ex. cu excepţia bacililor antraxului. pisici etc. m entală cu diferite m icroorganism e sau faţă de anum ite toxine m icrobiene (ex.. ®gelatinază (cultura microbiană lichefiază gelatina.2 ml pentru fie­ ®sensibilitatea la optochin (ex... om. urmărim evoluţia timp de 2-3 zile şi efectuăm genes) etc. după m enţinerea culturii . Vibrio cholerae ) . anim alele sunt m arcate şi ţinute sub observaţie (ferite de orice contam i­ » acţiunea reducăţoare (evidenţiată de ex. în • sensibilitatea la diferite temperaturi. cobai. P-hem olizina care produce o hem oliza de tip . anum ite tulpini . Mycobacterium spp. S... ELISA . .j.Caracterele de patogenitate p o t fi evidenţiate in vitro sau in vivo.. 7 -hemolizina produsă de Staphylococcus spp. efecte citopatice. lizează de iepure... :■ î continuare vom prezenta câteva exemple: ® toleranţa la un anumit pH (ex. p-hemolizina produce liza completă a hematiilor. Staphylococcus aureus). vezi capitolele 12 şi 28-34).). Clostridium spp. V. ’ . la C.de patogenitate ' cultură de 24 ore a tulpinii de identificat. efectuează testul/specia de animal cea mai sensibilă şi calea de inoculare cea mai ©termonuelează (ex.vi • ® endotoxine (testul Limulus. narea pigm entogenezei.. testul fibrino- lizei.aureus). Neisseria meningitidis..de câtev a ore. ■. testul • carbohidraze (evidenţiate pe medii diferenţiale. producerea de hem olizite etc). a-hem olizina produce o liză incom pletă a hem atiilor. .de Staphylococcus .. zintă gradul diferit de patogenitate exprim at în cadrul unei specii. potrivită).. . . observaţia este clinică urm ărindu-se evoluţia curbei febrile şi apariţia sem­ nelor de boală. I frotiuri din sângele recoltat prin puncţionarea cordului sau am prente de splină. unele tulpini d e Streptococcus spp.'. ‘ ‘ f • identificarea Bacillus anthracis: pregătim o suspensie a tulpinii care urm ează a fi ® toleranţa la o anumită concentraţie ă ţ NaCl (ex. După 4. ceea ce creşte suplim entaf costul acestui tip de testare. verificarea se face prin exam inarea acestora în ain te de efectuarea testării. -.-.66 Diagnosticul de laborator în microbiologie 1 1 Examinarea caracterelor de cultură. la u n lot de şoareci albi. Haemophilus • exam inarea aspectului coloniilor (m ajoritatea speciilor bacteriene sunt pato­ ducreyi). (ex. • catalază (ex. dar' consideraţie în prim ul rând testul coagulazei . S. Staphylococcus spp. pe parcursul a 10-14 zile. 2. are aspect orientativ.

(ăriaţom opatoiogic .■ u:. există toxină botuli ni că de tip A. o 0. ' .1 ml ser antitoxină A urm at la 30 m inute de supernatant.li .. V J . la locul de inoculare) în tim p „ce.fi'.. albicans patpgenă. n.p. se filtrează m ed iu l iar lichidul obţinut se menţine la tem peratura de fierbere timp de 50 m inute:..a ta re şi 3*■r’ :iI' cjî'ii: o 1 i. anim alele vo r. în cazul în care tulpina este toxigenă. *î prieumoniae: realizăm un am estec de spută şi soluţie'salină fiziologică sterilă şi inoculăm subcutanat sau intraperitoneal câte 5 ml de p.i mostabilă). .prote­ pensia obţinută şi urm ărim evoluţia anim alelor timp de 4-10 zile. ca're’e'ste anim alul -de la b o ra to r cel m ai sensibil la in fecţia ex p erim en tală cu Staphylococcus aureus. ■ supernatant după m enţinere timp de 15 m inute la 100°G. o supernatant inactivat.-i a. în 'baiul pre­ zenţei enterotoxinei apare o stare ele nelinişte. : . prezenţa m icroorganism ului va produce în 24-48 de ore o septicem ie m ortală. © identificarea infecţiei pulm onare cu Streptoccus pneumoniae sau cu Klebsiella 1{ .it. j .* * ■M. lichid seros.(enţerotoxina este tef.2-0. ® identificarea etiologici stafilococice a unei toxi-infecţii alim entare (producerea enterotoxinei): după ce se obţine în cultură tulpina de stafilococ (pornind de la materii fecale.8 ml pentru fiecare anim al) sus­ peritonea şi edem gelatinos. serofibrinos sau fibrinos în pleură. . pentru uri anim al. . lichid peritoneal şi am prentă de splină.vom putea evidenţia abcese. la un lot de şoareci albi. 'i ) \ tulinică fiind term olabilă. metabolice. ( Examinarea caracterelor de cul. Io. agitaţie urinate de diâfeefvărşă- turi şi som nolenţă. . facem frotiuri şi culturi din sângele1recoltat prin puncţie cardiacă. 1. inoculăm în lelor suprarenale. . venele cozii la un lot de şoareci (câte 0. m iliare renale.. lichid de vărsătură. . .(şi răcire) toxina bo. . anim alele neprote­ tură de 24 de ore în m ediul Sabouraud lichid separăm sedim entul şi realizăm jate vor muri în 1-4 zile. vorba de o tulpină de C. sau alimentelor. / • cercetarea patogenităţii unei' tulpini de.cobai (1 m l/cobai) după cum urmează. pentru determ inarea tipului capsular putem face reacţia de um flare a capsulei (vezi capitolul 12). testul D olm an se face la pisoi de 2-3' luni la care se inoculează intraperitoneal 1-3 ml din filtratul r ă c iţi după 2 0 -1 2 0 ’m inute.Ii „ . după 1-2 zile anim alele inoculate îşi revin. se vor inocula 4 loturi de şoareci (0. se va utiliza supernatant.anim alele. > ■ ' ■'• v'.unor:produse patologice splenice. stafilococ se face la iepure.1 ml ser antitoxină B urm at la 30 m inute de supernatant. X cfVM .sau.ca . .. © supernatant ca atare.m u ri. alim ente) se repică în . 1.5 ml/şoarece) erii.2% a acestuia în soluţie salină fiziologică sterilă.. în cazul în care anim alele din ioturile 1 şi 4 mor. Candida albicans): pornind de la o cul­ tru fiecare anim al). .1 malele din loturile 2 şi 3 supravieţuiesc. © spre exem plu.5% şi. . iar ani­ îtn .. botulihunt: se obţine supernatant după centrifugarea.:u . i1 O .d u p ă circa 1 o toxinodpia în cazul suspicionării unei toxi-infecţii alim entare du Ctostridium _ ^ săptăm ână. : . pericard. r . a altor caractere fenotipice . se incubează 48 ore în atm osferă de CO 2.p.a g a r 0. ■ : ' .turâ. în p. incrim inate şi triturate la care se adaugă antibiotice p entru a inhiba m ultiplicarea florei de asociaţie.At >1. . . hepatice) etc. ■A'UC.. dacă este ja te nu prezintă nici o reacţie. cu sem ne de intoxicaţie difterică (congestia capsu­ o suspensie 0. . 4 69 68 Diagnosticul de laborator în microbiologie AH• « testarea patogenităţii unor levuri (ex. t .■ O 0..

-. Utilizarea unui carbohidrat ca unică sursă de carbon . E xistă sisteme com erciale m anuale şi autom ate utile pentru identificarea speci­ Incubăm la 28-30°C pentru 24-48 ore. Testul sensibilităţii la bacitracină o mediu pentru asim ilarea carbonului de către levuri. D epunem aseptic 5 rondele din hârtie de filtru. perm ite identificarea unei E xistă şi alte m odalităţi tehnice în realizarea auxanogram ei. m in iA P I. să utilizeze un anum it carbohidrat ca unică sursă de carbon. Spre exem plu. .'. Se apreciază că dintre tulpinile de Streptococcus toză.s. voltarea unei levuri pe un m ediu în care este inclus un singur carbohidrat dem on­ strează utilizarea acestuia c a unică sursă de carbon (asim ilarea carbohidratului Control de calitate respectiv). D ez­ bileşte specia levurică. glucoza. sistem ul sem iautom at d e identificare şi testare a delelor. • rondele din hârtie de filtru. . I M ateriale necesare T eh n ica de lu c ru ! • colonii (3-hemolitice izolate pe geloză-sânge. : ij pyogenes. gam e foarte largi de specii m icrobiene. M ultiplicarea streptococilor de grup A este inhibată de bacitracină (antibiotic • soluţii 5% ale carbohidraţilor (ex.>1 . bacteriene şi respectiv fungice şi „fac parte" din etapa a patra a diagnosticului de la­ • dacă dorim să testăm pentru 9 carbohidraţi diferiţi avem nevoie de 2 plăci borator bacteriologic sau m icologic.rif. se sta­ spre exem plu.Auxanograma care am depus o ansă din soluţia 5% de glucoză.1 U (şi nu cu 10 U /m icro- tură pentru asim ilarea carbonului este încălzit până la topire şi apoi răcit la 50°C. m altoză. toate levurile pot folosi glu­ coza drept unică su rsă d e C.1. Petri. Schem a de prezentare este însă asemănătoare. produs de Bacillus licheniformis). azotate de către levuri. utilizând o ansă cu diam etrul buclei d e 3 mm. zaharoză. P rin c ip iu • se notează dezvoltarea culturii în jurul rondelelor unde aceasta este evidenţiată D iferitele levuri prezintă un anum it echipam ent enzim atic cu ajutorul căruia pot. C ultura fungică este suspensioriată în 5 ml de apă distilată sterilă. sterilizate prin filtrare. câteva dintre teste vor fi prezentate în depunem pe fiecare dintre rondele ceea ce vom preleva din diferite (5) soluţii de continuare. Interpretare • trebuie să existe m ultiplicare levurică (cultură prezentă) în ju ru l rondelei pe 12. în mod asem ănător se poate testa capacitatea asim ilării unor substanţe • tulpina de referinţă de Cryptococcus laureaţii. 2 ml Şl FUNGILOR soluţie de vitam ine şi 0. pe pantă de agar Sabouraud.'< i -jtcş'-y !■ '■■■« t i. sensibilităţii la antibiotice a bacteriilor izolate. una în centru şi 4 spre periferia Există numeroase teste utile în identificarea bacteriilor şi fungilor.. M a te ria le necesare • cultura pură a levurii de identificat.. ( I £. sterile (diam etru 6 m ilim etri).04 U şi cu 0. apoi urm ărim apariţia culturii în ju ru l ro n ­ ilor m icrabiene. necesită utilizarea unui inocul standard realizat pornind de la o cultură bacteriană pură.1 . lactoză.2.caracterelor biochimice ale fungilor şi bacteriilor 71 TESTE DE IDENTIFICARE AVÂND LA BAZĂ DIFERITE CARACTERE BIOCHIMICE ALE BACTERIILOR într-un tub steril cu capacitatea de 30 ml introducem aseptic 20 ml de m ediu. mai puţin de 1% sunt rezistente la bacitracină. Teste de identificare pe baza. M ediul de cul­ o m icrocom pîim âte d e bacitracină cu 0. com prim at). şi utilizând rezultatele obţinute. 1 2. Principiu: • soluţie de vitamine. având la bază fiecărui cadran al plăcii şi im ediat. carbohidraţi A ceste teste de identificare au o importanţă diferită la diferitele genuri şi specii • obligatoriu vom p releva din soluţia de glucoză. în contextul celorlalte date d e laborator. diferite proprietăţi biochimice ale acestora. galac. . . • tulpina de referinţă d e Candida pseudotropicalis.25 ml din suspensia fungică (levurică) după care am estecul este turnat într-o placă Petri sterilă şi se aşteaptă solidificarea m ediului îm preună cu " w . trehaloză etc) în apă distilată. celelalte com ponente.

." . o tulpină CA M P negativă şi 1 . suprapuse în 3 direcţii. care acţionează sinergie cufl-lizina produsă de unele tulpi­ e M artor pozitiv . • M artor negativ .. •„ . . Tehnica de lucru ’ • soluţie salină izotonă. Incubăm la'35-37°C aerob până a doua zi sau tim p de 6 ore în atm osferă de 5- litice izolate. '•putea utiliza fâşii din hârtie de filtru impregnate cu P-lizină stafilococică. . Interpretare . M unch-Petersen). Principiu * rezultă o inhibiţie a creşterii bacteriene cu diam etrul g 11 m m . M a te ria le n e c e s a re • ATCC = American Type Culture Collection.. .. V v ‘‘1 r c ■ băm pentru 18-24 ore la 35-37°C . ■v etalonului M cFarland 0. . ' Sî I n te r p r e ta r e .Streptococcus pyogenes. . . .4 . Testul CÂMP com prim atului cu 0.■ . | .. Testul bilolizei (Neufeld) Materiale necesare : P rin c ip iu u-.. *.04 U bacitracină. . ■. . .!ji .negativ . ' :. Streptococii de gm p B produc o substanţă extracelulară de natură proteică denu­ m ită factorul CA M P (după iniţialele cercetătorilor care au pus la punct testul/ Christie. . în jurul micro-.. * Repartizăm câte 0. ...■. Inoculăm în striu o tulpină d e S.ro: . li. .1 U bacitracină. com prim atului cu 0.. liza hemati­ • M artor... bou. 1 2 .j.5 ml apă distilată. în „vârf de săgeată" (vârful spre ttilpina 0. . . '.v.> Se prelevează 3-4 colonii p-hem olitice şi se însăm ânţează în striuri foarte apro­ • Testul este pozitiv (bacteriile au fost lizate în prezenţa dezoxicolatului de so­ piate. •t. ' . . :■ '.. aureus producătoare de p-lizină (A TC C 25923)/alternativ am unei enzim e autolitice.. . . indiferent de diam etru. . © colonii izolate. T urbiditatea suspensiei trebuie să fie asem ănătoare cu turbidjtatea 10% C 0 2.. . pe o jum ătate de placă P etri cu geloză-sânge .. a-h em o litice. aureus producătoare de p-lizină. =.. . J . gat dezoxicolat şi nu s-a clarificat în tubul îri care am adăugat apă distilată. v tulpini de cercetat. .‘l‘ ' ' . ■>. acolo unde cele 2 striuri se învecinează.Streptococcus vindem . ni de Staphylococcus aureus. .. D acă aceste 2 microorganism e sunt cultivate în 2 striuri perpendiculare (fără să se atingă).nt • Martor pozitiv^Streptococcus pneumoniae. •" . C o n tro l d e c a lita te • I'. • Testul este negativ d acă am bele tuburi au răm as opace. S e prepară în soluţie salin ă fiziologică o suspensie pornind de la coloniile hem o...‘ atingem striul de stafilococ) o tulpină CA M P pozitivă... Incubăm tim p de 2 ore la 35-37°C../ ? Interpretare n . de stafilococ) reprezintă un test pozitiv (confirmat de martorul pozitiv).. . • tulpini de cercetat. Control de calitate i :b. . . j ilo r (de berbec sau de bou) apare mărită... • soluţie de dezoxicolat de sodiu 10%. Perpendicular pe acest striu vom inocula (fără să T eh n ica de lu c ru • ! ' . în jurul m icro. . iar în al doilea tub adăugăm o apariţia unei zone de hem oliză lărgite.. Testul este pozitiv (bacteria este sensibilă lă bacitraciriă) în câZul'în care: ® rezultă o inhibiţie a creşterii bacteriene.< • colonii de streptococi hem olitici sau nehem olitici (dacă un anum it context sau anum ite teste sugerează prezenţa unui streptococ de grup B).". în „form ă de vârf de săgeată"..Mi l Atkins. Plasăm în centrul ariei însăm ânţate un m icrocom prim ăt cu bacitracină şi incu. < '■ ■ >.(din diu şi sunt pneum ococi) dacă suspensia s-a clarificat în tubul în care am adău­ m otive de econom ie se poate utiliza şi un sector de placă).. .5 sau 1. 1 2 . pe unul din • apă distilată. . ' .3.-t i: '■ ' " " ’• :'L " '/*■'i’. l!lt în primul tub adăugăm 0.72 Diagnosticul de laborator în microbiologie 12 Teste de identificare pe baza caracterelor biochimice ale fungilor ţi bacteriilor T e h n ic a de lu c ru ..5 m l din suspensie în 2 eprubete de sticlă. .fin. I . sau sărurilor biliare (unele tulpini necapsulate nu suferă acest proces) prin activarea 1 • tulpina de S.i'. ..5 ml dezoxicolat de sodiu.Streptococcus agalactiae. diametrele plăcii cu agar-sânge. . . Pneum ococii (Streptococcus pneumoniae) capsulaţi sunt lizaţi în prezenţă bilei • plăci Petri cu geloză sânge de berbec sau de.::. .

Diagnosticul de laborator in microbiologie 1 2 Teste de identificare pe baza caracterelor biochimice ale fungilor şi bacteriilor 75
74

• heraoliză nemodificată - test negativ (confirm at de m artorul negativ ) , j • M artor negativ - m£diu neinoculat peste care se adaugă soluţie d e peroxid de
hidrogen.
C ontrol de calitate
12.5.B. pentru alte microorganisme (spre exem plu diferenţierea stafilococilor
• M artor pozitiv - Streptococcus flgalacţiae;. . n.., de alte microorganisme)
• Martor negativ - Streptococcus pyogenes sau un streptocqc de grup D.
E xistă mai m ulte tehnici dintre care vom prezenta testul realizat pe 6 suspensie
bacteriană şi respectiv testul catalazei prin suspensionarea culturii pe lam ă. .
12.5. Testul producerii de catalază i ; <?>
P rin cip iu Materiale necesare

Catalaza descompune peroxidul de hidrogen în apă şi oxigen. • colonii izolate dezvoltate pe medii fără sânge/în cazul în care urm ează să testăm
o bacterie care s-a dezvoltat pe geloză-sânge, deoarece pot apărea reacţii fals
12.5. A. pentru mycobacterii pozitive datorită catalazei eritrocitare, urm ează să prelevăm cultura bacteriană
fără a atinge mediul de cultură; în acest sens vom utiliza o ansă „fîr“ şi să
M a teriale necesare prelevăm cultură din porţiunea cea mai bom bată a coloniei de identificat);
• cultura pură a m icroorganismului care urmează a fi testat, pe mediu Lowenstein; • soluţie de peroxid de hidrogen 3%;
• soluţie de peroxid de hidrogen în Tw een 80 şi apă distilată. • apă distilată.

T ehnica de lu c ru Tehnica de lucru

Peste cultura bacteriană se adaugă 1 m l de soluţie de peroxid de hidrogen şi se B l.
lasă tubul la tem peratura cam erei. R ealizăm o suspensie bacteriană densă în 1-2 ml d e apă distilată la care adăugăm
Se măsoară înălţimea coloanei de bule de oxigen şi se înregistrează valoarea în mm. 1-2 picături de soluţie de peroxid de hidrogen 3%.
O bservăm im ediat şi după trecerea a 5 m inute apariţia bulelor de oxigen.
I n te rp re ta re
B2.
Acesta este un test sem i-cantitativ, care ajută la diferenţierea speciilor de P e o lam ă de sticlă punem o picătură din soluţie de peroxid de hidrogen.
mycobacterii în funcţie de cantitatea de catalază produsă. în vederea unei diferen­ S uspensionăm cultura în picătura de H 2O 2 şi urm ărim timp de 30 de secunde
ţieri suplimentare, se poate utiliza testul term osensibilităţii catalazei (Mycobac­ apariţia bulelor de oxigen.
terium tuberculosis, sp re exem plu, produce o catalază term osensibilă).
N otificarea se poate face în modul urm ător Interpretare
• peste 20 m m + + + ' ' • apariţia bulelor de gaz sem nifică un test pozitiv, bacteria produce catalază;
• 10-20 mm ++ j • absenţa bulelor de gaz sem nifică un test negativ.
• 5-10 mm + j Control de calitate
• 5 mm - ' ' -j
• M artor pozitiv - Staphylococcus aureus;
/• ij
C ontrol de c a lita te • • M artor negativ - Streptococcus pyogenes.

• M artor pozitiv - M. fortuitum ; I
1 2 .6 . Testul utilizării citratului ca unică sursă de carbon (Simmons)
• M artor mai slab pozitiv (test semicantitativ) - M. tuberculosis/în cazul testu­
lui pentru term osensibilitateă catalazei rezultatul va fi negativ după încălzire Principiu
20 minute la 68 °C ; / , U nele dintre enterobacterii deţin un echipam ent enzim atic care perm ite asim i­
larea şi utilizarea citratului ca unică sursă de carbon. U tilizând un m ediu care con-

Diagnosticul de laborator în microbiologie
76 Teste de identificare pe baza caracterelor biochimice ale fungilor şi bacteriilor 77

ţine citrat şi un indicator de pH, putem indentifica alcâiiirizarea'm ediului şi respec­
• plasm ă de iepure (d e preferat)/în cazul în care plasm a de iepure nu este dispo­
tiv acea enterobacterie care poate utiliza citratul ca unică sursă de carbon:
nibilă se poate folosi plasm ă um ană (cu sensibilitate mai m are la coagulaza
Materiale necesare
uV’.sn irftn
',vv' '’ produsă d e S. schleiferi şi S. lugdunensis);
• lam e, tuburi. ' 1 ' ( ■•vr.mliij Scji
« o suspensie relativ densă obţinută din colonia (cultură pură) bacteriei p e care
* 1 ‘dorim să 6 identificăm ;
.■■■■• • j •
; ’•1 i
.. . . .
’h l-“): ■Jl ''
Vi' ; 'T iJii.-.- i V :.-V i’Ul.Mt . .,;tj
Tehnica de lucru :•*>./: 'o
® m ediul care conţine acid citric 0,2% (Sim m ons), turnat în pantă în eprubete a. Testul coagulazei pe lamă .... ,i:.;
mici; în prezenţa indicatorului de pH şi la pH neutru, m ediul neînsăm ânţat are V erifică prezenţa coagulazei legate. Pe lam ă se depune o picătură de apă disti­
o culoare verde. ru'd i " '..i i i .4! ';î ,J!' lată (nu soluţie salină fiziologică). Suspensionăm şi om ogenizăm 1-2 colonii în
> .ii'.'. Vj ■■it : r r ,-i -.iii t o i " o picătura de apă distilată (suspensia trebuie' să fie' tulbure omogen).
T e h n ic ă d e lu c ru
.1 î t Jj . U. ?ilt'OJjd- ii:')ti.' -iii
.. .■. ,. /i■ , » . . ! ;h;> .’i î i vt al'-.ii A şteptăm circa i 0 secu n d e şi urm ărim apariţia unei eventuale autoaglutinări (caz
• cu- ajutorul unei anse, prelevăm suspensie bacteriană, p e ,care o însăm ânţăm în care nu putem interpreta rezultatul testului; trecem la efectuarea testului coa­
într-un singur striu în „zig-zag“ pe suprafaţa m ediului Sim m ons; j.vr il | gulării în tub). D acă picătura răm âne tulbure om ogen, adăugăm 1 picătură de plas­
• incubăm Ia 37°C şi exam inăm dezvoltarea culturii şi eventuala m odificare a m ă şi urm ărim apariţia „coagulilor" timp de 10-15 secunde.
culorii m ediului. . .iut.iu.ii> i/in; * A lternativ se pot utiliza truse comerciale.
I. I... r 'l - ,
I n te r p r e ta r e • -a >>r..U:g.*i" Interpretare.
• apariţia unei culturi bacteriene de-a lungul 'striului, însoţită de m odificare • apariţia „coagulilor" în 10-15 secunde sem nifică un test pozitiv;
culorii care devine albastră,, sem nifică,un test pozjtiy = bacteria,.utilizează • absenţa „coagulilor" sem nifică un test negativ/5% din S. aureus dau reacţii fals
citratul ca unică sursă de carborţ; jţ01i,K. ;w. , j . b ■■uiihm.j-u-i negative la testul pe lamă, fiind necesară realizarea testului coagulazei în tub.

• /în prezenţa,unui tub fără-,dezvoltarea, culturii, cu lo area m ediului;,fiind verde b. Testul coagulazei în tuburi
(putem notifica un rezultat negativ. rj.. V erifică prezenţa coagulazei libere. Pipetăm aseptic 0,5 ml de p lasm ă într-un tub
steril. Prelevăm o colonie şi o descărcăm în plasm a din tub (alternativ putem
C o n tro l de c a lita te ': însăm ânţa o colonie de testat în 0,5 ml bulion glucozat, incubăm 18-24 ore la 35-
•■ , . i . 11C;i|,.j^ *-,»• |i,J ...I.ţ...
» M artor pozitiv - Klebsiella pneumoniae/Ehterobacter cloacae;, , ,, ,;., 37°C şi vom am esteca plasm a cu suspensia m icrobiană rezultată după cultivare).
Incubăm tubul tim p de 4 ore la 35-37°C (pentru unele tulpini reacţia poate fi p o ­
• M artor negativ - Escherichia coli.
zitivă chiar şi mai repede de 4 ore). Rezultatul reacţiei este exam inat prin înclinarea
tubului. Dacă reacţia este negativă la 4 ore, reincubăm până la 24 ore.
12.7. Testul coagulazei '.i • ■i;j ii a l;.a ; lo b itjd Hif f l '.>■]:>
1 ,i'i i:. i ' oi: :.. . "iolii!i.n• i:i t . A tenţie, cheagul poate fi lizat destul de rapid d upă m om entul form ării (unele
Principiu tulpini de S. aureus produc fibrinolizină). D in acest m otiv, unii autori recom andă
Stafilococii coagulazo pozitivi produc o enzim ă care ac tiv ează coagularea-; plas­ exam inare tubului test din 30 în 30 minute, în prim ele 4 ore.
mei. Există 2 tipuri de coagulază: coagulaza liberă ^ c o a g u la z a leg ată.d e(peretele Interpretare o.;
celular („dum ping factor"). Coagulaza liberă acţionează pe protrom binK C oaguiaza • form area unui cheag, sem nifică un rezultat pozitiv;
legată acţionează direct pe fibrinogenul plasmatic. Stafilococii coagulazo pozitivi • absenţa cheagului sem nifică un rezultat negativ.
sunt consideraţi Staphylococcus fţureiu..t ■ ,.:ît : a . . ,. .ţ.ţjţu ti k f
Control de calitate
Materiale necesare • M artor pozitiv - S. aureus;
• colonii izolate p e’mediu neseldctiv ale tulpinii care u rm ează să fie testată ( • M artor negatiy - S. epidemidis.
.. ........ .. a ' 1'-- . . iu -i.;. ' . tb îi t b j i » o i . , i r ' itÎH'Uiu i . - n r " ; ; r ' i : ' r c o -. ■!

... . / iaio • > ^Diagnosticul de laborator în microbiologie 12 Teste de identificare pe baza caracterelor biochimice ale fungilor şi bacteriilor
78 79

12.8. Testul filam entării, pentru Candida albicans Materiale necesare
• tuburi de dim ensiuni m ici cu mediul M IU ;
P rin d Piu ,V. "a, lUubor:
D upă cultivare în ser uman, ser bovin, ser de berbec etc tim p <p?, 1%35- • hârtiuţe indicator cu reactiv Ehrlich (se poate folosi şi reactiv K ovacs) sau
37°C, blastoconidiile individuale de C. albicans produc filam ente scurte (tubi ger­ reactiv E hrlich/K ovacs condiţionat în sticluţe de culoare brună; v ..........
minativi). . ' . OTi)Uil*jL • colonii d e identificat (colonii izolate, cultură pură);
Materiale necesare riu»\ wţ Wmwţrrr-v.twv m ‘.n • ansă fir etc.

, • colonii izolate, în'scopul identificării; 11 1■ 1 ; - . ' , Tehnica de lucru
• ser uman, ser bovin,,ser de|ber]}ec, ,ser, feţal de^jdţşl, ^ r n ^ b jt n c ii n ă bovină,eţc;; Utilizăm: pentru însăm ânţare o ansă fir. Prelevăm din colonia izolată p e mediu
• aplicaţogre de.lem n sau sterile, pipete .Pasteur:cu^^,yMul efilat, lam e şi lamele, neselectiv (dacă p en tru cultivare au fost utilizate m edii selective trebuie să pre­
tuburi mici. , . • s u t ir . v T t n r liiir . : p l t t q v t t n i « r r i t t '{ tm // io v
levăm cu grijă, fără să atingem mediul de cultură) şi însăm ânţăm m ediul prin înţe­
;iv . . . r . - ’ -i-î ii r iu r ş î - '; : i i 'î R b n r .'ii •.! .t *.!■•! i i i ifu :b .“ j
p are încercând să realizăm o însăm ânţare în „linie dreaptă1*. Fixăm de dop hârtiuţa
Tehnica de lucru indicator în aşa fel în c ât să ajungă deasupra coloanei de mediu, fără să î l atingem.
f i i .;:i; h i. n c o o , >•(''iB r ,*-'.1f'i.T .it " if. tivi
într-un tub de dimensiuni mici (ex. 12/120 mm) introducem aseptic 0 ,5 -l.jn l de Incubăm la 35-37°C tim p de 24 ore. în cazul în care nu are loc virarea culorii m e­
ser uman sau alt tip de ser. Cu un aplicator sterii (ca un beţigâş)1atingem colonia diului, incubăm până la ,48 de ore.
care trebuie identificată şi apoi îl introducem în tub. Incubăm tim p de 2-4 ore, la 35-
Interpretare
37°C. ’ ■ • : ■ j ,ţj; ir .! iHJifSW "î?t -U ! :'1, , 'r . r ' v ' . - ■' '■! .-’V;' ,v
Realizăm un preparat între lam ă şi lamelă şi exam inăm ia;m icroscopul optic. • din punctul de vedere al mobilităţii;
• opacifierea apare num ai pe traiectul de însăm ânţare - b acteria este imobilă;
Interpretare . , \ o • opacifierea este uniform ă în coloana de m ediu - bacteria este mobilă;
•(prezenţa unor.tubi. germinativi cu un calibru m ai îngust d ar cu o lungim e de 3- • din punctul de vedere al producerii ureazei;
4 ori mai m are decât diametrul celulei de origine, care continuă direct, fără nici
• culoarea coloanei răm âne galbenă - bacteria este ureazo negativă;
o strangulare sau sept blastoconidia, sem nifică un test pozitiv;:, , j i).T,
• culoarea devine roşie - bacteria este ureazo pozitivă;
• absenţa aspectului m enţionat mai sus sau prezenţa unor. pseudotubi germ ina­
tivi care sunt delim itaţi printr7o strangulare şi un sept de blastoconidie sem ­ • apariţia unui inel de culoare roşie la suprafaţa m ediului nu reprezintă un
test pozitiv;
nifică un test negativ. ■ . .t • ;■
• din punctul de vedere al transformării triptofanului în indol;
Control de calitate
• schim barea culorii hârtiei la roşu-violet - bacteria este indol pozitivă;
• M artor pozitiv - C. albicans; • culoarea hârtiei răm âne albă - bacteria este indol negativă;
• M artor negativ - C. tropicalis: • alternativ, în lipsa bărbuţelor indicator se poate picura reactiv Ehrlich Ia
suprafaţa m ediului şi interpreta m odificarea/lipsa m odificării culorii.
12.9. A. M ediul multitest M IU (mobilitate îndoi uree)
/• ir .: ui i’f H u r v . '. " !..• fc'
Principiu /, Control de calitate

Mediul conţine uree, ti'iptofan, roşu fenol (indicator d e pH ) şi este condiţionat în • M artor pozitiv - Proteus m im bilis M + U + 1+ ;
tuburi de dim ensiuni mici. G eloza este m oale perm iţând m obilitatea m icroorganis­ ® M artor negativ - Shigella spp. M - U- I- 1
mului însăm ânţat; hidroliza ureei va duce la alcalinizare m ediului (culoarea virează
de la galben la roşu); producerea de indol din triptofan v a fi indicată de înroşirea
reactivului Ehrlich.

T p b . ii ® ansă fir etc.-.bacteria este m obilă o din punctul de vedere al transformării triptofanului în indol )( Materiale necesare o schim barea culorii hârtiei la roşu-violet .l Concentraţia glucozei este mai mică. • din punctul de vedere al m obilităţii . . Teste de luentificare pe baza caracterelor biochimice ale fungilor şi bacteriilor 81 '■'1 80 Diagnosticul de laborator în microbiologic Control de calitate 12. Principiu . de la nivelul pantei să revină rapid la neutru. .” '. n. . 12. D acă zaharurile de la nivelul Tehnica de lucru >. • alcalini zarea coloanei ttaduce prezenţa enzim ei . peptonă cu D t-tr'iptofănl L-lizină. D ecarboxilarea lizinei va duce la alcalinizâfe m ediului (în şi conţine glucoza (în raport de 1/10 faţă de celelalte zaharuri).bacteria este indol pozitivă j ® tuburi de dim ensiuni mici cu mediul TSI. M ediul multitest M IL F (mobilitate indol lizin-decarboxilază fen il- o M artor pozitiv . >V i.9. cultură pură).t m . j • f t l ’s i U ' .. care în zona aerobă v o r fi decar- boxilaţi oxidativ şi vor m odifica pH -ul spre alcalin.i K * M ediul conţine o cantitate scăzută de glucoza.9.-d . (toate enterobacteriile ferm entează glucoza) este suficient de m ică pentru ca pH-ul • colonii de identificat (colonii izolate. am oniac. pantei sunt ferm entate. fără să atingem mediul de cultură) şi însăm ânţăm co lo an a prin înţe­ 10% traduce prezenţa enzimei pare. adăugând clorură ferică rezultă o culoare verde. L a nivelul coloanei se mai înregistrează şi producerea de gaz (de la apariţia unor • opacifierea apare numai pe traiectul de însăm ânţare —bacteria este imobilă bule fine pe traseul de însăm ânţare. incubăm la 35-37°C tim p de 24 ore. „ l h . J ■. D ezam inarea fenil-alaninei duce la apariţia1de acid fenil-piruvic şi oferă condiţii de m ultiplicare în aerobioză. pentru ca ferm entarea acestui zahar să Materiale necesare a .u ••ilru /p u m :«n<u>ihi. . Mediul m ultitesi TSI (triple sugar iron) DL-fenil-alanină.LD -ază+.FD -ază... A. pH -ul de la acest nivel să răm ână acid şi respectiv culoarea pantei să răm ână galbenă. . cultură pură).pacteria este indol negativă • colonii de identificat (colonii izolate. condiţionat în două „zone“ (în coloană la b az ă şi în pantă) reactivului Ehrlich. absenţa lizin-decarboxilazei rezultă o uşoară acidifiere a mediului: datorită . Prelevăm din colonia izolată pe mediu • apariţia unui „inel" de culoare verde la suprafaţa m ediului şi la niVelul neselectiv (dacă pentru cultivare au fost utilizate medii selective trebuie să prele­ traiectului de însăm ânţare după adăugarea unei picături de clorură ferică văm cu grijă.fermen­ citrat feric şi un indicator de pH (roşu neutru). alanin-dezaminază) .i.u m L v poată fi detectată chiar dacă este singurul zahar m etabolizat. . • opacifierea este uniform ă în coloana de m ediu .-. i r \fi ■ 7 V . Dacă o bacterie se dez­ • tuburi de dimensiuni mici cu mediul M ILF. B. . G eloza esta?nioale perm iţând m obilitatea m icroor­ 4 ganism ului însăm ânţat. Partea în clin ată (panta) tării glucozei).v t.Proteus mirabilis M + 1+ FD -ază+ LD-ază-.. • din punctul de vedere al producerii lizin-decârboxiiazer ( .. P artea dreaptă (coloana) nu vine în contact cu aerul şi oferă condiţii relative de anaerobioză.. / Tehnica de lucru • acidifierea uşoară a coloanei trtţduce absenţa enzim ei -■» ' ' ■' • din punctul de vedere al producerii fenil-alanin-dezam inazei | U tilizăm pentru însăm ânţare o ansă fir. ® M artor negadv . . în cazul în care bacteria produce H 2S duce la apariţia unei culori negre (se form ează sulfit feros). lactoză.Klebsiella pneumoniae M -1 . ••■ y J voltă în partea dreaptă vor fi eliberaţi am inoacizi. până la fragm entarea sau „ruperea" coloanei). apoi retragem ansa şi atingând suprafaţa coloanei descriem un striu în „zig­ zag". Interpretare P rezenţa citratului feric. în acelaşi timp.10. cantitatea de acid produsă prin ferm entarea glucozei reactiv Ehrlich/K ovacs condiţionat în sticluţe de culoare brună. • culoarea hârtiei răm âne albă . în cazul în care lactoza şi/sau • hârtiuţe indicator cu reactiv Ehrlich (se poate folosi şi reactiv K ovacs) sati zaharoza nu sunt ferm entate. . brom crezol p u rp u r soluţie12% ’(indicator de p H )'şi"eite condiţio­ / Principiu nat în tuburi de dim ensiuni mici. . Producerea de indol din triptofan va fi indicată d eîn ro şire a M ediul este agarizat. culoarea mediului răm âne galbenă) la nivelul coloanei pentru că în condiţii de rela­ tivă anaerobioză nu are loc decarboxilarea oxidativă. pH -ul răm âne acid (şi • ansă fir etc.v ii i-. cantitatea de acid produsă este suficient de m are pentru ca T ehnica de lucru este asem ănătoare cu cea expusă la punctul 12. . . zaharoză.

elim inare. brună la tem peratura frigiderului sau fâşii de hârtie indicator im pregnată în Materiale necesare reactiv (preparate com ercial).! v Tehnica de lucru • în ceea ce priveşte ferm entarea glucozei. • hârtie de filtru. A dăugăm cu ajuto­ • culoarea coloanei este galbenă . 12. T ransferăm câte 0. A d ăugăm succesiv • ferm entarea glucozei poate fi sau nu însoţită de producere:de gaz.Salmonella typhimurium. Testul producerii de citocrom oxidază Principiu 1 2 . vom „neutraliza11 tuburile prin adăugarea unui volum egal (aproxim ativ • în cazul în care.5 m l în fiecare dintre tuburile de testare.82 Diagnosticul de laborator fn microbiologie 1 2 Teste de identificare pe baza caracterelor biochimice ale fungilor şi bacteriilor 83 Interpretare . fără producere de H 2S - E. pH neutru la nivelul pantei şi pro­ • M artor negativ . ' 0. în vârstă de m inim 3 E xistă mai m ulte variante tehnice. . (dintre germ enii gram negativi) şi Micrococcus spp. tetra-m etil p- fenilendiam ină rezultând un com pus de culoare purpurie M ycobacleriile produc în timpul m ultiplicării niacină (acid nicotinic) pe care o utilizează în sinteza N A D şi N A DP. Folosim o subcultură m ycobacteriană cu creştere confluentă. Neisseria spp. lizăm fâşii de hârtie indicator im pregnate în soluţie de brom ură d e cianogen. M ajoritatea m ycobacteriilor posedă o enzim ă D intre bacteriile oxidazo-pozitive am intim Vibrio spp.Mycobacterium avium.glucoza este ferm entată. Interpretare o alte elem ente privind interpretarea acestor rezultate vor fi prezentate în capi­ tolul 28. agar-chocolat sau agar M ueller Hinton. * . reprezintă un test pozitiv. Testul producerii de niacină U nele bacterii produc citocrom oxidază. Alcaligenes spp. în m ediul de cultură se va acum ula niacină. M. dar vom discuta doar una dintre acestea. j • ansă cu fir de platină sau pipetă Pasteur (cudată).5 ml brom ură de cianogen..se produce H 2S. T uburile rămân 1 oră la tem peratura cam erei. • M artor pentru pH acid la nivelul coloanei. produse com ercial). tuberculosis). rem arcăm apariţia unei culori negre la nivelul 3 m l) de N aO H 10 % în fiecare tub.12. Control de calitate Control de calitate • M artor pentru pH acid la nivelul coloanei şi pantei. coli. N iacina este solubilă în apă şi poate fi extrasă din Materiale necesare mediu (dc ex. coloanei. • absenţa culorii galbene. rul unei pipete P asteur ap ă distilată sterilă sau soluţie salină fiziologică. • este posibilă şi utilizarea altor tulpini martor. m ajoritatea speciilor de care poate transform a niacina liberă în acid nicotinic m ono-nucleotid. Cu ajutorul pipetei Pasteur (sau cu ajutorul unei anse) raclăm coloniile pentru a perm ite extrac­ • culoarea coloanei răm âne roşie . săptăm âni.jh . • M artor poziti \ . • soluţie de anilină 4% (conservată în sticlă de culoare brună la 2-8°C). în soluţie salină fiziologică) iar în reacţie cu brom uravde cianogen • soluţie apoasă de tetra-metil p-feniiendiam ină 1% conservată în sticlă d e culoare (atenţie la utilizare!) în prezenţa andinei rezultă un com pus de culoare galbenă. enterobacterie). la nivelul m inute pentru a o bserva apariţia culorii galbene în cazul reacţiei pozitive. înainte de pantei. • soluţie de brom ură de cianogen 10% (ar fi de preferat datorită riscurilor să uti­ • colonii izolate dezvoltate pe agar-sânge. A ceastă hem oproteină acţionează şi asupra unei substanţe. • apariţia unei culori galbene. P unem într-o cutie Petri un fragm ent de hârtie de filtru p e care depunem 1-2 pică- .Mycobacterium tuberculosis. enzim ă care lipseşte la bacteriile strict Principiu anaerobe. (dintre germ enii gram pozitivi) m icroorganism ele nu prezintă această enzim ă (ex. E xam inăm după 5 • interpretarea se face sim ilar pentru ferm entarea lactozei/zaharozei. Dacă Pseudomonas . reprezintă un test negativ. ' / Tehnica de lucru • folosim culturi (realizate pe m ediul L ow enstein-Jensen).5 ml anilină 4% şi respectiv 0. ducere de H 2S .glucoza nu este ferm entată (nu este ţia niacinei din m ediu.

tor şi apare. test pozitiv. ' \ ’ ‘ • M artor negativ . A vând la bază noţiunile teoretice învăţate. proprietăţile biochim ice ci are la bază caracterele antigenice (structura antigenică) M a te ria le n ec esare ale m icroorganism elor din specia Streptococcus pneumoniae. . I n te r p r e ta r e ' . . testelor utilizate în laboratorul de microbiologie. cu agar-sânge. medicii rezidenţi aflaţi la debutul pregătirii în spe­ « M artor negativ .1'v i. dar U ltim ul test pe care îl vom prezenta în finalul acestui capitol nu se bazează pe la concentraţii mai m art ale substanţei active.. pneumoniae. acest test.Streptococcus viridans.. • apariţia zonei colorate m ai tardiv nu perm ite interpretarea testului. cialitatea de m edicină de laborator. Testul umflării capsulei (Meufeld.pneu­ Plasăm un disc cu optochin în centrul zonei însămânţate şi presării uşor pentru ca dia­ m ococi c cu anticorpii anti-capsulari are o refringenţă superioară m ediului înconjură­ cul să adere uniform. tic sunt utile atât pentru studenţi. o absenţa culorii purpurie. prin m işcări circulare de m ică am plitudine.' '' C o n tro l d e ca lita te • apariţia unei zone de c u lo a r e purpurie în 10 secunde.Escherichia coli.14. sterilizarea şi ră­ cirea ansei. 12. . ca un halou clar dispus în jurul bac­ teriilor. necesare în diferenţierea Streptococcus pneumoniae de Streptococcus viridans) am ® colonii a-h em o litice izolate.. în aşa fel încât să rezulte o cultură confluenta (din motive de economie. î _ •.Streptococcus pneumoniae. . sem nifică un teist n e g a t i v . . prelevăm dintr-o colonie izolată şi descărcăm cultura p e hârtia de filtru © absenţa inhibiţiei în ju ru l discului sem nifică un test negativ. . cu diam etrul de 6 m ilim etri.deprinzând arta acestui diag­ la concentraţii scăzute (< 5 gg/m l) de optochin (hidroclorid de etU-hidrocupreină). D atorită faptului că nu există un capitol special al tehnicilor im unologice unde • discuri cu optochin (5 pg/disc)./ r: ar putea fi integrat.. însăm ânţarea s-ar putea realiza şi pe o pătrim e de^pjaclfPetri). nostic atât de util în practica m edicală la nivel individual sau populaţional. C o n tro l de ca lita te înţelegerea lor din punct de vedere teoretic precum şi utilizarea lo r în m od prac­ « M artor pozitiv . precum şi datorită faptului că în paginile precedente am prezen­ ® plăci. peste 130 de teste fenotipice.13. diferitele exem ple precum şi m anu­ P rin c ip iu alele care prezintă din punct de vedere practic diagnosticul m icrobiologic. l 34 Diagnosticul de laborator Tn microbiologie I* Teste de identificare pe baza caracterelor biochimice aie fungi lor şi bacteriilor 85 • ~~* ~~ ’ turi de soluţie apoasă de tetra-m etil p-fenilendiam ină 1%. T eh n ica de lu c ru r . ‘‘ ■■ ■ i\■:'h • cultura unei bacterii care se presupune că aparţine speciei 5. sem nifică un M a te ria le n ec esare . la exam inarea cu microscopul optic.1reprezintă tin test pozitiv. care urm ează a ii testate. După. pentru viitorii m edici din alte specialităţi cât şi pentru medicii şi biologii im plicaţi în diagnosticul de laborator la nivel clinic sau în 12. : . . cu diam etrul de iO mm). halou care are dim ensiuni mai mari decât haloul identificat prin m icroscopie I n te r p r e ta r e •' 17 (preparat colorat cu albastru de metilen) în lipsa serului anti-capsular. Incubăm timp de 18-24 ore la 35-37°C în atmosfera de 5% COg. * interpretarea este diferită dacă se folosesc discuri de optochin cu alte dimensiuni Urm ărim apariţia unei reacţii de culoare în interval de 10 secunde ' (ex.. in tim p ce alte tulpini sunt rezistente. spre exemplu. Testul sensibilităţii la optochin interesul sănătăţii publice. Unele tulpini ale altor streptoci care produc hem oliză viridans pot fi sensibile. Numai în vederea identificării dife­ ritelor specii mycobacteriene se pot utiliza. Quellung test) Prelevăm cu un tampon steril de preferat'2-3 colonii şi realizăm 6 insamanţare pe P rin c ip iu jum ătatea unei plăci cu agar-sânge. Com plexul antigen-anticorp form at în urma cuplării antigenului capsular . >• M artor pozitiv .Pseudomonas aeruginosa. în principiu Fără îndoială că aceste teste reprezintă doar câteva exemple din multitudinea este vorba despre un rezultat negativ.. ' ' v ' ■ •' :l ■■ tat testul bilolizei şi respectiv testul sensibilităţii la optochin (am bele teste fiind « tam poane sterile. decis să includem aici. fiecare M ajoritatea tulpinilor de pneum ococi (Streptococcuspneumoniae) sunt sensibile dintre cei im plicaţi va putea să aplice aceste elem ente. • apariţia unei zone de inhibiţie cu diam etrul mai m are de 14 m m .

' . vom discuta numai utilizarea sondelor o testul um flării capsulei se poate realiza şi pornind pe produs patologic. interacţiunea dintre gazdă şi m icroorganism ul parazit poate varia în de la respectiv prezenţa pneum ococilor.: opaleşcentă din cultura bacteriană în. . .tulpină capsulată de Streptococcus iţneupţqniae. m itor m icroorganism e etc). . mai bine definit şi de dim ensiuni mai m ari decât haloul anume pacient cu o boală transm isibilă. j.pozitiv faţă de serul polivalent. • nucleotidice şi tehnica de am plificare genetică. fie la curs sau în cadrul lucrărilor practice. clinice. ■1 o v . în acelaşi sens putem discuta şi despre „raportul" dintre testele „m icro­ • în cazul în care nu este sesizată nici o diferenţă între preparatul test şi prepara­ biologici clasice" şi testele „m icrobiologici m oderne" care se com pletează reciproc.5 ml soluţie de albastru de metilen.\ vin să com pleteze m etodele clasice care răm ân şi astăzi foarte utile. f 86 Diagnosticul de laborator în microbiologie * . .-VMSb'ţuţiv-■ v.Streptococcus viridans. indiferent de specialitate. H ibridizarea acizilor nucleici (AN) reprezintă unirea a. B. fie citind im presionanta docum entaţie care • realizăm o suspensie omogen.5 ml a apărut în acest dom eniu în ultimii ani. examinarea. în structuri bicatenare stabile.’ Tehnici de biologie moleculară • după identificarea unui test. la un juraţi de un halou clar. în m om entul de faţă. în condiţii potrivite de tem peratură. D e cele mai • am estecăm prin m işcări circulare cele 2 picături. . . . / ■ Subliniem faptul că nim ic nu trebuie absolutizat. în funcţie de A. să ştie că există şi aceste tehnici de identificare/diagnostic. . .ii Control de calitate '* *’ I. particular. seruri anti-capsulare m onovalente (de tip). o ser anti-capsular polivalent. fiecare dintre cei interesaţi se poate docum enta suplim entar. pH şi con­ centraţie ionică. în momentul actual se utilizează din ce în ce mai frecvent . încon­ pacient anum e (întotdeauna diagnosticul se va pune într-un caz concret. . • lam e şi lam ele. ••••■' • a ' A ceste tehnici au fost puse la punct din diferite m otive (creşterea sensibilităţii • depunem pe o altă lam ă de m icroscop o picătură din suspensia bacteriană şi în şi/sau specificităţii. Utilizarea sondelor nucleotidice • M artor pozitiv .. Subliniem din nou faptul că cititorul tre­ soluţie salină fiziologică şi adaugăm 0. .. caz la caz). opţiunile personale. • soluţie de albastru de m etilen (1%). O pinia noastră este că un viitor medic. la un • identificarea unor coci coloraţi în albastru.. : • soluţie salină fiziologică. > N oţiunile care urm ează nu au im portanţă din punctul de vedere al unui examen. Principiu o M artor negativ . 2 fragm ente de AN mono- catenare. 0. Din m ultitudinea tehnicilor existente. ’ de referinţă. acoperim cu o la­ ar putea fi considerate drept o „sensibilizare" faţă de vastul dom eniu al tehnicilor m elă şi exam inăm dim ensiunea haloului care apare datorită prezenţei capsulei. specifice de tip pentru a indentifica tipul capsular. . de laborator. * TESTE DE IDENTIFICARE RAPIDE/MODERNE o se pot utiliza şi produse patologice (ex. m ulte ori tehnicile de identificare m oderne sunt practicate numai la nivelul centrelor • aşteptăm 10 m inute (preparatul se m enţine în „cam eră um edă“). ar trebui să fie Tehnica de lucru inform at. im posibilitate cultivării anu­ stricta vecinătate a acesteia depunem o picătură din serul polivalent anti-cap. după caz. dispuşi izolat sau în pereche.. iar diagnosticul în m edicină Interpretare trebuie să ţină cont de datele epidem iologice. tul m artor ne aflăm în situaţia unui test n egativ . LCR). putem utiliza seruri m onovalente. fiecare pacient poate reacţiona într-un mod vizualizat prin exam inarea preparatului m artor sem nifică un test pozitiv. paraclinice. buie să fie conştient că în cele ce urm ează sunt prezentate doar câteva exem ple. obţinerea unui rezultat mai rapid. m etodele de testare/identificare/diagnosticare m oderne sular. care • depunem o picătură din suspensie pe o lam ă de m icroscop. m oderne care sunt la îndem ână. H ibridizarea este condiţionată de com plem entaritatea secvenţelor bazelor celor două catene. examinarea preparatului test <■•••.preparatuM m a r t o p . • m icroscop optic.

ducem pe rnd pentiu citire într-un luminometru....M. Lăsăm tuburile să se răcească la tem peratura cam erei după care le intro­ • sistem foto Polaroid. şi respectiv 5 m inute com plexul M. după izolarea m icrobiană în culturi) constituie o m etodă rapidă de detectare a diferi­ ţilor agenţi infeeţioşi. situată în prelungirea am orselor hibridate. dGTP. I • pipete autom ate P2. kansjisii • aparat de electroforeză. s* ului cromozomi al.. ' • primeri (am orse) pentru M. conduce la acu­ m ularea mai m ultor m ilioane de copii ale fragm entului de A D N definit de amorse. P20. condiţii de tem peratură precum şi prezenţa. gordonqe.°C • m icrocentrifugă şi centrifugă dotată cu sistem de răcire. . I «3 Teste de identificare rapide/moderne 89 88 Diagnosticul de laborator în microbiologie Control de calitate sondele nucleotidice m arcate ne-radioactiv.. kansasii. Tehnica de Amplificarea genetică * Polymerase Chain Reaction (PCR) evidenţierea reacţiei pozitive cu ajutorul unui lum inom etru. pentru o durată care variază în funcţie de apartenenţa ipotetică a tulpinii de testat şi • vortex (om ogenizator). .100°C. 8 m inute pentru M. hibridizării şi polim erizării pe m atriţa A D N -ului ţintă (utilizând un sistem automat.. ® în cazul com plem entarităţii dintre A D N -ul extras din tulpina testată şi sonda • am estec dN TP (dATP. • M artor pozitiv . polim eraza) vor perm ite copierea A D N-ului ţintă într-o catenă com plem entară ® vortex (om ogenizator). nucleotidică.Incubăm la160.. baie de apă cu ultrasunete (15 minute). într-un aparat construit în acest scop care se num eşte term ociclor). M. încălzim 1. ’ ' A D N . • tuburi cu substrat pentru liza celulelor m ycobacteriene. drept un exemplu. există şi alte variante tehnice. din com plexul M. M a te ria le n ec esare Transferăm 10 0 p l de lizat în tubul în care am pus reactivul „sondă" şi incubăm • term ociclor 15 m inute la 6 0 °C . M : avium şi M. reactivul 3 şi reactivul „sondă". A ceastă tehnică presupune utilizarea unor am orse oligonu- • baie de apă cu u ltra su n ete . ® tuburi cu medii de cultură solide pe care au fost cultivate m ycobacteriile de R epetarea procedeului. în condiţii diferite d e tem peratură necesare denaturării. tuberculosis. luminoasă. de laborator) vom utiliza: în identificarea tulpinilor m ycobacteriene aparţinând speciilor din com plexul M.' : 1 ‘ cleotidice specifice A D N -ului ţintă.. T ehnica PCR pentru secvenţe specifice de A D N (direct în produsele clinice sau • reactivul 1. avium. . ® lipsa em isiei lum inoase sem nifică o reacţie negativă.un tub în care nu se introduc celule b ac te rie n e. am orsele vor hibridiza cu secvenţe com plem entare de pe acestea. avium sau M. tuberculosis sau M. Putem începe identificarea tulpinilor mycobacteriene după apariţia coloniilor pe me­ tuberculosis de la 3-8 săptăm âni (cât durează cultivarea pe mediu solid) la 2-3 zile. identificat.Punem tuburile în m ycobacterii ne-tuberculoase („atipice"). tSs . avium precum şi speciilor M. transferăm în tuburi M etoda poate fi . mtmpel- • transilum inator UV. va avea loc hibridizarea şi respectiv va fi evidenţiată em isia • Taq A DN polim eraza şi tampon de am plificare. P200. reactivul 2. tuburi Eppendorf. tuberculosis.0 minute la 95°C pentru inactivarea mycobapteriilor.'. P1000.. după care adăugăm reactivul 3 şi vortexăm . .. • r ‘ ■ r *' Prin m etoda PCR se poate reduce timpul necesar diagnosticului infecţiei cu M. A num ite o lum inom etru „L eader". A cesta are la bază hibridizarea A D N-A RN 16s şi este utilizată raclinice. noi. dCTP. în funcţie deţproducător. .. în urm a denaturării term ice a catenelor de • aparat term ostat 50. tuberculosis sau de câte o ansă de cultură şi. dTTP). Vom prezenta în continuare. în scopul lizării bacteriene şi extragerii ADN. ." intracellulare şi M. kansasii etc. M. utilă şi în identificarea tulpinilor de M. lulare. pa- unei truse com erciale. vârfuri. reactivii necesari fiind produşi şi livraţi comercial. . Interpretare / • gheaţă şi Cutii pentru gheaţă. modul de lucru în cazul în funcţie de specia m ycobacteriană suspectată (pe baza altor criterii clinice..' :. După ce pipetăm primii 2 reactivi în tuburile de liză. diile de cultură. avium. ceea ce v a perm ite II. gordonae. anume: 10 m inute pentru com plexul M. Tehnica de lucru .agităm pentru omogenizare („vortexăm ").. avium. M.. unei polim eraze term ostabile (Taq ® pipetă m ecanică 100-1000 pi.. Reactivii utilizaţi au în com ponenţă un ester de acridinium . >• Principiu M ateriale necesare i . reacţia este pozitivă.. tuberculosis sau pentru M. • M artor negativ . .

Extracţia ADN-ului mycobacterian comportă următoarele etape: hibridizare la 50°C (2 m inute). a nucleotidelor 15. : . . ■ speed-vac (20-30 m inute). i:. exam inăm şi fotografiem în UV. adăugăm 20 pl bro- 4..3 M ) şi 2. aspirăm lichidul cu precauţie. am estecând într-un tub E ppendorf 5 pl din tat alb proteic la interfaţă). lic h id pleural etc) sau a cuL în m om entul utilizării. centrifugăm scurt şi depunem în 5. de cicluri de tem peratură. T aq polim eraza va 2. . 3. . supunem m igrării la tensiune constantă de 80V în T B E lx până când co­ 6.( 2. centrifugăm (la rece) 30 de m inute la 12000xg. .. prelevăm faza apoasă rezultnd un volum notat cu „X “ .. centrifugăm 15 m inute la 12000 xg. etanol 70% . turii. . fiecare ciclu constând din: denaturare la 94°C (2 m inute). •.. .al. în fiecare tub cu reactiv i vom intro­ şi a enzimei term ostabile T aq polim eraza. d in acest m om ent tubul de lucru trebuie m enţinut în perm anenţă rece (utilizăm în • apă bidjstilată sterilă. Taq D in punct de vedere practic. • m arker de greutate m oleculară (DNA ladder 1 kb).f . V] . preparăm am estecul de reactivi (se lucrează „în gheaţă").wjjjv/V* \nrţi. A ceastă etapă. . . într-un godeu al gelului depunem markerul de greutate m oleculară. . pentru a nu antrena şi sedim entul (precipitatul). 1. . 5 m in) urm at de un n u m ăr de 35 de cicluri de am plificare. .i ftjj jr'iiadaY î| precipitatul. ) . d u ce câte 2 picături d e ulei m ineral. ulterior. D etecţia fragm entului am plificat prin m igrarea produsului de am plificare neral vom include în tuburi şi ADN-ul.5 volume (raportat la volum ul X ) de etanol absolut.titc ■ ■ -■■■'i.. cicluri de am plificare urm ează o etapă de extensie la 72°C. prelevăm 500-600 pi din produs şi transferăm într-un tub Eppendorf de.:.. Confirmarea specificităţii reacţiei PCR 8. A m plificarea propriurzisă în cursul căreja A D N -ul este supus unei succesiuni fi scoasă ultim a din congelator. spălăm cu etanol 70% 600-1000 pi. ttirţ&iis.5 cm . nNTP ■ uo ». ţestul PCR pentru diagnosticul infşcţiilorm ycqbqc- polim erază la care se va adăuga A D N ru l„ex tras"] .. . j lorantul se deplasează circa 2. adăugăm acetat de 4 . avium+. :<4CI ' 14. suspendăm . turnăm gelul (folosim un „piepten" cu 15 dinţi). 10. genetică în gel.de agaroză 2% . soluţie «bleu». ‘ ' 1. între timp putem prepara am estecului de reactivi nece­ Tehnica de lucru sari pentru am plificarea genetică j [tam pon pentru Taq polim erază 10 X . teriene com portă 4 etape m ajore: . . pregătim probele pentru migrare. prelevăm cu grijă faza apoasă (superioară) şi o transferăm într-un alt tub m ură de etidium . amoniu 10 M.:M » tu a l o scurtă centrifugare • agaroză.. • ■ :• ■.: . fără să agităm tubul şi efectuăm even­ . a cărui secvenţă este derivată din secvenţa studiată (ex. în prezenţa am orselor (prim eri) specifice. m arcată neradioactiv. 3. i .. al doilea prim er (ex. . pentru liza peretelui m ycobacterian şi Vortexăm... 2. prelevăm ultim a fază apoasă şi o transferăm într-un alt tub Eppendorf. realizăm tratam entul term ic. extensie la 72°C (2 m inute). tuberculosis+ sau M. în prezenţa brom urii de etidium şi vizualizare după utilizarea radiaţiilor U . Mir 10mM .-Tratarea produselor c lin ic e (spută. . în acest S pecificitatea reacţiei s-ar putea controla prin hibridizare cu un oligonucleotid interval reglăm centrifuga la 0°C. • !■ « ' 7. în vederea lizei celulelor şi eliberării A D N-ului m ycobacterian. ap ă distilată.. primul prim er (ex.. / 4. în vederea adăugării A D N-ului „extras".. La sfârşitul celor 35 de 1.i: . 12. trecând cu precauţie p r in uleiul m i­ 3. . u nc'roi <!«}*« to . pientru a nu antrena şi precipitatul) şi Uscam • b ro m u răd e etidium. pH 5 (în aşa fel încât să rezulte în final o concentraţie de 0. .. ‘ 1 .. ' .. vor fi introduse în term o ciclo r şi sunt sondă specifică. jj. centrifugăm 15/ininute la 12000 xg..V.. adău­ godeurile gelului. 13. r . • 9. Confirm area specificităţii reacţiei PC R prin transferul fragm entelor am plifi­ cate din gelul de agaroză pe o m em brană de celuloză sau nylon şi hibridizarea cu o T uburile cu reactivi şi A D N -ul purificat. găm un volum echivalent de cloroform -alcool izoam ilic (24:1). 1S6110). i m arcat. 11. eventual repetăm extracţia cu fenol (până când nu m ai apare un precipi­ 2. ' cloroform -alcool izoam ilic. M T ]).. Eppendorf. • ADN M. fie sub protecţia hotei biologice (cteva ore) fie cu ajutorul unui aparat • tampon pentru electroforeză. ( ■ 90 Diagnosticul de laborator în microbiologie Teste de identificare rapide/mpderne • ADN de am plificat. 3. ’ • I. aspirat bronic. fenol saturat cu Tris-ED TA .. 1. turnăm un gel de agaroză 1 % în care după răcirea la 50°C. supuse unui ciclu de denaturare iniţială (94°C. .. am estec de acest scop o cutie cu gheaţă). 10 min.j. produsul de am plificare cu 3 pl soluţie «bleu»..A D N ru l extras în 50 p l apă distilată şi îl congelăm (-20°C) până 1.-om:.5-2 ml. ulei miner.. : 4.V .. M T 2).se realizează în term ociclor.. Detectarea fragmentelor amplificate prin reacţia PCR adăugăm un volum echivalent de fenol saturat cu Tris-ED TA . Amplificarea propriu-zisă : . aspirăm etanolul (cu precauţie. doar înainte de includerea ei în am estec. (rezultatul se poate fotografia). . introducem tubul (tuburile) de lucru pentru 10-30 de m inute la -70°C.

iiiy ^ u m • determ inarea prezenţei m anozei şi D -arabinolului la pacienţi cu candidoză sis • din cauza sensibilităţi foarte crescute a reacţiei de polim erizare în lanţ (am pli­ tem ică (G C -FID ). v ■' \ţ ■! 1 T oate m etodele crom atografice necesită existenţa unei faze m obile şi unei faze IT ’ . problem ă de diagnostic (TLC.!!': j. cu bacterii angerobe (GC-FID).. . un ăm plicon. în plus.d e m ăsuri care să • determ inarea prezenţei acidului -hidroxim iristic. v UK ju h ! Câteva elemente tehnice • Martor negativ .i: *' 1..i>biv. ■ . o adevărată flux lam inar dotate cu surse de lumină UV pentru inactivareă A D N conta. M S-SIM ). Cromatografia reprezintă o tehnică de separare şi/sau identifi­ faze. .o singură folosire). *■■* . . tuberculosis (Mt308).. -iii :Kf.i li V . standard (GLC) etc.10) este reprezentată d e un Prin tehnici cromatografice se pot identifica anumiţi compuşi care sunt în m od carac­ ăm plicon (produs de am plificare genetică) având o dim ensiune de 201 pb în teristic asociaţi cii 'agefitul etiologic al unei anum ite boli transmisibile. ficarea unei singure m olecule ADN) trebuie luate o serie. . una mobilă şi alta staţionară. rozici în cultură de 5 zile. .! lichid sau un solid. spre exemplu: tim p ce pentru M. . D iferitele com ponente ale unui am estec se absorb în m od «Iile renţiat la o suprafaţă sau se dizolvă în m od diferenţiat în cele două faze imişcibile. reactivi şi am estecurile pentru reacţie în spaţiile în care • identificarea acidului tuberculostearic în spută sau LCR şi/sau acizilor m icoce- so m anipulează produşii PC R . se recom andă c a diferitele etape să fie exe. ■>: .. Identificarea rapidă a unor microorganisme • sc lucrează num ai cu m ănuşi care se schim bă frecvent. aerosoli." .de preferat într-un spaţiu* de congelare special destinat acestui scop. în două faze.i* ■it niim n t.ffii .tub cu toţi reâctivii în âfafâ de ÂDN. etc) există diferite tehnici crom atografice. care conţine toate com ponen­ nul Mycobacterium (H PLC).. '■* «K "■ . tele reacţiei de am plificare cu excepţia'A D N .92 Diagnosticul de laborator în microbiologie 13 Teste de identificare rapide/moderne 93 Interpretare . sem nificând o infecţie • o reacţie pozitivă pentru M. tuberculosis (1561. 1 -A f staţionare. . lichid pleural etc pentru a diferenţia inflam aţia bacteriană de cea ne-bacteriană • (GC) etc.. pentru diagnosticarea infecţiilor produse de myco- eiitate în cam ere separate.■->:-1 îxiuî nevolatili) în puroi.. este recom andată folosirea h o te lo r cil bacterii. • determ inarea prezenţei acizilor graşi cu lanţ lung (ex.v::» 1 . . Cromatografia a început să fie utilizată încă din 1905. G C.. 2. . M S.ADN extras din tulpina'de referinţă pehtru 'M : tuberculosis. adsorbţie. etc (TLC. fiecare acid pus în evidenţă într-o anum ită cultură este identificat prin com parare cu datele dintr-o crom atogram ă Control de calitate . acesta'se pregăteşte ultim ul • analiza produşilor de m etabolism (acizi organici cu lanţ scurt. . teristici pentru Mycobacterium spp. • nn se prepară A D N .ţvi . . schim b de ioni cromatogramă cu ajutorul căreia se pot face analize calitative sau cantitative. pornind de la produse patologice sau cultură • o reacţie pozitivă pentru M.având o . acizi m icolici). extracţia com puşilor din am estec dintr-o fază sau alta se va face cu eficiente care a unor structuri chimice aflate în amestec. partiţie.:.*• . Prin realizarea acestei tehnici rezultă o In funcţie de fenom enul „utilizat" (absorţie. lichid pleural..K J .. lichid de ascită. . A şa cum am enum erat m ai sus (între Tehnicile cromatografice se pot utiliza în microbiologie în următoarele scopuri: paranteze) tehnica crom atograficâ se alege şi în funcţie de substanţa care urm ează . lichid de ascită etc. -Ui1. !.i j. este reprezentată de un ăm plicon • identificarea şi analiza unui am estec de acizi graşi cu lanţ s c u rt (volatili şi avand o dim ensiune de 276 pb .. *»i’'?. carac­ • reactivii se păstrează în-eşantioane m ici (de regulă pentru . . ... spre exem plu unei infecţii cu bacterii gram negatice (GC.. H 37r v.?»)1’ V-'Ş 1‘. GC).iînsă metoda a. Nocardia spp. alcooli) pentru etc. I î : n :. Faza m obilă poate fî un gaz sau un lichid.de. dimensiune de 205 pb. dacă acestea au solubilităţi diferite diferite. identificarea bacteriilor strict anaerobe. Faza staţionară poale ii un Tehnici cromatografice " ^ im .fost mujt Pentru că fiecare com pus are o anum ită solubilitate specifică în raport cu celo două îmbunătăţită în timp. M S). m etoda ar fi extrem de utilă în m eningita tuberculoasă. • determ inarea unor concentraţii crescute de acid lactic în LCR.. Diagnosticul rapid al infecţiilor. • analiza acizilor m icolici care perm ite identificarea a peste 40 de specii din ge­ • întotdeauna se include un tub-m artor negativ. t .•. pentru a dem onstra existenţa provină contam inarea cu acizi nucleici exogeni. • Martor pozitiv . .^avium e ste reprezentată . >V i î .:■.:jţoii tJnxr iii !>.

în acest scop trebuie să ne punem cel puţin -.. ’ ■•.b :)jj urii.jrJ i-. deţectareg unor. m ril'd Rezistenţa dobândită este „achiziţionată1* de anumite subpopulaţii-dintr-o anumită specie . . Precizarea căii şi modului de administrare pentru antibioticul ales. Rezistenţa naturală este determinată: genetic. 'j PP: î h: -. Ji ■ ' •• .J ! il i :. M odul de detectare pentru diferitele m olecule este şi el diferenţiat în SI » CHIIVIIOTERAPICE funcţie de sem nalul biologic (determ inare şpectrofoţom etrică a absorbanţei lum inii în funcţie de concentraţia substanţei.'fi. minime asupra celulelor organismului gazdă. antimicrobiene s e ...'d :/:0..■ .iţi . : h k ' V ţ medicamentoase capabile să distrugă sau să blocheze multiplicarea microorganismelor (în î'î ri'l.'(U ■:> 'iii .• h 2. T i i . în acest scop trebuie să avem în ■'î ■ i):> vedere: a. 1' i i ' f . d. medicamentele..iU i ' . ■ •: :■■ •' . Selectarea tul­ .. . e. x\ • •nfî'iî. de exemplu antibioticul acţionează ca un presor selectiv.('li' U : .> •• <■ !OI|l . în spitale. : 'I. b.t• •• •i.o. duce la variate aspecte negative: infecţii cu germeni rezistenţi.!.** = spectrometrie de masă (mass spectrometry). .i Rezistenţa poate fi naturală sau dobândită. substanţe care se colorează prin diferite tehnici etc). Testarea sensibilităţii la.: capacitatea de a supravieţui şi de a se multiplica în prezenţă medicamentului antimicrobian). Diagnosticul de laborator în microbioîogie 94 TESTAREA SENSIBILITĂŢII LA ANTIBIOTICE a fi analizată. jr. AV. f . a . este necesară’. : ■:. :■ i.. . MS . a i sbi':1' extinderii rezistenţei multor microorganisme la antibiotice şi‘chimioterapice (rezistenţa = . O O O ’■ .-i» ’i i ' i v i .!.datorită apariţiei şi /iT. este în discuţie o infecţie certă sau foarte probabilă? b. notificarea şi evaluarea statistică. i r continuare vom utiliza numele de „antibiotice" pentru ambele tipuri de produse medica­ ..P P p i " ■\ • ‘'. liif. .'.' ' tatea microorganismelor implicate etiologic..i. . publicarea periodică a datelor şi punerea lor la dispoziţia sistemului sanitar. .1 ■■ .i: î i c-Vi U P i ^ y P iii sro ri : t j . Se ia decizia de a recurge la antibioterapie.■ ‘ .posibilitatea şi oportunitatea utilizării unor asocieri de antibiotice etc. "î. . Este strict necesară supravegherea fenomenului de rezistenţă la antibio­ tice şi chimioterapice.= gaz lichid cro­ vedere didactic) în a cincea etapă a diagnosticului de laborator microbiologic.. alte unităţi sanitare • ■. care este I: u -/■ ** ■ ' • . .( . . i i r i " i . . testarea sensibilităţii germenilor. 3.. în continuare vom discuta numai despre medicamentele antibacteriene şi antifungice. pentru majori­ matografie: ( v -'. ’•. realizează (din punct de matografie de înaltă performanţă (high performance liquid’chromatography). „ t i t f.o: v.1 4' Alegerea corectă a antibioticelor în tratamentul bolilor infecţioase . j' -‘ ■< . UU următoarele 2-întrebări: a.il •.vipii sb awfţprris >ums i.fi : o pinilor rezistente (adeseori datorită unor abuzuri de prescriere. ■Vii v=-î».î'i'i. .’>i/t *• GC = gaz cromatografie. ».ionilor (selected ion monitoring).»Tî T ■h ivi» î i microbianâ. '(•rifcv'ijjsdri hi U ih > . SIM = monitorizare selectată a.in.. ■ '. testarea sensibilităţii la antibiotice.i ? i.. I . devalorizarea şi pierderea unor medicamente antimicrobiene etc. apariţia şi transmiterea „germenilor de spital11. « . r) u u . 1. GL€. .' ■ t. ni. ■. ţji.■ i i i)i. ii. exercitând acţiuni (! i£i. . • : .»«-I mentoase). epideiniologice şi administrative ale fenomenului de rezistenţă bacteriană la antibiotice şi chimioterapice sunt extrem de mari. Etape de urmat în vederea instituirii corecte a unui tratament cu antibiotice •.vSŢHlf "i îri lo i. terapeutice.:)U -nî in .1 . f m î ><:■ .: o<i . .-vcnm. delectarea pH -ului. ■:.-»*. Testarea .i i / ’ .t)myftiwî.!■■■ ./ n b■iî „terenul11pe caras-a instalat infecţia (este o gazdă normo-competentă imunologic)? • I. TLC = cromatografie in strat subfire (thin layer chrbmatography).•smji-r.’ sau prin auto-medicaţie). ' '-ii/ . .. ? ■’ / VrV/ : U ' p î .. F I D * detector qu ionizare în flacără (flam e ionization detector).. .iţi. :i'ţi : '. i ti iii'i'tţ.... •' -• : • •.rj : i î t d A i Modificări ale spectrului antimicrobian iniţial U .Vţ î i i .Jiu: |a. Au o acţiune'selectivă asupra celulelor microorganismelor. w . HPLC''='lichid cro. li-i.:P "tiri ii. ' • • ) i: . c. r ‘{ -î *.sj >. p: *. în circumstanţe date. stabilirea diagnosticului etiologic. .' . pro­ prietăţile farmacologice ale antibioticelor propuse pentru a fi folosite.'iik'. •• f. ’./ fijua'tn 1 t St 1 . Se aleg antibioticele care urmează a fi prescrise. of rf ir oi o vil Antibioticele şi chimioterapicele antimicrobiene reprezintă un grup de■substanţe a P P ‘ ' X r . criteriul economic..\\ 1 •A l .t i u ''.■ .ii': K Implicaţiile clinice. .

monitorizată corespunzător). . nu cunoaştem foarte bine situaţiile în care antlbioticoprofilaxia este utilă şi recomandabilă. Este incorect să • metode şi sisteme comerciale. nu tre­ • metoda diluţiilor în mediu lichid buie nici subestimată şi nici supraevaluată. de specii sau de tulpini („mutante") bacteriene cu1rezistenţă la antibiotice şi înmulţirea reacţii­ lor adverse fală deaceste medicamente. . o tulpină poate fi considerată sensibilă atunci când germenii sunt în mod efi­ clinice. implicarea acestora în diferitele. . automatizate de testare etc.entităţi clini­ bolnavii cu infecţii bacteriene. utilizarea unor căi de şi confirmat prin studii de laborator. "• • ■■■’ ' Muelier-Hinton) turnat în plăci Petri. Este incorect ca atunci când avem un dubiu cu privire la decizia pe care urmează (există şi alte variante tehnice). . Principalele probleme sunt reprezentate de un număr imens administrare speciale/injectare intravenoasă. .j ..scop profilactic trebuie. în cursul unui tratament „la întâmplare" sau „pe încercate".m u : ' . difuzibilitatea în focar. în acest sens fiind necesar.n. .nefunda. dozarea antibioticelor în ser etc). •i i . după cultivare pe medii speciale (de exemplu pe agar ce. a cărof examinare poate dura uneori • antibiograma difuzimetrică standardizată doar 5 minute. Este incorectă prescrierea unui medicament antimicrobian în afara contextului (şi Pentru antibiograme trebuie să folosim culturi pure (reprezentând o singură tulpină bac- interpretarea corectă a datelor de laborator). ni ucUm. pentru a alege întotdeauna cea mai bună capacul întredeschis în vecinătatea becului de gaz. aseptic. Muelier-Hinton). iar efectul terapeutic poate fi obţinut cu doze şi pe căi de Erori frecvente în utilizarea antibioticelor administrare „obişnuite". . Indiferent de specialitate este necesară cu­ teriană). chiar în cazul infecţiilor multibacteriene. care contribuie la evitarea erorilor în Din punct de vedere tehnic însămânţăm germenul de testat pe mediul solid (ex. Tulpina va fi considerată moderat sensibilă dacă germenii sunt afectaţi într-o măsură mai mică. Ck rezultat se dbnkta't'ăiapariţia că o tulpină este rezistentă dacă rezultatul testării sensibilităţii in vitro este negativ. . care ţin cont de relaţia agent terapeutic-infecţie. (. . aprins) se aplică microcomprimatele în variantă posibilă. fiziopatologie. . sumar de urină etc). Nu trebuie să uităm că în supiciunea unei infecţii avem la îndemână posibilitatea efectuării • antibiograma difuzimetrică comparativă de preparate între lamă şi lamelă şi frotiuri colorate. folqşirea raţională a medi­ Deoarece între rezultatele testării in vitro şi efectul terapeutic in vivo pot exista anumite camentelor antimicrobiene deja existente. Nu • Tehnicile calitative se va (începe antibioticoterapia înainte de recoltarea produsului patologic şi de efectuarea • antibiograma difuzimetrică comună (cu discuri) unor examene paraclinice elementare (leucogramă. . intrarahidiană etc).reacţiile adverse posibile.' \ ’[ ‘‘ ‘ M etode de testare a sensibilităţii bacteriilor la agenţi antimicrobieni Soluţia cea mai bună pentru prevenirea acestor problemei este.S a. metodele de testare a sensibilităţii pot fi diferenţiate în: cele mai frecvente erori în folosirea antibioticelor. .-ir.. permiţând în scurt timp obţinerea unui rezultat orientativ. elementare de microbiologie.j> ■: • testul „E“ 4. 2. unei infecţii". în mod absolut se consideră de prescrieri abuzive şi de folosirea iraţională a unor antibiotice. . însămânţarea se poate realiza de exemplu prin „inun­ darea" plăcii urinată de aspirarea. . metode in vivo. Oferirea criteriilor de. metode de testare a sensibilităţii in vitro 1. Cele mai frecvent utilizate tehnici sunt: noaşterea şi utilizarea în mod corespunzător a unor noţiuni. farmacologie. . radiografie. După circa 20 minute (timp în care placa Petri se lasă cu să o luăm să nu ne consultăm cu alţi colegi. VSH. uneori foarte • antibiogramele difuzimetrice rapide important. Este incorectă utilizarea'antibioticelor în -lipsa unui diagnostic clinic. metodă care nu trebuie interpretată mecanic. încă din al doilea an de studiu se obţin primele date referitoare la testarea sensi­ • Tehnicile cantitative bilităţii la antibiotice (antibiograma). privită cu rezerve. medicamente în orice „stare febrilă" (temperatura trebuie. semiologie medicală. folosirea acestor b.ytk^ nril. A ntibiogram a difuzim etrică comună 3. medicină internă.probabili­ Antibiograma face parte din prima categorie de metode menţionate.dot -. . a excesului de inoculsau cu ajutorul unui tampon 6. în „bănuiala. Utilizarea antibioticelor în. • metoda „punctelor de ruptură" mecanismul de acţiune. Reprezintă metoda tate este o datorie a centrelor naţionale de referinţă care trebuie să realizeze şi să publice peri­ de laborator prin care se apreciază sensibilitatea la antibiotice a germenilor recoltaţi de la odic studii privind circulaţia tulpinilor microbiene. cient afectaţi de către antibiotic. ameliorarea simptomatologiei) şi de laborator (examene para- în general. prescrierea unor doze mai mari decât cele „obişnuite". agar conducerea tratamentului sau/şi greşelile în tehnica de administrare. Metode de testare a sensibilităţii in vitro mentat pe criterii raţionale (cel puţin criterii de probabilitate). Este incorect să nu cunoaştem şi să nu utilizăm corespunzător noţiunile şi datele • metoda microdiluţiilorîn agar privind spectrul antimicrobian. sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor izolate etc.'folosirea antibioticului1de elecţie..96 Diagnosticul de laborator în microbiologie 14 Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice 97 Controlul terapiei antimicrobiene se va realiza pe tot parcursul administrării şi va Testarea sensibilităţii la agenţi antimicrobieni cuprinde metode clinice (ex.m ■ nnmm . iar efectul terapeutic nu poate fi obţinut decât în condiţii Antibiotico-terapia se află într-un impas constatat clinic prin numeroase eşecuri terapeutice speciale (ex. Este incorect să nu acumulăm cunoştinţele necesare de microbiologie.. • metoda diluţiilor în agar 3.: .. să cunoaştem care sunt diferenţe. . ...i> .

. .. care mai exercită o acţiune bacteriostatică marcând pe partea externă a plăcii liniile de demarcaţie) se inoculează în treimea medie asupra germenului testat. sau cu ajutorului un apli.. umiditatea atmosferei de incubare. Microcompriniatele • se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins între 7. la +4°C). din aceeaşi specie (sau o specie asemănătoare). în funcţie de diametrul zonelor de inhibiţie a multi­ plicării celor doi germeni.4). ex. Plasăm şi până la 0. exprimată în micrograme/ml. reprezintă cea mai mică concentraţie de agent Din punct de vedere tehnic. ganisme (ex. cu •ajutorul unei pense le • există suplimente nutritive care trebuie adăugate în cazul testării Unor microorga­ presăm uşor (după cai).din tabelele puse la dispoziţie de producători şi/sau centrele de referinţă). 11 . plus 2 tuburi martor. la 28 sau 35-37°C. fără antibiotic (cantitatea finală microcompriniatele cu antibiotice pe liniile de demarcaţie dintre culturi. în ziua următoare citim şi interpretăm rezultatele.. în condiţii aseptice. • interpretarea rezultatelor (se măsoară diametrul zonei de inhibiţie şi se compară rezul­ Prin această metodă se înlătură o parte din factorii de eroare ai metodei precedente. spre tatele cu ceje. Dacă în interiorul zonei de inhibiţie (phiar turbiditate corespunzătoare standardului turbidimetric 0.la bulion Mueller-Hinton în concentraţii descrescânde (diluţii binare) pornind spre ex. cu toate că este folosită pe scară largă în laboratoare. Cu'cât zona de inhibiţie este mai largă. pentru cocii grain pozi­ tivi putem alege pentru comparaţie o. o inoculul. menul va fi considerat rezistent.> ■:• i . permite de fapt plăci suprapuse). • timpul de incubare (în majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37°C. Pentru controlul Din punct de vedere tehnic se realizează asemănător cu prima metodă prezentată. dar care să nu fie confluente. diluţia finală va fi 16 pg/ml). inţă.. (de ex.. . pentru Din punct de vedere tehnic. Incubăm cele 8 tuburi cu antibiotice şi 1 tub martor timp de 16-20 ore la 35-37°C. ( . de la 32 pig/ml apariţia după incubate a unor colonii foarte apropiate. microorganismul de referinţă iar în treimile exterioare 2 microorganisme diferite.5 McFarland (circa IO8 unităţi dacă diametrul înregistrat este foarte mare) se dezvoltă colonii. calitatea discurilor de antibiotice. Deoarece am utilizat o canti­ care permite obţinerea unor rezultate reproductibile şi corelabile între laboratoare difeţite. atunci cator „automat" (la minim 30 mm distanţă între ele şi minim 15 mm de ntarginea plăcii. în funcţie de temperatura optimă de multiplicare a microorganismului testat. calitatea mediului. CM1 = concentraţia minimă inhibitorie. pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa. Antibiogram a difuzim etrică com parativă (Stokes. pe o placă de forma tmtri'pătrat („împărţită" în 3 zone egale antimicrobian. . trebuie să vină în contact perfect cu mediul. Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzează în'm ediu. Mg2+ şi Ca2+. 1• li? z .. • există elemente minerale care trebuie adăugate în cazul testării anumitor microor­ matelor se poate face cu ajutorul unei pense. tulpină de Staphylococcus spp. în tubul martor menţi­ corespunzătoare şi nu conţine substanţe cu acţiune înmbitoare). Agităm pentru a omogeniza. nisme pretenţioase.125 pg/ml. ger­ formatoare de colonii/ml) în majoritatea cazurilor. pentru că are o valoare nutritivă tubul martor menţinut la +4°C ar trebui să nu fie prezentă creşterea. faţă de acdaşhmtibiotic (jumătăţile de cerc se examinează com­ Metoda diluţiilor în mediu lichid parativ). După încă115-20 minute. vom când este testată sensibilitatea la aminoglicozide). Spre exemplu. concentraţia finală de antibiotic se va înjumătăţi Elementele necesare standardizării surit:__ ^ . în cazul în care cunoaşteiiTCMI (concentra|j«'mTnimă inhibitorie) a microorganis­ Oferă informaţii cu privire la CMI ale antibioticelor studiate.98 Diagnosticul de laborator în microbioiogie care sunt încorporate antibiotice în concentraţie standardizată. iar al doilea Antibiograma difuzim etrică standardizată (Kirby-Bauer) tub martor îl menţinem pentru aceeaşi perioadă la temperatura frigiderului. în total 8 tuburi. • păstrarea plăcilor cu mediu până în momentul utilizării (maxim 7 zile. „mutanţi rezistenţi". Rezultatele se exprimă cu termenii: ale antibioticului la nivelul focarului infecţios. în pungi de poli­ Se efectuează pentru microorganismul de testat în paralel cu un microorganism de refer­ etilenă.• comprimatelor (6 mm diametru). faţă de microorganismul mului de referinţă. „intermediar". care se obţine de preferat din 5 colonii izolate (cultură pură)'trebuie să aibă o cu atât germenul va fi considerat mai sensibil. pentru că tehnica nu este standardizată. testat. Aplicarea microcompri. atmosfera de incubare. cu câte 1 ml de inocuj. numai eliminarea antibioticelor complet inactive şi eventual selecţionarea antibioticelor • concentraţia substanţelor antimicrobiene din microcomprimate şi dimensiunea micro- foarte active. care vor fi identice pentru microor­ Metodele difuzimetrice au dezavantajul că nu permit aprecierea concentraţiilor eficace ganismul de referinţă şi pentru microorganismul testat. Balş) • alegerea substanţelor antimicrobiene pentru care se face testarea. realizând zone de • grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm (25 ml de mediu/placă de 9 cm).. în tuburile inoculate cu tulpina de referinţă trebuie să avem rezultatul corespunzător datelor pe care le cunoaştem privitor la respectiva . o sensibilitate cunoscută la diferitele antibiotice pe care le utilizăm. aseptice inoculăm'toatei cele 10 tuburi. Inoculul trebuie să fie astfel realizat încât să conducă. inhibiţie în care coloniile microbiene nu se dezvoltă./dar de calitate utilizăm şi un şir de tuburi pe care le inoculăm cu o tulpină de referinţă cores­ este standardizată.2 şi 7. nut la 35-37°C creşterea trebuie să fie prezentă. tate de inocul egală cu cantitatea de mediu. pentru fiecare antibiotic avem nevoie de mai multe tuburi cu care dorim să realizăm testarea. fiind singura metodă difuzimetrică recunoscută pe plan internaţional. „sensibil". putem face apretseri-mi privire M CM Ipentru microorganismul testat. . în tubul în care diluţia iniţială a fost de 32 pg/ml. „rezistent". Preparăm un inocul standardizat turbidimetric şi în condiţii noapte la 35-37°C urmând ca în ziua următoare să citim şi interpretăm rezultatele.Tulpina de referinţă are • utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate.. nu mai mult de 2-3 Această metodă. incubăm plăcile peste noapte în termostat. în © mediul (în majoritatea căzuţilor agar Mueller-Hinton. motiv pentru care. punzătoare. Incubăm peste va fi de 1 ml în fiecare tub). ' . " / '’'i "/1" . utiliza 5 antibiotice diferite pentru o placă Petri cu diametrul de 9 cm).

Pornind .5 şi 1. - Determinarea CMI şi CMB este extrem de . eficacităţii • scoatem plăcile cu mediul de cultură şi benzile Etest din congelator. luiui bacterian. geloză sânge etc). t-fu-vA /: >-V. • tulpini martor. le lăsăm la tem­ antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene. pentru ajustarea inocu. . • păstrăm restul benzilor în tuburi în care introducem o substanţă desicantă pentru. se păstrează în congelator la -20°C. funcţie de specia microbiană) că microorganismele în cazul cărora CMI este <3 pg/ml vor • tampoane sterile. incubarea în atmosferă îmbogăţită respunzător numărului de tuburi fără creştere microbiană. B. gradientul riană de 18-24 de ore într-un tub cu soluţie salină sterilă sau bulion. se păstrează C. atunci benzile din interiorul ei nu se mai Determ inarea CM I p rin testul E (E test) . severe (de exemplu endocardite. • ajustăm (vizual) densitatea folosind soluţie salină sterilă 0.5 mg cationi de mag- neziu/litru. tă la lumină (punem tuburile în congelator.aprecierea. =<.. în plăci.5 McFarland..0. Inocularea plăcilor: ®medii de cultură pentru menţinerea în stare viabilă. este uşor de utilizat şi spre deosebire de metoda difuzimetrică permite determinarea valorii CMI. însămânţăm în condiţii aseptice cu CO 2 este necesară în cazul testării anumitor microorganisme. pot folosi. se repartizează câte 5 ml în tuburi sterile cu capac. . suspensia se poate ajusta la standardul dorit cu ajutorul unui nefelometru (aprecierea vizuală a turbidităţii inocu- • plăci Petri cu agar Mueller Hinton (păstrate la 2-8°C până în momentul utilizării)^ . inspectăm pentru a observa dacă există perforări.lichid. fecă de-a lungul liniei întrerupte apoi între compartimentele ce conţin benzile. pentru a deschide o folie mai intâi tăiem cu o foar­ E test reprezintă o metodă de testare in vitro a sensibilităţii la antibiotice pentru diferite mi. . să incubăm timp de 2-8 1024 pg/ml. . .i u. Petri. omogenizăm acoperă un şir continuu-'de concentraţii între 0. plet suprafaţa mediului (ex. este necesară protecţia şi faţă de căldură şi expunerea direc­ Asemănător metodei dîfuzimetrice. sursă de inocul tuburile în care dezvoltarea microbiană a fost inhibată^ Este necesară o placă • plăci Petri sterile cu diametrul de 90 mm şi respectiv de 150 mm. D eterm inarea CMB (concentraţia minimă bactericidă) • pipete Pasteur sterile. efectuarea acestei metode este indispensabilă.002-32 jig/ml. rotind placa cu câte o treime). inhibiţie. . .•«. se vor utiliza ca •. au o durată de utilizare de 1-2 ani (pentru microorganismului corespunde CM1.Î0-12.064. la -20°C). * bulion Mueller Hinton (cu 20-25 mg caţioni de calciu şi. E: test le putem aplica pe mediul de cultură care conţine inoculul microbiah de testat. fiecare în secforitl deplăcă cbrespunzator. (există şi varianta să transferăm mai multe colonii în bulion. . distrus microorganismele însămânţate (sectoare de placă fără apariţia culturii). Pentru tratamentulinfecţiilor peratura camerei pentru echilibrare termică timp de 20 minute sau până când nu mai observăm nici o urmă de umezeală. rotim efectuării controlului de calitate. . inclusiv pentru bacteriile pretenţioase şi germenii anaerobi.»foarfece. După incubare (timp de 16-18 ore la 35-37°C) se formează o zonă eliptică de ore până când obţinem densitatea dorită). pentru că CMI diferă în prima grupă) şi respectiv de 2-3 ani. în funcţie de antibiotic. f de câteva ori.85% NaCl) sau bulion Mufeller Hinton... septicemii etc).. lului nu garantează numărul corect al unităţilor formatoare de colonii). Se consideră (în general. Valoarea CMI se citeşte acolo unde creşterea bacteriană intersectează banda Etejist.t. apoi eliminăm excesul de lichid prin presarea tamponului de pereţii inte­ riori ai tubului. CMB va corespunde ultimei-concentraţii de antibiotic care a • aplicator Etest şi bandă adezivă (opţional). fi eficient inhibate de către antibioticul respectiv şi in vivo. • depunem inoculul pe suprafaţa plăcii cu mediul de cultură având grijă să acoperim com­ o soluţie salină sterilă (0.85% sau bulion. E test se aseamănă • scoatem benzile din folie cu ajutorul unei pensete şi le punem în plăci Petri sterile. E test necesită un inocul bacterian ajustat ca turbidi. 0. Incubăm ■ • sursă de lumină. cu agenţi antimicrobieni cu nucleu (3 lactam. dacă folia respectivă nu este intactă. Se consideră Tehnica de lucru: că antibioticul va fi eficient in viyo dacă în serul pacientului se pot atinge concentraţii de A. Benzile Etest conţin un gra­ • cu ajutorul ansei sau a unei pipete. Petri cu agar MiieUer-Hiftton care va fi împărţită în sectoare. meningite. la un stan­ M ateriale şi reactivi necesari: dard de turbiditate echivalent cu 0. a tulpinilor bacteriene necesare • introducem tamponului steril în tubul care conţine suspensia bacteriană de testat. .1 100 Diagnosticul de laborator în microbiologie • benzi Etest (a. apoi metodei diluţiei în agar combinând principiile metodei dîfuzimetrice cu cele de diluţie.4 Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice 10. mediul Mueller-Hinton. inoculăm pe 3 direcţii diferite. pentru 16-18 ore la 35-37°C. a le Principiu: proteja faţă de umezeală. cu alţi agenţi antimi- tulpină. ultima diluţie care a inhibat dezvoltarea crobieni).de la rezultatul obţinut prin metoda dîluţiilpr în mediu. . croorgahisme. • înainte de a deschide folia care include benzile.i ' . ce urmează a fi depus pe mediul de cultură potrivit microorganismului stu­ diat (ex. . ' • •/ a inocul bacterian.importantă pentru. din fiecare tub fără creştere microbiană. precum şi la imunodeprimaţi. i 1 . transferăm mai multe colonii dintr-o cultură bacte­ dient de agent antimicrobian se aplică după însămânţate. b. alternativ. u. numărul de sectoare fiind co­ • incubator cu atmosferă obişnuită reglat la 34-35°C. dacă nu sunt probleme. în tuburile cu microorganismul testat. .016-256 pg/ml sau 0. • standard de turbidîtate McFarland de 0. Inoculul bacterian: tate (standardizat). Benzile Etest antibiotic care să depăşească de 4-8 ori CMB.

apucăm cu grijă de căpătui benzii notat cu Etest).. dacă se. metode radiometrice etc. teste acidimetrice. . este depus agentul dacă zona de inhibiţie nu intersectează banda (zona de inhibiţie se află sub banda antimicrobian. • rezultatele C M ! se interpretează conform'criteriilor stabilite de NCCLS (National • dacă lucrăm cu plăci cu diametrul de 90 mm.. '■ o .când mediul este Mueller-Hinton). • putem citi rezultatul în cazul în care creşterea bacteriană este confluentă sau aproape confluentă. • în caztil unei valori CMI situată între două marcaje ale gradientului benzii. Mueller Hinton sau alt mediu opac. rezultatul rul Etest. . pe gradient până la capătul notat cu E (prezenţa bulelor mici nu va afecta rezultatul • se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid.. înainteide a aplica benzile Etest. • Testarea sensibilităţii fungilor (antifungigrama): Interpretarea rezultatelor: 1 ® ţine cont de temperatura şi durata de incubare. • Testarea sensibilităţii la antibiotice a bacteriilor anaerobe: • banda trebuie să fie în contact cu suprafaţa agarului.( 10 2 Diagnosticul de laborator în microbiologie 1 4 Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice • lăsăm placa timp de circa 10 minute. • în cazul în care nu apare nici o zonă de inhibiţie. mediu lichid. . o . Incubarea: •• • timpul şi temperatura de incubare depind de combinaţia microorganism-agent antimi­ » există şi alte bacterii pentru care trebuie respectate condiţii particulare... metoda proporţiilor. . eliminăm eventualele bule de aer o metodele sunt utile în special din punct de vedere al supravegherii epidemiologice.. pentru testarea sensibilităţii la antibio­ • incubarea în atmosferă de CO 2 modifică pH-ului mediului de cultură şi poate afecta activitatea agenţilor ăntimicrobieni. Streptococcus pneumoniae etc). se lozei (care indică situaţiile în care vor fi efectuate aceste testări). :r. vom utiliza pentru citirea rezultatului o sursă de • se pot utiliza teste iodometrice. sau gfeloză şocolăt care pot produce p-lactamază (ex. raportăm valoarea CMI caifîind mai D.i Iui>. teste cu cefalosporine cromo- lumină reflectantă şi o lupă. cu capătul ce conţine concen­ pentru tulpina de referinţă (control de calitate). pe care îl notăm va fi valoarea cea mai mare. . • spre exemplu pentru testarea sensibilităţii stafilococilor la oxacilină/meticilină se recomandă ca mediul să conţină 4% NaCl. dacă ®este utilă atunci când se verifică sensibilitatea la antibiotice a microorganismelor am utilizat agar Mueller Hinton suplimentat cu 5% sânge de oaie. Haemophilus spp. f ■ ■ m n i i v-.. testul E... cu plăci cu diametrul de 150 mm. ca să se usuce.-dacă folosim pensa sterilă... . putem aplica şase benzi Etest (benzile se pun la dis­ tanţe egale. . întoarce şi se pune corect pe suprafaţa mediului. traţia cea mai mare aproape de marginea plăcii. » se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid. crobian ce urmează a fi testate. hemolizei. • Testarea producerii de P-lactamaze: • ţinem placa lângă o sursă de lumină (atunci. metoda o substanţă lichidă. există şi metode puse la punct pentru testarea sintezei de P-lactamaze cu o pe geloză-şânge citim zona de inhibiţie a creşterii bacteriene nu zona de inhibiţie a spectru extins (BLSE). teste pentru producerea de p-Iactamază etc. • raportăm rezultatul obţinut pentru tulpină studiată după ce verificăm rezultatul obţinut • aplicăm banda Etest pe suprafaţa mediului de cultură. dacă banda â atins suprafaţa mesei de lucru sau un alt obiect. V . . Aplicarea benzilor Etest: mare decât cea mai mare concentraţie a agentului antimicrobian de pe banda Etest. . agentul antimicrobian de pe pârtea posterioară se eliberează imediat). marginea capătului' benzii noţâtâ cu E Alte metode de testare trebuie să atingă marginea plăcii). valoarea CMI se raportează ca fiind mai mică decât concentraţia cea mai E (benzile trebuie să fie complet separate una'de cealaltă’înainte’de a' le aplica pe scăzută a agentului antimicrobian de pe banda Etest.. • Testarea sensibilităţii altor bacterii: E.. f rapoartelor de rezistenţă. 1 . care diferă faţă de cele pentru bac- • terii. suprafaţa mediului de cultură inoculat cu tulpina de testat). » se efectuează respectând prevederile Programului naţional de control al tubercu­ dacă banda a fost aplicată cu partea posterioară în sus atunci se apucă cu grijă. aplicăm una sau două benzi. pornind din centrul plăcii. nismele supuse testării necesită pentru multiplicare CO2 (Haemophilus spp. se poate folosi în continuare atâta timp cât nu!a luat contact cu • se pot utiliza metoda concentraţiilor absolute. Staphylococcus aureus etc). mediul utilizat fiind mediu! Sabouraud. • luăm cu grijă o bandă fără să atingem sau zgâriem partea pe care. dacă lucrăm Committee for Clinical Laboratory Standards). radial. Neisseria gonorrhoeae.citim valoarea CMI în punctul în care creşterea bacteriană intersectează banda Etest. j gene etc. banda adezivă trebuie să fie în poziţia corectă (la fiecare capăt al aplicatoru.. se foloseşte numai în cazul în care microorga­ tice a streptococilor se recomandă ca mediul să conţină 5% sânge defibrinat de berbec etc. de sub bandă cu ajutorul undi pense începând de la mărginea bulei' şi tnutând-o în sus dar sunt rezervate pentru laboratoarele de referinţă. tehnici de microdiluţii în testării). •.foloseştejaplicato.. . • banda aplicată' pe suprafaţa agarului nu se mută în altă poziţie (luând contact cu me­ • Testarea sensibilităţii mycobacteriilor: diul de cultură.

se determină diluţia cea mai înaltă de ser care mai manifestă capacitate bactericidă. • forţe electrostatice (coulombiene sau ionice)/energie de legare 5 kcal/mol. pre­ cum leucograma. genic (epitop) cu situsul de combinare al. LCR sau alte umori. au pe suprafaţă un număr mare de epitopi repetitivi: Ag. . specifice utilizate pentru apreciera eficacităţii terapeutice sau pentru . • determinarea NEI (nivel de eficienţă inhibitorie) pentru ser. examenul sedimentului urinar. Cu cât ertergia de legare a reactanţilor este mai mare. spre exemplu • legături de hidrogen/energie de legare 3-7 kcal/mol. • legături van der Waals/energia de legare 1-2 kcal/moR •-legături hidrofobe. proteina Bazele moleculare ale interacţiunii Ag-Ac C reactivă etc. ATB şi rapid ATB) sau sisteme semiautomate (ex. posedă mai mult decât un epitop. pentru a forma legături stabile.complementaritatea structurală dintre epitop şi paratop (reacţia este specifică). deoarece forţele de atracţie sunt active numai pe distanţe foarte mici şi sunt diminuate de forţele de respingere. . paraclinic şi prin teste de. culare. Afinitatea anticorpilor se poate măsura prin dializa la echili- "brii. Complexele Ag-Ac formate de .) ■ Dintre metodele. Complementaritatea structurală sau forjele intermoleculare nu sunt suficiente fiecare în Sparte. pentru testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice. . de tipul „cheie unui bolnav tratat cu antibiotice de a inactiva un inocul conţinând germenul infectant.. poliza- haridele etc. examenul citologic al LCR. este necesară îndeplinirea ambelor condiţii. LCR sau alte umori. O interacţiune cu afinitate înaltă presupune structuri complementare perfecte.. Interacţiunea dintre epitop şi. Factorii care condiţionează. Energia totală de legare a epitopilor multipli ai unui Ag.antigenf(Ag) §1 anticorp (Ac) necesită interacţiunea determinantului anti­ evaluarea eventualei nocivităţi a medicamentelor folosite.mo­ lecule de anticorpi. De exemplu.complementaritatea electrochimică a grupărilor care intră în reacţie este p consecinţă a • determinarea nivelul de antibiotic realizat în sânge. bacteriile.terapeutică poate fi apreciată clinic. pu­ . . proteice au epi- topi multipli. Antigenele multivalente leagă un număr echivalent de. cu atât complexele Ag-Ac sunt mai stabile. dar diferiţi. Afinitatea este rezultanta forţelor de atracţie şi de respingere care mediază interacţiunea celor doi reactanţi. pentru stabilizarea legăturii intră în acţiune forţe intermole- metode microbiologice. VSH.. .LCR sau în alte umori (prin complementarităţii structurale.. Aviditatea caracterizează energia medie de legare a unui Ag multivalent cu Ac specifici şi măsoară forţa rezultantă a afinităţii dintre epi- topîi multipli ai unui Ag şi paratopii complementari. Există unele criterii nespecifice de laborator care sunt utile în aprecierea eficienţei terapeutice.. paratop este definita de 2 parametri (afinitatea şi aviditatea anticorpilor). forţe nespecifice cu' valoare mică. uti­ ÎN MICROBIOLOGIE lizând criteriile de interpretare NCCLS. HPLC etc).. Metode de testare a sensibilităţii in vivo şi de apreciere a eficienţei terapeutice Eficienţa. • Afinitatea măsoară forţa de legare dintre epitop şi paratop.104 Diagnosticul de laborator Tn microbiologie Exista şi sisteme automate (ex. enzimâtice. ATB REACŢII ANTIGEN-ANTICORP UTILIZATE Expression sau miniAPi). cu para- topii specifici este mult superioară în comparaţie cu energia separată a fiecărei inter­ acţiuni dintre epitop şi paratop. anticorpului (paratop). • Aviditatea este un parametru dl interacţiunii Ag-Ac care rezultă din multivalenţa Ag. Cele mai multe Ag.. laborator. Reacţia dintre. vom enumera: . care sunt legături necovâlente. în broască". în timp ce complementaritatea imperfectă a grupărilor reactante determină o afinitate scăzută. . com­ terea bactericidă a serului celor trataţi (NEB) măsoară capacitatea diluţiilor din serul plementaritatea presupune adaptarea conformaţională a celor două grupări. interacţiunea Ag-Ac sunt:- o determinarea NEB (nivel de eficienţă bactericidă) pentru ser.

.' . sau în declanşarea unor reacţii de hipersensibilitate (ex. în reacţia de hipersensibilitate de tip I). Din punct de vedere diagnostic. RIA) . botulinică etc). solubile şi se pot desprinde uşor).. •r Ag posedă anumite grupări determinante comune). Interacţiunile terţiare pot conduce la un rezultat pozitiv (protecţia gazdei) sau negativ (degradare tisulară). In vivo. • reacţii de. fi puse în evidenţă 'prin nefeiometrievln • chemiluminiscent (chemiluminişcent assay... . insolubil.. . CLA). 1 Tipuri de reacţii Ag-Ac ] 1 în funcţie de natura antigenului.«’• .şi depind în special de anumite variabile care sunt caracteristice gazdei. un Ag reacţionează cu un Ac care a • reacţia de fixare a complementului (RFC) fost sintetizat faţă de un alt Ag (aceste reacţii pot apărea de ex. (în diagnoşticul serologic al infecţiilor ştreptococice) galactoză).. FIA) ' reactanţii se află în interacţiune primară pot. • cazul tipurilor de reacţii care vor fi discutate în capitolele următoare. reacţiile Ag-Ac în care • fluorescent (fluorescent immunoassay. manifestările interacţiunilor seciindare sunt dependente de natura reactanţilor şi de condiţiile de reacţie.. ..îepţospirozei etc . . Datorită faptului că Ag poate avea mai mulţi epitopi iar Ac are.Vl l:!u • /' I' ". Y*. . • reacţia.a n t i c o r p >s y >r: « . interacţionează între ele formând complexe secundare. reacţia Wright) în anumite cazuri pot avea loc reacţii încrucişate. pentru inhibarea activităţii unor bacterii sau virusuri. Nu vom detalia aceste. . • Interacţiunile secundare apar la circa 30 de minute: după interacţiunile primare.106 Diagnosticul de laborator în microbiologie 1 5 Reacţii antigen-anticorp utilizate în microbiologie 10 7 antigenele multivalente sunt stabile.. târ serul imun' mti-Escheri. solubile.. • reacţii cie seroneutralizare ' '' . ’ ■: harid capsular de Streptococcus pneumoniae aglutinează eritrocitele umane de grup A (cu specificitate' antigenică 'conferita de :N-acetil-găîactozamină).. Din punct de vedere diagnostic. • izotopic (radio immuno assay. ELISA) de cantitatea şi'afinitatea Ac.i f ţ i n ■.{-Wh'ViC:? . In vivo aceste interacţiuni sunt spre exemplu necesare şi suficiente în vederea neutralizării unor exotoxine circulante i(difterică. minim 2 paratopi complexele pri­ mare mici. precipitarea în inel Ascoli etc) ruperea tuturor legăturilor existente. reacţiile Ag-Ac în care reactănţii se află în interacţiune secundară pot fi puse în evidenţă prin tehnici care vor fi enume­ rate în finalul acestui capitol şi discutate în capitolele următoare.* :Spre exemplu. datorită faptului că anumite ■dai • în diagnosticul.■. deoarece esţe necesară • pot avea loc în mediu lichid (reaeţia Ramon. mult mai stâlpii depât complexele primare. disocierea lor fiind dificilă. serul imun ariti-poliza- ’i » îri diagnosticul serologic al infecţiildrivirale etc *v • .. interacţiunea pri­ mară nu devine vizibilă (complexele Ag-Ac sunt de dimensiuni mici. i " • reacţii în care componenţele sunt marcatei.:.• chia coli aglutinează eritrocitele umane de grup1B'(cu spedificitate'ănfigenică conferită'de . a. . iStadiile reacţiilor a n t i g e n . . după cum urmează: •/ • reacţii de precipitare • pot avea ioc în gel (imunodifuziaradială simplă Mancini. dubla difuzie Ouchteriony etc) sau . : vţi. metodele aplicate pentru vizualizare. produsul final fiind un complex Ag-Ac ca o reţea tridimensională. scopul urmărit există mai multe tipuri de reacţii Ag-Ac..a!i‘ • : •-n»: m w w » diferite intradermoreacţii cu mecanism imun umoral etc .. trims.1(1'' ui • Interacţiunea primară se datorează legării efective a Ac de Ag şi depinde în mod direct • enzimatic (enyzme linked immuno assay. A S t0 . aglutinare. • • Interacţiunile terţiare definesc manifestările in vivo ale reacţiilor Ag-Ac. • se pot folosi în diagnosticul bacteriologic (ex.. reacţia Huddleson) sau Reacţii încrucişate • se pot folosi în diagnosticul serologic (ex.aspecteîn‘materialul'deifăţă.serologic al sifilisului.

care. martor. metoda Mancini) ta soluţia antigenică. . f.l! •. 109 1». Reacţii de precipitare în care difuzia în gel este combinată cu migrarea în câmp electric REACŢIA » DE PRECIPITARE • Imunoelectroforeza. Spre exemplu pentru titrarea toxinei difterice (Ramon) se pun în contact. de la un animal care a decedat şi pentru care se suspecta că decesul a fost produs de o infecţie « Dozajul nefelometric etc j generalizată cu Bacillus anthracis. Cunoscând titrai anticorpilor. Din punct de vedere tehnic vom utiliza 3 tuburi. se află imediat titrai toxinei (1 Lf = / limes floculans = cantitatea de toxină care se combină cu o unitate de antito- Clasificarea reacţiilor de precipitare xină = 1 UA = 1 unitate antitoxică).5 ml soluţie salină fizio­ logică iar în al doilea tub martor vom pipeta 0. 1 pentru reacţie şi 2 tuburi o Difuzia dublă . superiori Ac de tip Reacţii de precipitare în amestec IgM cu 10% glucide).) iJ e■ Reacţia Ag-Ac de precipitare poate avea loc în mediu lichid sau solid şi constă în unirea . Cantitatea maximă de precipitat se găseşte în tubul unde există cută diferitele situaţii legate de prezonă (exces‘de Â6)i1exces'relâtiv. •« c • Eiectroforeza urmată de imunofixare. carne (în industria alimentară). Fragmentul de organ se mojara în soluţie de clorură de sodiu sterilă. eXces relativ de Agşurespectiv post-.anticorpi anti-toxină difterică (ca şi în valenţă (Ag şi Ac se găsesc „în totalitate" în precipitat). astfel încât se poate observa relativ uşor tubul în care apare optim ă.anumiţă „cantitate" de Ag şi Ac. în primul tub martor vom pipeta 0. soluţia de antigen se prepara pornind de la organe (de ex. complex? antigen-anticorp.a (i'i Dny. După decantarea şi alcalinizarea cu NaOH. determinarea grupului streptococic etc.5 ml soluţie de anti- • metoda Elek • difuzia dublă radială (Ouchterlony) .J' j ! ‘ !iJ (i'l'. Ac puţin giicozilâţi. rezultând.anticorpi anti-toxină tetanică).jar Ag. în raport cu Ac). în amestec în tuburi. ■ Demonstrativ.'irth ou •<. reacţia care apare la interfaţa dintre Ag şi Ac se concretizează printr-un inel de RPR (Rapid Plasma Reagin) etc. în diagnosticul serologic al sifilisului. Reacţiile de precipitare se pot clasifica după cum urmează. v ' ' l . ■: i». formându-se complexe Ag-Ac. cantitatea cea mai importantă de precipitat.-iîK lifii J .participă la formarea agre­ cantităţi egale din componenta care trebuie titrată (toxina difterică.5 ml ser normal de cal şi 0. de tip IgG cu 3% glucide. cunoscând titrul toxinei. Reacţii de precipitare în mediu lichid Ag solubile cu Ac specifici.5 ml ser anticărbunos şi 0. realizarea reţelei Ag-Ac este necesar ca în reacţie să intre o.ih-m ih-Aiit w * • Electroimunodifuzia.i J ahthracis). Pentru anumite sisteme Ag-Ac va fi definită şi noţiunea de proporţie „suprapune" peste proporţia optimă. USR (Unheated Serum Reagin). adăugându-se ulterior câteva picături de acid acetic.'l'b j'i. în medicina legală) şi pentru identificarea provenienţei unor preparate pe bază de • reacţia Ascoli. prin metoda Dean şi Web se poate determ ina titru l anticorpilor Reacţii de precipitare în mediu lichid anti-toxici. care nu devin insolubile Au la bază unirea Ag cu Ac în mediul lichid.î •fi'-. supune: un Ag cel puţin trivalent pentru amplasarea Ac. reacţii de floculare. care să se găsească într-un anumit raport/prpporţie. apoi se menţinea la temperatura de Reacţii de precipitare în mediu gelifiat i fierbere timp de 5-10 minute. splină) recoltate • determinarea prezenţei tipului M streptococic (streptococi de grup A) etc. Pentru sistemul toxină difterică . cazul sistemului toxină tetanică . Istoric. Reacţii de precipitare în inel • titrarea toxinei difterice (metoda Ramon).M U) ii l ?i■ i-'-î/Vtiîţ'î'i of. în cursul lucrărilor practice. raportul de echivalenţă se zonă (exces de Ag). care vor şi stabile decât în cazul formării unei reţele tridimensionale. determinarea titrului Ac antitoxici etc. Ag) cu cantităţi variabile de gatelor sunt într-o cantitate proporţional niai mică. nutr. titrul toxinei este de 10 Lf. Se utilizează pentru identificarea originii petelor de sânge (reacţia • Reacţii de precipitare în inel Uhlenhut. urma filtrarea şi rezul­ I' ®Imunodifuzia radială simplă (ex.de. un Ac bivalent şi condiţii Fizice favorabile precipitării (ex. constă în punerea în contact a Ag şi Ac astfel încât să nu • VDRL (Venerai Disease Research Laboratory). Dacă spre exemplu precipitarea maximă apare în tubul în care titrai anticorpilor este de 10 UA. • Reacţii de precipitare în amestec. reacţia de precipitare în inel (reacţia Ascoli) se poate utiliza pentru identificarea prezenţei antigenului cărbunos (Ag obţinut de la Bacillus • determinarea prezenţei proteinei C reactive.'.ii vuriiib ••• Reacţia de precipitare între Ag şi Ac se poate cuantifica şi este foarte utilă pentru a demon­ Reacţia de precipitare este sensibilă şi specifică în evidenţierea1prezenţei' Ag (pentru stra prezenţa şi respectiv absenţa precipitatului în funcţie de concentraţiile relative de Ag şi Ac. precipitare albicios. • Contraimunoelectroforeza.Ac^| . conform teoriei reţelei care pre­ precipita atunci când Ag şi Ac se găsesc în anumite proporţii. se amestece. • Reacţii de precipitare în tub capilar j.z6hâ de echi­ raportul de echivalenţă. în mod asemănător. ‘.. Reacţia de precipitare în inel.*b«-*.> . în cadrul cursului se dis­ Ac la care titrai este cunoscut.

în ceea ce priveşte tubul de reacţie trebuie să pipetăm întâi 0. cu diametrul de 5 cm) în care se toarnă un gel cară include referinţă care conţine CRP. pentru IgA culoarea este albastră.5 mm ne-toxigenă (martor negativ) şi tulpini de cercetat.no Diagnosticul de laborator în microbiologie 16 Reacfii antigen-anticorp: reacţia de precipitare 111 gen.1 Această metodă permite depistarea capacităţii toxigene a unei tulpini de Corynebac- cu stratul de gel poziţionat în sus. migrarea reactanţilor unul spre celălalt deter­ mină formarea unor linii de precipitare la locul de întâlnire Ag-Ac. Deoarece „scurgere picătură cu picătură". apărea linii opace.. în care pot să migreze cei doi reactivi (se va utiliza o anumită con­ teina. la interfaţa dintre cei 2 reactivi apare un „inel" de precipitare. în cameră umedă (într-o cutie Petri putem pune o culoare roşie. siderofilinei etc.ser antidifteric. iar după pentru celelalte componente. câte un striu (de fiecare parte a şanţului) pentru în loc de 6 mm.6 mm pentru IgCÎ ică în concentraţie de 1. Cantitatea de ser introdusă în fiecare godeu este de central şi godeurile 1 şi 2) sunt una în continuarea celeilalte (imagine de „genunchi îndoit"). în godeul 2 există CRP. avem nevoie de un ser cu Ac anti-CRP.află sşrulpe diametre. în aşa fel încât cele 2 soluţii să nu mărimea moleculelor de Ag şi Ac este mai mică decât diametrul porilor gelului. dar urmărim zilnic apariţia culturii şi precipitatului citirea diametrelor. IgM. Sunt necesare seruri de cercetat şi un pitare pot deveni vizibile după 2-4 ore dar sunt mult mai clare după 24 de ore. Dacă spre exemplu dorim să determinăm prezenţa proteinei C reactivă (IgG. fica prezenţa exoantigenelor fungice (Histoplasma capsulatum. va duce la vizualizarea reacţiei Ag-Âc printr-un arc/linie de precipitare. dacă obţinem o valoare de 50 Ul/ml pentru IgG. între godeul central şi Ul/ml pentru fiecare dintre cele 3 imunoglobuline). în celelalte godeuri pipetăm serurile de cer­ şi spre exemplu. Blastomyces dennatidis. pentru siderofilină culoarea este portocalie bucată de vată îmbibată în soluţie salină fiziologică. Dubla difuzie Elek După 10 minute de nienţinere a plăcuţei pe masa de lucru aceasta se incubează la 37°C. După. în şanţul respectiv pipetăm 0. fiecare Ag care urmează a fi testat. în gelul transparent vor Reacţii de precipitare în mediu geiifiat . în gel sunt perforate mici godeuri (3 mm diametru).5 ml din seruî anticărbunos.de cercetat se scad. pentru maxim o săptămână). Metoda permite determinarea cantitativă a imuppgl^ulinelpr cu diametrul de 3 mm). centraţie de agar în soluţie de’tampon veronaî. toxina va difuza în mediu. se poate face direct citirea diametrelor cercurilor de precipitare pentru serurilejde Corynebacteriwn diphteriae toxigenă (martor pozitiv).. Citirea se realizează cu ajutorul unei rigle gradate. anticorpi. De-a lungul liniilor de însâmânţare apare cultură bacteriană.să corespundă. ser care conţine Ac anti-toxină difter­ referinţă iar rezultatul obţinut trebuie. în caz contrar este necesară o „corecţie" (dacă spre exemplu diametrul este 6. spre exemplu în diagnosticul serologic al unei aspergiloze invazive.5 ml) să fie pipetată foarte lent. IgA). decupăm un şanţ pe unul din măsura iniţial diametrul cercului de precipitare din jurul godeului în care se . ^ :: . determinând Sunt necesare lame de microscop pe care se toarnă un gel de agar 1%. Ac anti-toxină difterică vor difuza în mediu. Corynebacterium diphteriae toxigen. după circa cursă de reactant într-un anumit timp este direct proporţională cu gradientul concentraţiei sale 5 minute. în micologie. toxina (Ag) difuzează în mediu. proteine Bence-Jones tip kappa şi lambda. alături de lama respectivă). Este certificată prezenţa CRP în cazul în care cele 2 linii de precipitare (dintre godeul de proteina care urmează a fi determinată.aşteptărilor (de ex. alfal-anţitripsinei. fiecare tulpină.. Se pot evidenţia alfa-fetopro- Utilizarea gelozei. Diluţia serului de referinţă se face în funcţie nr.o cantitate conştantă de. Coccidioides immitis etc) sau prezenţa Ac faţă de Ag fungice. Pentru a obţine un cerc de precipitare de mărime convenabilŞ. iar distanţa par­ se amestece. numărul lor corespunzând numărului sistemelor Ag-Ac studiate. pipetăm Ac anti-CRP în godeul Ac faţă de structura a cărei concentraţie dorim să o determinăm. lama putând fi folosită apariţia unui cerc de precipitare al cărui diametru este direct proporţional cu concentraţia de pe parcursul unei zile (dacă acest lucru nu se poate îndeplini. unirea cu Ac anti-toxină. în cazul în care de realizează diluarea acestora. timp de 24 de ore. lama trebuie păstrată în camera antigen din probă. ..000 Ul/ml. IgA şi siderofilină şi respectiv 1/2 ex. După circa 2 ore care a fost diluat 1/4 şi astfel are concentraţia'de 25 Ul/ml). Din cultura de nută se înmulţeşte cu diluţia probei (spre ex. în gelul de pe lamă se perforează traţia Ac înglobaţi în gel trebuie să fie aleasă în funcţie de titrul acestora şi de coî^enţraţia 3 grupe de godeuri. proteina C reactivă. de fiecare parte a şanţului. ser de referinţă în care se cunoaşte concentraţia diferitelor componente (spre ex. Această metodă este încă frecvent utilizată pentru Imunodifuzia radială simplă (Mancini) şe pazează pe ciifuzia spontană şiiradială a Ag din determinarea specificităţii anticorpilor antinucleari sau a altor anticorpi în patologia umană. Imunodifuzia radială simplă (IDRS Mancini) j. o tulpină de Corynebacterium diphteriae cercetat. o tulpină de aşteptat. seruri de cercetat şi un ser de Sunt necesare plăcuţe (de ex. beta-2 microglobulina. prin imunodifuzie se poate identi­ migrarea). Se va într-o cutie Petri turnăm mediul Elek şi după ce mediul s-a întărit. pe peretele interior al tubului. eventual prin Imunodifuzia dublă se bazează pe difuzia Ag şi Ac (unul spre celălalt) într-un gel.0. proba de cercetat. la temperatura frigiderului. plastici.5 ini. într-un gel care conţine. în cazul în care tulpina este toxigenă. Incubăm Ia 37°C. va apărea un arc de precipitare şi între godeul central şi godeul pentru IgM. o riglă specială pentru această analiză (demonstrat în cursul lucrărilor practice). Unirea dintre Ag şi Ac duce vom înmulţi cu 4 pentru a obţine rezultatul real). Liniile de preci­ etc.5 mm). înainte de pipetarea serurilor în godeuri se godeurile 1 şi 4 (martori pozitivi) vor apărea linii (arcuri) de precipitare. în cazul că rezultatul este cel însămânţăm perpendicular pe şanţul cu Ac anti-toxină. în cazul reacţiei pozitive (prezenţa Ag cărbunos în soluţia antigenică).iar cifra obţi­ (liniilor de precipitare). godeu central şi 6 godeuri periferice. în aşa 'fel încât porii getului şâ permită produşi de degragare ai fibrinogenului etc. timp de 48 ore pentru IgA şi IgM şi respectiv-24 de ore terium diphteriae.: concen­ umedă. fracţiunii C3 a complementului. Imunodifuzia dublă radială (Ouchterlony) urmând ca soluţia de antigen (în cantitate de 0.câte 100 Pentru citire poate fi necesară o lupă şi o sursă de lumină. complement C3 şi alfal-antitripsină. diluţia fiind 1/4 pentru IgG. Incubăm la 37°C pentru 48 ore. câte 7 godeuri în fiecare grup (1. 5 pi (un godeu pentru serul de referinţă şi restul pentru serurile de cercetat).Vi . plăcuţele care vor fi utilizate pentru determinarea concentraţiei âe IgG au cetat. Există un cod al culorilor central şi ser de referinţă cu CRP în godeurile 1 şi 4. din valoarea obţinută pentru serurile. Metoda certifică prezenţa sau absenţa proteinei cercetate.. se compară rezultatele cu cele puse la dispoziţie în tabele. complexele Ag-Ac vor'da naştere unor linii de precipitare. (CRJP) în seruri de cercetat. 2. Numerotând godeurile periferice. şi invers proporţională cu greutatea sa moleculară. . din.

se-elimină cantităţi. prezenţa acestuia poate fi evidenţiată de ex. care conţine o cantitate constantă de anticorpi monospecifici (atiti-proteină ahti- plină cu micropartieule de sticlă.. Deplasarea proteinelor într-iiri strat de gel care. faţă în faţă.în godeul catodic se găseşte Ag presupus) poate. pe scurt. 112 Diagnosticul de laborator în microbiologie ia formarea unor complexe Ag-Ac care precipită. hematiile se depun în porţiunea inferioară a coloanei. partea în care se introduc reactivii (situată superior) şi o coloană situată inferior. .este supiis acţiunii unui câmp electric se va realiza diferenţiat.. pentru iden­ tificarea enterobacteriiior (Shigella. Pentru vizualizare este necesară bilă. ce­ Contraim unocîectroforeza lule) de către Ac specifici. inhibarea aglutinării. după ce în preala­ fost utilizată din punct de vedere istoric pentru identificarea prezenţei Ag HBs. în Contraimunoelectroforeza reprezintă. iar îrr mediu.electric. urmată de o imtinodifuzie dublă utilizând un antişer în coloană şi aglutinarea mediată de Ac anti-imunoglobuline. respectiva tulpină este toxi- genă. Ag-Ac se va putea vizualiza la nivelul coloanei. coloditi etc) sau naturale sunt „încărcate" in vitro cu Ag sau Ac şi sunt agluti­ (polul pozitiv) pipetăm Ac cunoscuţi. unor proteine’patologice.-în funcţie Aglutinarea este mai sensibilă decât precipitarea.întâmplă. latex. Există mai multe variante tehnice de aglutinare. a căror arie este diirect „incubare'a" acestora. prin imunoelectroforezâ.. Ulterior vom discuta reacţiile corespunzător).. determinarea CRP. Aglutinarea directă reprezintă aglutinarea Ag naturale ale unor particule (bacterii. celălalt este amplificată fie câmpul. hematii.concentraţia antigenului. pentru deter­ a Ag şi Ac este. Pe o lamă de microscop se toarnă un gel de minarea grupelor sanguine (ABO) etc. specifici Ag pe care dorim să-l identificăm. dispozitivul este centrifugat. Se utilizează în principal pentru mai rapidă şi mai sensibilă decât dubla difuzie deoarece migrarea celor doi reactanţi unul către decelarea factorului reumatoid. Se poate uti­ bil Ac reacţionează cu Ag corespondent. Metoda poate fi utilizată pentru acele structuri antigenice care în câmp electric migrează către anod. o componentă monoclohală). metodă foarte utilă în studierea purităţii unui Ag (sau Ac). Ag fiind o particulă şi nu o moleculă solu­ de greutatea moleculară şi încărcătura electrică !a proteinelor. Reacţia va fi negativă pentru martorul negativ şi pentru tulpinile de cercetk rie-toxigene. A glutinarea îri coloană •.în dubla difuzie Ouchterlony. rezultând zone de precipitare în'formă de rachetă sau conuri. gită acută (Haemophilus’influenzae. în cazul unei reacţii pozitive complexul proporţională cu . aglutinarea indirectă.^ ’*'> Câteva tipuri de aglutinare Im unoelectroforeza • ‘ V. pentru fiecare structură proteică-în' parte. în cazul în care. Metodafa Reacţia constă în inhibarea aglutinării particulelor „încărcate" cu Ag. coli etc) pe baza structurii antigenice.destul de A glutinarea directă importante de Ag K. Anticorpii de tip IgM sunt mai aglutinanţi decât Ac de tip IgG (pentru că au mai multe fixarea. Reacţii de precipitare în care difuzia în gel este combinată cii migrarea în câmp electric ■’ 1 In reacţia de aglutinare antigenele sunt de n atu ră corpusculară. în timp ce în cazul unei reacţii negative.precipitare între godeuri. determinarea grupului streptococic etc. nuare. . .: .. ^or apărea linii de . aglutinarea directă. Salmonella... bruceloză etc). Eiectroimunodifuzia : a * . Este o de aglutinare utilizate în bacteriologic şi micologie. o dublă difuzie în care deplasarea unul faţade celălalt diagnosticul serologic al unor boli infecţioase (febră tifoidă. Există şi Ac neagiutinanţi (hicompleţi/blocanţi) sau care aglutinează numai la rece. determinând aglutinarea acestora prin scăderea Electroforeza proteică în gel este folosită în laboratorul de i'munbehimie pentrit'decelarea forţelor electrostatice de repulsie dintre particule şi formarea unor punţi de legătură. Datorită faptului că-în boala pneumococică prin urină. îhtrfun mente. Reacţia (apariţia.fi citita.după numai Inhibarea aglutinării 30-90 minute în loc de 24 de ore aşa cum se. în godeurile care vor fi pozi­ Este o reacţie în care particule artificiale (globute roşit formolate. Neissena meningitidis. Etreptocbccfs pneumoniae). de ex. particule de latex. linii de. Se poate utiliza în diagnosticul bacteriologic.n jj •. Reacţia Ag-Ac se va vizualiza prin apariţia unor arcuri de precipitare. agar 1% şi se perforează 3 grupe de perechi de godeuri. constă în reacţia Ac cu Ag (natural sau artificial) de pe suprafaţa unor particule (bacterii. cristale de colesterol etc). accelerată de un câmp electric.unei. Dispozitivul utilizat are 2 comparti­ Electroimunodifuzia âre la bază electroforeza probelor care conţin proteina-antigen.ţ. cristale ţionate spre catod (polul negativ) pipetăm Âg iar în godeurile care vor fi poziţionate spre anod de colesterol. strat de gel. După introducerea hematiilor şi a serului de cercetat şi gen). normal sau unor eventuale proteine patologice (ex. pentru decelarea mioglobiiiei liza pentru identificarea ântigenelor capstilare îrilichidul cefalorahidian la pacienţi cu menih- sau în diagnosticul imunologic al sarcinii. Metoda permite o mai bună vizualizare a reacţiei. Metoda are o sensibilitate mai mare decât 1DRS.precipitare în unghiurile dintre cultură şi şanţul cu Ac anti-toxină. uscarea . aglutinarea troforeză a proteinelor în mediu gelozat. E. însă în mod curent are indicaţii didactice. Luând în discuţie A glutinarea indirectă sau pasivă spre exemplu doar una dintre cele 3 grupe de perechi de godeuri. Dintre acestea vom prezenta în conti­ Se asociază electroforeza în gel cuimunodifuzia dublă (realizându-.se separarea prin elec. Se utilizează de ex.şi colorarea liniilor de precipitare care corespund fracţiunilor proteice din serul valenţe). . în cazul în care apar linii de precipitare în REACŢIA i DE AGLUTINARE unghiul dintre una dintre tulpinile de cercetat şi şanţul cu Ac anti-toxină. Reacţia de aglutinare Electroforeza proteică în gel . Reacţia este nate de către Ac sau Ag corespondente din proba de cercetat.

E: coli tip capsular K l. a coloniei de identificat. fond negru. Lamele pe care se fac reacţiile de aglutinare. 1 j de Ag pe care dorim să-l identificăm (ex. streptococii anumit p. E. E. a forma reţele de complexe Ag-Ac.regulă. meningococilor. influenzae tip capsular b. care se vor dilua succesiv. Vom utiliza un şir de eprubete în Pentru realizarea reacţiei de aglutinare sunt necesare următoarele: cultura de identificat care vom introduce Ac cunoscuţi. Este indicat să citim reacţia pe torului reumatoid (tehnica Waaler-Rose). în nici un caz nu se vor utiliza pen­ înveliş. cată cu ajutorul microscopului. un microscop sau un âglu- Utilizarea reacţiei de aglutinare în microbiologie 1 tinoscop. în ziua următoare.. Ac monovalenţi de grup. iar bacteria ar putea să prezinte şi Ag H sau Ag K (care ar putea inhi­ încadrarea tulpinii izolate într-o specie. de ex. coli.(pentru Vibrio choleras. în tuburile respective vom adăuga o cantitate echivalentă de suspensie Ag (spre ex. pahar Berzelius cu amestec dezinfectant etc. pacientului Salmonella spp. va determina prezenţa (sau se va dovedi absenţa) Ac necunoscuţi în serul pacientului respectiv. pentru.7-1. în urmă­ în diagnosticul serologic. lame de microscop curate. în toate direcţiile. a streptococilor de grup Reacţii de aglutinare utilizate în diagnosticul de laborator microbiologic direct A sau B. după cultivarea p. în funcţie de tipul după caz). Aşa cum am de grup A-D.) sau a unor virusuri. pe baza caracerelor antigenice. pensia rămâne omogenă. Pentru identificarea diferitelor microorganisme există scheme care orientează. solubile.00°C pentru inactivarea Ag de voltată pe mediul TSI.p. ml Ac vom adăuga 0. De cele mai multe ori citirea se face cu ochiul liber însă în cazul unor aglutinate de dimensiuni foarte mici poate fi necesar să folosim o lupă.. Ac cunoscuţi faţă de Ag pe care ică. Candida albicans. Tot o serie de date pornind de la informaţiile clinice. epidemiologice. putem trece la etapele următoare. 20 ore la 52°C pentru identificarea Ag O). Listeria monocytogenes etc. putem face reacţia de aglutinare. cu soluţie salină fiziolog­ (colonii de tip S. cultură pură. avem deja mai multe elemente pentru tificăm Ag de tip O.îlT cazul prezenţei Ag H etc).labo­ reacţiilor se introduc în amestecul dezinfectant. care s-a examinat din punct de vedere microscopic şi a fost cultivat. soluţie salină fiziologică. în momentul aplicării acestei reacţii avem fungi (Cryptococcus neofonnans. Vom avea ia dispoziţie cultura pură de identificat care se va prepara diferenţiat în colonii izolate şi din porţiunea superioară (bombată) a coloniilor izolate facem treceri pe funcţie de tipul de Ag pe care dorim să-l identificăm. trebuie în cadrai lucrărilor practice vor fi discutate aglutinările pentru identificarea E. ciostridiene etc). după care se va trece la realizarea aglutinării în tuburi (o procedură asemănătoare tru identi ficarea pe bază de caractere antigenice tulpini mai „vechi" de 18-24 ore. binar. Aspergillus spp.în cazul prezenţei Ag O. . rator serologic se. punem o picătură de ser cu Ac cunoscuţi. Tehnica de aglutinare se execută în a patra etapă a diagnosticului de laborator.. menţionat anterior. etapele de urmat (tabelele şi schemele respective se livrează de către producători împreună Vom prezenta atât exemple de utilizare a reacţiei de aglutinare în diagnosticul direct cât cit serurile cu Ac specifici). s-a prelevat un prin tehnica de aglutinare indirectă se pot identifica exotoxineîn filtratul de cultură. Spre exemplu. de. T ot‘prin aglutinare directă se mai pot identifica tulpini de acest scop vom realiza minim două determinări diferite la un . paraclinice. 2. tulpini de E. în Anticorpii anti-Ig se vor cupla cu particule „încărcate" cu Ac şi vor duce la apariţia unor cazul reacţiei pozitive (corespondenţă între Ac cunoscuţi şi Ag pe care dorim să îl identi­ aglutinate (prin apariţia complexului imun). de 18-24 ore). în acest capitol vom discuta atât entero-patogen.-ar putea fi vorba de o tulpină care provine dintr-o colonie de tip R. lamei o picătură de soluţie salină fiziologică. Iniţial.5 dorim să le identificăm (Ac polivalenţi. în care suspendăm un fragment din colotjia de floconoase . folosind spre exemplu cultura bacteriană dez­ ba aglutinarea cu Ag O) cultura se va menţine 1-2 ore la 1. coli etc). Se utilizează spre exemplu în decelarea fac­ ficăm) picătura „se limpezeşte" şi apar grunji de aglutinare. pe o lamă de microscop curată şi degresată punem la una dintre extremităţile Reacţia este pozitivă în cazul apariţiei aglutinatelor (grunjoase . să putem răspunde la minim trei întrebări esenţiale: există anticorpi în serul. dar. pe medii selectivo-diferenţiale se obţin clar. reacţiile utilizate permit detectareaprezenţei toarea etapă. lncubarea se va face diferenţiat. .. la cealaltă extremitate a lamei. Reacţii de aglutinare indirectă se pot utiliza pentru detectarea în p.p. . . Ac monovalenţi de tip. opalescentă.0 zile . în vederea identificării este necesar să avem colonii izolate. Reacţia de aglutinare în tuburi permite şi verifi­ identificat în aşa fel încât să obţinem o suspensie omogenă. tulpina este ne-tipabilă prin această metodă (apare „aglutinarea nespecifică"). . pentru detectarea unor etapa de identificare.internal de ... în cazul în cai. pentru a favoriza contactul dintre cei 2 reactanţi şi unirea complexelor Ag-Ac mici. TSI. Legionella pneumophila. tulpini de Brucella spp. Haemophilus influenzae tip b. în cazul în care picătura „se Reacţii de aglutinare utilizate în diagnosticul serologic limpezeşte" şi apar grunji. în mod obişnuit.p. poate fi necesară şi în cazul tehnicii de aglutinare pe lamă).: Ac în serul de cercetat dar şi stabilirea litrului. opalescentă. la 0. coli 0:157. ducă încercăm să iden­ medii multitest (ex. respectiv în pentru detectarea unor enterotoxine (stafilococice. 1. până la nivel de specie (conform clasificării Kauffmann-White) şi respec­ investigat? care este titrai anticorpilor? cum evoluează în dinamică (în timp) acest titru? în tiv a grupurilor de Shigella spp.. iar îri cazul leptdspirelor şi unor rickettsii apariţia aglutinării trebuie verifi­ reacţii serologice calitative cât-şi reacţii serotogice cantitative. înclinăm aglutinare calitative.. în cursul identificării unei tulpini enterobacteriene (Shigella spp. pneumococilor. H. coli majoritatea infecţiilor care pot fi diagnosticate astfel). A glutinarea în tuburi / . MIU).b sus­ care litrului la care are loc formarea complexelor Ag-Ac. după terminarea şi în diagnosticul indirect (serologic). Totuşi există şi câteva exemple de reacţii de polivalenţi şi realizăm o suspensie omogenă. uşor.5 ml suspensie Ag). Aglutinarea pe lam ă Tehnica de aglutinare în tuburi se poate folosi pentru confirmarea unui rezultat pozitiv Spre exemplu.. utilizând Ag cunoscutei în diagnosticul serologic. la aglutinarea pe lamă sau atunci când rezultatul unei aglutinări pe lamă nu este suficient de Salmonella spp. Diagnosticul de laborator în microbiologie / Reacfii antigen-anticorp: reaefia de aglutinare 115 114 Aglutinarea mediată de Ac anti-imunoglobuline si lama de câteva ori. Reamintim faptul că în cadrul diagnosticului de.

de ser de cercetat şi diluant va fi în cantitate de 0. în care nu se admit erori tehnice.microscop .iar tuburile cu Ag H. Reacţia. dar Citirea se. Dacă amestecul. Pentru că nu urmează să discutăm pe larg prima variantă.agita uşor tuburile.pro­ virusuri sau de proteina C reactivă cuplată cu anumiţi liganzi.tub 1/40 etc. baie de apă cu temperatură reglabilă.ser de cercetat.vom RFC se bazează pe proprietatea sistemului C’ de a se fixa pe complexul imun Ag-Ac.5 ml Âg O în primul rând de tuburi şi respectiv câte 0. inclusiv diluţii binare.5 nil Ag H în al doilea rând de tuburi. şi litrului Ac anti-O. o reacţie pozitivă pe lamă trebuia sâ fie confirmată prin aglutinare în tuburi. prima fază a reacţiei se introduce serul de cercetat iar dacă acest ser conţine Ac specifici faţă . Calea alternă duse de Helicobacter pylori. aglutinarea O. vom introducerea micrometodeior RFC. RFC permiţând identificarea unor Ag rickettsiene.y . a acesteia. Sistemul complement depunem o picătură dirhsoluţia de Ag brucelos şi în imediata. în a) doilea. Vom proceda în aşa fel încât să obţinem în primul Reacţia de fixare a complementului se poate folosi atât pentru identificarea Ag cât şi în diagnosticul serologic.curate. fungi. formarea complexelor imune (Ag-Ac) dar şi de apariţia celulelor apoptotice. . Prin Complementul reprezintă un constituent foarte important al apărării naturale şi respectiv mişcări de înclinare a lamei în toate direcţiile facilităm formarea complexelor Ag-Âc. doi reactanţi. 1 t y <v . ’' . în care se remarcă prezenţa aglutinatelor. pentru fiecare rând de tuburi.. serologic al febrei tifoide a Intrat în istoria. .* i . '' ’ devine vizibil cu ochiul liber. Activarea pe calea clasică este declanşată în primul rând de diagnostic. clearance-ul celulelor apoptotice sau în reglarea răspunsului imun. Pentru evidenţierea reacţiei voiţi. Diagnosticul de laboratorân microbiologie 116 REACŢIA » DE FIXARE A COMPLEIVIENTULUI 1. RFC a fost imaginată încă din anul 1901 de către Jules Bordet şi s-a perfecţionat destul de mult de-a lungul timpului. febrei tifoide etc.Un tub va. repectiv calea clasică. . complexul C5b7. inclusiv febra tifoidă.. sistemul C’ poate avea şi efecte dăunătoare. C2b. 2. v. în diagnosticul serologic.„it . cea mai cunoscută metodă rămâne încă incuba tuburile cu Ag O timp de 20 ore.stabilirea. are o mare sensibilitate şi specificitate. adăuga o cantitate simiîârifde Ag. apariţia aglutinatelor fiind clară iar tehnica de lucru foarte simplă.in şi soluţie. Ultimul tub care mai prezintă aglutinare vizibilă Principiu permite. vecinătate. va fi diluat cu tampon fosfat salin. folosi în diagnosticul serologic al bfuceiozei litarea fagocitozei.Cu colţul unei.T i . poate fi activată de bacterii.va realiza după incubare.alte lame amestecăm şi. . Luând în discuţie diagnosticul serologic al febrelor enterice. virusuri sau de celule tumorale etc. .or fi incubate timp RFC Bordet-Wasserman. utilizată în diagnosticul serologic ai sifilisului. în metabolismul complexelor imune.Âg (tub martor). capitolul 31. de 2 ore la 52°C urmat de 10 minute la temperatura camerei. prin hemaglutinare pasivă). comparând rezultatul din fiecare tub cu martorul pen­ fiind executată corect este foarte exactă. D upă. tanf mera doar câteva dintre exemple. la 52°C..cqnţiiie doar un amestec de. anumite . O şi Ab H). câte 0. Sistemul complement (C’> cuprinde circa 30 de compo­ în care în serul de pacient sunt prezenţi Ac anti-Brucella spp. prin tehnici clasice sau tehnici care au suferit modificări. vom relua acest tip de diagnostic şi ./de nea una dintre metodele cu un mare grad de reproductibilitate.este pozitivă în cazul nente celulare saii plasmatiee. virale etc. . C4a. 1 J i:*v . Âgbrucel’os inactivat (colorat în violeţii ser de cercetat. Este de aseme­ tru Ag. A glutinarea în tuburi Sistemul C prezintă numeroase activităţi biologice fiind implicat în inflamaţie (componen­ tele C3a. pon fosfat sai. două rânduri de eprubete. de ex. C3e). Tehnica de aglutinare indirectă poate fi utilizată în diagnosticul serologic al infecţiilor. în. Această reacţie este utilizată în peste Serul de cercetat. Aglutinarea H. tampon fosfat salin. medicine!. .de reacţie Widal pentru diagnosticul obişnuit are un rol benefic.. liza microorganismului implicat). mai grunjos. Se va lucra cu minim. în timp ce aglutinatul H este ihai floconos şi uşor de disociat prin agitare. Cu toate că în mod diagnosticul serologic al. Ag cunoscute (Ag Face parte dintre reacţiile al căror rezultat nu poate fi vizualizat fără un artificiu tehnic.5 ml. Treponema pallidum (hemaglutinare pâsivăTetc. Sistemul C’ se poate activa pe trei căi. sunt Reacţia de fixare a complementului (RFC) necesare'următoarele: seruri recoltate (în dinamică) de la pacienţii la care se suspicionează acest diagnostic. un rând pentru detectarea în acest caz utilizarea unui sistem hemolitic indicator. >Ş1 Subliniem faptul că RFC este o metodă laborioasă..diferă. în cazul o componentă normală a serului. Prima dintre reacţii o utilizăm demonstrativ în cadrul lucrărilor practice. vom enu­ tub. pe p lam^ de. în apărarea anti-infecţioasă (opsonizare. iar complexul Ag-Ac format nu identificăm în serul de cercetat Ac şi titrul Ac ânti-Vi. Sunt necesare următoarele materiale: lame de micro­ scop. în discuta modalităţile de. C5a. diagnosticul serologic ai infecţiilor produse de Cryptococcus neoformans.ce omogenizăm conţinutul tuburilor. Chiar şi în perioada în care această'se utiliza în calea lectinică şi calea alternă. faci­ Tehnica de aglutinare în tuburi se poate.omogenizăm cei. . Aglutinatul O este mai dens. vorh chlamydiene. . litrului reacţiei. al doilea pentru detectarea prezenţei şi titrului Ac anti-H (pen­ sistem indicator se datorează faptului că Ag este fie sub formă macromoleculară fie este tru persoanele în convalescenţă sau în cazul suspicionării stării de purtător vom încerca Să reprezentat de corpi microbieni de dimensiuni foarte mici. Motivul pentru care este necesar acest prezenţei. în 100 de sisteme Ag-Ac. . A glutinarea pe lamă Reacţiile de aglutinare pe lamă Huddleson (în diagnosticul brucelozei) şi respectiv Kudicks-Steuer (în diagnosticul tifosului exanţematic) au intrat în istoria'medickţei. (reacţia Wright). Calea lectinică poate fi acti­ vată de microorganisme care prezintă în structură grupuri manoză-terminale. Denumirea. interpretape. o picătură de. o diluţie de 1/20.

. 2 • sistemul hemolitic indicator format din -1 " . i • •' : ni ” •d < « i ‘ • se pun plăcile la 4°C. ifn RFC utilizată în diagnosticul serologic. martor pentru Ag. reacţia se realizează în eprubete. soluţie 4%. » hematii de berbec. _ ( . diferite virusuri etc. spre ex. . în cazul în care serul de cercetat nu conţine Ac specifici faţă de hemolitic.. '■ ' ‘ ■' v i. dar principiile « Ag. există 2 posibilităţi: a. 4°C în loc de 37°C în RFC Kolmer) etc. Ag cunoscut va fi ales în funcţie de suspiciu- hernatie). reacţii specifice (vezi capitolul 45). martor pentru Ag. tuburi de hemoliză. ®există anumite diferenţe între tehnicile cantitative şi cele calitative. . nu trebuie să fie hemoliză. în tubul martor pentru serul de cercetat / trebuie să fie hemoliză. b.sde diagnostic. în serul de cercetat există Ac specifici. • se adaugă în toate godeuri le sistem hemdlitic • serul de cercetai recoltat de la pacientul suspect sau o pereche:de seruri.ophiulljbeiv « plăcile se introduc până a doua zi la 4°C • a două zi. C ’ nu este liber) nu are loc hemoliza. Leptospira spp. Pentru a stabili diagnosticul final. metodă calitativă. lizează hematiile şi observăm apariţia hemolizei"’ . obţinute „în • plăcile se menţin la 37°C timp de 30 minute dinamică". După fixare va urma tru C ’. hemati­ ile se depun formând un „buton" în partea inferioară a tubului (în serul de cercetat există C’ propriu. RFC are loc în 2 etape.. e sistemul C’ obţinut din ser proaspăt sau conservat recoltat d e ja cobai.caz). C’) Ag cunoscut. r r ! 1 - ■si /. Rickettsia spp.-... eelaltă cu ser diluat 1/16. în baia de apă.. C’ se fixează nea... tivă sau calitativă). Diagnosticul de laborator în microbiologie I 8 Reacfii antigen-aniicorp: reacfia de fixare a complementului 119 118 de Ag cunoscut se va forma W boniplex Ag-Ac. iar C ’ „liber" se va fixa pe acesta. serurile de cercetat. până la sedimentarea hematiilor • seruri de referinţă (martor pozitiv şi negativ). • serul de cercetat se va menţine 30 minute la 56°C.. tehnica de lucru este laborioasă şi nu va fi prezentată în totali­ în tuburile cu serul de cercetat.. hemoliza putând fi examinaţii cu . . limpede). sunt aceleaşi ' ■. dacă apare hemoliza.. : ■ . : In terp retare » baie de apă cu temperatură reglabilă Iniţial se verifică rezultatele apărute pentru martori (fie că este vorba de o metodă cantita­ • plăci cu godeuri. Ag şi C’ introducerea în reacţie a sistemului hemolitic indicator.cunoscut (suspensie. martor pen­ cupla. vor forma un complex imun. plăcile se menţin la 37°C timp de 30 minute i M aterial^ şi reactivi necesari . mar­ • ser hemolitic anti-hematii de berbec (obţinut prin injectări repetate de hematii'de tor pentru serul hemolitic) oaie la iepurele de laborator.. înseamnă că nu există Ac. Ac). o omogenizarea suspensiei de hematii cu eventuală etalonarc prin spectrofotorhetiie în-scopul creşterii sensibilităţii şi specificităţii se aleg proprietăţile Ag cunoscut. în cazul metodei calitative. la fel ca şi în tuburile martor pentru Ag.şpluţie coloidală. 2 martori pentru serul de referinţă. nu se fonneîiză ■ţ . • în a doua etapă se introduce în reacţie sistemul hemolitic indicator Chemată t Ac jmţi. • în prima etapă se pun în reacţie C \ serul de cercetat şi Ag cunoscut. w ) 'Aen j..:urmat de fixarea C ’. nu va avea loc formarea unui complex Ag-Ac în prima etapă a RFC. în Tehnica de lucru1 tuburile martor sigur pozitiv şi martor pentru sistemul hemolitic. tul este negativ (lichidul din tub va avea un aspect roşu. . După ®se repartizează în godeuri le corespunzătoare serurile de cercetat. pipete1diferitb etc. în serul de cercetat nu există Ac specifici. Brucella spp. . C ’ rămâne liber » reacţie. spălate cu soluţie salină fiziologică) titrat şi conservat îa 4°c ' r . lor produse de Mycoplasma pneumoniae.. Ag.i u a • • în RFC Bordet-Wasserman. martor sigur negativ) activarea C ’ şi respectiv liza hematiilor. pentru inactivarea Testul este pozitiv atunci când în tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliză. Treponema pal­ • toţi reactivii utilizaţi trebuie standardizaţi. în cele ce urmează. rezultând un complex Ag-Acjpe Control de calitate care se va fixa C ’ b. RFC cantitativă se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infecţii­ pe sistemul hemolitic. . . este necesar ca RFC-BW să fie confirmată prin o principial. C şi ser sigur negativ. hematiile şi Ac-antihematie se vor e pe o placă separată se prepară martorii (martor pentru sistemul hemolitic. Aşa cum am menţionat. valabil timp de o săptămână la4°C respectiv martor pentru serul de cercetat. pentru reacţia propriuzisă (una cu ser diluat 1/8. .. Borrelia spp.. Ac fixatori de C ’ apar precoce în cursul bolii astfel încât identificarea prezenţei lor poate semnifica o ®titrarea C ’ în prezenţa Ag infecţie acută sau recentă • titrarea bidimensională a Ag şi a serului de referinţă . j lidum. coipusculară şavi. pentru fiecare complex Ag-Ac. serurile de referinţă. iar tes­ tate. Chlamydia spp. . după.. Cu privire la controlul de calitate am menţionat utilizarea martorilor..' ‘ ' !/. care se va activa pe * în RFC finală se va proceda astfel calea clasică şi nu va mai fi „disponibil" pentru a se fixa pe sistemul hemolitic indicator » se diluează conform indicaţiilor din protocolul de lucru reactivii utilizaţi (serul (hematii + Ac-antihematie). sunt 2 posi­ bilităţi: a. respectiv se vor realiza . martor pentru C ’. o anu­ o titrarea serului hemolitic • ! mită temperatură „de incubare" (de ex.. 2 pentru martori sigur pozitiv şi sigur negativ şi câte una pentru fiecare din ceilalţi martori.

250.include o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) în faza. în care se verifică rezis­ ce sau pentru confirmarea etiologiei unei boli poststreptococice (împreună c u . • SLO liofilizată (standardizată de către producător). în reacţia de seroneutralizare (RSN) este necesar un artificiu tehnic pen­ • eprubete. Trebuie urmate toate indicaţiile din protocolul de lucru.3%. recoltate la interval de 2 săptămâni). • diagnosticul microbiologic direct .125. 1 . tru a permite vizualizarea rezultatelor. Neutralizarea efectu­ Tehnica de lucru lui biologic respectiv se poate realiza doar în cazul în care determinantul pentru toxicitate sau pentru activitatea enzimatică respectivă este acelaşi cii determinantul antigenic (epitop). Reacţia ASLO < ‘ ! Control de calitate Această reacţie poate fi utilizată în diagnosticul retrospectiv a! unei infecţii streptococi- Ultimele două tuburi sunt reprezentate de tubul martor pentru hematii. Ag are o anumită proprietate biologica | H > baie de apă.500 rotaţii/minut) şi se menţin până a cinale ' doua zi la 4°C (temperatura frigiderului).ţ . criteriile tenţa hematiilor şi respectiv tubul martor pentru SLO în care se pun SLO şi suspensia de hematii.. /' J ‘ Există şi posibilitatea de a realiza o micrometodă ASLO în plăci de material plastic cu godeuri.. combinată constantă de S L O vom putea determina titrul ASLO. • se îndepărtează inhitorii SLO din serul de cercetat (utilizăm soluţie de rivanol şi sus­ pensie de cărbune activ. 100. ulinum (vezi cap. Titrul reacţiei ASLO este dat de cea mai mare diluţie de ser la care lipseşte complet • tratamentul/profi 1axia unor boli infecţioase prin utilizarea de imunoglobuline specifice hemoliza. combinarea serului vezi cap. cap.I. centrifugă etc. Primovaccinarea se începe vârsta de 2 luni a nou-născutului. v La fel ca şi RFC. • se omogenizează suspensia de hematii. Principiu j Titrarea Ac anti-SLO se bazează pe faptul că SLO are efect hemolitic asupra hematiilor Utilizarea RSN în profilaxia şi tratamentul unor boli infecţioase de iepure sau de berbec. tetanică etc) ® testarea prin IDR (intra-dermo-reacţie) a susceptibilităţii faţă de o anumită boală Pornind de la o diluţie iniţială a serului de 1/10. 44) • se realizează diluţiile de ser şi se repartizează în tuburile de reacţie (ser în diluţii suc­ • testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium diphteriae (test de seroprotecţie.50 în tubul următor... DT. enzimatică) care poate fi blocată prin cuplarea cu Ac specific. • prevenirea unor boli infecţioase prevenibile prin vaccinare şi evaluarea eficacităţii vac.333 etc în tuburile infecţioasă care are la bază drept mecanism patogenic efectul unei exotoxine următoare. acţiunea Vaccinarea în scopul obţinerii unei protecţii prin seroneutralizare hemolitică a S L O este neutralizată. . respectiv Reacţiile de seroneutralizare ar putea fi utilizate în mai multe împrejurări. • sânge defibrinat de iepure/berbec. unităţi ASLO.5 ml/tub). vezi şi cap. soluţie de rivanol 0. 22) Interpretare e titrarea prezenţei Ac anti-toxine (difterică. realizăm o diluţie de 1/10 a serului care se va menţine 30 • identificarea Clostridium perfringeus prin metoda plăcilor semineutralizate (vezi minute la 56°C). spre exemplu în: . cu anatoxina difterică şi tetanică. • diagnosticul serologic câte 0. minore şi majore de diagnostic). ’ • vaccinarea cu anatoxine (DTP. ATPA. 11 şi 45) • urmează a doua etapă a reacţiei ASLO. • se centrifughează tuburile timp de 1 minut (1.166. câte 0. după adăugarea tuturor reactivilor titrul (numărul de unităţi ASLO) va fi 12. cesive) împreună cu SLO (în cantitate constantă. în cazul RSN. Pentru zona noastiă geografică se acceptă ca normal un titru de 200 (maxim 250) omologe sau utilizarea unor seruri hiperimune heterologe. . respectiv adăugarea suspensie de hematii (5%).însă' metoda clasică rămâne metoda de referinţă. ■ . (toxică.5 ml în fiecare tub. : . • toxinotipia în cazul suspicionării unei toxi-infecţii alimentare cu Clostridium bot- • se agită tuburile pentru omogenizare şi se menţin timp de 15 minute Ia 37°C. în cazul în care în serul de cercetat există Ac anti-SLO.. 25) • se agită pentru omogenizare şi se incubează timp de 45 minute la 37°C. • reacţia ASLO (vezi şi cap. • soluţie salină izotonă. Combinând diluţii din serul de cercetat cu o cantitate Vaccinul DTP. 11) de cercetat cu SLO reprezintă pritiiâ etapă a reacţiei. Reacţia ASLO determină titrul Ac anti Streptolizină O (SLO). Există teste serologice şi pentru evidenţierea prezenţei şi litrului anticorpilor faţă de alte structuri antigenice (de exemplu streptodornază. hiaiuronidază. streptokinază). • . pipete gradate foarte curate. ADPA. / ( ( ■ 19 Reacţii antigen-anticorp: reacţia de neutralizare (seroneutralizare) 121 REACŢIA DE NEUTRALIZARE (SERONEUTRALIZARE) Materiale şi reactivi necesari • ser de cercetat (sau seruri „pereche".

în cazul în care se infectează cu un bacii difterie toxi. ÎVS Evaluarea eficacităţii vaccinurilor scopul urmărit există mai multe tipuri de reacţii Ag-Ac. elaborate de autorităţile de sănătate publică. metodele aplicate pentru vizualizare. permite cuantificarea unor can­ rapia infecţiei cu Clostridium tetani (tetanos) se pot administra intramuscular 3-6. Spre exemplu se consideră că un copiî este protejat (prezintă rezistenţă/specifică în 4. Introducerea RIA. gam bele IDR se realizează similar din punct de vedere tehnic • chemiluminiscent (chemiluminiscent assay. RIA a fost şi încă mai este utilizată în multe dintre specialităţile medicale. 3. 14C etc. în cazul în care persoana respectivă nu prezintă Ac anti-toxină difterică. FIA). gen). toxina inoculată va fi neutralizată şi nu va apărea nici o modifi­ importante în domeniu. • fluorescent (fluorescent immunoassay. care permite testarea susceptibilităţii faţă de difterie (toxina este elaborată • enzimatic (enyzme linked immuno assay. nă (difterică. ceea ce se poate face: istoria medicinei au intrat IDR Dick. costului apara­ UAI ' f turii şi reactivilor. iar revaccinarea a Il-a se practică la REACŢII ÎN CARE COMPONENTELE SUNT MARCATE 36 de luni de viaţă a copilului respectiv. in vivo. în 1966. conform normativelor 1. Se introduc în reacţie o cantitate inoculat va conduce la apariţia unui eritem ia locul de inoculare cunoscută de Ag marcat radioactiv. este înlocuită din ce în ce mai mult cu tehnici de tip • Administrarea de seruri imune heterologe. în acest scbp. obţinute prin hiperimunizarea căilor. cu ajutorul unei lupe etc) în cazul RFC şi RSN este necesară utilizarea unor „sisteme • Se pot face teste de susceptibilitate. în imunote. EIA) rapid. difteriei. Marcarea enzimatică a fost introdusă pentru prima oară în histochimie. de ex. l25I. după 5 ani devenind un marker şi în cazul reacţiilor Ag-Ac. care permite testarea susceptibilităţii faţă de scar­ • izotopic (radio immuno assay. la cei predispuşi la boală şi la cei care au avut o reacţie adversă semnifica­ tivă la o administrare anterioară a DTP-ului. ELISA). / Terapia bolilor în care mecanismul patogenic implică exotoxine trebuie instituită cât mai Analiza imunoenzimatică (ELISA. datorită problemelor legislative. obţinute de la persoane imii. • spre ex. botulismului etc. prin diferite tehnici. în funcţie de natura antigenului.se practică IDR. în necesară marcarea reactanţilor. cazul unei infecţii difterice) dacă titrul Ac-anti toxină difterică1este mai mare de 0. în cazul în Radioimunoanaliza (RIA) care în sângele persoanei testate se găseşte o cantitate de Ac anti-toxină mai mare Posibilitatea utilizării izotopilor radioactivi în medicină a condus la multe descoperiri de 0.. strict ( intradermic o cantitate de 0. un real succes. Prezenţa complexelor Ag-Ac va putea . Pentru menţinerea imunităţii se practică revaccinarea I ia 6 luni de la primo-vaccinare. RIA este o tehnică obiectivă. latina (toxina este elaborată de către streptococul de grup A lizogenizat) şi respectiv IDR Schick. '' Reamintim că.QOO tităţi foarte mici de Ag sau de haptene dar. pentru determinarea cantitativă a prezenţei unui care la locul inoculării (lipsa eritemului semnifică faptul că persoana testată nu este mare număr de substanţe prezente în cantităţi foarte mici în lichidele biologice. pentru a verifica dacă persoana investi­ indicator*1. 6 luni).03 UAI / ml. în cazul IDR Schick se injectează în treimea medie a antebraţului. cu specificitate faţă de Ag. reacţia de fixare a complementului (RFC). 2. mentul tetanosului. Datorită posibilelor reacţii adverse (faţă de com­ . Ag Pentru marcarea Ag se pot utiliza 3H. cu foarte mare sensibilitate. metodele au la bază titrarea Ac anti-toxi. După respectarea timpilor din protocolul de lucru se măsoară Terapia sau profilaxia specifică (imunoterapie pasivă) radioactivitatea complexului Ag-Ac şi aplicând formule de calcul corespunzătoare se poate • Administrarea de imunoglobuline specifice omologe.122 Diagnosticul de laborator în microbiologie administrându-se 3 doze la interval de 2 luni (la 2. în trata­ ELISA. afla cantitatea de Ag nemarcat. CLA) etc.V» ponenta pertussis) se recomandă eliminarea acesteia la nou-născuţii cu probleme ale sis­ temului nervos. reacţii de precipitare. a constituit susceptibilă să facă difterie. Ag nemarcat pe care dorim să îl dozăm şi Ac cunoscuţi • UAI = unitate anti-toxică internaţională ■ ■ .1 ml toxină difterică diluată corespunzător. de către bacilul difterie lizogenizat). nizate (natural sau artificial) faţă de o anumită maladie infecţioasă. tetanică etc) în seruri prelevate de la copii vaccinaţi. Se va realiza o competiţie pentru cuplarea cu Ac între Ag mar­ cat şi Ag nemarcat radioactiv. riscurilor implicate. deoarece exotoxinele pot fi neutralizate numai atunci când se găsesc în circulaţie. 4. Se studiază posibilitatea utilizării pe scară largă a unui vaccin acelular în care să fie inclusă toxina pertussis inactivată. reacţii de aglutinare. reacţii de seroneutralizare. în continuare vom discuta despre reacţiile Ag-Ac în care pentru interpretare este gată este sau nu protejată faţă de o eventuală infecţie.03 Dacă în cazul primelor 2 tipuri de reacţii vizualizarea se poate face direct (cu ochiul UAI/ml v ' liber. RIA). şi anume: • Se recomandă testarea stării de imunitate indusă prin vaccinare.

anti-mycobacterieni în ser. rezultatele obţinute prin ELISA trebuie confirmate prin metode mai fi vizualizată şi cuantificată deoarece unul dintre reactivi este conjugat cu o enzimă.0.05% caseinâ. Enzimele utilizate mai frecvent sunt fosfataza alcalină şi peroxidaza. ' -0 .. Pentru această operaţie.'se poate determina prezenţa Ag îh diferite'produse pato­ (25 pi ser + 0. dar se • Ortofenilen diamină (pastile de 9mg.0 . a devenit auto? şi se incubează 60 minute la 37°C. care nu au intrat îh complex are loc o primă Spălare.. ■ > . «fii: tie de filtru).H‘ 1 ". . în atmosfera umedă. tehnice)..' ’ >■■■■■ ’*•". iar inter­ • Ser martor negativ (M-). densitatea în continuare vom prezenta succint etapele ELISA în cazul determinării prezenţei de Ac optică a mediului de reacţie se va modifica iar valoarea densităţii optice se poate înregistra. 42) dar aşa cum urmează să discutăm. reacţionează prin fragmentul Fc al imu- suport solid (foarte frecvent reprezentat de godeurile unor plăci de plastic. putem discuta despre variantele clasice (aşa cum spumei. excepţia caseinei Hammersten. • Soluţie concentrată de conjugat SpA-HRPO.. toate datele care pot fi obţinute sunt importante şi tlfebuie anali­ cuta decât despre al doilea „tip“ de reacţii.peroxidaza din bile. . Este utilizat pentru rehidratare şi diluări.6 m l Tampon 1). reacţiile imunoenzimatice se realizează în următoarea succe­ •| i.Nu există încă o. . cret) şi respectiv despre variantele simple/rapide. tuberculosis. cântărite de producător) citeşte cu ajutorului unui spectrofotometru. se aplică formula . Tehnicile ELISA pot fi dtilfcate.. £.> ft.15M.1dar pot fi şi noglobulinelor (în special IgG) cu conjugatul Proteină A stafilococică . • Perhidrol (30% H20 2). ’ u • adăugăm al doilea reactiv. pentru înlăturarea • în funcţie ele complexitatea tehnicii. atât pentru identificarea Ag cât şi pentru identificarea şi/sau titrarea Ac.. alte umori. Principiu ■ .indicată. Tehnica este obiectivă. iar sensibili? • în godeurile plăcii sensibilizate (Institutul Cantacuzino) se introduc 100 pi Tampon 1 tatea este comparabilă cu cea obţinută în cazul RIA.<U • Ser de cercetat 1 • valorile înregistrate pentru „probă" se compară cu valorile înregistrate pentru martorul . substratul cromogen va fi o-fenilen-diamina în soluţie de apă oxigenată. iar acest reactiv este • Tampon 2 (TFST) de 10 ori concentrat are aceeaşi compoziţie ca Tamponul 1 cu la rândul lui cuplat cu enzima (conjugat enzimatic). Există mai multe modalităţi de clasificare pentru aceste tehnici* spre exemplu: . finalul acestui subcapitol vom prezenta pentru exemplificare una dintre Variantele . în general. '. ..2. de regulă această fixare se fealizeazăde Către companiile1producătoare.: M! • Tampon 1 (TFSTCH) este format din tampon fosfat salin pH 7. în cazul primei enzime. siune: Anticorpii prezenţi în serul de analizat se leagă specific de Aţj imobilizate pe microplă- • primul reactiv (Ag sau Ac. de către producător.• Plăci sensibilizate (IC) 1 ■ « > ■ . pentru eliminarea reactivilor .. iar în cazul peroxidazei. notându-se în caietul de lucru poziţia serurilor. j. tive sau de competiţie (directesau indirecte).enzima poate • Tampon citrat (3) pH 5. . tuburi etc). ■ ■ •••’« . pentru dizolvarea OPD acţiona şi conduce la apariţiţt unei culori care se poate vedea şi cu ochiul liber. .. de ex. .. 0. j'1-1’... substratul cromogen va fi p-nitro-fenil-fosfatul. ' reactivi. adăugarea în mediul de reacţie a unui substrat cromogen specific enzimei marker. i. • Ser martor pozitiv (M+) pozitiv şi martorul negativ. .. lele. în continuare are loc o nouă spălare. Tween 20 • reactivul adăugat în următoarea etapă variază în funcţie de tipul de tehnică ELISA (în 0.. iar după specifice. ( (' Reacţii antigen-anticorp: reacţii în care componentele sunt marcate ] 25 12 4 Diagnosticul de laborator în microbiologie în anumite situaţii. care sunt mai frecvent utilizate în microbiologie. Complexul imun forhiat. • Placa se spală de 3 ori cu Tampon 2 şi de 2 ori cu apă distilată. este utilizat pentru spălări. • în funcţie de tipul şi ordinea reactivilor introduşi în reacţie tehnicile pot fi necomţieti.l% . Tehnica de lucru Prin tehnicile de tip’ELISA se obţine o specificitate bună sau foarte bună. iar prin extinderea ofertei şi creşterea numărului celor care o utilizează preţurile • Placa se goleşte de conţinut (automat sau prin răsturnare şi scuturare pe un strat de hâr­ sunt competitive.u' 5 l. în funcţie de ceea dorim să determinăm) este „fixat" pe uh ci Koh-I-Nor Hardmuth. Reacţia este cuantificată fotometric. LCR.'T-' Uli-i: I îi:: :■! • • în cazul în care există complemeritaritate structurală şi electrochirhică între 'cei doi M ateriale şi reactivi necesari ( V. standardizare a diagnosticului serologic în Reacţiile imunoenzimatice pot avea lor în sistem omogen sau heterogeii (activitatea tuberculoză (vezi cap. ' ' ' .. are loc cuplarea şi formarea complexului Ag-Ac. se poate adăuga un reactiv care se poate cupla cu Ac.Hammersten 0. Serurile se repartizează câte 100 pl în 3 godeuri para­ logice sau prezenţa Ac în ser... adăugăm un substrat cromogen pe care . întâi se diluează Tamponul 2 concentrat prin ameste­ •a fost descris mai sus şi respectiv aşa cum urmează să fie prezentat în exemplul con­ carea unui volum Tampon 2 cu 9 volume apă distilată. • pentru vizualizarea reacţiei. cel necunoscut (Ac sau Ag). matizată. • Incubăm placa la 37°C timp de 60 min. zate în context. în continuare nu vom dis­ infecţii cu M. hrean (SpA-HRPO) care este pus în evidenţa cu orto-fenilen-diamină HC1 (OPD).-j î« j • Probele de ser de analizat şi serurile martor (M+ şi M-) se diluează 1/25 în Tampon 1 • în funcţie de scopul urtn&rit. pretarea se face aşa cum este indicat în protocolul tehnic care însoţeşte trusa ELISA. "■ .5% şi mertiolat de sodiu 0. pentru a pune diagnosticul unei markerului enzimatic nu este influenţată de către reacţia Ag-Ac). Se păstrează la + 4°C.

iar în etapa următoare. putând indica o creştere a titrului. Ag este necunoscut şi se poate afla într-o cultură. intrat în reacţia Ag-Âc. Metoda este rapidă şi aplicabilă pentru frotiuri din p.: ■ patologică sau în histochimie:' Pentru fiecare Âg de cercetat trebuie preparat serul care • Se prepară soluţia de OPD prin adăugarea a 15 ml Tampon 3 şi 8 pi perhidrol. a fost evidenţiată încă din anul. Produsul care urmează a fi analizat este incubat în prezenţa Ac marcaţi fluorescent. Leptospira spp. • Valorile de pînă la 10 UIE sunt considerate nesemnificative. marcaţi'fluorescent şi se incubează timp de 30 • Analiza se face cu ajutorul unui fotometru ( X = 450 nm) fără blocare cu acid.. iar OD M+ densitatea optică a serului martor pozitiv. IF) . Pneumocystis jiroveci etc.' minute la 37°C.. Pneumocystis jiroveci etc. Dintre fluorocromi am putea aminti auramina O. Putem. cu . Spre ex. . -. Mycoplasma pneumoniae. rhodamina B. Borrelia burgdorferi. recoltat de la bolnav sau pe cultura pură) cât şi în diagnosticul serologic. se spală. Ac ănti-Ig de om se cuplează pe • Rezultatele se exprimă în Unităţi Imuno Enzimatice (UIE) după relaţia: (OD X . fără alterarea specificităţii Ac.ser de cercetat şi. marcaţi fluorescent. repar. re^ Y % ţ. ' / tizându-se câte 100 pl/godeu. Fluorocromii sunt compuşi organici care. Metoda poate fi utilizată îh diagnosticul serologic: al infecţiilor produse de • în cure OD X reprezintă densitatea optică a probei de analizat. nu au. Imunofluorescenţa poate fi utilizată atât în diagnosticul microbiologic direct (pe p. Diagnosticul de laborator în microbiologie 20 Reacfi i antigen-anticorp: reacţii în care componentele sunt marcate 12 7 126 • Conjugatul SpA . sau din cultură dar şi în anatomia ori cu apă distilată. . Posibilitatea cuplării stabile: a Ac Cu fluorocromi.acope­ rim lama cu serul care conţine Ac marcaţi fluorescent. Helicobacter pylori. Unul dintre reac­ tivi (Ag. până în'momentul peră.HRPO se diluează 1/500 în Tampon 1 (30 pi conjugat + 15 ml Tampon intrat în complexul Ag-Ac). Treponema pallidum.ca re . tor negativ. dujiă o ihctibaţieide ŞO minute la 37°C spălăm cu tampon fosfat apariţiei în godeul corespunzător serului M+ a unei. ' Boreletella pertussis. etalat pe frothj ca atare sau „parazitând" anumite celule (ex. Ac sau Ac anti-Ac) este marcat fluorescent..p. ferit de lumină directă. aşteptăm să se: usuce şi examinăm cu microscopul cu fluo- 1) şi se repartizează câte 100 pl/godeu rescenţă. galben-portocalie pentru combinaţia de auramină O . . Chlamydia trachomatis. incubăm timp de 30 minute la 37°C. i loc formarea complexului Ag-Âc. • Se incubează 60 min la 37°C în cameră umedă. la microscopul cu fluorescenţii în situaţia în care în serul'de cercetat există Ac specifici Ag cunoscut. Treponema pal­ • Se înlătură din godeuri conjugatul şi se spală ca mai sus de 3 ori cu Tampon 2 şi de 2 lidum. identificăm5(şi în unele variante tehnice putem M-/OD M+ . după „iradiere11 cu radiaţii ultraviolete absorb radiaţia excitantă.rhodamină B etc). Toxoplasma gondii. •!.ta^ p $ rtârea.. Lumina vizibilă emişă depinde de fluorocromul utilizat (spre exemplu culoarea este galbenă pentru auramina O. Cryptococcus neoformans. acridin-oranj R sau tripaflavina. intră în stare de excitaţie iar atunci când revin în „starea normală" pierd energia acumulată emiţând radiaţii luminoase (vezi şi cap. culori galbene intense iar core­ salin şi cu apă distilată p fti^ . urmând examinarea..'are Interpretare . Mycobacterium tuberculosis. în cazul frotiuiui „colorat" fluorescent. prin fluorescenţă.IF indirectă presupune realizarea unui. epi­ demiologie şi paraclinic. după realizarea frotiului.este densitatea optică a serului mar­ Legionella pneumophila. frotiu se pune un ser cu Ac anti-Ig (le om. în cazul IF directă. spălăm cu tampon fosfat salin şi apoi cu apă distilată (pentru îndepărtarea Ac care nu au . ! ^ ‘ i " ■ V ■.! l. deşi pot indica un început de sinteză de anticorpi. identifica astfel Ag aparţinând speciilor Legionella pneumophila. se poate utiliza o probă recoltată prin biopsie).p. OD M. Hiştoplasma capsulatum. • Indiferent de valoarea obţinută rezultatele se vor-interpreta în contextul clinic. 1942. Aceasta se realizează în circa 10-30 min. conţine Ac specifici.OD complex şi în mod indirect. frotiuj pornind de la Âg cunoscut. Tehnicile IF pot fi de tip direct sau de tip indirect.OD M -) x 100 titra) Ac. cunoscuţi. ţinând cont de rezultatele examenului microbiologic direct.lipsa apariţiei culorii. se aşteaptă uscarea frotiului. Imunofiuorescenţa (F!A. repetarea determinării după 1-2 luni. Froţiul se aco­ • Se incubează la temperatura camerei. 8). Pe spunzător serului M.

i'l iii : ‘iil i . ăf. sau popuţaţioiiai.cel mai frecvent pomtm.sus. deficienţe îri mieloper. antecedentele heredo.de antigene.'l' diverşi mitogeni. După ce o persoană data se infectează cu ată celular. Pseudomonas cepacia.! ' . utilizat în mod curent pentru decelarea infecţiei tuberculoase (TB). (RIC).. Având în vedere cele de. ! » Tuberculină (derivai proteic purificat. VSH etc): l *' .’!:U 'iiifilfs 'Will In vederea stabilirii unui astfel de diagnostic. . Tuberculiha. comparând-cu valorile considerate normale pentru vârsta respectivă.extras din virusul urlinn. dentiţiei şi evoluţiei acesteia. candidină etc).■' Jfi V Ai. urinează sensibilizarea şi proliferarea anumitor populaţii de iimfocite T (LT). citokine (IL-2). inhibiţia migrării ma. Adeseori anamneza are o importanţă crucială. ■M. cu Staphylococcus.reprezintă un amestec relativ bine standardizat de antigene proteice myco- oxidază. . prin tehnica intradermoreacţiei (IDR). investigarea pacientului la care se suspicionează o • Coccidioidinâ (antigen extras din Coccidioides immitis) care însă poate interfera cu imuno-deficienţă ar trebui să fie realizată prin următoarele activităţi: testele seroiogice realizate pentru histopiasmoză. Serratia • Candidină (antigen extras din Candida albicans.la nivelul granuiaţiilor.. cu concentraţia de 30 limes floculans/ml (nediiuat). deficienţe în NADPH oxidază. citotoxicitatea mediată celular anticorp-dependentă/ADCC. trombocite. • Histoplasmină (antigen extras din Histoplasma capsulation) care produce şi o tă de respectivul pacient. ficări fizidpatologice a RIC. lectine care se leagă de membrana celulară (fitohemaglutiriihă. infecţiile cu recomandată o „baterie”. purulente. procent) prin metode clasice şi moderne (ex. i • Trîcofitină (extras din Trichophyton spp. stimulează răspunsul imun ele tip celular („întârziat”). CD8+ etc (număr. creştere a titrului anticorpilor fixatori de complement.etioiogici consideraţi „oportunişti"' poate să ." colaterale.f P l! lili ■ ! S . momentul debutului suferinţei respective. organelor interne care pot fi exa­ • Toxoid tetanic. evalparea răspunsului imun. de tip celular. ijil. ia nivelul tegu­ • O combinaţie între streptokinază şi streptodornază. infecţiile. afectare a limfociţelor T. crea probleme importante în ceea ce priveşte evaluarea răspunsului imun de tip • studiul mai aprofundat limfociţelor şi subpopulaţiiior limfocitare CD3+. indu. • studii privind reactivitatea celulelor implicate în răspunsul imun de tip celular apreciată prin incorporarea de timidină tritiată de către iimfocifoie stirfiulăte cu ■ţ • ■ l’. granulocite. Injectarea intradermică a luberculinei stimulează LT şi declanşează o serie de evenimente ce conduc la un apariţia unui RiC şi a unor manifestări de hipersensibilitate de tip IV. tuberculosis).de la o suspiciunş care i • Teste imunobidiogice. Principiul metodei crofageior sau leucocitelbr..ttice isâie pot influenţă în mod’'Wvbmblî’ rieceâăr să • studiul secreţiei de citokine. ® Fitohemaglutinină (mai rar folosită in vivo). în literatura internaţională este reprezinte semnalul pentru declanşarea. diferite antigene (PPD. antigenul este numit şi „Dermatophyton 0 “). • studiul funcţiei subpopulaţiiior limfocitare (prin metode clasice şi modeme). (' Testarea imunităţii de tip celular TESTAREA IMUNITĂŢII DE TIP CELULAR „ cere de iimfocite T Citotoxice in vitro prin culturi stimulate cu antigene tumorale şi IL-2 etc). modalitate indirectă de apreciere a funcţiei celulelor avem la'dispoziţie mb'dâlităţi’de1identificare a deficienţelor. r în cele ce urmează vom discuta despre IDR cu PPD. mai. iar asocierea unei infecţii cu agenţi. un extract apos realizat în diluţie marcescens. pentru uitime- • Examene de laborator (numărul elementelor figurate: hematii. Există q serie de. tinuare. PPD. prezenţa unor Lemne clinice sugestive (la nivelul feţei. concavaiină A etc). care se suspicioneazi prezenţă componente membranare. pornind de ia cunoaşterea înălţimii şi greutăţii pacientului investigat • Lizat din cultură de Staphylococcus aureus. unei stări de imuno-deficienţg. Aspergillus spp.. substanţe care acţionează direct fără a necesita existenţa unor Evaluarea RIC este necesară atât în situaţia unor pacienţi ia. Datorită faptului că dn momentul de faţă au: fost ţ«ise la punct vâriante tefâţ5ei. ■ :■ ii: ' • .' le 2 antigene pot apărea reacţii de hipersensibilitate de tip umoral ceea ce poate formula teucocitară. lectine etc). eliberarea radicalilor de oxigen activi de către bacteriene. I/iO. CD4+. date privind vaccinările efectuate (vezi şi capitolul 22). " iii V' . utile pentru. ■•y'-. . imtirfe.. cu concentraţia de 10 limes floculans/m! (diluat). individual celulelor fagocitare nestimulate şi/sau stimulate cu. celular. diferitelor investigaţii. etiologici izolaţi şi identificaţi ulterior etc. folosind antigene care poate fi clinică. zimosan. deficienţe. extras din cultura de Mycobacterium • determinarea numărului de celule formatoare de anticorpi faţă de antigeifo tirao. minate clinic etc). date privind agenţii o Antigenul. citotoxi­ mycobacterii.). • Aplicarea anamnezei pe parcursul căreia. flow-citometrie).ar trebui să aflăm date privind medicaaţia primi­ . la nivelul scheletului. metode. citatea' specifică faţă de celule tumorale sau normaie/prin eliberare de 5!Cr. aureus. patru-cinci dintre antigenele menţionate în con­ Pneumocystis jiroveci sau Cryptococcus neofprmans pot „ţrăda“ o. mentului şi anexelor acestuia. inhibiţia aderării. • studiul funcţiei celulelor fagocitare (aderare.J'i*-' • ■i'iii '/■/ '}■:'■• p .repetate. • Examenul clinic. • Toxoid difteric. •■:V ".1 v' implicate în răspunsul imun de tip celular etc. aspectul pe frotiul realizat din sângele periferic.putea ft datorate unor suferinţe ale celulelor fagocitare etc.. dependente (plaje hemoiitice). Spre exemplu. cât şi în anumite boli transmisibile care se pot însoţi de modi­ ' celule allogenice etc. Acest extract se poate utiliza în cadrul unei „baterii” de teste IDR pentru • evaluarea activităţii citotoxice a celulelor NK şi K (citotoxicitatea naturală imedi­ evaluarea reactivităţii din punct de vedere al RIC.

de la infecţia cu mai multă atenţie. • tip IV. dar reactivitatea scade ' La persoanele infectate anterior (sensibilizate). Limfocitele sensibilizate.. preparat de Citirea rezultatului Seibert în anull941).cu diviziuni clar marcate. semnificaţia fiind următoarea. • utilizăm numai seringi cu volumul. . puţin pentru fiecare 1/10 ml precum şi ace pentru injecţie intradermică.celular).neutro.şi intraindividuale din partea persoanelor care efectuează lectura.000028 mg de PPD-S (0. la locul injectării apare o reacţie con­ de regulă o dată cu vârsta. • persoane care au avut un contact recent cu un caz de TB. cauzată de vasodilaţaţia capilară.r Vţ’... iar ulterior. asigurând o bună iluminare a zonei fost reprezentată de precipitarea proteinelor din filtratul mediului de cultură concentrat la examinate (este de preferat lumina naturală). y . ® eliberăm tegumentul şi fixăm seringa presând-o pe antebraţul subiectului. în 1901 a fost rea­ perioadă îndelungată o zonă de hiperpigmentaţie.. Reacţia este considerată a fi pozitivă dacă diametrul induraţiei este >5 mm în urmă­ toarele cazuri. dacă injectarea s-a făcut strict intradermic apare o bulă uşor Aria induraţiei. îh mod uzual se utili­ de infiltraţie dermică (percepută ca fiind reliefată) corespunzând din punct de..iar apariţia eritemu.de maxim 1 ml şi. .-.. Iimfocite. Metoda de obţinere a Citirea rezultatului se face de regulă după 72 ore. bulă de aer apărută între piston şi orificiul acului. tuberculosis. 1891).. până acesta este situat în derm.. ' . derivatul proteic purificat (PPD-S. Eritemul denivelată. cel • tip 111. la unirea treimii medii cu cea superioară. ţ. edem şi infiltrat cu Iimfocite. & în funcţie de analizele statistice efectuate. . • injectăm strict 0.48 ore după injectare. stând din eritem-edem-indiiraţie începând după circa 6 ore şi atingând un nivel maxim după M ateriale şi reactivi necesari .. iniţială cu M. induraţie fermă sau prezenţa unei flictene. . pe de altă parte. Tehnica de lucru Măsurăm „diametrul maxim" al zonei de infiltraţie. o a doua citire la 48 ore şi citirea finală la 72 de ore. ( . apreciem tactil (prin mişcări repetate. de sticlă ai fiolei. întinzând pielea cât mai uniform recent clasificarea reactivităţii la testul cutanat efectuat cu 5 UI PPD după cum urmează: între extremitatea inferioară a eminentei tenare şi hipotenare pe de p parte şi cele patru degete strâns lipite. perioadei de eficacitate şi conservării în condiţiile prevăzute de către producător.. Răspunsul maxim se constituie ia circa. cu soluţie 50% sulfat de amoniu.. infiltraţiei dermice („tip Palmer").faţă de antigenul injectat. macrofage.se lui nu va fi interpretată drept o reacţie pozitivă.r .. Notăm şi semicantitativ intensitatea în ţara noastră se utilizează tehnica injectării intradermice (Mantoux). infiltraţie depresibilă. cu condiţia ca ambele persoane care „citesc” rezultatul să aibă experienţă cu • aspirăm în seringă o cantitate suficientă de soluţie pentru a putea elimina integral orice această tehnică.. 5-8 mm.. . adoptat ca Standard Internaţional pentru PPD. lizat produsul New tuberculin. .reflectă hipersensibilitatea d e. macrofage.000008 mg structură proteică). induraţie elastică. existând posibilitatea unor că în timpul unei conservări mai îndelungate tuberculina tinde să se absoarbă pe pereţii importante variaţii inter.. în cazul existenţei unei astfel de reacţii. ating un nivel adec­ pierde soluţie între seringă şi acul incorect montat).'Pe locul reacţiei poate persista o Pornind de la tuberculina preparată de Koch (Old-tuberculin.. fără infiltraţie aparentă.de reprezintă o reacţie inflamatori? acută. în România se utili­ histopatologic inflamaţiei (edem. • pătrundem cu acul aproape tangent la supmL i antebraţului. PPD-RT 23 reprezintă lotul de tuberculin# purificată în anul 1958 în Danemarca şi : Identificăm existenţa unei eventuale arii intens eritemato-violacee care circumscrie zona asigură omogenitatea produsului antigenic folosit in studii epidem iologie în lumea întrea­ gă. atingând zona respectivă) cu pulpa policelui sau inelarului limitele zonei Tween 80 în scopul reducerii absorbţie! pe peretele de sticlă al fiolei. • agităm energic fiola pentru u omogeniza concentraţia produsului biologic. ' . echivalentul a 5 UI PPD-S. Sensibilitatea poate persista mai mulţi ani.13 0 Diagnosticul de laborator în microbiologie 21 Testarea imunitâfii de tip celular 13 1 Reacţiile implică vasodilataţie. există câteva recomandări cu privire la inter­ • antiseptizăm cu alcool (minim 3 minute) o arie situată pe faţa anterioară a antebraţu­ pretarea IDR cu PPD.. • tip II. • controlăm produsul biologic pe care urmează să îi utilizăm din punct de vedere al • tip I.. Interpretarea rezultatului testului tuberculinic (IDR cu PPD) O poziţionăm acul astfel încât bizoul să fie aliniat diviziunilor seringii. . vedere zează 2 Ul/doză. .. PMN) şi care reprezintă reacţia ne- zează PPD IC-65 produsă de către 1NCDMI „Cantacuzino”. . lui stâng.'.00002 mg PPD + 0. Din produsul realizat iniţial se prepară diluţiile necesare (etalbnate) la care se adaugă în care am făcut inocularea. LT antigen-specifice proliferează şi eliberează limfokine care mediază acumularea să nu se acopere diviziunile seringii pentru a putea urmării cantitatea injectată. ştiut fiind Citirea reacţiei tuberculinice reprezintă o evaluare subiectivă. cu margini relativ abrupte. locală a diferitelor alte celule. poate reduce variaţiile “grosiere”. . este recomandat să se reia manevra vat pentru a conduce la apariţia unui răspuns interpretabil . . i. tip întârziat.. cu aspect de coajă de portocală şi diametru . săruri). Recomandăm o primă citire la 24 ore (pentru cald. cu bizoul în sus. : 1.. Unitatea internaţională pentru PPD este definită drept a surprinde o eventuală hipersensibilitate de tip umoral faţă de antigenul inoculat care are activitatea biologică conţinută în 0. Dubla citire „în orb" fără cunoaşterea rezultatului celeilalte lecturi.10 mi.. . care se retrage în următoare câteva zile. bazofile.dţjpâ'j2-4 săptămâni. specifică şi specifică. circa 36-60 ore. repetând injectarea la o distanţă de 3-5 cm sau la antebraţul opus.f Centrul de control şi prevenire a bolilor Atlanta-Georgia (CDC) a modificat relativ • cuprindem zona respectivă a antebraţului în palmă. .. în lipsa apariţiei acestei bule (în cazul injectării hipodermice sau când.(infiltratului . de unică între­ buinţare.. având-grijă file. în raport cu PPD-RT23.

pozitive.ceea. serurile imune utilizate în identificarea microorganis­ NB.■ (i U-! i 1 Ufill . BIOPREPARATE 2.i. 3.j r A . . iu!.'V-i-v'.. num ărul prevalenţei infecţiei pe vârste ia intervale definite de timp. .f ’ţ ' . semnificative statistici la :care‘analiza epidemiologică . Aceste produse sunt obţinute i:. frecvent sunt utilizaţi cai)..mm.:'vJv.exemplu rezultatul. ..+ Sffer-vj • ufr.ii‘.v i. ...a distribuţiei valorilor a arătat că plasarea limitei între valorile de 9-10 mm separă cel mai bine cele 2 categorii .cele.rezultatele unor testări efectuate pe eşantioane 19 şi 21).» iu ■v '„x•. diabet zaharat.. f -ii . H exemplu: ‘"A • " .. din macroorganisme sau prin intermediul unor tehnici de inginerie genetică. i .falş..î. diagnostic sau diferite produse utilizate în profilaxia sau tratamentul bolilor infecţioase.i Jţ .„baterie" de antigene. dermic pentru evidenţierea răspunsului imun de tip celular sau umoral. apariţiei TB .În. excepţiile (diametra>. 1 • nivelul unui laborator ul care sunt asigurate normele de asigurare a calităţii stabilite la nivel truc „■'•u' riv\i!.. un plus de informaţie prin analiza separată pe grupe de vârstă.ce. . tive. însă de regulă diametrul induraţiei. . Reacţia este considerată a fi pozitivă dacă diametral induraţiei este â 15 mm în cazul Dintre reactivii de diagnostic: altor. . .NV i. America Produsele biologice de uz uman sunt preparate obţinute pe scară mai mică (de ex. vezi capitolele Această definiţie convenţionalăse bazează pe. " ! . . \u ■ ..iy/. Produsele imuncbiologice (biopreparate) se pot clasifica • persoane care prezintă afecţiuni care cresc riscul.n. mm) capitolele 15-20). Europă de Est etc). . fiecare cohortă permite determinarea riscului anual de infecţie. >••>> ?s . > -»* . • i . . bacterii.. inoculate pe cale injectabila. tul actual.sus. boli hematologice şi ale sistemului reticuloendotelial. în anumite situaţii fiind indispensa­ bilă. vezi IDR cu PPD. internaţional) sau pe scară mai largă.situaţii decât . Reacţia' este considerată a fi pozitivă dacă diametrul induraţiei e s t e ţ i 0 mm în cazul persoahWlbr:căre nu infra in categoriile rtienţioriatO ifmi'sus dar hu ‘alţi’factori de risc.. indicator fiabil al evoluţiei endemici tuberculoase. putem descrie o serie de reactivi utilizaţi în medicamente imunosupreşjţve.bL-o o persoane infectate cu HIV. Ia. : • . .pei. ce! mai frecvent sunt folosite serurile imune heteroioge obţinute prin imunizarea (hiperinumizared) unor animale perfect'sănătoase. Dintre produsele biologice de uz uman vom discuta în special despre seruri. malnutp|ie) sau sunptratate cu Spre exemplu.:.este <l. În instituţii specializate. . Dacă se repetă determinarea Produsele inumologice s-ar mai putea clasifica după starea fizică. menţionate‘mai .iadebutul infecţiei. din diferite microorganisme (ex. .-wy p ^ v v iiî'.' .. j. putând apare în special.r . Clasificarea indivizilor di. ••«•:< <•>.soane fără adăpojţt saujcare locuiesc în . Persoanele infectate cu alte tipuri de mycobăcterii pot prezenta reacţii pozitive după melor pe baza caracterelor aritigenice ale acestora. . în final vom enumera o serie de produse realizate de către Institutul . eşte anergic. în ceea ce priveşte investigarea reactivităţii din punctul de vedere al RIC pentru un anu­ mit subiect.10.este'crescută'(dinAsia. în momen­ • .i. vaccinuri şi imtinomodulatori.În acea populaţie (prevalenţa infecţiei) oferind • imunomodulatorii. spre r ?. - • imunoglobuline standard • obţinute din placentă sau din sângele donatorilor (concentrate de Ac)..su­ “Cantacuzino". . virusuri). utilizate numai în acest scop (cel mai " j‘: : liifjfr .r .itzile sau în instituţii cpţecţionale. -i •' -‘ l •>i ' f 'i îf .PPD sau alte produse inoculate intra- în ţara noastră se consideră drept pozitive reacţiile atunci când diametrul este > 9 mm. n i ’! j.priveşte RIC şi se.recomandă efectuarea unor inves­ Serurile imune tigaţii suplimentare.!n .V r .care s-a utilizat o.l : . Imunoterapia reprezintă un mijloc terapeutic eficace.i Mi '•! Vi' ir'fK toxine sau anatoxinfe. biectul respectiv.respectiv fals nega­ • serurile hiperimune.. prin reacţii antigen-anticorp.asigurând cei mai scăzut procent de rezultate. 132 Diagnosticul de laborator în micrdbiologie « persoane Cu semne'radiologice deTB . ’ÂMca. :. • în timp ce alţi reactivi sunt utilizaţi in vivo (ex. ■ r. Imunoterapia este de obicei pasivă (administrarea de anticorpi gata formaţi) bazându-se! . S . după mai multe criterii.(silicoză. ■' . dapăjSpre .' u t r y s : j.Dezvoltare pentru Microbiologie şi Imunologie (INCDMI) „negativ" pentru fiecare dintre cele 4-5 antigene folosite se poate presupune faptul că.. biologică.este Naţional de Cercetare .şi. . în vederea hiperimunizării putem utiliza spre exemplu anumite CRl'I ir. «persoane care folosesc droguri.• ■ V» persoane născute în ţăt'i încare prevaienţaTB.«.-V i ! J. i-:.V '■ ! ! • ■:> -. în funcţie de scopul urm ărit. Ia Lătină. f-' .?iiVr! • unii se pot utiliza'»? vitro (ex’.0..V.(neiafectaţi şi Dintre produsele utilizate în profilaxia şi/sau tratamentul bolilor infecţioase putem aminti: infectaţi). dinamica prevalenţei infecţiei în com ponentelor incluse dar există şi alte criterii pentru clasificare. :iA Α Serurile imune utilizabile în scop terapeutic pot fi omologe sau heteroioge. pe utilizarea de: .ntr-o populaţiei în negativi şi pozitivi la testul tuberculinic • vaccinurile şi serveşte la măsurarea extinderii infecţiei TB.

' V. prima dintre ele . sistemului medical atât sub formă de preparate monomicrobiene cât şi sub formă de In ceea ce priveşte schemele de vaccinare recomandate pentru. . Vaccinurile alge) sau diferiţi compuşi chimici prezintă proprietăţi asemănătoare. Neisseria catarhalis etc). să poată fi administrat. la nou născuţii în vârstă de 0-7 zile se vor administra vaccinul BCG. Acest produs este recomandat în Simultan cu HepB. Dintre preparatele polimicrobiene amintim cele cunoscute sub vom prezenta câteva . Bronhodin. Polidinul. respectiv în Prim ii im unom oduiatori de origine bacteriană au inclus suspensii ale tulpinii vaccinale municipiul Bucureşti). . Proteus . b. tetanos. strategia fiind ulterior inclusă în acte normative de nivel superior. 53 din 30 ianuarie 2000 (redactată şi propusă pentru apro­ dularea şi substanţele imunomodulatoare. Haemophilus influenzae. Klebsiella pneumoniae.copii. Cu privire la revaccinarea cu trarea de ser imun anti-difteric. ■. j moniae. . Streptococcus pneumoniae. să nu conducă la apariţia fenomenului de hipersensibi­ temul de raportare şi programul naţional de imunizări precum şi instituirea unui registru unic litate.:formelor. I ît « 134 Diagnosticul de laborator în microbiologie 2 2 Biopreparate 135 • de regulii folosite în scop profilactic . ' ‘ toxine (difterie. Aerodin. în limite normale (activându-le atunci când scad sub pragul inferior al valorilor normale sau după aprobarea Parlamentului României. Este necesar un diagnostic foarte rapid (dar tratamen­ trol al tuberculozei. Staphylococcus aureus. • sunt utilizate în tratamentul unor boli în care rolul esenţial aparţine unei exo. menţin funcţiile imune efectuării vaccinărilor. Am considerat necesară sublinierea poziţiei inhibându-le atunci când depăşesc pragul superior).vV în cazul localizării faringiene.. c. . Imunomoduiatorii au fost puşi la dispoziţia de sănătate publică din România. iar elevii şcolilor Sanitare postliceale şi respectiv studenţii • seruri-imune hetfcfbloge-i*' • .v > v ' / :!>! . principala resursă terapeutică în difterie este reprezentată de adminis­ funcţie de recomandările tehnice naţionale şi internaţionale. Pe baza datelor acumulate au fost puse la punct conceptele de bază privind imunomo- Prin Ordonanţa Guvernului nr. Următoarea doză de vaccin VPO se va aeruginosa. . în clasa a 111-a copiii nevaccinaţi primesc trei doze de HepB. . apariţia unei „rezistenţe” faţă de alţi agenţi infecţioşi sau chiar şi faţă de apariţia unor metas­ taze neoplazice. Broncho-vaxom. Vaccinurile sunt produse biologice administrate în special în scbp preventiv. 'U-u' v-rnV . facultăţilor cu profil medical. sepsis) copilul cu vârsta cuprinsă între 30 şi 35 de luni. Ulterior s-a demonstrat că structuri aparţinând şi altor organisme (fungi..concomitent cu alt antigen de vaccinări şi respectiv a carnetului de vaccinări (au existat iniţiative în realizarea utilizarea folosit în scop terapeutic. agenţii utilizaţi.v. în maternitate. Prevenirea difteriei şi tetanosului se realizează prin vaccinarea copiilor în clasa a VIII-a (Ia vârsta de 14 ani) cu rapeluri ulterioare la fiecare 10 ani sau de câte ori este necesar în Spre exemplu.j. numele de: Omnadin. să fie cât mai uşor de produs iar preţul de cost să fie rezonabil)..severe de Pentru reducerea incidenţei hepatitei cu virusul B (şi în consecinţă şi a hepatitei cu viru- herpes zoster. varicelei. dozele ulterioare de prin diferite tehnici (Haemophilus influenzae. respectiv prevenirea difteriei —tetanosului—tusei convulsive (DTP) în timp ce la vârsta de Streptococcus pneumoniae. să nu genereze reacţii adverse. imunomoduiatorii. . 649/2001 reprezintă o referinţă din punct de vedere legislativ pentni sisleiftul suspensii obţinute din Coryiiebcicterium parvum. aceasta se va realiza în colaborare cu programul naţional de prevenire şi con­ în funcţie de anumite aspecte clinice. se consideră că: a. Astfel. Staphylococcus aureus. • pot fi utilizate în tratamentul tetanqsului. tul începe chiar şi în lipsa diagnosticului de certitudine.şii Spre exemplu. primesc 3 doze de HepB în primul an de studiu. ICB-10 etc. Klebsiella pneu­ HepB fiind administrate la 2 şi respectiv 6 luni. în primele 24 de ore de la debut în privinţa obţinerii substanţelor cu efect imunomodulator s-a pornit de la observaţia că şi respectiv 40-80. preparate polimicrobiene. carnetului de vaccinări şf înainte de anul 2000 în câteva judeţe ale ţării şi. Doza în terapia difteriei depinde de sediul infecţiei (ex. . Pseudomonas 4 luni se vor administra simultan DTP şi VPO. 649 din 20 noiembrie 2001. la vârsta de 2 şi 6 prevenirea şi terapia unor infecţii ale căilor respiratorii inferioare şi superioare. /j administra la 12 luni. m tiv» mu. în dozele corespunzătoare calculate fie pe kilogram-corp fie vaccinul BCG.exemple. ■' ■ A n -''. • imunoglobuline specifice (hiperimune) Sugarul în vârstă de 9-12 luni va primi vaccinul pentru prevenirea rujeolei. simultan cu DTP în timp ce ultima doză de DTP se va administra la • pot fi utilizate în tratamentul asociat al unor infecţii severe (ex. botulism.000 UAI pe cale i. gangrenă gazoasă etcj. rabiej.. în cazul localizării laringiene. terapia nespecifică este bare de către autorul acestui manual) a fost instituită obligativitatea raportării bolilor şi a utilă menţinerii homeostaziei. iar copilul în vârstă de 7 ani (la intrarea în clasa 1) va primi simultan o nouă doză de vaccin rujeolos şi • obţinute de la persoane imunizate (natural sau artificial) cu un anumit Ag bivaccinui DT. Ordonanţa Guvernului nr. Broncho-vaxomul este o suspensie alcătuită din specii bacteriene distruse prima doză de vaccin pentru prevenirea hepatitei cu virusul B (HepB). . Au mai fost utilizate şi prin Legea nr. Acest act normativ a devenit Legea nr.> . în cazul suspiciunii clinice) şi administrarea de antitoxină difterică. Aerodinul luni se vor administra doze vaccinale pentru prevenirea infecţiei cu virusul polio (VPO) şi conţine un amestec de 10 specii bacteriene (Streptococcuspyogenes. simultan cu o nouă doză de VPO.000 UAI pe cale i. infecţiei cu virusul: sinciţial • sul delta).. conform recomandărilor naţionale şi internaţionale. Im unom oduiatorii 20-40. : . Neisseria catarrhalis.. Escherichia coli. Am introdus • obţinute de la animale imunizate (hiperiniunizate) artificial această politică de vaccinare îrt România prin ordin al ministrului sănătăţii în anul 1999. • uv. adolescenţi şi ţineri. infecţiilor cu virusul citomegalic. respectiv tulpina BCG. în cazul difteriei unele infecţii (bacteriene) stimulează în mod nespecific organismul gazdă şi conducând lâ maligne şi respectiv atunci când de la debut au trecut 48 de ore). Streptococcus faecalis. 53/2000 şi respectiv aprobarea acesteia obţinute din Mycobacterium tuberculosis. un imunomodulator trebuie să aibă o medicilor de familie (indiferent dacă lucrează în sistemul public sau privat) în raport cu sis­ serie de calităţi (să nu fie antigenic. ■ respirator etc /.

a monospecific anti-IgA umană etc). defaţă .'iar îi* unele j cazuri chiar pe cale digestivă: ’ ' . ser aglutinam anti-Shigella shtga. Ag Mycoplasma pneumoniae pentru RFC. penicilinază liofilizată în două concen­ Pornind de la diferitele molecule naturale identificate ca fiind utile.ORL. ham- teza diferitelor substanţe cu structură proteică prin activarea fagocitozei. DTP. . 0X 2 şi INCDMI „Cantac.funcţiij pentru testul ELEK.a realizat.uzino". pornind. Ag Pertussis. Biopreparate 13 7 136 Diagnosticul de laborator în microbiologie 0X19). supli­ Efectul iliuinomodulator se realizează consecutiv restaurării funcţiilor macrofagelor. ser normal de cal. la distanţă de o tumoră'solidă aşa cum poî fi administraţi şi sistemic prin injecţii intramusculafe. : j Produse realizate de INCDM I „Caiitacuzino" în anul 2004. Cantastim. Animale de laborator (şoareci non-consangvini. timopoietinele. seruri aglutinante anti EPEC etal) pot fi utilizate ca imunoniodulatorLAstfel. 4. activarea mobi­ steri. interleukinele. tiniozinelejeuco.vaccinuri (BCG liofilizat.imunomodulatori (Aerodin în două variante. Modul de adminis­ trare este destul de variat.medii pentru culturi celulare (soluţii Hancks.seruri pentru diagnostic in vitro (hemoîizină anti-oaie.produse strict necesare.ale căilor respiratorii dar şi . Este important cu imunomodulatorii să fie utilizaţi în mod corespunzător şi să se ţină sânge Jaeat de cal. : ^ . .antigene pentru diagnostic (Ag brucelos pentru diagnostic serologic. Orostim etc). SLO activată şi liofilizată piratorii superioare sau a infecţiilor genitale. i . antirabic. ser de referinţă sunt cunoscute. a fost obţinut Canţasţjrnul produs de către. Ag Leptospira patoc. macrofagelor şi/sau granulocitelor (MG-CSF). Spre ekemplu. gripal. parţial lizate. 1. mediu IC 65 cu tam­ pentru unele substanţe care fuseseră produse iniţial cu un alt scop. . numeroase. ser anti-Yersinia pseudotuberculossis.funcţiile fagocîtare . . . Ag cardiolipiitic pentru pregătirea preoperatorie în intervenţiile chirurgicale. ser ântidifteric nosa. rujeolos etc). rabic.tradiţiei de aproape un veac.şi.pentru car. mono şi polivalente.de la o tulpină foarte. gripal.enzime (enzimă distrugătoare de receptori. . D. factorii decreŞtefe. cobai.medii de cultură pentru diagnostic bacteriologic (peste IOC) de produse diferite). j.• conform.suplimente pentru medii de cultură (supliment Tinsdale. factorii de necroză ai tumorilor. iepuri etc). seruri anti -Salmo­ limfocitelor T helper (CD4+) şi limfocitelor’B (CD19+). INCDMI „Cantacuzi. special localizate la nivel. Ag Coxiella burnetii pentru RFC. Fplidinul are în . Polidinul este încă utilizat în prevenirea sau terapia infecţiile acute ale căilor res­ Salmonella grupele A. ' ' 1 ’ .ale ipacrofagelor. Produse din sânge de animate (sânge defibrinat de berbec.‘bacteriene (în.I aminti o mai mică parte. activitatea de tip a-f.ste sănţitate din România. Ag. seama atât de beneficiile care pot fi obţinute cât şi de limitele existente. distruse prin căldură. DT. virulentă de pseudomonas aerugi­ OXK. pentru proteina C reactivă. dizenterie viu oral. precum: tuftsina.sistemului-.V nella diferite grupuri şi tipuri. Acest produs normalizează. intfadermice. ser trofina.şi. Bronhodin.diferite extracte. ser de referinţă pentru aî-fetoproteină umană. în categoria imunomodulatorilor intră. Imunbstimulâtor cu Căndidină. B. ser mti-Yersitiia enterocolitica. structurile . . şobolani. Substanţa activă din acest medicament are efecte imiinoniodulatoare deoarece influenţează mecanismele de apărare a gazdelor aflate în . . şoareci consangvini. sânge defibrinat de iepure.e îp momentul. Este recomandat pentru prevenirea infecţiilor nespecifice .’antitetahicîn două variante eţc).compo­ pentru VDRL.şi diferite produse. s-a arătatşcă . .pari­ . Reactivi biologici pentru diagnostic in vitro laţii. Ag Chlamydia pşitacii pentru RFC.acestea voiţi. hipofuncţie imună (ex. ser aglutinam anti-holeric grup 01. ser fluorescent antirabic. Ag meni/ml). soluţie EDTA. subcutanate. meni/ml. amestec reducător pentru itnaerobioză etc).reactivi pentru diagnostic imunochimic (ser uman de referinţă 1C. . ser normai de iepure etc). Dintre. citelor t ! granulocitelor PMN etc. Imunomodulatorii pot fi inoculaţi intratumoral. limfo­ ment tip Fildeş. ser anti-EHEC etc)..seruri terapeutice (anticărbunos. interferonul. .antigene pentru intradermoreacţie (PPT iC 65 de 2UT şi 10UT). cooperările interceiulare. îevămi- pon Hancks etc): solul (Decarisj este un medicament antiparazitâr. lităţii celulelor fagbcitare etc. dT. ser normai de bou. Ag nenţa sa 13 tulpini bacteriene distruse prin căldură (o fiolă conţine circa 48 de milioane ger. Salmonella H.moleculare. au permis obţinerea unor produse sintetice sau identificarea! efectelor imunbmodiilafbare . supliment tip HYL. după cum urmează: . Produse medicamentoase imtinologice de uz uman . din cauza vârstei înaintate sau a unor boii) modulând în special RIC. . ser aglutinam imti-Haemophilus influenzae polivalent sau anticapsular le citotoxiee ale celulelor NK şi T citotoxice (CD8+). studii aprofundate traţii). peritumorai. Ag Salmonella Vi. în funcţie de substanţa activă şi efectul dorit. etc). exprimat printr-o mai bună secreţie de limfoktne sau sin­ 3. ser anti-Proteus 0X19. Ulterior. concentraţia fiind ^de circa 11 miliarde ger. secretarii. ântidifteric. Aerodinul este condiţionat sub formă de suspensie nazală pentru aerosoli şi disti­ 2.no".

Pentru obţinerea unor date corecte prin examenele de laborator. Vaccinarea npu-născuţilpr logic. maximă atunci când rezultatele sunt interpretate în contextul clinic şi epidemiologie. prevenire şi control pentru bolile cu transmitere sexu­ vedere importanţa tratamentului antimicrobiun. Şi în ţara noastră. Datele obţinute trebuie privite ea un tot măsuri cu mare importanţă ia nivel naţional: reabilitarea centrelor de referinţă pentru micro­ unitar. dar utilitatea lor este lioreze situaţia creată datorită erorilor anterioare. 7 aprile 2000). Cu toate că în primii de studiu este abordată în mod spe­ eroare care a creat şi crează încă mari probleme în sănătatea publică. având în naţionale a sistemului de diagnostic. includerea României în sistemul de pregătire în scopul supravegherii bolilor ceară. când şi cum să le recolteze. spută şi nu salivă în infecţiile respiratorii inferioare). adaptarea la standarde inter­ indispensabil să se stabilească un diagnostic etiologic în toate maladiile inlecţioase. tate în care o serie de nou-născuţi au decedat datorită unor infecţii de spital). Folosirea corectă a laboratorului consti­ ală. Utilizarea în mod repetat a unei scheme clare permite o mai bună fixare a cu­ Fiecare din aspectele menţionate are o strânsă legătură atât cu microbiologia cât şi cu noştinţelor. parazitologică. Conferinţa internaţională „Health Issues of Joint Interest to Romania and the INTRODUCERE ÎN DIAGNOSTICUL DE European Union" organizată în octombrie 2000. cunoaşterea acestor elemente de bază ar putea preveni o serie de anomalii şi erori care uneori sunt dezastruoase (aşa cutn s-a întâmplat de ex.de laborator microbiologic 139 PARTEA SPECIALĂ urmat în „ateliere de lucru". Este necesar ca fiecare medic clinician să ştie ce analiză să prin vaccinare. reforma sistemului de supraveghere a tuberculozei. mieolpgică) a diag­ special jîncepând cit anul 1998) s-a înţeles că bolilor transmisibile trebuie să li se reacorde nosticului. Anamneză trebuie destul de aproape de reforma care are loc restul Europei. deoarece de stabilirea corectă şi precoce a diagnosticului depind atât vindecarea bolnavului.. în anul 1999. Nici un element iniţiate în special în perioada 1997-2000 îşi găsesc şi astăzi concretizarea în aplicarea unor obţinut prin examenul obiectiv nu trebuie neglijat.Aprecierea stal tisului imunologic poate fi esenţială. I. ignorarea primului caz al unei boit . iniţiativa organizării unei reţele de supra­ veghere a bolilor transmisibile în ţările din Europa Centrală şi de Est (întâlnire plenară pe LABORATOR MICROBIOLOGIC care am organizat-o în decembrie 2000. înţr-o materni­ In bolile inlecţioase (transmisibile). un mare număr de generaţii capitolul 5. cum să le expe­ dieze către laborator. paraclinice şi de laborator) este urgentă. au fost elaborate numeroase acte deosebită valoare.şi programe realizată cu rigurozitate.r •v Chiar dacă reprezintă o măsură pentru prevenirea. o ştiinţă cu foarte mare aplicabilitate sănătatea publică şi merită a fi cunoscute de către medicii şi viitorii medici din sistemul sani­ practică. logia în sănătatea publică în mod particular a crescut după anul 1997. este strici necesar să menţionăm că examenul clinic îşi păstrează şi astăzi o importanţa cuvenită. cianul va respecta câteva reguli: produsele se recoltează înainte de administrarea tratamen­ Din anul 1999 România face parte (ca membru fondator) din Reţeaua de supraveghere a tului antimicrobiun. în scopul diagnosticării bolilor inlecţioase au fost puse ia punct nu­ normative în acest domeniu iar fondurile alocate au sporit substanţial. schemă pe structura căreia am discutat de altfel şi diferitele aspecte din partea de copii să fie vaccinate faţă de o infecţie care devenise endemică la nivelul anilor ‘90. Spre exem­ Dacă.. a fost organizată una dintre cele mai impor­ nat. întâlnirile cu factori de decizie ai Organizaţiei Mondiale a Să­ nătăţii. nu pot fi absolutizate nici posibilităţile clinice şi nici cele ale laboratorului. Activitatea desfăşurată în domeniul reformei pentru sănătatea publică în România este. Diferitele proiecte . se trimite laboratorului o cantitate suficientă de produs pentru exami­ bolilor transmisibile în Balcani. caţi în sistemul sanitar. în Bucureşti) au condus la elaborarea unui program de reformă în domeniul . Obţinerea datelor (clinice.în urmă cu circa 30 de ani a început să se considere la nivel internaţional (în mod plu.expe- Prezentarea pe care autorul prezentului volum a făcut-o cu acest prilej. Italia. ce produse tie recoltează de la bolnav. încercând să se ame­ meroase tehnici de laborator. produsul examinat nu trebuie con­ Meeting on Surveillance of Infectious Diseases. dar în 1999 prin politica dusă în domeniul sănătăţii publice Având la bază aceste cunoştinţe. Elementele de bază ale microbiologici sunt necesare şi utile pentru.unor maladii virale (şi nu bacteriene . 3. diagnosticul are o importanţă considerabilă. produsul patologic trimis trebuie să lie reprezentativ pentru boala respectivă (de exem­ tante întâlniri cu. cât şi succesul măsurilor preventive care trebuie iniţiate cât mai rapid posibil.scopul armonizării supravegherii bolilor inlecţioase în Europa (Consensus plu. în capitolele următoare vom discuta pe rând diagnosticul a fost inclusă şi vaccinarea copiilor din clasa a lll-a. 4. 2. după părerea noastră. epidemiologice foarte importante. Microbiologic este. Această politică va duce ca în numai câţiva ani. în ultimii 5-6 ani (în cial partea microbiologică (bacteriologică. virusologică. avea deja o „vechime" de 4 ani.inlecţioase grave (ex.şi obiective. Este biologic. în anul 2000. la şcolile sanitare postliceaie şi respectiv a studenţilor din anul I din facultăţile de medicină Pentru fiecare dintre capitolele 24-52 vom utiliza schema ele diagnostic prezentată în şi stomatologie. metode paraclinice. precise .sau fungice) vom mai aminti dintre iţiăsuri luate în ultimii ani îmbunătăţirea programului de vac­ îti prima parte1a manualului am prezentat date privind bazele diagnosticului în1microbio­ cinare împotriva infecţiilor cu virusul hepatitei B. vaccinarea tuturor elevilor din anul I de de laborator al infecţiilor produse de principalele microorganisme studiate. 23 Introducere în diagnosticul. taminat cu alţi germeni în cursul recoltării sau al transportului (recoltare aseptică). . Grottaferrata. studiul microbiologic dirbct şi respectiv evaluarea răspunsului gazdei faţă de infecţie. după cum urmează. din acest punct de vedere. inclusiv la nivel european. Astfel.toţi cei impli­ tar românesc. preocuparea faţă de sănătatea publică în general şi faţă de microbio- în diagnosticul bolilor transmisibile trebuie respectate o serie de reguli. clini­ transmisibile la nivel european ele. menţinerea la un nivel corespunzător a imunizărilor pentru a preveni bolile prevenibiie tuie o uită regulă importantă. generală. discuţiile care au .supravegherii bolilor transmisibile eu sprijin european (PHARE) care a fost aprobat de asemenea în anul 2000. holeră) poate avea consecinţe eronat) <^ă problemele legate de bolile inlecţioase sunt din ce în ce mai puţin importante.

Proteus spp. Noţiunile legate'de diagnosticul mitologic sunt prezentate mai pe larg în tratatele de tuse convulsivă. laboratorul trebuie să informeze clinicianul-pe parcurs în legătură zae.4 1. Treponema pallidum. Introducere în diagnosticul de laborator microbiologic 141 140 Diagnosticul de laborator în microbiologie dierea către laborator se face în condiţiile de conservare cerute pentru fiecare tip de produs Un prim grup important este Cel care include cocii cu importanţă medicală. Dintre metodele de laborator nespecifice sunt utile în diagnosticul bolilor infecţioase microscopic fie în preparate proaspete (utilizând tehnici microscopice speciale) fie utilizând hemograma. Bordetella pertussis.. Spre exemplu. Trebuie să existe o colaborare strânsă şi continuă între elinician şi specialistul de laborator. rinichi. discuta câtevâ1date.. tehni­ ca de rezonanţă magnetică nucleară. în acelaşi timp. Listeria spp. examene oftalmologice.şi va fi aplica­ tă concret în capitolele care urmează. Schema generală a diagnosticului de laborator microbiologic a fost discutată în capitolul 5 . citodiagnosticui revărsatelor pleurale şi al LCR poate aduce date preţioase'pentru elucidarea etiologici unei pleurezii şi Microorganismele din genul Mycobacterium se-pot colora (cu dificultate) prin metoda respectiv a unei meningite. . plămân. determinarea prezenţei pro­ Până în urină cu o.p. Referitor la alte metode paraclinice vom aminti examenul radiologie care poate furniza' în obiectul de studiu sunt încadraţi şi fungii (ciupercile) care au o serie de caracteristici date de valoare pentru bolile infecţioase cu participare pulmonară (pneumonii virale. testele de disproteinemie. Principalei microorganisme pentru care se va studia diagnosticul microbiologic j Bacteriile studiate pol fi grupate după mai multe criterii. tuberculosis. Borrelia spp. se solicită examinarea imediată a produselor transmise către laborator. febră Q.* lerium diphteriae. Shigella spp. ' Baci!ii gram negativi studiaţi aparţin fie familiei emerobacteriilor (E..iun diagnostic imunologic (indirect) sau o combinaţie a celor două variante menţionate. Leptospira spp. Klebsiella pneumoniae. tomografia computerizată. a hematiilor.. &tc) fie sunt incluşi Diagnosticul citologie constă în punerea . utilizând iln produs1prelevat de Iii Bolnav. Diagnosticul tie laborator microbiologic (ex. se colorează. posibil de utilizat.prin metoda Gram datorită structurii particulare a peretelui.1 / r ‘ -n' 1J. impregnarea urgentică). tice. vom alege pentru prezentare câte unul singur. neoplazii şi în Chlamydia şi Mycoplasma erau incluse în categoria virusurilor.lista p. Brucella spp. leueograma (cu modificări caracteristice în unele boli). Diagnosticul histologic implică biopsii (recoltate prin tehnicii' Gram.. dar o variantă utilă este cea în care avem în vedere structura peretelui bacterian şi respectiv afinitatea acestuia faţă de dife­ riţi coloranţi. Este necesară o informare clinică a omului de laborator de către clinician pentru orientarea Dintre bacteriile gram negative care au dimensiuni pe baza cărora nu pot fi încadrate studiilor în 'laborator şi peîrtrti alegerea Celor -mar bune!metode'de identificare-a' agentului drept coci sau bacili se află parvobacteriile. aparte. din. iun ide prioritar este ocupat de diagnosticul micro." . cu datele obţinute. dar în mod caracteristic se colorează prin metoda Ziehl-Neelsen. Clostridium spp. Fpârte pe/scurt'volţi. damentale fac să le studiem astăzi între bacterii. Specia principală chirurgicală) sau puncţii-biopsii ale diferitelor organe (ficat.în evidenţă a unor aspecte celulare cahicteris-J în genuri separate precum' Vibrio cholerae din genul Vibrio sau Pseudomonas aeruginosa din genul Pseudomonas.'mucoasă digestivă sau respiratorie) care permit punerea în evi­ O serie de bacterii spiralate (ex. Yersinia spp. etc). pneumococi etc) şi respectiv gram negativi (meningococi şi gonococi etc). spp. elcctrocncefalografia. scintigrafia. .considerat reprezentativ. care va fi prezentat în continuare anthfacis. ecografia. Totuşi proprietăţile lor fun­ procese necrotice). Pot fi studiate bian. diferite determinări biochimice. streptococi. etc). ' (vezi 'şi capitolul 5). în diagnosticul bolilor infecţioase se mai pot specialitate. pneumonie pneumococică etc). Pentru fiecare microprganism/diagnostic în parte. diferite teste enzimatice. 5. coli.) nu denţă a unor modificări structurale caracteristice. ' ■ ■ --T' ■ JBacilii gram pozitivi care vor fi discutaţi se pot grupa în bacili nesporulaţi (Corymbac- în cadrul-examenelor de laborator. mitologic şi/saU imunologic). perioadă de limp microorganismele aparţinând genurilor Rickettsia.. utile în diagnosticul bolilor infecţioase. electrocardiograful. alte teste de inflamăţie (reactanţi de faza acută) etc. tivi (stafilococi.' referitoare la alte examene >pa. teinei G reactivă (beta-globulină care apare în ser în afecţiuni inflamatorii. ganglioni lim­ studiată este reprezentată de M. cocob’acilii gram negativi (Haemophilus influen­ etiologic. gram pozi­ patologic în parte. bacteriologic) Diagnosticul de laborator în microbiologie poate fi un diagnostic bacteriologic (direct). fatici.-viteza'de sedimentare coloraţii particulare (ex. determinate de acţiunea agentului rnicro. fragmente vasculare. etc) şi respectiv bacili gram pozitivi sporulaţi (Bacillus biologic (bacteriologic. . 1 folosi rectosigmoidoscopia. Salmonella raclinice.

Pe mediul geloză-sânge. r'i! i. prelevate de pe suprafaţa materialului genetic.. .-( .B). manitolui. eu diametrul de circa 0. la care administrarea necontrolată a antibioticelor poate produce disbacteriemii teme multitest care se pot procura comercial (API. cuplează coagulaza legată şi proteina A (tehnici de aglutinare indirectă).serie aglutinarea pasivă inversată (vezi şi capitolul i 1). peritoneală. '- patologice: secreţii purulente (clin foliculite. saprophyticus (la femeile tinere). (puroiul poate fi . ■.. aureus. 1! . -1iţ. abcese profunde. Stafilococii se pot multiplica pe medii hipercloru- itate.) ■ . ExisiiS sis­ maturului.'începând caractere: cu infecţiile superficiale ale tegumentelor şi mucoaselor şi continuând cu panariţii.'iii'/'u . izolaţi sau în grămezi. e Caractere morfolincloriale: Suni coci gram-pozitivi. $)ăureiis’este 4.specia cei mai frec vent implicată’în clinică. celulite.neregulate. aureus şi se poate testa la nivelul centrelor deuisffe- asepsie şi antisepsie etc).-fu «I. Pentru a discuta diagnosticul de laborator în infecţiile produse dp * Caractere antigen ice: Se pot utiliza teste comerciale care includ fibrinogen şi IgGo®s stafilococi vom aleg?-drept reprezentative infecţiile purulente ale tegum entelor şi mu-..7).» v i •1. Există şi alte s’p^qii nepato­ tolele 9 şi 10).5 g. ( .|. tolerând o concentraţie de 7-10% NaCi (ex. spută. ar fi de menţionat toxinozele (datorate în special toxinelor!elabo­ * Caractere de cultură: Produc colonii de tip S. Împlânte. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să specii sunt reprezentate de: Sfapfiyiqcwcus-aureuiş. efifarmidisj tS. necroliza toxică a epidermului.se pot situa intra sau extraleucocitar. infecţii ale diferitelor organe interne cu sau fiM generalizăreit ito dispuşi în lanţuri scurte.. secreţie vagi. Se poate face şi testul fosfatazei.VI. ! * Caractere de patogenîtate: Trebuie efectuat testul coagulazei (vezi capitolul 12.. tampoane vaginale. cu urm ătoarele etajje. înainte ca pacientului să fi primit antibiotice. coaselor şi ne vom referi numai ia Staphylococcus aureus. în funcţie de maladia provocată se pot recolta următoarele prbduse rinţă. hibridarea moleculară. : / . dispuşi în lanţuri scurte. izolaţi sau în grămezi neregulate fecţiei.i-1>-■. . facultativ anaprabi.| tul 12. faringian. Stafilococii se dezvoltă în general pe medii de cultură obişnuite în 18-24 ore. Se are în vedere locul de unde a fost recoltat. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două _________DIN GENUL STAPHYLOCOCCUS frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător. direct.p. saprcipliyţicusl S." ■ ’!'> •. Determinanţii patogenităţii la stafilococ includ produsele toxice şi eiizimatice. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o . Fermentează glucoza.penetrează mentativ. urină. piocite) şi prezenţa cocilor gram-pozitiyi. ftiruri.p»® - Diagnosticul de laborator este ndmai bacteriologic. i 1 . >â. gene sau condiţionat patogene. articulară.i\nA>t Stafilococii sunt coci gram-pozitivi aerobi. alimente. pentru identificarea exotoxinelor se poate utiliza o tehnică de tip ELlSAsaw 1. care se vor colora cu albastru de meliten (AM) şi respectiv Gram. interes medicai (unele dintre aceste grupuri incluzând mai ffiulţe specii).[!>:■. Minitek etc). abcese.. .i. exsudat nazal sau exsudat. j. m twftififij» i. puncţie-aspirare dintr-o colecţie purulentă profundă şi este foarte probabil contaminat cu catalazo-pozitivi. se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură. *"*’ ••••.. perechi.■. fie prin multiplicare şi toxinogeneză (fiind posibilă şi combinarea acestor mecanisme). de reguli (cât mai aproape de debutul bolii. Ar. Genul Stctphylocdccuţ cuprinde mai multe grupe de microorganisme de floră de asociaţie dacă a fost recoltat dintr-o leziune superficială). mediul Chapman). ineşporiţlaţi. pigment auriu). cu prodtemr® bariera cutaneo-mucoasă (cateterisme. unor enzime sau ai unor polipeptide-totale) sau genotipiee (fragmente de restricţie site nală.5.. Coloniile au aspect de tip S. toţi stafilo­ la 35-37°C. şi anume toxiinfecţiile alimentare. . lactoza. lichid de vomă. p. aureus (manito-pozitiv) şi SCN (manilo-negativ).5-1. leucocite. ale acestora. materii fecale. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Staphylococcus 143 #|J DIAGNOSTICUL DE LABORATOR &*$* ÎN INFECŢIILE PRODUSE DE MICROORGANISME . zaharoza etc.» j j . Toxiinfecţiile alimentare sunt provocate de exotoxinele prefofmate. dacă se recoltează de ex. prezenţa celulelor inflamatorii (ex. în funcţie de specia izolată (ex..tnt.:i 2. .p.'1. pleurală. sânge.inai. lichide (de puncţie sinusală. pe mediile cu sâiîge rate). rate.prin i}.afl perieardică). Cocii. intobili. . diametrul cuprins între 1-3 mm şi sunt pigmentate cocii coagulazo-pozitivi sunt grupaţi-ca S.. în continuare vom discuta cazul în care p. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor implicat ca agent etiologic într-o mare varietate de infecţii supumtive (cu puroi). S'. LCR. cu diametrul de 0.. S-au dezvoltat tehnici a p tto catetereior şi'ti inserţiilor iv. Capacitatea de acidifiere a mediului conţinând manită este utilizată ca tes*«Hs amintit infecţiile tractului urinar şi genital cu S. .. existenteîn aliiiiente în care s-au multiplicat stafilococi enterotoxigeni. fistule. în funcţie de capacitatea de a elabora coagulazâ. care se bazează pe proprietăţi f'enotipice moleculare (studiul acizilor graşi celutoaţ. protezări intravasculare etc). poate apărea o zonă de bemol iză clară. cule.■ 'i:1' ■: .11>■ «. mastoidiană. Micro Scan. isindroniul detşoe pot produce hemoiiză. t'. este utilizând truse de identificare şi instrumente automatizate pentru evidenţierea unarafe- reprezentat de puroi (vezi şi capitolul 6). respectând toate normele de sistematizată pentru tulpinile de S. Stafilococii coagulazo-negâtivi * Caractere biochimice: Stafilococii au un meiabolism glucidic atât respirator cât fî fer- (SCN) sunt implicaţi în infecţii apărute după manevre medico-chirurgieale care.necontaminat. . otică.r. Cele mai.f! j. O infecţie diferenţiere între S..Lv. pigmentate auriu. Pe de alta parte.:. perechi. infecţii ale plăgilor şi « Alte caraclere/teste utilizate în identificare: Se pot utiliza (în centre de referinţă) lisate arsurilor).. xiloza. V j VJ Vvn»AiV.M-* ■■■ •• O l'.5-1. ribottpia).s :: K : ■iii de normal). toxţb etc. cât * Sensibilitatea ia bacteriofagi: Susceptibilitatea la acţiunea iitică a bacteriofagiloralfetiit mai rapid şi corect din punct de vedere ai tehnicilor Utilizate.cunoscute 3.vnws t1. Frotiurile se examinează la microscopul optic ' .••. în jurul coloniilor Stafilococii pot deveni patogeni şi se pot manifeştâcaatarefie prin multiplicare'şi jnvaZiv.5. cu consecinţe grave). Stafitassdii gravă produsă de SCN este enterocolita postantibiotice a nou născutului (mai ales a pre­ aurii sunt catalazo-pozitivi (vezi 12. care se va identifica (vezi şi capi­ aureus reprezintă.: cu imersie şi se notează prezenţa celulelor de la nivel tegumentar (eventual modificate faţă <i .fi de de acid.:.

• Boli produse de streptococi lizogenizaţi. în faringita streptocoeică. coagulaza legată).•. cât mai rapid şi corect din punct de vedere . * Streptococii sunt potenţial implicaţi într-o mare varietate de boli. celulita. Streptococii sunt rnni ş-feriri pi-mn-poziiud.: diviziunii celulare. pneumoniae T p netimbcocul) etc.r. care formează perechi sau lanţuri în cursul ■ •' l '* ' ■• r "«•. a enzimelor elaborate în ali­ ÎN INFECŢIILE PRODUSE DE MICROORGANISIVIE ment sau lichidul tie hemdcultură xftestui pentru termonuclează) şi a toxinelor (entero- toxine. viridans (care aparţine florei normale). Streptococii piogeni sunt hefa-hemolitici fnroduc în mod caracteristic zone largi de hemo- liză clară în jurul unor colonii de dimensiuni mici). Există metode care utilizează marker! moleculari pentru DIN GENUL STREPTOCOCCUS evidenţierea prezenţei MRSA (stafilococ rezistent la meticilină) şi pentru diferenţierea intraspecifică la 5'. :i V a -■■■ 5. j>. în acest capitol. Streptococii sunt imobili. Pentru a discuta diagnosticul de laborator în infecţiile produse de streptococii piogeni vom alege faringita streptocoeică. sepsisul streptococic etc. în care putem include scarlatina şi sindromul de şoc toxic streptococic. Cei mai mulţi dintre streproeeefi care conţin antigenul de grup A sunt streptococi piogeni. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chîriliotefâpibeîriAedefeă sta- bilirii tratamentului) este obligatorie şi se realizează de 'obicei'prin metode difuziitietricfe. pyogenes (grup A). în care putem include faringita. Diferiţi autori iau în considerare şi alte entîtăţT clinice. nesporulaţi şi pot avea sau nu capsulă. TSST1. Unii fac parte din flora umană normală.y '■-. trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât mai aproape de debutul bolii. Infecţiile streptococice ar putea fi grupate astfel: • Boli invazive. pneumonia. Dintre speciile cu importanţă medicală ar fi de amintit S. u u t e u s şi SCN.nl pi-nHnsnlui patologic. • Bolile poststreptococice care includ reumatismul articular acut (RAA) şi glomerulo- . impetigo streptococic. diferite “infecţii în sfeFa ORL. / u R ecoltarea si transpnn. în vederea confirmării unei boli poststreptococice vom discuta reacţia ASLQ (vezi si capitolul 19). în cazul unor infecţii grave trebuie să fie însoţită de alte determinări (vezi capitolul 14). •" alţii sunt asociaţi cu afecţiuni umane importante datorate partial infecţiei streotococice şi parţial răspunsului iimtn al gazdei. j *• r. Nu s-a elaborat un sistem perfect pentru clasificarea tuturor streptococilor. . S. fasceita necrozantă. S. . direct. erizipelul. în principal strepto­ cocii piogeni pot deveni patogeni datorită multiplicării şi capacităţii de invazivitate. exfoliatine). angina streptocoeică. înainte ca pacientului să fi primit antibiotice. Proprietăţile hiningico ale microorganismelor infectante. endocardita infecţioasă.vom discuta diagnosticul de laborator ai infecţiilor produse de Streptococcus pyogenes. Diagnosticul de lab o rato r bacteriologic. De regulă streptococii piogeni sunt sen­ sibili la bacitracină.:. agalactiae (grup B). secreţia purulentă de la nivelul farttigelui. Enterococii aparţineau grupului D.’î'rî 'iii Ar U. febra puerperală. nefrita acută poststreptococica (ONA). natura răspunsului gazdei şi poar­ ta de intrare a infecţiei au o mare influenţă asupra tabloului clinic. însă în momentul actual fac parte dintr-un gen separat. genul Enterococcus. Sunt larg răspândiţi în natură.144 Diagnosticul de laborator în microbiologie DIAGNOSTICUL DE LABORATOR mente ale peretelui celular (proteina A.

. în cazul în care se estimeazădgpăşireadîcestui interval coaaluiinarea sd a E LiSA. fără să fi • Caractere antigenice: utilizat gargarisme cu diferite soluţii.». înconjurate de o zonă de P-hemoliză sau colonii oeT ijfM .. :'V. pentru testul PYR). în general antibiograma se realizează în scop epidemio­ în 18-48 ore.pinr.-rrianevră (există şi alte variante ţehniţe) ar putea consta din investigarea fie a răspunsului imun umoral (prezenţa şi litrul anticorpi­ este necesară pentru a permite activitatea hemolizinei O (această streptoiizină este inactivată lor. dar • Alte teste utilizate în identificare: Se pot utiliza sondele nucleotidice pentru detectarea şTâ^l'tof. care. care sunt inhibate dar nu distruse de către peni- tolele 9 şi 10)./b? . • : f 3. înconjurate de o zonă de B-liemoliză (zonă clarW e Jie m d iză .se va identifica (vezi şi capi­ caheTn ultima perioadă tulpini “tolerante”. streptokinază).. Testarea se face în dinamică. mediul Stmniiwy/i şi capitolul 9). Se divid într-un pian perpendicular pe axa lor lungă şi se pot dispune îţi recoltate la interval de 7-10 zile. . Se apreciază că dintre tulpinile de Streptococcus pyogenes. • Caractere de cultură: Produc colonii d*rtlp*S>cu diametrul de 0. Această. ' •r.p.^ ^ =*—____ de timp trebuie folosit un m ^ i" h»Transport^. Frotiurile se examinează lâ microscopul optic cu imersie şi ■'■( ' aglutinare pe lamă.ncii piogeni produc hemoliză de tip behu_ suspicionează prezenţa unei glomerulonefrite acute.beta-lactamine se poate alege pentru tratament eritromi- cină. dar au fost identificate tulpini rezistent&ja acest medicament antimicrobian şThracesT de cultură obişnuite..ii v's-'. Se pot folosi pentru cultivare şi medii selec. fie a răspunsului imun de tip celular. Diagnosticul serologic este util pentru certificarea etiologiei bolilor poststreptococice tiv^Xde ex. nu ar trebui să treacă mai mult de 24 de ore până la prelucrarea p. evaluarea evoluţiei clinice şi eficacităţii tratamentului. gi-up (Lancefieid) sau de lip. sau precipitare se în această situaţie. directă a streptococilor (le grup A în exsudatul faringian. sferici sau ovoidali. în continuare în prezenţa oxigenului). Este strict necesară realizarea controlului intern şi ‘7 extern de calitate. cu un diametru mult mai mare decât diametrul coloniei). Chiar şi •" “ Prin reacţii ele aglutinare (latexaglutinare. iar dacă aceste condiţii nu au fost respectate. • Multiplicarea streptococilor de grup A este inhibată de bacitracină (antibiotic oro- dus de Bacillus liclwnijbrniis). după extracţie chimică sau enzimaticâ mai repede posibil. pe seruri cleTcirca )pm. J ... reincubăm placa Petri pentru încă o zi. cu diametrul anticorpilor anti-streptolizină O (vezi şi capitolul 19). care identifică titruri ale • Caractere morfotinctoriale:.t . • ' / strcptociornază este Crescut la pacienţii cu infecţii tegumentare şi trebuie investigat dacă se <TSti-p.. .. Mediul cel mai frecvent folosit este stear-sângo? pe care cultura apare caz anţibiograma devine necesară.. din acid hialuronic. Lungimea lanţurilor variază şi este condiţionată de factorii de mediu. însă în nici un caz nu trebuie să treacă mai mult d & 3 o v e \te la recoltare (ex. prezenţa celulelpr inflamatorii (ex. Speciile care produc material capsular. adese­ nu vom discuta decât diagnosticul serologic. care are importanţă practică. ( 146 Diagnosticul de laborator în microbiologie . ‘ Există teste seroiogice pentru determinarea prezenţei şi litrului anticorpilor faţă de altd^ structuri antigenice (streptodomază.5-1 mm. preferabil dimineaţa înainte ca pacientul să mănânce şi % ă să se fi spălşt pe dinţi.. litiu de 200 (maxim 250) unităţi ASLO. piocite) şi prevenţii cnrijor gram-pozitiyi aşezaţi separat.jCultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşg fel încât să Slreptococii piogeni îşi menţin sensibilitatea cunoscută la penicilină fan fost identifi- sejîlSată obţFnecoloniilzolatc şi respectiv o cultură pură. Streptococii piogeni sunt germeni pretenţioşi caceuţu se dezvoltă pe medii cilină).. •teste comerciale. recoltarea • Se pol utiliza teste comerciale pentru detectarea rapidă a polizahariduiui specific se va face după minim 4 ore etc vezi şi capitolul 6). ori dau naştere unor colonii mucoide (de tip M).JlS Diagnosticul de laborator în infecjiile produse de Steptococcus 14 7 i" \ i y ' *i *' i..ieu- cocite. mai puţin dc \% sunt rezistente la bacitracină (vezi capitolul 12). recoltarea se face • Streptococii piogeni sunt rezistenţi la trimetopriin-sulfametoxazol. identificarea unei eventuale stări de hipersensibilitate. Pentru zona noastră geografică se acceptă ca normal un lanţuri. hialuronidază.(peste 80) prin reacţia de precipitare în tuburi capilare şi T (28 serotipuri) prin reactiTcTe metilen (AM) şi respeeliv'Gram. Coloniile au asp ecp d etip S cuiliametrul de 0.Egiiixii pacienţii alergici ia . pe cel puţin una Diagnosticul de laborator serologic dintre laţurile „poligonului" descris trebuie să realizăm şi o înţepare a mediului în aşa fel Diagnosticul imunologic al infecţiilor produse de streptococii p-heinolitici din grupul A încât inoculul să ajungă mai în profunzime. caractere: Diagnosticul serologic se realizează de obicei prin reacţia ASLO.p. în cazul în care nu remarcăm apariţia de'colorm ^^ictedstice după logie.. până la cultivare (preferabil 1-2 ore). în cursul însămânţării. agar-sânge plus irimetoprim-sulfanietoxazol). !v pot determina antigenele streptococice de.p. " . Aceste testări se fac în centre de referinţă. Examenul microscopic al p.5-1 mm. rapide. respectând. . Se pot determina şi anticorpii anticar- • Prin testul PYR este identificată sinteza pirolidonil-amidazei (actualmente există şi bohidrat (hemaglutinare pasivă) sau anti-MAP (prin latex aglutinare). Examinarea microscopică a produsului patologic iricliKle realizarea a două frotiiirj din proaus&r^tttbtegidTTOdTîîrşrtranspdrtat' cores^ se vor colora cti albastru de •J .coaglutinare) pe lamă.pyogenes este împărţit în serotipuri pe baza antigenelor proteice M. 24 de ore. GNA).../Vii-1: ri'Qirî'Cifj'* ' L . diagnosticul retro­ 6 1U Identificarea 1 microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor spectiv al unei infecţii streptococice. i-■.. Titrai anticorpilor anti- • Caractere biochimice: . la 35-37°C. (RAA. în perechî sâu în lanţuri. al tehnicilor utilizate. toate normele de asepsie şi antisepsie. în cadrul diagnosticului seroiogic). se notează prezenţa celulelor de la nivel farmgian. are doar uiţ rol orientativ. Produsul recoltat trebuie prelucrat cât de grup A al streptococilor piogeni în p.Sunt coci gram-pozilivi. tipuri de microorganisme. / î . cu p ro n az ăh je taicije utilizate pot fi aglutinarea indirectă (latexaglutinare)..

normală.1 a ultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să i obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură. Pneumonia pneumococică se • Caractere morfotinctoriaie: Sunt coci gram-pozitivi.estetreprezadM^aŞguţă_(. punctul 12. biliare.3). tice o reprezintă apariţia pneumococilor rezistenţi la penicilină şi alte. alungiţi.9frep/ncnr. lichid pleural. utile în identificarea pneumo- celulelor inflamatorii (ex.i t l i . în coloraţia cu albastru de . prin reacţia de imsflnre -arcmvsirteffvea-eapitoliil 12. * Giucoza reprezintă principala sursă de energie pentru pneumococi (aceştia ela­ Una dintre marile probleme terapeutice decurgând din dezvoltarea rezistenţei la antibio­ borează enzime zaharolitice. oare nu se dezvoltă pd medii simple. LCR. Pfeigeloză-sânge determină a-hemoliză la fel Produsul patologic . Creşterea lor este favorizată în: atmosferă d ^ J % W )2 la o tem­ peratură de 37°p.- 11 vii ţ ţ | t ]' i"| Ş . viridans care fermen­ Pentru a discuta diagnosticul de laborator în infecţiile produse de pneumococi vom alege tează inulina). şi infe. ce protejează pneumococul faţă de fagocitoză şi permite invazivi- i^ZdEXaminareă•microscopică a.vor colora cu Până în prezent au fost identificate peste 85 de serotipuri capsulare diferite. Frotiurile se examinează la microscopul optic. minimi două tateaŢStracţura polizaharidului capsular este specifică fiecărui serotip în parte.:. • Caractere de cultură: Pe geloză-sânge formează colonii d ^ lip S sau M. lanceolaţi.13). kinceo- laţi. puroi. ale sinusurilor.. aspirat bronşic sau traheal. macrofage alveolare). punctul 12. punctul 12. 26 Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Steptococcus pneumoniae 149 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN INFECŢIILE nietilen. Multiplicarea este favorizată în. «otâuj din 1produsul patologic recoltat şi-transportat-corespunzător. încapsulaţi (cu o capsulă comună). .primit antibiotice. Ţn pheurponia • Caractere antigenice. capsula poate apărea ca un halotf în jurul pneumococilor.. scopică trebuie să demonstreze calitatea produsului patologic şi să realizeze o identificare prezumtivă a microorganismului implicat (vezi şi capitolul 52). lanceolaţi. Neufeld. există o serie de pro­ b Zonă de a-hem oliză (la fel ca Streptococcus viridans).. Pneumococii sunt aerobi. util în dife­ renţierea pneumococilor de £ viricknsjex. Cndocardită. Autoliza esleJndusă şt accelerată de / ^ / Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie bilă. vezi capitolul 12.atmosferă de 5% CO 2 la o temperatură de 35-37°C. a căror albastru de meiilen fAM) şi respectiv Gram. sputa'recoltată prin expectoraţîe). ale urechii medii. Îeucocite) şi prezenţa cocilor gram-pozitivi. şoareci albi. prin diseminare hemato- genă (ex. > i V l i . înconjurate de .'. dispuşi în însoţeşte de prezenţa edeimilui alveolar şi a Unui exSudat fibrinosî* urmat de apariţia de genera! in diplo. pe produsul patologic (de exem- ă). vazivitate. facultativ anaerpbi. bleme în ceea ce priveşte interpretarea semnificaţiei prezenţei pneumococilor în produse • Caractere biochimice: patologice care pot fi contaminate cu această floră (ex. dispuşi în general în diplo pe axul longitudinaf. Se utilizează un mediu în care există inulină şi un indicator de pH.• rior. facultativ anaerobi.medicamente antibac- terierie___ " ' — 1 ~ ~ ^ • F erm entarea innlinci reprezintă un caracter biochimic important. V j :' : ' ■ \ :' j . vaie. conducând la apariţia unor variate infecţii ale tractului respirator superior. cociibr cu ajutorul reacţiei de umflare a capsulei (vezi capitolul 12..vezi şi capitolul 6).14). mediului. dispuşi în general în diplo. încapsulaţi. (jmtigenuljiy.istă tulpini de S. sensibilitatea la această substanţă asepsie şi antisepsie etc). Diagnosticul de labortţţor microbiologic este numai bacteriologic (direct) » Pneumococii elaborează enzime autolitice. nesporulaţi. nesporulaţi. punctul 12. înconjurate de o zonă de rx-hamoliyJM^a-fel-ea-. respectând toate normele de • Sunt sensibili ia optochin (etil-hidrocupreină). cte-fCguli (cât mai aproape de debutul bolii. sunt aerobi.d :. Utilizând anticorpi anti- PRODUSE STREPTO COCCUSPNEUMONIAE capsulari.^ frp iic a re şi in.ctt.. (vezi capitolul 12. drept entitate reprezentativă pneumonia pneumococică. în continuare vom dis­ # Cel majjmpprtant determinant antigenic şi patogenic este capsula polizaharidică cuta cazul în care p.. Pneumococii sunt germeni pretenţioşi. prezenţa specifice anticapsulare polivalente şi monovalente. meningită. exsudat faringian. lichid pericardic. dar şi alte infecţii produse. punct de vedere ai tehnicilor utilizate.y viridans). se poate realiza o identificare rapidă inclusiv direct. ■! ' i Streptococcus pneumoniae se prezintă sub formă de coci^eram-pozitivi. material necroptic. _ . Examinarea micro­ în acelaşi scop se poate utiliza şi reacţia de aglutinare. hematii şi Îeucocite. alungiţi.cu structură a fost determinată pentru majoritatea serotipurilor. săruri. . înainte ca pacientului să fi. cât mai rapid şi corect din. care se.se poate inocula şi la animale de laborator sensibile. Streptococcus pneumoniae poate: deveni patogen p rin . liesporuiapT imobili. Datorita faptului că poate face parte din flora midrobianâ. sânge. proteoiitice şi lipolitice). care pot fi foarte grave). produsului patologic include realizarea a.p. în mediile de cultură lichide tulbură omogen mediul../alungiţi. pneumococică agentul etiologic poale fi izolat şi prin hemocultură. care se va identifica (veziişi capi­ tolele 9 şi 10). acizi biliari: testul este util în identificarea pneumococilor (tes­ tul bilolizei. i 4). Au fost produse seruri imereieşi se notează prezenţa celulelor de la nivel alveolar (ex. încapsulaţi (cu o capsulă comună). în funcţie de maladia provocată se pot recolta-următoare le produse TTnFfflertîsenTCTTEr^ă fn identificare şi diferenţierea de Streptococcus viridans patologice: spută. Diagnosticul pneumoniei pn'eumo- în cazul reacţiei pozitive are loc o modificare de pH şi respectiv modificarea culorii cocice este adeseori clinic şi radiologie. secreţii otice sau conjiincti. "H !"1' . "j .. respectiv la ca Streptococcus viridans. Pe geloză-sânge formează colonii de tip S sau de tip M.

în genul Neisseria. mai rapid în cazul meningococului.‘în cazul unor linfeţţii grave Neisseriile se prezintă sub formă de coci gram-negativi..•••) „■ '. i » q ii ic.'iL'o o v ilu . sicca. Principial se pot multiplica pe mediul Mueller-Hinton (amintit şi la antibiograma -ligii. '••. poate fi evidenţiată prin reacţii de latexaglutinare sau mai bine J € ÎN INFECŢIILE PRODUSE DE MICROORGANISME DIN GENUL N EISSERIA prin iinunoelectrof'oreză..de patogenitate:-Setpoate-utiliza.. .. i c .: t .. Diagnosticul de laborator 11 în m eningita meningococică diagnosticul este urgent (risc de evoluţie cu sechele şi/şau deces). de importanţă-maximă fiind recoltarea şi transportul rapid al LCR către laborator..). Kmgella.. -'.. înconjuraţi de o structură capsulară comună: în funcţie de structura capsulei există mai •M !'.a f u jf u >'■ . Meningococul este un microorganism condiţionat patogen care poate fi implicat în infecţii respiratorii... chiar dacă pentru concen­ trarea germenilor ar putea fi necesară centrifugarea LCR. în acest capitol vom discuta numai medii suplimentate cu sânge defibrinat de oaie. dar Se bilirii' tratamentului)1este5obligatorie şl' se idilizează de obicei prin metode !difuzimetrice pe pot aminti şi N. Coloniile-apar în 24-48 de ore. 11.! Îiîîo io u .. Pentru verificarea sensibilităţii/rezistenţei la diagnosticul de laborator în infecţiile produse de meningococ şi gonococ.. lactamica..■ r.. N. •.s j. '.. Ambele microorganisme sunt oxidazo pozitive şi au nevoie în vederea izolării de medii de cultură îmbogăţite. Colonizarea poate persista săptămâni sau luni de zile. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând re­ gulile cunoscute (cât mai aproape de debutul bolii... clin punct de vedere al stabilirii etioiogiei este un diagnostic bacteriologic (direct).(vezi capitolul . ■:) ii . Analiza citologică şi biochimică a LCR este utila în stabilirea etioiogiei.ito !' i Ui i tr iV 'J i .'! >(. subflava etc.. . dar este '■ / semnificativ de reţinut faptul'că prin invazivitate poate conduce la apariţia unei bacteriemii în cursul căreia complicaţia principală este meningita meningococică..p.. 1 : • bili.jjehtni*identificarea Familia Neisseriilkclcie include mai multe genuri.-ii i r . difuzimetrică) după ce izolarea din p.. Diagnosticul meningitei meningocociee Diagnosticul meningitei meningocociee porneşte de la elementele clinice...' . Este de preferat realizarea unei cultivări „la patul bolnavului". a fost realizată pe alte medii îmbogăţite.. ... cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate. Moraxella...• Âcinetobacter. M . reniformi.. ■! \ i . spre exemplu Neisseria.. eventual într-un anume context epidemiologie...inocularea la şoarecele alb. Meningococul repre­ zintă una din primele trei cauze de meningită infecţioasă la adulţi (alături de Haemophilus influenzae şi Streptococcus pneumoniae). :•• Alte teste1utile în identificare: Se pot utiliza sonde nucleotidice... I :■ . Mul­ tiplicarea are loc la o temperatură de incubare de 35-37°C şi în condiţiile unei atmosfere de 3-10% CO?.. imo­ antibiograma trebuie să fie însoţită de alte determinări (vezi capitolul-14). dispuşi în diplo.tv . iiii'/ t i f multe serogrupuri..'I" . Ântibibgrâifiiî \^'nsibiiiUiţii ’ia' antibi6tice‘‘^i chimidterapice îii'vederea sta­ sunt Neisseria meningitidis (meUiitgococul) şi Neisseria gonorrhoeae (gonococuî). • • Caractere. respectând toate . Neisseriameningitidis IJt T1 V . . penicilină se utilizează ’microcdmprimate cu oxacilină (1 pcg)..î -vf ' t:. i ' cocului.. N. Iii ItrtS:».'.v ... speciile importante pentru patologia umană 5.'ARNr. 1. prezenţa acestuia. nazal sau faringian. Neisseria meningitidis poate face parte din flora microbiană de la nivel oral.150 Diagnosticul de laborator în microbiologie DIAGNOSTICUL DE LABORATOR • Datorită faptului cîbprin urină se-elimină cantităţi destul de importante de-Ag K.. '■iiii. înainte ca pacientului să fi primit antibi­ otice. necesităţile nutritive fiind mai mari în cazul gono- [ţi:.--. ut :A) Uv/w not lid-..... f i i .

infecţii grave antibiograma trebuie să fie însoţită de alte determinări (vezi capitolul 14). cu dimensiuni de circa 1. 1/ .p. 37°C). franc purulent. ( 152 Diagnosticul de laborator în microbiologie 27 Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Neisseria 153 normele de asepsie ţi antisepsie etc). dar se poate extinde. care se vor colora. trompelor uterine. tenosinovite gonococice etc. recoltarea LCR prin puncţie 0. sunt aerobi. Aşa cum am menţionat. W-135 şi respectiv seruri monovalente anti-B (se pot detecta 0. m . medii în care se include vancomicină. . LCR pentru examenul citologic şi biochimic (vezi şi capitolul 6)..p. minează la microscopul optic cu imersie ş i se notează . respectând toate tip M. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regu­ • Caractere de cultură: Coloniile de meningococ sunt de tip S. colistin.. activitate care poate fi utilă în identificare. îeucocite) şi . oculară. la nivelul uretrei. lile cunoscute (cât mai aproape de debutul bolii. C. nesporulaţi. cultivarea • Caractere antigenice: în funcţie de structura lipooiigozaharidului există 12 serotipuri. Rareori gonococu! poate disemina pe cale sanguină (bac- CO2... faringiană etc) şi produce local o şi 10). se poate utiliza Urina care trebuie centrifugată şi însămânţată im ediat pe medii de lară permite subdivizarea speciei în 13 serogrupuri.iniţial. transportul trebuie realizat fără • Caractere utilizate în tiparea tulpinilor izolate: Există diferite tehnici . Mueller-Hinton. (mobili.p. Gonococul ar putea fi izolat şi prin hemocultură. întârziere (la o temperatură apropiată ’de. Secreţiile au de obicei un '• Metabolizează diferiţi carbohidraţi. faringiene. repartizarea unei cantităţi de în cultură. cultivarea secreţiilor nazale sau faringiene. artrite.. Quad Ferm+. Utilizarea PCR are o sensibilitate şi specificitate de circa 91%. La femei. 4. Dacă mama are gonoree şi nou-născutul se naşte pe cale naturală. cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate.. 2. situaţi intra sau extraleucocitar.. Miniteketc). înconju­ Neisseria gonorrhoeae raţi de o structură capsulară comună. buie tăcută pe cât posibil la patul bolnavului.02. reniformi.minim două • Prezenţa meningococului poate fi detectată direct în produsul patologic prin latex frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător. .. atm osferă de CO 2. . endocervical. care se vor colora cu aglutinare.cu 5. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere': Diagnosticul de laborator în gonoree 1 ■■. în cazul în care nu există nici o Cel mai important determinant antigenic este capsula polizaharidică. Î 11funcţie de calea de transmitere. Meningococii sunt germeni pretenţioşi.. Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic (direct). având la dispoziţie tot ce este necesar pentru • Tehnici similare se pot utiliza pentru identificarea tulpinilor de meningococ izolate pregătirea frotiurilor. cultivarea pe diferite medii de cultură. 3.(imunologice. .. secreţiilor conjunetivale. rectală. 2. înainte ca pacientului să fi primit antibio­ 2 mm.. dispuşi în diplo. dispuşi în diplo. care se va identifica (vezi şi capitolele 9 se ataşează de mucoase (genito-urinarâ. La bărbaţi apare uretrita gonococică. Dintre acestea mai importante siint cultură. reniformi.. Antibiograrna (testarea sensibilităţii tulpinilor izolate în vederea stabilirii tratamen­ albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. gonoreea se localizează facultativ anaerobi. iar la femeie recoltarea trebuie efectuată pe masă ginecologică de la nivelul colului uterin şi glandelor Bartholin (vezi şi capitolul 6).. acesta nu ar trebui să Neisseriilor (ex. RIM..centrifugarea LCR. în cazul în care p. LCR poate fi purulent. Îeucocite) şi prezenţa cocilor gram-negativi. Este de preferat cultivarea imediat. în cazul unor executa direct din p. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a . Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se După pătrunderea în organismul receptiv. dureze mai mult de 6 ore. o serie de sisteme comerciale pentru identificare . Se pot utiliza medii selective (ex. De notat posibilitatea unei reactivităţi încrucişate faţă de Ag (după verificarea presiunii din artera centrală a retinei prin examinarea fundului de ochi) tre­ grupului B. transportul • Produc citocrom-oxidază.. cultivarea urinei etc. vaginului. în caz. .prezenţa celulelor inflamatorii (ex.. trimetoprim şi nistatin) sau neselective (ex. geloză-sânge sau geloză. normele de asepsie şi antisepsie etc). Y şi W -135. grupele: A. 1. Tulpinile încapsulate (ex. un test cheie în identificare (vezi şi capitolul 12) trebuie realizat fără întârziere (la o temperatură apropiată de 37°C). grupele A. Este necesară o atmosferă de 3-5% apărea oftalmia gonococică. Meningococul ar. Spre aspect purulent. C) pot conduce la apariţia unor colonii de tice. este. . coagiutinare sau contraimunoelectroforeză utilizând seruri polivalente albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. gonococu! poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură. supuraţie acută. care nu se dezvoltă pe medii simple. / rinţâ.etc. . cu apariţia unor leziuni dermice. C. cu imersie şi se notează prezenţa celulelor.Dacă LCR. teriemie). de biologie moleculară) care sunt practicate numai în centre de refe- hemocultură.minim două frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător. înconjuraţi de o structură capsulară comună. La bărbat se prelevează secreţia u retrală (eventual o Caractere biochimice: „picătura matinală").. la o temperatură de 37°C. poate chocolat) pe care formează colonii de tip S sau de tip M. B.05 pg de Ag/ml). glandelor Bartholin. Chiar şi în cazul uti­ • Există . pe medii de cultură potrivite şi în exemplu meningococul metabolizează atât glucoza cât şi maltoza. Frotiurile se examinează la microscopul optic anti-A.. Infecţiile gonococice continuă să reprezinte o problemă importantă de sănătate publică. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a.frotiurile se pot tului) este recom andată şi se realizează de obicei prin metode difufcimetrice. foarte utilă la pacienţii pentru care s-a iniţiat dejaantibioticoterapia. urmează a fi transportat către laborator. API. • Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-negativi. a celulelor inflamatorii (ex.. mediul Amies plus cărbune activat). Froţiurije se exa.contrar realizării. . respectiv Ag Ki de la E.. Structura capsu­ secreţie. .exoenzimatică a lizării mediilor de transport (ex. în cazul în care p. putea fi izolat şi prin electroforetice. imobili. Y . coli. urmează a fi transportat către laborator.

utiliza Ac monoclonal! cunoscuţi.tip.. . pQtsutiliza mediii selective (ex.. • Testul catalanei (superoxol) este intens pozitiv. cu dimensiuni de 0. ..■ • : p .nunţiii medii selectiveiEste necesară o rezistente la penicilină (fie datorită unui plâsmid care codifică o fS-iactamază de tipul TEM. Este de remarcat faptul că în aceeaşi placă pot apărea până sice . sunt aerobi. 9: şi 1. după 72 de ore. j • Se pot . 'I . hemoglobina şi nu a sângelui proaspăt).154 Diagnosticul de laborator în microbiologie Li Diagnosticul de laborator în infeefiile produse de Neisseria 155 prezenţa cocilor p kam-negsitivi.au.0). . la o temperatură de 35-37°C. • Caractere biochimice: .etQprim §i ţiistatin) sau neselective (eţi imeţăul GC. ceea ce trează probleme tehnice.ontandă. bili. pentru identificare gonococttlui prin tehnica inuinoiluorescenţei directe. Au fost identificate tulpini rectului sau .CMI se poate realiza prin metode cla­ mentate. rertiformi. imobili. esţe reprezentat ele secreţie de ia nivelul este GC suplimentat nutritiv clar fără pulbere de hemoglobină). în. Minitek. 4. înconjuraţi cîe o struc­ • Metodele biologiei moleculare au atât o specificitate cât şi o sensibilitate foarte bună.p. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe bazamai. transparente sau opace. . / .. eventual înconjuraţi de o structură capsulară comună. un test cheie în identificare (vezi şi capitolul 12). situaţi intra sau extraleucoeitar. dispuşi în di'plo. fie datorită unor imitaţii cromozomiale). nesporuîaţi.'Gonococii po't exprima simultan mai multe structuri antigenic diferite.* • în funcţie de structura lipooligozahariduiui există 6 serotipuri. facultativ anaerobi. f . API NH (manuală) putem identifica. 3. i .. • Caractereantigenice: ■/ ■ .. . dezvoltă pe.'-. .sim­ ple. Determinarea. aureus tip Cowan i stabilizată şi sensibilizată cu Ac monoclonali antiproteină I din membrana externă a gonocodlor) sau printr-o tehnică imunoenzimatică (cu Ac policlonali).Mi(..secreţii yaginaieşŞHU'e un. RIM. utilizarea (>''> 5. diferite suplimente iputritjve. tec.v) medii.ancomicina..sau Pu ajutorul’testului E'(vezicapiloluN4). activitate care poate fi utilă în identificare. geloz#sânge sau geloză-chocolaţcu. Cultivarea pe mediii de cultură a produsului patologic se realizează în-aşa fel încât să * Sondele nucieotidice se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură. reniformi.cplqnij de . se pot utiliza fie pornind de la culturi fie de la p. .trim..: • Caractere morfotinctoriale: Surit coci gram-negativi. care se • IţCR (Ligase Chain Reaction). atmosferă de 3-10% COa..de la.. Gonochek II etc). folosi .. care se va identifica (vezi şi capi­ • PCR tolele. API. • Există o serie de sisteme comerciale pentru identificare exoenziinatică a Neisse- riilor (ex. • Produc citocrom-oxidază.jyeişşţiaa.coliştin.. Aceste testări se realizează în centre de referinţă. Pitica eşte eliminată în cazul în care nu se dezvoltă colonii. sau.specii .de.singur. Antibiogrnma (testarea . Quad Ferm+.Se.p.sensibilităţii tulpinilor izolate în vederea stabilirii tratamen­ pulberii de.multor caractere: ■ ■■ . i'mo- . .5-1 mm s.. >•'' ■ la cinci tipuri de . tură capsulară comună.sţint germeni . . -ri < • Caractere de cultură: Coloniile de gonococ sunt de tip S sau M (vezi punctul 3). Este'necesară testarea producerii de (3-lactămază Gonococul produce colonii de tip S.v.\n numai 4 ore.. . Coloniile apar în 24-48 de ore. această metodă se poate utiliza pornind de la urină includ®: y.. 1: ■‘ "■■if • Prezenţa gonococutui poate fi detectată direct în produsul patologie prin coaglutinare (suspensie de S. iaringiană se vor.'COSţui ridicat».foarte pretenţioşi.. dispuşi în dipio. Eşţe preferată cultivarea „în dublu". se. Goiipcpcii.colonii (TI-Ţ5)..rneclii . Se poate utiliza şi „coloraţia"fluorescentă.j • 4 Metabolizează diferiţi carbohidraţi.dezavantaj. Haemq- philux şi Branheiimllq caiurrhali$. Gonococul metaboiizează glucoza dar nu şi maitoza.. • • Utilizând galeria. . <• ^ ■1 .care nu se.nepig­ (de ex»< folosind discuri cu nitrocefin). pe tului) este recomandată:şij’se:reâlizează de obicei prin metode difuzimetrice (mediul utilizat medii selective şi nesejectivefln câzuj 'în care p.de secreţie..

pot diferenţia-prin. > ' ■' '•V-! V ••• i Vl (de ex. Salmonella. Morgane. primelor . diferenţiale şi selectivo-diferenţiale.se. 0robacter. etc). genurile incluse în această vastă familie.microscopie. Spre exemplu."sau imobili (ex. stare generală alterată etc). me etc) sau alte caractere fenotipice (ex. Foarte important şi obligatoriu de reţinut este că BDA înaltă (ex. Citrobacter spp. Escherichia coli. următoare. Klebsiella pneumoniae). febrele paratifoide. de variaţii care sunt prezentate procentual în tabele special dedicate. Pentru izolarea speciilor de ente- datorită BDA circa 100 de pacienţi. robacterii putem folosi medii selective. R (în cazul culturilor . game extinse de caractere biochi­ mice (ex. niotilitatea). infecţiile produse de microorganismele -i aparţinând . nu. Yersinia. 81. numărul de cazuri de boli diareice acute catalazo-pozitivi. mobile deţin Ag H. evidenţierea unui anumit metabolit.). în . Escherichia. mucos. Sindromul diareic include eliminarea a peste 3 scaune în 24 de ore iar scaunele au con­ voltareâ tuturor enterobacteriilor (ex. Yeninia pestis prezintă Ag FI etc. despre diagnosticul în multe dintre infecţiile produse de enterobacterii. nu numai din Enterobacteriile sunt bacii! gram negativi care. sindroame asemănătoare holerei. în fiecare an au decedat sunt lactozo negativi (ex. Proteus spp. Shigella. în continuare vom discuta examenul bacteriologic al materiilor fecale. mediul Wilson-Bîair cu verde briliant în concentraţie crescută). medii cu selectivitate medie care inhibă multipli­ în holeră). la nivelul tractului urinar. j . Caracterele biochimice sunt esenţiale pentru identificarea enterobacteriilor. Un alt aspect foarte util pentru identificare este reprezentat de studierea caracterelor anti. Dintre riile fecale. Enterobacteriile capsulate deţin Ag K..5 °/nooo în 2002. nu numai cea bacteriană sau fungică.. Formează colonii de tip S.>Edwarsiellti. punctul de vedere al unei infecţii enterobacteriene. pot fermenta lactoza (ex. Proteus spp. purulent. cu o sau M (pentru speciile capsulate). duce la pierderi de apă şi electroliţi iar intervenţia cea mai importantă care trebuie avută în vedere este reechilibrarea hidroelectroliţicâ. Toate enterobacteriile deţin Ag O. EAEC/enteroagregant. Klebsiella).optică. •• .. Yersinia). vom discuta numai.V . enumerate. mondial. toxi-infecţii ali­ mentare etc). Uzi­ semne şi simptome digestive (dureri abdominale. preferat în multe dintre ţările Uniunii Europene) şi medii cu selectivitate (febră. teesine. Enterobacteriile • Klebsiella spp. Shigella. Salmonella typhi prezintă şi Ag • aite enterobacterii (Yersinia enterocolilica. Simmons etc). în capitolele. Boala diareică acută Sunt germeni nepretenţioşi care se pot multiplica pe medii simple. Datorită semnificative din punct de vedere medical(28) şiţriumeroase speqii (peste >IQQ. se poate adăuga şi cristal violet).că pentru fiecare test fenotipic există o serie • Salmonella spp. reduc nitraţii.Proteus. DAEC/aderent difuz) reacţii Ag-Ac (vezi şi capitolele 15-20). mobili cu cili peritrichi (ex. etc) Vi. . cltrat şi lactoză. aerobi facultativ anae- Boala diareică acută (BDA) a fost şi rămâne o entitate patologică foarte răspândită la nivel robi. în aceeaşi perioadă de timp. EHEC/enterohemoragic. cu ajutorul diferitelor EIEC/enteroinvaziv. genice folosind seruri cunoscute (preparatg pe animale de laborator). Shigella. mediul Mac Conkey cu săruri biliare în concentraţie sistenţa diminuată (până ia emiterea unor scaune apoase. Infecţiile enterobacteriene pot avea şi alte localizări sau poţ fi generalizate . utilizează fermentaţiv glucoza cu sau fără producere de gaz. Dorim să menţionăm. în continuare vom tere biochimice (fermentarea zaharurilor. mediul ADCL cu dezoxicolat.6.vom-aminti următoareie:. îrfcazul în faptdlui că în multe dintre aceste infecţii produsul patologic este reprezentat de către mate­ care-nu luăm în considerare clasificarea genului Salmonellatn pesţe 200Q d e specîi). C0PR0CULTURA Hai Providencia şi Serratia. . unele specii prezintă capsulă (ex. de menţionat că marea majoritate a BDA infecţioase au etiologie virală. la nivelul aparatului respirator sau la nivelul sis­ temului nervos. .. De regulă sindromul diareic asociază şi alte mediul Shigella-Salmonella cil săruri biliare şi verde briliant sau mediul XLD cu xifSză.055 în anul 2000. culoare modificată. galeriile API).... • Shigella spp. ETEC/enterotoxigen. utilizarea căratului ca unică sursă de carbon. în febra tifoidă. Este unui anumit substrat.*Enterobacter. • Vibrio cholerde şi alţi vibrioni . genuri. • Escherichia coli (EPEC/enteropatogen.317 în anul 2002.1 . sunt oxidazo-negativi. în cele ce urmează vom discuta coproculturaîn general. Klebsiella) sau incidenţă de 446. Salmonella spp.268 în anul 2001 şi respectiv 97. în momentul de faţă există baterii de Etiologia bacteriană include teste şi sisteme comerciale care permit examinarea unei. prin repicarea coloniilor suspecte pe medii potrivite (TS1. utilizăm coproculturu. sanguinolent carea Enterobacteriilor lactozo-pozitive (ex. miros. care se manifestă prin sindrom diareic. Pot fi localizate la nivel digestiv (dizen­ terie şi sindroame asemănătoare dizenteriei.>'!»î'J*v ' MfjfO 0£>*l£: ' ?l J-r > i? în majoritatea infecţiilor produse de enterobacterii diagnosticul este bacteriologic. vărsături etc) sau generale nă şi dezoxicolat. nesporulaţi. Există medii cu selectivitate mai redusă care inhibă majoritatea bacteriilor gram pozitive şi permite dez. identificarea unor enzi. M1U/M1LF. în ţara noastră în ultimii ani. După exami­ narea caracterelor de cultură. greaţă. cu pierderea a până la 20-30 litri/zi mică. Diagnosticul de laborator în infecfiiie produse de enferobacterii 157 0 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR 2 O # ÎN INFECŢIILE PRODUSE DE ENTEROBACTERII Infecţiile enterobacteriene sunt destul de variate. Yersinia. pestă).Salmonella. particular etc. direct. Materiile fecale pot avea aspect patologic (apos. Klebsiellai. Familia Enterobactiriacecte Cuprinde tin impbftant nuM tide geriiiri'de microorganisme în febra tifoidă diagnosticul poate fi atât bacteriologic cât şi imunologie (serologic). în zilia următoare se pot examina diferite carac­ Boala diareică acută poate fi de etiologie infecţioasâ şi neinfecţioasă. (pe mediile selectivo-diferenţiale se poate identifica şi comporta­ Agenţi etiologici mentul în ceea ce priveşte fermentarea iactozei).vechi“) a fost de 85. metabolizarea discuta pe scurt etiologia infecţioasă în general.

.. Shigella spp. . • mecanism de „penetrare". • Tricliinella spiralis ’ • **' ' .. într-un recipient de carton sau îiur-un container din material plastic de unică între­ • adenovirusurile etc... tir rile patogene)... Tamponul steril se • mecanism inflamatori atunci când din punct de vederemicroscopic în preparatul între introduce cu blândeţe şi se prelevează secreţiile de la nivelul mucoasei rectale.p. 1 ■. Defecaţia are loc • enterovirusurile . Introducem cu blândeţe sonda până la nivelul dorii (circa 10-12 cm 'diareic produs de Salmonella typlti-.o Si.’. publică (conform normativelor stabilite de către ministerul sănătăţii) ‘ < .p. tăiem în mod corespunzător tija s hystoliticci etc) ■v .p. staţii de distribuţie a apei potabile etc) ■.... mediul de transport. în acelaşi timp Gruparea agenţilor etiologici în funcţie de mecanismul patogenic efectuăm şi examinarea macro.' Se. Pentru a putea închide recoltorul...••• ' :: ■ i' • atunci când sindromul diareic persistă mai mult de o săptămână sau are loc o recădere • Cryptosporidium parvum • în scopul verificării stării de sănătate a persoanelor care lucrează în unităţi de alimentaţie • Strongvloides stercoralis etc. simplă recoltare a produsului patologic urinată de realizarea gă şi aspirăm p. ' buinţare (care poate fi apoi decontaminat şi eliminat fără probleme). urmărim recoltarea p. (la pacienţi. Vibrio parahaemolyticum. Introducem p. pentru tratament poate fi importantă elucidarea permit cu o mai mare şansă izolarea agentului patogen'(fragmente mucopurulente. tipului de mecanism im plicat Astfel.. utilizăm un mediu importante cu privire la etiologia probabilă precum şi atitudinea terapeutică de urmat. de la nivel sigmoidian.. .. Giardia îdmbliâ.. grădiniţe. / » . adaptăm la celălalt capăt al sondei o serin­ După cum se poate remarcă.. diareic persistă şi după întreruperea anţibipticoterapiei. trebuie să se realizeze înainte de administrarea de medicamente antimicrobiene.i-..-i. » • •< v'lmm-. Clostridium perfringens.'ii lb ! .. Se pot • astrovirusurile ....evidenţiază leucocite' polirriorlbnucleare (ex.. Staphylococcus aureus..p.. Este de transport. flocoane riziforme etc) sau porţiuni diferite dintr-un scaun în care nu • mecanism neinflamator. pentru a recolta material din criptele rectale. Entqţnoeba . tamponul în. pe care o suspensionăm în mediul de transport (minim 2 ml în cazul scaunelor apoase). Campylobacter spp. -i ■< ■■ . Etiologia virală include • rotavirusurije !i Recoltarea şi transportul materiilor fecale • virusurile Norwalk şi asemănătoare virusurilor Norwalk .. prin lamă şi lamelă' se. nu poate II prelucrat imediat sau în maxim 1 oră. Salmonella enteritidis. Yersinia enterocolitica sau Salmoiîella spp..scopică a p..p. BDA ar putea fi produse prin: : .. transportul la rece (+4°C) sau transportul în mediu de transport menţinut la. în special faptul că recoltarea :• calicivirusurile i .la nivelul între lamă şi lamelă se evidenţiază leucocite mononucleare (ex. 'fotaViru- • tamponul rectal este recomandat în cazul unei infecţii cronice cu Shigella spp... [ .. Prelevăm o cantitate de aproximativ 1 gram între lamă şi lamelă nu se evidenţiază leucocite (ex.. BDA produse de Vibrio cholerae. ' când suspicionâni portajul de Shigella spp..! tamponului. unităţi 'de alimentaţie publică. în mediul de transport. virusuri Norwalk.. evident că într-o BDA pentru care agenţii etiologici suiit virali sau mecanismul patogenic .!?> ' ■■■. . porţiuni cu sânge. vor respecta recomandările menţionate în capitolul 6. ■!... coli (tipu­ : • Staphylococcus aureus etc. EIEC. YirsiniirenterocoUt'lca etc).p.. utilizat cel mai frecvent. . Diagnosticul de laborator în microbiologie Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de enterobacterii 158 ! • alţi bacili gram negativi -(Aerâinohad:spp4 Alâdligenes sppj Pseudoiiiolias spp...... E. BDA sau Vsindrom colonului sigmoid.. • scaunul emis spontan care reprezintă p. Ciyptpsporidium parvum etc). 1d ■la copil şi respecti v circa 15-20 cm la adult). Vibrio cholerae. Apoi introducem. Etiologia parazitară include tabere. . uiiui preparat nativ (vezi capitolul 7) şi examinarea microscopică a acestuia pot da informaţii în cazul în care p. . în specia! la pacienţi cu vârste extreme sau imunodepresie' Etiologia fungică include ‘ " • după circa .atunci când BDA apare la pacienţi care ati fost trataţi cu antibiotice iar sindromul • Giardia lamblia '• Entamoeba'hystoUtica Entamoeba call' 1 ’ 1 1 ■ 1” '. &tc) include acţiunea unei toxine este contraindicată administrarea de antibiotice sau chimiote- • Bacillus cereus rapice antibaqteriene. . • Campylobacter jejuni ■ Indicaţiile coproculturii în bacteriologie • Clostridiumpeifringenx. atunci când din punct de vedere microscopic în preparatul se remarcă aspectele menţionate anterior. . ETEC.v .. Utilizăm pentru prelevare linguriţa recoîtorului alegând porţiuni care Atât din punct de vedere diagnostic cât şi. sau Salmonella spp. culorii sau aspectului.. : • atunci când BDA prezintă riscul extinderii la nivelul unei colectivităţi (creşe.. Clostridium difficile '' " ’ -ii ■-ii • "• • Clostridium bvtuliniirn • atunci când este suspicionută o infecţie cu Shigella spp.se poate utiliza atunci când. recolta şi examina: • coronavirusurile .. BDA produşe db : rotire.. atunci suri..p.. .. <■!' t p. d e. din punctul de vedere al mirosului. .. atunci când dur punct de vedere microscopic-în'preparatul • sonda Nelaton-.. e t C t i i .1 săptămână de la debutul febrei tifoide etc • Candida albicans.. • în scop de cercetare etc. cu S I p A ) .

Respectiv o epriibetă cu bulion selenit acid de sodiu şi 2 plăci Petri. post antibioticoterapiC. E test). în mod similar pe mediul încă neînsămânţat.. de tip S. sunt seini transparente. m ' Alegem fragmente caracteristice clin p. de regulă prin metode difuzimetrice lităcu Campylobacter spp.. dis­ persăm p. roşii. de ex. . '• fain.. în căzui în care nu există colonii Iactozo- supravieţuirea enterobacteriilor patogene timp de 24-48 de ore. Atingând din nou ultimele 3-4 striuri.disponibil. biochimice (vezi capitolele 11 şi 12). .. după apariţia coloniilor izolate pe mediile selectivo-diferenţiale trecem ia iden­ Exam inarea m ateriilor fecale tificarea speciilor implicate patogenic pe baza caracterelor morfo-tinctoriaJe. Acest mediu asigură ■-jp' 3-5 colonii în cazul îti care pacientul este adult. de tip S. ADCL sau XLD). Materiile fecale în special capitolul 17). comparativă. fără să le atingem. de cultură Materiile fecale sunt examinate macroscopic şi microscopic. până aproape de marginile plăcii fără să/le atingem. .-' . mediul Cary-Blair (vezi capitolul 9). perpendiculare pe primele. întindem p. pentru identificare vom repica (fără să atingem mediul de cultură) 10 colonii la multiplicarea florei de asociaţie. Spre exemplu. apoi cu obiectivul 40x. Atunci când este suspicionată infecţia cu V.•« în mod obişnuit. . Realizăm: o suspensie omogenă în mediul lichid. însoţite de măcrolage şi hematii.2-3 anse în mediul cu bulion selenit (mediu de îmbogăţire în special pentru Salmonella spp... ■I 160 Diagnosticul‘de laborator în microbiologie 28 Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de enterobacterii 161 4°C. Frotiurile colorate pot fi utile în suspicionarea diagnosticului de enteroco. •î studiul sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice..•ui--»:’ ■■ ‘Hi-. pot prezenta un halou opalescent. • • •{( . iar pentru etapele de identificare vom repica (fără a atinge mediul de cultură) 3 colonii în cazul în care pacientul este cppil şi . ■■: ■ ">■ ' • ' ■ De regulă urmărim apariţia coloniilor Iactozo-negative. până aproape de marginile plăcii. Pentru interpretare vom utiliza diferitele tabele disponibile va examina iniţial cu obiectivul I0x. jv Iu--.?•i> . inhibând în acelaşi timp negative.p. nu sunt colorate.p. Pentru tulpinile considerate a fi implicate patogenic vom realiza terii bacteriene.standardizată.p. (antibiograma difuzimetrică .... Cultivarea m ateriilor fecale . dacă produc H2S centrul coloniei . puroi etc) şi însămânţăm. conduce la suspicionaVea unei dizen­ comerciale de diagnostic. Coloniile iactozo-negative au dimensiuni de 1- 2 mm. antigenice (vezi capitolele 11-20. una cu mediu cu selectivitate scăzută (exr Mac Conkey) şi alta cu mediu cu selectivitate medie (ex. Aceste medii selec­ tive sunt în acelaşi timp şi medii diferenţiale. pe baza sensibilităţii la bacteriofagi şi eventual pe sunt suspensionate într-o picătură de lugo! sau de albastru de m e t i l e n i a r preparatul se baza unor caractere moleculare." . pe jumătate din mediul. i . (mucus. în alte striuri paralele. Aşadar. sunt transparente. Din punct de vedere micro­ (vezi capitolul 11). *■• : ■) ■' f Alte aspecte particulare urmează a fi prezentate în capitolele următoare.(între lamă şi. scopic... • 7. lamelă). Modul de însămnnţare diferă de cel prezentat în capitolul 10. de regulă sunt de tip S dar pot fi şi de tip M. pornind de la tubul cu bulion selenit însămânţăm aşa cum am menţionat mai sus o placă cu MacConkey . de patogenitate. ■. Pe mediul MacConkey coloniile lactozo-pozitive au dimensiuni de 1-3 mm. Fără să sterilizăm ansa... în striuri paralele pe o jumătate de placă. .. . în izbucniri epidemice de BDA). . • .: !j ■ Pe mediul ADCL majoritatea bacteriilorîactozo-pozitîve sunt inhibate. cholerae. apa copil şi respectiv 10 colonii la adult (dacă se consideră că identificarea este necesară. în ziua următoare examinăm plăcile însămânţate precedent în vederea selectării colonii­ lor suspecte.).. atingem ultimile 3-4 striuri şi dispersăm p. Apoi. Prelevăm o ansă (sau o picătură) din suspensie şi o depunem pe mediul MacConkey. nu sunt colorate. de fiecare dată se vor realizapreparaţe native. . peptonată alcalină serveşte în acelaşi timp drept mediii de transport şi m ediu'de 1îmbogăţire.y* .'evidenţierea a în tratatele de specialitate sau recomandările producătorilor în cazul utilizării unor sisteme peste 40 PMN/câinp. sunt roşii. sau hi coliiCi pseudbmembranoaiîe. de regulă sunt i de tip S. pot apărea tai/div colonii de dimensiuni mai mici.incubăm aceste plăci timp de 18-24 de ore la 35-37°C.. pentru cultivare vom-utiliza13-medii diferite..p. -l este de culoare neagră.. Cel mai frecvent utilizăm. Incubăm timp de 18-24 de ore la 35-37°C.şi o placă cu ADCL (sau XLD). Coloniile lâc- tozo-negative au dimensiuni de 1-2 mm.

Transportul se va realiza aşa cum am menţionat în capitolul nr. pe lângă mediile menţionate în capitolul precedent bioză). După ce o serie de date sugerau asemănarea din punct de vedere molecular între speci­ . sau prin seroneu- • tipul patogen implicat în infecţia meningeală la nou născut. lâctbzo poizt. 4 . deoarece spre deosebire de tivi. aerobi facultativ ânaerobi. latex • tipuri (grupuri) patogene implicate în infecţii ale tractului urinar (ITU) aglutinare. cunoştinţele actuale pledează pentru o grupare a între lamă şi lamelă. mobili (dar există şi tulpini imobile) etc. în special la sugari • Produc colonii de tip S cu caracterele menţionate mai sus. MlU/MiLF) sau galeriile vitate maximă (ex. API 20-E. pe sol. / ază două citotoxine şi este implicat în apariţia unei BDA apoasă. în con­ tinuare vom discuta diagnosticul unei infecţii produsă de EHEC (ex.:-rn '. reprezentat de materiile fecale. • jE. coli (patotipuri) se disting trei 4. ile genurilor Escherichia şi Salmonella. Cu toate acestea. tralizarea efectului citotoxic pe celule Vero Indiferent de localizarea infecţiei. it •! faptul că în practica medicală. subliniem '■ i ■■ . toxinele pot fi identificate prin tehnici de tip ELISA.H7) dar. . API Rapid 20 E sau alte variante • E. • Caractere biochimice şi de mobilitate (pentru EHEC se vor examina la nivelul centrur. cu dimensiuni de 1-3 mhi.p. Produsul patologic este reprezentat de obicei de scaunul diareic dar am putea nului de rezistenţă la antibiotice şi chimioterapice.. Sunt bacili gram negativi'mobili sau imobili. cu mucus. Materiile fecale pot avea aspect : . Examinarea microscopică â produsului patologic include realizarea preparatului nativ. peritonite. 28. avea o culoare roz). . spre ex. la copii în aglutinare sau latex aglutinare (se pot utiliza şi seruri monovalente anti 0157 şi vârstă de 1-5 ani respectiv anti H7). coli enteroagregativ (EAggEC) implicat în apariţia unei BDA apoase. infecţii ale plăgilor. uneori de gra­ • Se pot folosi mediile multi-test convenţionale (TSI. pneumonii etc) există şi anumite tulpini dotate cu caractere patogenice particulare. care se va identifica (vezi capi­ (în apă. latex aglutinare pasivă inversată (VET-RPLA). 0157. repicate (fără a atinge mediul) în vederea identificării vor Cu toate că majoritatea tulpinilor de E. sau de la coloniile izolate pe MacConkey cu D-sorbitol). • E. etcf iar la nivelul intestinului'uman au rol în sinteza unor vitamine'‘(sim­ tolul nr. nu produc H2S ducând un sindrom dizenteriform • Pot produce îndoi. coli EHEC nu fermentează' sorbitolul (sau îl fermentează tardiv). Specia tip este reprezentată de Escherichia coli. fermentează tardiv) sorbitolul. ' colecistite. speciilor din genurile Escherichia şi Shigella. coli enterohemoragic (EHEC). direct.3 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR 9 • ÎN INFECŢIILE PRODUSE DE ESCHERICHIACOLI recolta şi lichid de vărsătură sau un anumit aliment incriminat. 1. pornind de la p. persisten­ • Caractere de cultură: tă. care elabore. spre exemplu serotipul 0157:H7. coli sunt saprofite sau condiţionat patogene (fiind fi necolorate. detectarea genelor de patogenitate pornind de Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu localizare digestivă la p. 28). • E. Dintre aceste tipuri de E. j letală la purcel.p.p. putem observa prezenţa unor lambouri de mucoasă epitelială. coloniile suspecte. de regulă de tip S (coloniile sorbitol-pozitive vor implicate în infecţii oportuniste cu localizări în afara tractului digestiv. persistentă. în acest sens. coli enteroinvaziv (E1EC) care elaborează una sau mai multe enteroxine pro­ (sau. nu fermentează • E. coli aderent difuz (DAEC) care produce diaree apoasă. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Escherichia coli \(. Vom prezenta în continuare separat diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganismele aparţinând 3. sunt urează-pozitivi. coli enteropatogen (EPEC) care determină diaree la copilul mic. coli enterotoxigen (ETEC) cure elaborează două enterotoxine (termolabilă şi ter. diaree malignă la nou născut) multi-test API 10 S. în vederea izolării EHEC. sindromul hemolitic uremie • Fermentează glucoza (cu producere de gaz). se recomandă utilizarea mediului MacConkey cu D-sorbitol. :: majoritatea tulpinilor de E. Genul Escherichia cuprinde germeni comensali care se găsesc ubicvitar se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură. putem izola orice microorganism implicat etiologic în BDA. [ : ’ l : . Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regu­ 5. endomelrite. neceşitând măsuri suplimentare de siguranţă): ! severă şi se poate însoţi de o complicaţie gravă. • Alte teste ce pot fi studiate în scopul identificării germenilor: mostabilă) şi produce un sindrom holeriform • Testarea caracterelor antigenice: Ag somatice pot fi identificate prin reacţii de • E. după caz. diagnosticul de laborator microbiologic este bacterio­ ' • Testarea caracterelor de patogenitate: EHEC produce enterocolită hemoragică logic. Antibiograma este recomandată de regulă numai pentru supravegherea apariţiei fenome­ lile cunoscute. sunt lactozo-pozitivi. se realizează prin metode difuzimetrice. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor grupări mai importante: caractere: • tipuri patogene implicate în boli diareice acute (BDA) • Caractere morfolinctoriale: Sunt bacili gram-negativi. care poate deveni lui de referinţă.ij'liJ hemoragie iar la examinarea microscopică a p. Materiile fecale se examinează macroscopic şi se trimit către laborator aşa cum am menţionat în capitolul precedent. 2. remarcăm prezenţa hematiilor şi leucocitelor PMN. se poate studia efectul citopatic pe celule Vero' • Teste de biologie moleculară (PCR. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să genurilor „clasice".

Citrobacter freundii. ITU înalţe includ pielonefrita aquţă.iţurinaj.unităţi formatoare.• .p. după spălarea organelor genitale şi a tamina p.microorganisme provenind din. Invazia tractului urinar poate avea Ioc pe cale E xam inarea macroscopică şi microscopică a urinei ascendentă. O l.numărului. ‘ ■•. stuartil. Cu privire ia E. fiind contam inată cu.'-.(^1{*t • Ţjtî ‘ /" Există o serie de factori care favorizează apariţia 1ŢU. în afară de recomandările generale menţionate anterior.‘stricturi anumit miros etc.repetăm urocultura.sau. jzola. disurie. putem lua decizia-să.că aţunci când se. uretrei distale stafilococi coagulnzo-negativi. Candida albicans..o . în cazul în care urina nu este prelucrată imediat Salmonella typhi sunt semnificative indiferent’<ie număr ui UFd/ml.dţCcindida spp. poate prezenta un care duc la stază urinară (adenom sau carciiiom de prostată. Enterobacter aerogenes...: pptenpăprecizăm dacăpacientLil. Adenovirusurile pot determina cistite hemoragice' la copii. laborator. coli. (sau în cel mult 30 de minute după recoltare).i ITU. Mai rar. Dintre aceste microorganisme. ITU joase includ cistita. Mycoplasma spp^Ureplqsma spp.i Cjî‘*■}. . • . cateterizare urinară etc). stafilococii coagulază-nega- sau Fusobacterium spp. tumori.dar după urină în recipientul steril.că indiferent' de grija cu cţire vom . „din mijlocul jetului". difteromorfi. .amintim fapj. . Citrobacter diversus. Datorită acestor rezultate.. tiyi.. t-<•J■ • • • aspecte-particulare ' H Cu toate acestea.iti> 15.ru. în funcţie de sex sau ia pacienţii spitalizaţi recoltată.de altă parte. ' i s u t .arătat. în mod cert. spre ex.urina'proaspijţ în ceea ce priveşte etiologia ITU. [. Serratia liquefaciens.p. trebuie să subliniem unele ». iar personalul medical trebuie să explice şi eventual să asiste recoltarea iar izolarea aceleiaşi bacterii poate indica prezenţa ITU. efectuarea testării sensi­ • în cazul în care nu se poate recolta prima urină de dimineaţă. trebuie menţinut la temperatura Pentru a sublinia încă!o dată importanţa etapei . calculi Tractul urinar este în mod normal necontaminat. Mai multe studii. • i. purulent). opalescent.. Enterobacter cloacae. o floră microbiană foarte variată. neinvazive sau invazive (puncţie şi aspiraţie supra- papilară (complicaţie a pielonefritei acute sau care poate apărea în absenţa infecţiei).ll'». necrpfea • Există şi alte tehnici de recoltare.are. La acelaşi nivel ai. Morganella morgani. febră). iar lungirea timpului de transport va conduce la multiplicarea bacteriilor.nu infecţie urjnarăi în comparaţie cu pacienţii pentru care se solicită urocultura în ambulatoriu. pe grupe de vârstă.uretrei distale) şi abia apoi se recoltează 20-50 ml (preferabil 50 ml) Clasificarea ITU se poate.. Proteus mirabilis. Spre exemplu. prin micţiune se elimină circă 100 ml urină (îndepărtând astfel o parte a ger­ ore la temperatura camerei va conţine K)5 bacterii/ml. în ordine descrescătoare i-ll i . etiolbj|ia ITU poate fi reprezentată de Staphylococcus aureus. iar o probă de urină care are iniţial (în momentul recoltării) f O3 bacterii/ml.-1 Iri n iu p n . p. prfeenţa de‘PlvîNjimumăful de unităţi'forinâtbare de colonii/ml neului. pufea fi identificate şi tu|pini(. •. Pseudomonas aeruginosa.164 Diagnosticul de laborator în microbiologie Diagnosticul de laborator în infecfiile produse de Escherichia coli 165 UROCULTURA : (ţlln- uretrale sau ale colului vezical. 02. Klebsiella pneumoniae.••!:•[} 1 | menilor de Ia nivelul. la nivelul ordine descrescătoare E. •. ■ vt-iîlo.. 07 etc.u majoritatea bacteriilor care pot con­ • De regulă se recoltează urina „din mijlocul jetului". cel mai frecvent microorganism implicat în tativă. Proteus ' vulgaris.recolta p. B. face după. j : £ în ITU se pot recolta urină. explică mdtivdî pentr P. Salmonella spp. enterococi.de. izolarea a. limfatică său heinatogenă. . p'rin aprecierea.de tive. sânge (ex. coli. refluxul vezico-ureteral. acesta^a fi contaminat. Enterococcus Jaecalis.cronică'ţdiîpă unii autori)'.de .. compresiune uretraiă în timpul sarcinii. demppstrează prezenţa.putem.. există recomandări specifice pentru sexul feminin şi masculin şi respectiv pen­ urină şi elemente clinice (ex.zona Microorganismele mai frecvent implicate în producerea unei infecţii a tractului urinar sunt în genitală sau de la nivelul colonului.a. ' -.A o n o ! n o n iss a ra m nAtrsifriV/i îi n u A r /S K î.bacterii/mj.cantitativă ă. streptococi. în pielonefrita acută) sau chiar şi LCR. micţiuni mai frecvente. dorim să subliniem că interpretarea rezultatului .nu trebuie realizată mecanic şi decizia finală în ceea ce priveşte identificarea bacteriei. frigiderului iar transportul trebuie realizat ia +4°C tul că urina reprezintă un foarte'bun mediu de cultură penti.'de vecinătate. . renal sau pielonefrita.. după 2 perineului..este luată în considerare. prostatita şi epidjdiniita. i .peste IO4 • Este contraindicată recoltarea urinei la domiciliu (pot exista erori de recoltare iar pre­ unităţi formatoare/ml în cazul stafilococilor sau (evurilor . corpi străini. în practica medicală se consideră că ne aflăm în situaţia unei ITU atunci când numărul de bacterii/ml• urină /•este > 105/ml. streptococi (3-hemolitici din grupele A. alţi factori funcţionali.au. neis.. Klebsiella oxytoca.colpnii„ţn. există diferenţe Cu toate . aceas­ Recoltarea şi transportul produsului patologic ta indică o infecţie a tractului urinar (ITU) în aproximativ 80% dintre cazuri întinrp .ce.de. în schimb uretra distală poate prezenta urinari. există anumite grupuri uropatogene.1 * 1' ‘ . cateterizare uretraiă. poate fi tulbure. mai multe criterii.p.105.p valoare de 104 bacterii/ml indică ITU în mai puţin de 30% dintre c a z i i t i .de recoltare şi transport â urinei. după recoltare. dintre care amintim: obstrucţiile Realizăm iniţial examenul macroscopic. în cazul unor elemente suges­ • Este preferabil ca recoltarea să aibă ioc într-un spaţiu corespunzător în apropiere. trebuie aşteptat pentru recoltare 3-4 ore după micţiune bilităţii la antibiotice şi respectiv redăctdrea buletinului de analiză ar trebui să fie luată având în vedere aspectul macroscopic 'al urinii (ex. rezultatul exameriului microscopic • Recoltarea se realizează după spălarea cu apă şi săpun a organelor genitale şi a peri- al sedimentului urinar (ex.serii saprofite. C sau G. Corynebucterium urealyticum. i . Serratia marcettcens. în contin­ uare vom discuta despre recoltarea şi transportul urinei.i. după care micţiunea continuă unui autori şi uretrita.p. .. abcesul pubianâ. Provklencia rettgeri.r. p.Pe. chiar dacă numărul de bacterii este de 104/ml. Acin’etobacter calcoaceticus'. în vederea examenului microscopic al urinei omogenizăm urina prin „răs- . cu riscurile respective). aşa cum am prezenţa în urină a Listeria monocytogenes la femeile însărcinate sau prezenţa în urina a menţionat mai sus). cualte cuvinte Colabo­ tru copilul mic rarea între clinică şi laborator este esenţială.

levuriufeventuaLînrnuguriteVcu textul clinic şi corelat cu rezultatul microscopiei iar în cazul anumitor bacterii (ex.Din motive:deEco­ nomie am putea însămânţa o jumătate de piacă cu mediu MacConkey. i i .f în cazul în care numărul de UFC/mi este mai mare de IO5 realizăm teste suplimentare • Izolarea a două bacterii diferite. .q serie de alte teste pentru aprecierea repetării analizei (există şi unele excepţii.permite vizualizarea de celule epiteliale (malpighiene. '0'i!ilornrr!.Electrolyte Deficient agar) omogenizare. ■.. pentru a doua probă de urină este posibilă ITU mixtă (îri caz1contrar este o foarte Control de calitate probabilă contaminare) • ! : -■ • Pregătim o suspensie baeteriană în soluţie salină fiziologică sterilă cu 105-I06 bacterii pe mi din fiecare dintre tulpinile de referinţă .'-.Piuria. pentru levuri în concentraţie de peste 104/ml de urină.epi tel i aii. urină reprezintă o urocuîtură negativă vezicule. succesive. recoltat cu mai mult timp în urmă şi menţinut cu o bună aproximaţie să.ftMtul spre ex. Mediul MacConkey fură cristal violet de pe a doua parte a lamei are culoare ore la 35-37°C.'.i Este... biochimice. • Lipsa multiplicării bacteriene sau dezvoltarea de UFC în concentraţie de 103/ml de . examenul sedimentului urinar este fqarte util şi Salmonella typhij rezultatul este pozitiv indiferent de concentraţia UFC/ml de urină.. acoperim cu o lamelă şiexaminămcu • Izolarea a trei bacterii diferite. putem vorba de o contaminare sau de un p. leucoci.' granulaţi etc:). chiar şi în cazul în care concentraţiile pentru fiecare în microscopul cu imersie (sau microscopul cu contrast de fază). ( 166 Diagnosticul de laborator în microbiologie Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Escherichia coli 167 turnare". .. ‘ .ţ i . în care rezultatul este considerat pozitiv. de placă Petri cu mediii MacConkey.p. îndepărtăm excesul de urină pe o hârtie de filtru curatăl$rptmem la ioc în dispozitiv lama însămânţată.de. în mod obişnuit. de 2-3 ori. • Izolarea unei bacterii cu o concentraţie de peste lO-Vnil de^urină confirmă ITU la băr­ bat sau la femeie (cu simptome caracteristice). Alte elemente privind interpretarea au fost impune repetarea recoltării şi însămânţării...Trichomonas•vaginalis etc. pe cele 2 părţi înmulţirea numărului de UFC x inversul diluţie x inversul volumului însămânţat. impune repetarea analizei..cantitative . protejată într-un tub de plastic. extrem de probabil este prezenţa a cel puţin unei bacterii..i Examenul sedimentului urinar . bacteria izolată se identifică (pe baza caracterelor morfo- Cultivarea urinei tinctoriale. >>• în cazul unei uroculturi pozitive. căreia prelevăm urină prin atingerea suprafeţei p.. după Mediul CLED de pe prima parte a lamei (Cysteine . în:cazul în care identificăm parte depăşesc 10-Vml de urină.■v« :Ş> rrj+i: ni!.. în striuri paralele. Concentraţia scăzută de electroliţi inhibă invazia p. ■ i::ăt •. uretrale etc). prezenţa piuriei • Izolarea unei bacterii cu o concentraţie de !04/ml de urină conduce !a recomandarea i (peste 10 leucocjte/mtţi3' de prină^Â u fost .Lactose . A doua zi citim rezultatele. însămânţăm de ex.. pi^«uşi. 24 o rela 35-37°C. O variantă de însămânţam pentru mediile MacConkey şi geloză-sânge este utilizarea unei Principiu anse calibrate d e : 1' ţii cu ajutorul. dintre. !••• Tehnica de lucru Frecvent este utilizată înşămânţarea urinei după diluare (ex. pe fţecafe cârnp..p. repartizăm p.bt«te4un^L spre exetp^ju. . In terp retare certificarea. Dintre acestea vom aminti metoda imaginată în Institutul de boli tiv agarcu eozină şi albastru de metilen (EMB) în cazul în care examenul .1 ml de urină diluată 1/100.p.şi bacteriuria trebuie inţerpţetaţe'încontex­ negativi în concentraţie de peste 5 x l0 4/ml de urină etc) tul clinic. 45 faţă de striurile precedente: După o incubarc de 18-24 Proteus spp. cristale urinare.. însămânţăm iniţial un striu pe centrul jumătăţii‘de placă după care întindem are culoare verde şi permite numărarea coloniilor bacteriene (indirect a numărului de p. 1/100) cu ajutorai pipetei gra. inclusiv abordarea jumătate de placă cu geloză-sânge şi câte un sector de placă cu mediu agar telurit şi respec­ unor tehnici miniaturizate. .imaginate . .eritrocitari. Dacă examenul microscopic este negativ. celule sanguine (leucoeite..p. Spre exemplu ultima urinei este pozitiv. •i mmr.. Deştirubăm capacul şi extragem iama iară să atingem. Injjubăni în poziţie dreaptă. hematii). blastoconidii). timp de 18- Interpretarea rezultatelor uţoculturii. stafiiococii coaguiazo- razei leucocitarej teste. necesşrsăapreciem.'fiecare cu o concentraţie de peste 105/tnl de1urină.p în striuri paralele în unghi de. suprafaţa agarului.. 10? bacterii/ml. Punem o picătură de urină pe lamă. • Dorim să subliniem din nou că rezultatul microbiologic trebuie să fie analizat în con­ tari.Gram. pe o placă cu mediu MacConkey 0.cilindrii urinari (hialini.(fără cristal violet).o Există o serie de încercări pentru optimizarea diagnosticului ITU.bioIuminiseenteptc' . '• 'l .în fiecarp. Imersăm lama în incubăm în' condiţiile cunoscute şi după apariţia coloniilor calculăm numărul de bacterii/ml prin proba (je urină recoltată (dacă urina nu este suficientă cahţitativ. '1 j ale Jaijjgi cu ajutorai unei pipete Pasteur).... metoda „Uriline“ etc. alte caractere) şi se testează sensibilitatea la antibiotice şi chimioţerapice.microscopic al infecţioase „Matei Ba!ş“ (prof.şr. numărul de bacterii/ml de urină. comparând numărul de colonii apărute pe me­ diul CLED cu modelul producătorului. trebuie realizat de fiecare dată. Florin Cărunţii). în cazul că pacienta este asimtomaticâ. Alternativ se ■la temperatura camerei şi nu la frigider poateuţiliza preparatul'colorat.5 ^âmpuri. ITU este dată de izolarea aceleaşi bacterii în a doua probă de urină. în final fără sterilizăm ansa întindem UFC/mi urină) şi identificarea prezumtivă. considerăm că aveni o bacteriurie. în cazul în care rezultatul este similar şi prezentate anterior.\k u . inhibă majoritatea bacteriilor gram pozitive.pentru cultivare putem utiliza 3-4 medii diferite. de cultură.§i..concomitenţ. de regulă prin metoda difuzimetrică (vezi capitolul 14). putem' aprecia care este roz. pentru identificare şi respectiv antibiograma.( date.:e în jisw » ' . însămânţăm doar o jumătate dintre metode utilizează o lamă de plastic acoperită pe ambele părţi cu mediu de cultură. perpendiculare pe primul striu.'înmulţind cu 1000 numărul de UFC dezvoltate.

... . cu mucus. Exotoxina shiga afectează atât intestinul cât şi sistemul nervos central (putând... Microorganismele din genul Shigella sunt patogene prin multiplicare şi invazivitate. izolăm bacteria patogenă. dureri abdominale intense. abcese care evoluează spre ulceraţie. necroză. însoţite de colici intestinale şi tenesme rectale. necapsulaţi.. respectiv R şi S). -v i: *S* 1.■y' . Ulterior se elimină scaune foarte numeroase (20- 40/zi). După o perioadă de incubaţie de circa 2-5 zile. hemoragie). pe Mac gen care include şi Escherichia spp. S.. Recomandăm recoltarea şi cui- . poate produce şi toxiinfecţii alimentare de tip infecţios. Starea generală se înrăutăţeşte (mai grav în cazul unei infecţii produse de Sh. Ffe bâza structurii antigenice au fost dife­ Conkey apar colonii incolore. lactozo negativi. până la comă). la apariţia unor fenomene de meningism sau chiar pierderea stării de conştienţă. aerobi facultativ anaerobi.'flexneri (6 . glucozo pozitivi fără producere de gaz oxidazo negativi.prezenţa culorii ■galbene în jurul coloniilor dezvoltate.8pm/2-3 pm.se elimină circa 103. . Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic (direct) şi trebuie făcut de urgenţă datorită implicaţiilor posibile ale unei dizenterii.Fermenţarea. doar. • Escherichia coli: apar colonii galbene pe CLED şi colonii roz pe MacConkey. în cazul serotipului 1 din subgrupui A (Sh. nefecaloide. Din punct de vedere macroscopic materiile fecale pot fi în cantitate mică. în lipsa tratamentului corespunzător (în special în lipsa reechilibrării hidro-electrolitîce) evoluţia poate fi fatală. ■Genul Shigella ar trebui să facă parte conform studiilor de biologie moleculară dintr-un • Proteus mirabilis: apar colonii translucide iar culoarea CLED este albastră. sluga) este implicată şi toxigeneza. pe baza fermentării manitei (subgrupui A este mani to negativ). La începutul bolii este mai uşor să. în cazul unei dizenterii tipice apar brusc febră. în s'pecial recoltarea cât mai rapid după'debutufbolii şi înainte de iniţierea antibioterapiei. Faţă de ani­ *iS malele de experienţă are efect letal. şi lichid de vărsătură. sorinei (1 serotip cu 2 faze sau variante. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând re­ gulile cunoscute (vezi capitolul 6). cu dimensiuni de 0.. . dia­ ree apoasă. conduce. Produsul patologic este reprezentat de m aterii fecale. genul Escherichict-Shigella. Genul Shigella include bacili gram negativi.citim şi interpretăm rezultatele . Shigella spp. se multiplică şi invadează epiteliul intestinal (pot apărea abcese la nivelul peretelui intestinului gros. renţiate patru subgrupe (A-D) respectiv Shigella clysenteriae (13 setotipuri). Actualmente este accep­ tată tratarea separată a celor două genuri înrudite. în afară de dizenterie.-a * • Staphylococcus aureus: apar colonii. boydii (18 serotipuri) şi S.. . .lactozei este indicată de. conţinând mucus. nesporulaţi. puroi şi sânge (uneori sângele nu este vizibil macroscopic). Infecţiile cu Shigella spp. puroi şi sânge. Dizenteria poate apărea după ingestia a numai 10-100 de bacterii. Subgrupele se pot diferenţia de ex. ( 168 Diagnosticul de laborator în microbiologie DIAGNOSTICUL DE LABORATOR • Staphylococcus aureus ATCC 25923 » ÎN INFECŢIILE PRODUSE MICROORGANISME • Escherichia coli ATCC 25922 DIN GENUL SH IGELLA • Proteus mirabilis ATCC 12453 . 1. '[ ■.pe mediul CLED. deoarece iniţia! . h ■i > :i ?tK'' . sunt de regulă limitate la nivelul tractului intestinal.IO9 bacterii/gram de materii fecale. . imobili. . la nivelul ileonului terminal. shiga). . care se localizează. iar după 18-24 ore incubare. Cresc pe medii simple şi produc colonii de tip S în 24 de ore. ţJriline. dar s-ar putea recolta. ■ • .. o Inoculăm suspensiile astfel pregătite pe suprafaţa mediilor de cultură. .-H ' ' serotipuri care se pot subdiviza în sub-serotipuri). S.5-0.

sau. ' ” 1 luţie spre cheratoconjunctivită (testul poate fi pozitiv şi în cazul unor tulpini de 3. O altă variantă de recoltare posibilă (de ex. . cu diametrul de 1-2 mm pe MacConkey sau ADCL (S.j • Caractere anţigenice: • 7 • se utilizează seruri imune polivalente pentru subgrup sau seruri imune'specifice ide tip. M ili' M1LF) sau procedăm conform protocolului d e’lucrii pentru tulpini rezistente la» medicamentele antimicrobiene dar şi pentru stabilirea tratamentului galeriile tip API.flexneri 2a şi S. a: • se pot investiga analizând rezultatele obţinute pe mediile multitest sau pe galeriile API.după 8 ore. în care o tulpină izolată are un comportament biochimic sugestiv'dar reacţia de aglutinare este negativă.pentru gice sau în scop de cercetare.' ’ • Caractere morfotinetoriale: Sunt bacili gram-negativi cu cu dimensiuni de 0.8 pm/ 2-3 pm.tre. repicăm colonia suspec­ mecanismului bolii diareice. imobile. schemele de controlul stării de „purtător") este reprezentată de utilizarea sondei Nelaton introdusă în lizotipie au fost utilizate în special pentru S. cobai.5-20 cm la adult) aspirând p. prin reacţii de aglutinare pe iarnă. Transportul trebuie să din respectiva tulpină. conform unor scheme stabilite ■ • în cazul. lactozo negative.'-dar eăle'-'pttsferabilli•‘ftisamânjtti«ârla' patul bolnavului.). prin rectosigmoidoscopie. puroi şi sânge:. lactoza) şi roşii pe XLD • Caractere biochimici şi de mobilitate: ■ 1 . pe care o menţinem-timp de 30-60 minute la o temperatură fie realizat rapid.soluţie cloruro-sodică sau în mediul Cary- Blair. Preparatul se examinează'la|micro­ logie scopul optic cu obiectivul 4Qx. . Shigella se dezvoltă pe mediile slab şi moderat selective şi nu se multiplică pe mediile înalt 5. repicăm 3-5 colonii izolate pe prin metoda difuzimetrică standardizată. care se va identifică (vezi şi capi­ f tehnici ale biologiei moleculare (stabilirea profilului plasmidic. lactozo negative. prezentate în capitolul 281 ADN etc). în special în scopul supravegherii apariţiei unor mediile multitest (TS1. sonnei poate produce colonii care devin roz deoa­ rece poate fermenta tardiv. cu ajutorul unei * Alte caractere/teste utilizate în identificare ia nivelul centrelor de referinţă: seringi. pentru S. Se vor utiliza mediile de cultură recomandate. • Caractere de cultură: . Anumiţi autori recomandă utilizarea imuho. fluorescenţei directe. fi^duH’''dm'_'âcesţ tip' cîe proidusiii' patologic. introducem o ansă de cultură sub pleoapa ţinui lor este sugestiv pentru dizenteria bacteriană. . Evidenţierea a numeroase PMN vine în sprijinul stabilirii .fel încât să Escherichia coli) ' ■ se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură. indol negative. după 12-24 ore în cazul unei reacţii pozitive apare congestie conjunctivaiă. sondele tolele 9 şi 10). 7 • pot fi necesare. iar un procent de peşţe 75'°/o PMN însoţit de prezenţă hematii­ tă pe gelozu înclinată iar. sonnei) pjrbaspftt' în. 4. utilă în scop epidemio­ cazul în care suspectăm o infecţie ca'SHigellajpp. fiind rezervată laboratoarelor de referinţă. semitransparente. urează negative. ribotipia..giucozo pozitive. sonnei colonul sigmoid (10-12 cm la copil sau 1. Antibiograma (verificarea sensibilităţii ia antibiotice şi chimioterapice) se realizează selective. • teste biochimice suplimentare (biotipie) 2. recomandăm folosirea unui mediu de transport. în • rezistotipie (tipare prin patern-ul rezistenţei Ia antibiotice). nu produc H2S.. teste biochimice suplimentare . microbiologie Diagnosticul de laborator în infecfiile produse de Shigella 171 tivarea în special a fragmentelor care conţin iiiucus.^’n u. în cazul apariţiei unor colonii lactozo negative. 1 !" " ’ ’• 'A 'Ji' ’ antimicrobial! corespunzător. Materiile fecale se vor suspensiona în.. în cazuri atipice.. mediul bacte­ • Testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza în studii epidemiolo- riostatic Cary-Biair. ’ • testul Sereny (producerea cheratocoiijunctivitei la cobai). iDacă această reco­ de 100°C şi ulterior repetăm reacţia de aglutinare mandare nu poate fi urmată.170 Diagnosticul de laboratoei . trebuie să realizăm o suspensie (destul de densă) . examenul este costisitor în special datorită1existenţei numeroaselor secreţie purulentă şi opacifiere a corneei cu accentuarea acestor fenomene şi evo­ serotipuri. l&rnSV*""iameia ‘. fără producere de gaz.. Există şi posibilitatea de a recolta p.p. ExaminareaMicroscopică a produsului patologicincludeyrealizafea‘!unui preparat '■ ■ • bacteriocinotipie (ex. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa. caracterele biochimice sunt utile şi în diferenţierea subgrupelor genului ! • microorganismele clin genul Shigella sunt.p.5-0. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: ' .. • produc colonii de tip S.

în canalul toracic şi conduc la apariţia unei prime bacteriemii umitată de invadarea altor organe şi formaţiuni lim­ • Nu produc indol. S. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând're­ din respectiva tulpină. După o incubafe de 18-24 ore la 35-37°C. care nu include iactoză) coloniile sunt negre. Febra tifoidă este o boală gravă care în lipsa tratamentului poate conduce la • Caractere biochimice şi de mobilitate: deces. galinantm putlorum).’Produsul patologic este reprezentat de obicei-de materiile fecale dar'am de 100°C şi ulterior repetăm reacţia de aglutinare. Una dintre clasificările acceptate. pistării agentului cauzal. pură în scopul identificării şi stabilirii sensibilităţii la antibiotice. este urmată de o a doua bacteriemie masivă şi de eliminarea • Pentru punerea în evidenţă a caracterelor biochimice se pot folosi mediile multi­ prin bilă şi/sau urină. se mul­ • Fermentează glucoza (cu producere de gaz). în cazul în care a fost folosit şi me­ Enterocolita (gastroenterita. excreţia prelungindu-se mult timp în conva-. ii):'!' ii' *■"’ între lamă şi lamelă. colecistită. produc lizindecarboxilază şi ornitin- fatice. necolorate dar cu centrul negru pe ADCL. Materiile fecale se examinează macroscopic şi se trimit către laborator aşa cum am menţionat în capitolul 28.)>•< jj j. necapsulaţi. salmonele. direct.se va realiza cu cili peritrichi (cu excepţia S. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea preparatului nativ. ' / respectate). t ! ! .■' >! '• ” . i : ■. > • Alte teste ce pot fi realizate în scopul identificării germenilor. La sfârşitul primei săptămâni de boală. glucozo-fer. cu diametrul de 1-3 mm (necolorate şi salmdneloze minore (enterocolite. în funcţie de rezultatul obţinut. bolnavul poate deveni purtător (ex. intestinali şi prin bilă în materiile fecale. S. pe care o menţinem timp de 30-60 minute la o temperatură gulile cunoscute.>•'. Febra tifoidă (febra enterală) poate apărea după ingerarea a circa 103 margini neregulate şi halou metalic.jiî!î-iti an-v « 3. • se utilizează seruri imune specifice. typhi).şpA enterica pe un mediu lichid de îmbogăţire (bulion selenit) şi pe două medii gelozate selectivo-dife- (produce boli diareice la ora şi la animal. C ] . lactozo-negative. ■' 1.î| Genul Salmonella include bacili gram. MIU.îU . un anumit aliment incriminat etc. toxiinfecţia alimentară de tip infecţios) apare după ingestia diul Wilson Blair (foarte selectiv.anumţ S. putem remarca prezenţa granuiocitelor mononucleare. gruipul Ai'($ paratyphi A).s ' ' ' ■■■■■'. ( DIAGNOSTICUL DE LABORATOR IN 3 1 Diagnosticul de laborator în infecţii produse de Salmonella 173 INFECŢIILE PRODUSE DE MICROORGANISME DIN GENUL SALM ONELLA — putea recolta şi lichid de vărsătură. Pentru izolarea şi identificarea agentului patogen p.şj. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să Există mai multe clasificări pentru microorganismele care. produc FUS. ■ V i! v’iijîf* j/!i!! . Identificarea microorganismului implicat patogenic izolat în cultură pură. typhi trece prin şi printre celulele epiteliale de ia nivelul ansei ileocecale.S. '• (pe MacConkey şi ADCL/XLD).negativi.p. febre entefale). produc KfeS • Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativi. tifoidă. Ac anti-H. API Rapid 20 E sau alte variante). cultura de 18-24 ore în bulion selenit va fi trecută pe mediile solide enter'iiidis) e tc . trebuie să realizăm o suspensie (destul de densă) 1. în cazul afecţiunilor sistemice. în scheme care folosesc iniţial Ac anti-0 şi în cazul afecţiunilor strict digestive. • Caractere de cultură: Infecţiile produse de microorganismele care aparţin genului Sălihdneilăsepoiîmpat# în • Produc colonii de tip S.(Ewing)grupează genul. pe mediile cunoscută schema de identificăm sm-ol6gică' (Kaufmann-White)' cares'ubîihparte genul solide pot apărea colonii bacteriene âuspecte (lâctozb-hegative) din'care obţinem cultura Salmonellaîn grupe care includ foarte multei „speCii“'iSpre'ex. diagnosticul de laborator microbiologic este bacte­ ulterior. ocazional şi ia om) . Pentru a creşte şansa de­ grupul B (51 paratyphi B. typhi (pato­ capitolele 9-10 şi 28). în special lâ nivelul organelor cu sistem reticulo-endotelial decarboxiiază etc. bine reprezentat (ficat. / reacţia de aglutinare este negativă. t y p h i . i . semitransparente. la nivelul • Caractere antigenice: veziculei biliare) după vindecare. este însămânţat genă doar pentru om). toxiinfecţii alimentare) şi" saltnondoze''mi^OT<5''. •■. splină). de regulă la nivelul cen­ trului de referinţă: . API 20 E.. MILF) sau galeriile multi-test (API 10 S. cu centrul negru pe XLD).specii. mobili 4. Multiplicarea importantă.(febrii semitransparente pe MacConkey..3 . 1111 fermentează lactozâ. cu dimensiuni de 2-4 pm/0. ■i Itîv \i!hw'lnil iu* vii 2. Microorganismele trec apoi. lescenţă. /. diagnosticul poate fi bacteriologic şi/sau lamă conform schemei Kauffmann-White (există tabele şi scheme care trebuie serologic. pe baza mai multor caractere: mentativi (cu producere de gaz cu excepţia S. în ganglionii mezenterici. roşii. (există şi excepţii) şi utilizează citratu! ca unică sursă de carbon.(î / î 5 ‘ ■*’f.aparţin genului.i ?.6 pin. mobili. cholerae suis (patogenă ia porc. cu a 105-10^ Salmoneie. se poată obţine colonii izolate şi respecti v o cultură pură. cu aproximativ 2000 de serotipuri^Este încă bine renţiale (MacConkey şi ADCL/XLD). tiplică activ în submucoasă şi este fagocitată de macrofage unde supravieţuieşte şi continuă (exisă şi excepţii) şi utilizează citratu! ca unică sursă de carbon. sunt tirează-pozitivi. S. nesporulaţi.Salmonella. sunt lactozo-negativi. care urmează a fi identificată (vezi. • în cazul în care o tulpină izolată are un comportament biochimic sugestiv dar Diagnosticul bacteriologic (direct) cuprinde etapele cunoscute. să se multiplice.în.} J j j i ' . Pot apărea angiocolită. typlii se elimină din foliculii test convenţionale (TSI. S. prin reacţii de aglutinare pe riologic. Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu localizare digestivă ..4-0.

penajul mai energic . în momente folosind culturi vii de S. serologic. Atunci când presupunem o febră . typhi. Atât în cazul bolnavilor. teriilor/fungiior în torentul circulator. respectăm ceea ce am prezentat mai sus.Cea mai cunoscută metodă utili­ diferite. Creşterea de 4 ori a titlului la 2 determinări succesive sau pentru supravegherea‘apariţiei fenomenului' de.sânge. paratyphi A. iar . serul de cazul în care presupunem că agentul etiologic poate face parte din flora normală vom recolta cercetat fiind diluat corespunzător protocolului de lucru. de iniţierea antibioterapiei. măduvă hematogenă etc. şi anti-. ' .S. typhi nu se mai practică astăzi. studiul. ulterior putem recolta materii fecale. AO . este reprezentat de temperaturii şi/sau frison precum şi de alte semne sau simptome. în Utilizăm serii separate de tuburi. (ex. 7i" Având în vedere cele menţionate mai sus.-. cu o serie de sublinieri: conduce ia apariţia unei bacteriemii putem aminti: o extracţie dentară.» . Trebuie însă menţionat că. cu anumite particularităţii iMulte din aspecte au.S. typhi. O bacteriemie/fungemie se poate însoţi de creşterea Hemocultura va fi discutată în cele ce urmează. .S.S. dar mai ales în cazul convalescenţilor şi purtătorilor a fost reco­ Diagnosticul definitiv (cert) este reprezentat de izolarea şi identificarea & typhi în p.17 4 Diagnosticul de laborator în rnicrobiologie vf iî Diagnosticul de. (interval de 7-10 zile) poate confirma diagnosticul. Pentru identificarea Ag' H poate fi necesară inactivarea cu putem aminti: Staphylococcus epidermidis. Acinetobacter calco- . se realizează prin metode difuzimetrice.. în anumite cazuri (de ex. fungi. principiile generale ale acestui tip de diagnostic. La persoanele vaccinate recent diagnos­ rapice..jderitificarea Ag O. nu foloseşte citralul ca unică sursă de carbon şi este ornitindecarboxilază negativă.m mjn. Este importantă utilizarea noţiunilor de microbi­ tul de vedere al rezultatelor obţinute în comparaţie inclusiv cu metode ale biologiei mole­ ologic clinică care trebuie foarte bine cunoscute de către medicul microbiolog în colaborare culare.p.cu Vârste extreme cazul Ac anti-H ar putea fi sugestiv. infecţii produse de Salmonella 17 5 • scheme suplimentare pentru testarea. typhi în general nu produce gaz din glucoza. destui de frecvent. de Bacteriemia/fungemia reprezintă prezenţa tranzitorie şi de regulă interm itentă a bac- sânge. Pe de altă parte.:.. Micrococcus luteus. camerei. incubâm • teste privind sensibilitatea la bacteriofagi spe^jfici (lizotipie)!.Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapie© este recomandată pentru fiecare infecţioase şi atitudinii de urmat. Diagnosticul serologic se realizează respectând e volumul de sânge recoltat. Serodiagnostieul /Widal. Corynebac- formaldehidă. dorim să subliniem şi alte două dintre aspec­ Diagnosticul serologic _ : u : / tele importante de care trebuie să se ţină seama în realizarea unei hemoculturj: Unii autori consideră că nici unul dintre testele utilizabile în diagnosticul'serologic nu ®momentul recoltării sângelui este suficient de specific. lost prezentate anterior. tulpină de S. a . typhi pot să nu prezinte centrul de culoare neagră pe ADCL sau XLD. Bacteriemia/fungemia însoţesc infecţiile generalizate cu bacterii/fungi. 6 serii de tuburi. în cazul în care p. cu restul membrilor echipei complexe. . i Coloniile de S.p. typhi izolată. paratyphi B). însă cel mai frecvent sunt recoltate 3 probe de sânge. Diagnosticul bacteriologic. virusuri.S.p. b . minim 2 probe de. paratyphi B). hominix. . realizată tot prin tehnica aglutinării în tuburi. bacteriemia fiind continuă.’ refeistenţă la antibiotice şi'chimiote. Un titra de 1/250 în cazul Ac anti-0 şi respectiv 1/250O în 5. sensibil şi rapid. paraziţi). cu Ag cunoscute şi inactivate. Dintre agenţii contaminanţi întâlniţi mai frecvent substanţă acidă suu acetonă). caracterelor antigenice (serotipie) tifoidă sau paratifoidă utilizăm spre ex. o hemo- cultură pozitivă nu indică de fapt agentul etiologic al infecţiei ci o contaminare survenită pe . acută).H2S poate. După realizarea diluţiilor. medico-chirurgicaie invazive realizate la diferite niveluri anatomice (cateterisme etc).Pentru identificarea Ag O poate fi necesară o inapţivare prealabilă (termică. BO . iar tuburile pentru Ac anti-H timp de 2 ore ta 52°C urmat de 10 minute la tempe­ unor secvenţe specifice la nivel cromdzomial $tc). direct respectă etapele cunoscute ale acestui tip d& 'diag­ nostic. HEMOCULTURA Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile' cunoscute (vezi capitolul 6).' "• Slt *■■II ratura camerei şi citim reacţia.în p. . Dintre situaţiile care pot materii fecale. Prezenţa Ag Vi poate crea probleme în ceea ce priveşte. mandată reacţia de aglutinare în tuburi pentru identificarea prezenţei şi litrului Ac anti-Vi. streptococii non-hemolitici etc. H (d . f ticul serologic nu poate fi utilizat (rezultatele nu sunt interpretabile) şi este strict necesară Diagnosticul de laborator microbiologic în febrele enterale este bacteriologic şi/sau izolarea în culturi a S.::. Antibiograma esie recomandaiă de regulă numai în cazul pacienţiior. în endocardita bacteriană sub- zabilă actual este analiza serică cantitativă. de multe ori se dovedeşte superioară din punc­ aceticux. pe parcursul a 24 de ore.S.Sunt în studiu metode de identificare a prezenţei S. materii al dinţilor folosind o periuţă neadecvată (prea dură) precum şi multe acte medicale sau fecale) prin latexaglutinareşi PCR •••* .S. . ribotipia.Deşi lizotipia este'o metodă laborioasă.! . direct. typhi. folosind o parcursul diagnosticului microbiologic. Există o mare . laborator în. Se consideră că un titra > 1/40 poate fi considerat sugestiv. Propionebacterium acnes. . pen­ • teste suplimentare biochimice (biotipie) '• » ' tru a evidenţia Ac anti-0 (TO .18-20 ore la 52°C urmat de 10 minute la temperatura • teste de biologie moleculară (determinarea piofilului plăsmidic. lichid biliar. anaerobe. câte o serie pentru fiecare Ag cunoscut folosit.: - tuburile pentru Ac anti-0 timp de . . ."reprezentat în prima săptămână. ■. pentru stabilirea în mod corespunzător a etioiogiei . Reacţia W idal a fost imaginată înfinalul Cu privire la primul aspect este de reţinut că întotdeauna se recomandă recoltarea a secolului al IX-lea şi standardizată la mijlocul secolului XX. sunt suficiente 2 hemoculturi/24 ore. urină.fi produs în cantităţi mici varietate de microorganisme capabile să producă infecţii generalizate (bacterii aerobe şi şi tardiv. în special recoltarea cât mai rapid după debutul bolii şi înainte Arborele circulator este în mod normal steril. teriuin spp„ Brevihactenum epidermidis. Produsul patologic este . S. paratyphi A. typhi.

Matei Balş.ii' ■ i'jV. în ordine descrescândă a frecvenţei putem aminti. prin simpla înclinarea a flaconului şi „scăldarea" pantei cu mediul de diminuată (aceasta se realizează pe de o parte prin diluarea 1/10 a sângelui Cultivat în cultură solid). îmbogăţite (ex. Este recomandat ca recoltarea să fie urmată de însămânţarea direct pe ganisme în torentul circulator.j în cazul în care am utilizat mediul bifazic etc). Haemophilus influenzae (tip b). funcţie de vârsta pacienţilor. Cryptococcus neoformans. Din punct de vedere microscopic... Dr. stafilococi coagulazo-negativi. de colecţie). recomandare nu poate fi urinată am putea folosi un tub care conţine 1 ml dintr-o soluţie în ceea ce priveşte al doilea aspect. Mediile de cultură stint medii lichide. manipu­ o există anumite particularităţi în ceea ce priveşte etiologia infecţiilor generalizate în. „la patul bolnavului". 0. având în vedere faptul că de regulă în cursul bac. Brucella spp. i .. pe patcursul a 1-2 ore. streptococi hemolitici (inclusiv pneumo. Fusobacterium spp.. -Prin utilizarea mediului bifazic subcultivarea se realizează uşor şi fără » în sânge există o serie de factori antimicrobieni a căror acţiune trebuie pe cât posibil riscul contaminării. în SUA a fost utiliza­ pentru toate cazurile menţionate.nespecifice) a gazdei respective tea nu apar („treceri oarbe") vom realiza subcultivări pe medii de cultură solide (de ex. I p. Staphylococcus aureus.diferite. ®cel mai adesea hemoculturile trebuie realizate „în urgenţă". raport cu volumul mediului de cultură dar există şi o serie de substanţe chimice care După obţinerea culturii pure trecem la identificarea agentului etiologic şi stabilirea sensi­ pot fi utilizate în acelaşi scop. în cazul în care recoltarea afiost realizată simultan în două flacoane pentru hemocultură.. Clostri­ semnifice dezvoltarea microbiană (tulburarea mediului mai mult sau mai puţin uniformă. Atunci1când este necesară realizarea unei hemoculturi (de fapt a unui .recoltăm 3 hemoculturi din sedii . vom izola cel mai adesea un unul va fi incubatîn aerobioză iar celălalt în anaerobioză. X . • sepsis . dium perfringenş etc). Utilizarea sistemelor. pe parcursul a 10 minute (ideăl ar fi. poarta de intrare posibilă. un inter­ să fie urmată imediat de însămânţate..şâ recoltăm sângele cu circa 30. fiind un produs biologic în mod normai steril.p. Dacă această val de timp de 45-60 minute etc.50% de polianetol sulfonat de sodiu în care realizăm recoltarea sângelui şi pe care îl teriemiilor/fungemiilor numărul de unităţi formatoare'de colonii/ml de sânge este destul de transmitem imediat către laborator pentru însămânţarea pe medii de cultură. /' putem utiliza ca inocul bulionul de hemocultură. Subliniem însă importanţa respectării cu stricteţe a regulilor de prelevare aseptică şi • endocardită acută . 15 minute. ceea ce în astfel de situaţii ar necesita un sus) la un interval mai mare de. • endocardită subacută . incubare este cel mai frecvent 35-37°C. Pentru bacteriile cu multi­ mai mare la aceste grupe de vârstă). recoltarea ar trebui • febră de origine necunoscută .recoltăm minim 2 hemoculturi din 2 sedii diferite (vezi şi mâi Oricât de urgent ar fi considerat că trebuie începută terapia se poate „temporiza" până se realizează recoltarea sângelui pentru hemocultură. fără a mai exista o etapă de transport. apariţia unei pelicule la suprafaţa mediului lichid. Pseudomonas aeruginosa. polianetol sulfonatul de sodiu are atât efect anti­ bilităţii la antibiotice şi chimioterapice a acestuia. plicare lentă este recomandată utilizarea mediului bifazic (mediu solidificat în pantă.cu vacuum este relativ recentă în ţara noastră. antibiograma difuzimetrică standardizată pornind de la coloniile izolate (cultura pură). '.:set“ de hemocul­ geloză-chocolat plus mediul lichid bulion tripticază din soia).lot cât şi minim 3 probe pentru hemocultura.) este necesară incubarea în atmosferă de 5-10% CO 2. zilnic pentru minim 7 zile (în anumite situaţii flacoanele pot fi incubate timp de mai multe cocul). i: i” / ■!. Examinarea o facem macroscopic urmărind o serie de aspecte care ar putea să anaerobi (Bacteroides fragilis. Histoplqsma( din zona declivă a flaconului.. vom recolta circa 20 ml de sânge în cazul adulţilor şi 1-5 ml de sânge în cazul nou- tru aerobi şi respectiv bulion Columbia cu cisteină pentru anaerobi) condiţionate în flacoane născuţilor. în ceea ce priveşte momentul recoltării sângelui şi numărul de hemoculturi reco­ Pentru recoltarea sângelui trebuie respectate condiţiile impuse recoltării oricărui tip de mandate: I-. Listeria monocytogenes. diferite Examinarea flacoanelor de hemocultură se realizează de 2 ori/zi în primele 3 zile. sugarilor şi copiilor mici (deoarece numărul de UFC/ml poate fi de circa.de. spre ex.:. etc. tă încă înainte de 1974.’ Brucella spp. Candida spp. spre exemplu într-un sistem închis de recoltarea şi însămânţare aşa cum a fost realizat de Prof.voltarea agenţilor etiologici probabili. germeni săptămâni). redus. Pentru unele microorganisme (ex.ori corespunzătoare cantităţii de sânge pe care trebuie să o recoltăm. • sângele. de ex. din sedii diferite. în cazul apariţiei unor modificări precum cele descrise mai sus dar şi atunci când aces­ starea din punctul de vedere ăl apărării (specifice şl . enterococi. !• . rnediulde cultură. interval de timp de numai 10-15 minute. Aspergillus spp. în cele ce urmează o să listăm câteva din exemplele controlul eficienţei acestora (prin inocularea mediilor cu tulpini de referinţă. la. dar este dificil de precizat).recoltăm 3 hemoculturi din 3 sedii'diferite. lând aseptic flacoanele de hemocultură putem realiza frotiuri pe care le colorăm Gram.3. . acest moment ar coincide cu cea mai nune concentraţie. apariţia unor bule de gaz.microor. apariţia unui depozit pe stratul de hematii Leptospira spp. .. dar rezultatele obţinute vor fi confirmate prin • mediile de cultură şi..recoltăm 2-3 hemoculturi. bulion infuzie de cord-creier pen­ Astfel. Temperatura de • dintre agenţii etiologici cu semnificaţie clinică izolaţi mai frecvent prin hemocultură.. Neisseria meningitidis. apoi enterobacterii. Altfel spus. focarul infecţios principal. • | geloză chocolat)-. apariţia unor colonii pe mediul solid capsulation. în finalul prezentării vom dis­ turi) este necesar să ne gândim şi lâ următoarele aspecte:' '! cuta şi despre sistemele automate pentru hemocultură. etc. ( Diagnosticul de laborator în infeefii produse de Salmonella 176 Diagnosticul de laborator Tn microbiologie ■• asigurarea calităţii mediilor de cultură va include atât controlul sterilităţii fiecărui. .minute înainte. trebuie să recoltăm un volum de sânge adecvat (pentru fiecare hemocultură în parte). de. respectiv a recoltării sângelui înainte de administrarea oricărui tratament antimicrobian.25-0. singur agent infecţios (dar existaşi posibilitatea Onor asocieri). în vederea testării sensibilităţii la antibiotice coagulant cât şi de neutralizare a unor factori antimicrobieni).j. posibile. Peptostreptococcus spp. . „vârful febril”. condiţiile de incubare trebuie ales în aşa fel încât să permită dez.

care per­ infecţii a!e tractului respirator superior.şi culturale observaţe tru de metilen. semnal luminos sau sonor. Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic. ce detectează producerea de CO 2. . • . infecţii urinare etc. anaerobioză. j dimensiuni relativ mari.de flacoane. un senzor LES (senzor emulsie lichidă). 3 A * ÎN INFECŢIILE PRODUSE MICROORGANISME DIN GENUL KLEBSIELLA Spre exemplu. Glucoza este degradată cu producere de gaz. sistemul BaeT/Alert reprezintă un instrument automat pentru detectarea multiplicării microbiene.K. 14). ' Cu toate că nu este cea mai reprezentativă entitate clinică. diagnosticul bacteriologic fiind util în stabilirea adulţi sau copii. Flacoanele şi instrumentul sgnt produse în pneumonii (grave. direct.* . rezultând o medie de 144 citiri/zi. de culoare roşu închis. în continuare vom discuta cazul în care p.dp reflectometrie) aerob .un modul de control care include un ebrari ce permite operatorului să intervină (prin atin­ ' Microorganismele din genul Klebsiella sunt enterobacterii imobile. de infecţii generalizate. cititor de cod de bare (codul . să poată fi luate cele mai adecvate măsuri. . prin reflectometrie cu alîşaj pe monitor. punctul 12. ză cu producere de acizi şi uneori de gaz. urină. "y l' " . cât identificării speciei microbiene şi stabilirii sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice. vezi şi capitolul 23. înainte ca pacientul să fi primit antibiotice. Flacoanele Considerat iniţial ea agent etiologic al pneumoniilor. mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate. FDA şi Quality poate fi implicat într-o mare varietate de boli precum toxiinfecţii alimentare de tip infecţios.care sunt introduse flacoanele (nefiiiîd necesară intervenţia operatorului). Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător. macrofage alveolare). pentru elemente clinice. Citirea se efectuează automat la fiecare . rhinoscleromatis şi K. medicii microbiologi să stabilească etiologiţţ microbiană (uneori polimicrobiană) |i unei. panicii nice şi de laborator. în cazul unui rezultat pozitiv. respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc). ozaenae.posibilitatea realizării autovnate a controlului de calitate al „celulelpr în. vom discuta în continuare diagnosticul pneumoniei produse de Klebsiella pneumoniae. în special la pacienţi cu un sistem de apărare deficitar) sunt produse de Klebsiella pneumoniae. K. ' 4. nesporulate. prezenţa celulelor inflam atorii (ex. 1. . System Regulations). Diagnosticul complet include Există mai multe tipuri . . Fiecare flacon conţine Klebsiella pneumoniae este izolată în infecţii nosocomiale (de spital). s-a dovedit că numai 1-3 % din introduse în instrument sunt recunoscute de acesta cu ajutorul unui. microscopice. BACŢEC. pentru pacienţi la care nu s-au administrat medicamente andmicrobiene etiologiei şi tratamentului antibiotic corespunzător. capsulaţi (capsula poate avea dimensiuni de 2-3 ori mai mari decât diametrul bacteriei). . . .se poate evidenţia multiplicarea microbiană) pentru. .178 Diagnosticul de laborator în microbiologie 9 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR în momentul de faţă există numeroase sisteme autom ate utilizate pentru hemocultură (BacT/Alert. se poate realiza o identificare rapidă inclusiv direct. pentru incubare în aerobioză.în care sunţ impli­ un aspect mucoid. Flacoanele de cultură conţin mediu de cultură lichid (bulion}. rezultatele antibiogramei nestandardizate etc. în infecţiile produse de Klebsiella pneumoniae se pot recolta Interpretarea rezultatelor hemoculturii materii fecale. incluzând urmă­ toarele etape. prin reacţia după o săptămână de observaţie nu.un modul de incubare ce poate prelucra 120 până la 240 flacoane însămânţate. încapsulaţi (înconjuraţi de o capsulă voluminoasă). Vital etc). aspectul microscopic pe frotiul colorat tificare prezumtivă a microorganismului implicat (vezi şi capitolul 52).10 minute. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie flaconul respectiv este analizat prin metode ale microbiologici clasice sau moderne în vederea de reguli (cât mai aproape de debutul bolii.se află. . .. Instrumentul prezintă: ■ . necrotice şi hemoragice.ca de um flare a capsulei (vezi capitolul 12. leucocite) şi prezenţa bacililor gram negativi.p. în favoarea vindecării pacientului respectiv. . laboratorul are datoria să comunicş microscopică trebuie să demonstreze calitatea produsului patologic şi să realizeze o iden­ rezultatele pe măsură ce acestea sunt obţinute (de ex. izolarea aceluiaşi microorganism din mai multe albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. condiţionat patogen» conformitate cu standardele internaţionale de calitate în vigoare (ISO 9001. pe partea laterală a flaconului). în coloraţia cu albas­ Gram după tulburarea bulionului de cultura. Din punct de vedere macroscopic. Klebsiella pneumoniae este. Frotiurile se examinează la microscopul optic flacoane de hemocultură) şi clinice care permit medicilor infecţipnişti în colaborare cu cu imersie şi se notează prezenţa celulelor de la nivel alveolar (ex.ţi anaerob prelevate de la pacienţi suspecţi de bacteriemie/fungemie. care se vor colora cu Există argumente bacteriologice (de ex. rizate prinţr-o intensă activitate metabolică asupra hidraţilor de carbon pe care îi hidrolizea- . pe produsul patologic. 2. . iar pe de alta prezentat de spută (vezi şi capitolul 6). este re­ Având în vedere pe de o parte posibilitatea contaminării unei hemoculturi. Din ce în ce mai frecvent mit multiplicarea majorităţii speciilor bacteriene precum şi a furişilor. Intervalul optim de funcţionare al instrumentului este jjiţuat între +5° şi 45°Q.. K. . „în jeleu de coacăze11. să agite şi şă monitorizeze continuu (pe bază. sânge. Septi-Chek.. . sputa poate avea parte creşterea incidenţei hemoculturilor pozitive cu semnificaţie clinică. specia principală a genului şi include bacili gram nega­ tivi. . anterior recoltării (varianta strict recomandată) sau chiar şt pentru pacienţi aflaţi sub trata­ ment antibiotic. cate microorganisme condiţionat patogene care fac parte din flora microbiană normala. caracte­ gerea cu degetul) în alegerea opţiunilor de încărcare şi descărcare a flacoanelor introduse. .. rezultatele trebuie interpretate cu responsabilitate şi în echipă. Examinarea Fiind vorba de infecţii cu pronostic adesea rezervat. . sau-faptul că lari. Există mai multe specii de exemplu Klebsiella pneumoniae. . aspecte. capsula apare ca un halou în jurul klebsielelor. . Isolator. capabil să incubeze. oxytoca. Utilizând anticorpi anti-eapsu- după dezvoltarea ijnor colonii. Microorganismul. . ea indicatoi al multiplicării microbiene. puroi etc.

nu produce H2S.\.. în infecţiile produse de Proteus spp. Determinarea CMI şi CMB poate fi necesară (vezi capitolul 14). pe de reguli (cât mai aproape de debutul bolii. dispuşi în lanţuri scurte. mari. medii de cul­ • Caractere de patogenitate: Se poate utiliza inocularea la şoarecele-alb (vezi capitolul 11).j. . alimente. ‘ ' v’ ’ ' observa bacili. .80 proaspăt între lamă şi lamelă.. Sunt necapsulaţi şi ne­ • Gruparea în funcţie de rezistenţa la antibiotice şi chimioterapjce . care se va identifica (vezi şi capitolele ’ @ ÎN INFECŢIILE PRODUSE MICROORGANISME 9 şi 10).p. bo mbate. care dau aspectul de „curgere" pe suprafaţa mediului de cultură. necapsulaţi. • Caractere biochimice: ■/ ' (. / •Klebsiella pneumoniae'este glucozo pozitivă (cu producere de gaz). Există peste. v'.(stabilirea spectntlui iplaşr imersie sugerează piuria. caracter evidenţiat prin reacţia Voges-Proşkauer. Vom discuta în continuare diagnosticul de laborator ai ITU. p. Din folosind cifratul ca unică sursă de carbon. în mediul de De regulă microorganismele din genul Proteus sunt implicate patogenic în afecţiuni ce cultură pot pierde capsula. iar dacă această recomandare nu poate fi îndeplinită.. direct. i l . care se dezvoltă tinuare vom discuta cazul în care p. 1. produc ure­ ază. f rur / ' ' mite observarea unor elemente care orientează diagnosticul. în maxim 30 minute.. MIU). studiază după repicarea unor colorai. Se preferă utilizarea unor medii'de cultură slab selective (ex. Examinarea microscopică a urinei ar putea conduce la economii importante (de timp. Există 2 specii princi­ caractere: -■ " ' pale. aerobi facultativ anaerobi.. Se poate. este reprezentat de urină (vezi şi capitolul 29). sunt.-ţ /■ -m Genul Proteus este format din germeni pleomorfi (de unde şi numele genului). gram negativi. lichid de vărsătură. şi Proteus vulgaris. . mari (2-3 mrii la. în caredin urina omogenizată prelevăm cu ansa calibrată de 0. prin tehnici de aglutinare. care daţi alte localizări în cursul unei bacteriemii la pacienţi cu status imun deficitar săli în spital/ aspectul de „curgere" pe suprafaţa mediului debultură. capsula fiind voluminoasă.p.implicate în virulenţă eţc).. . Transportul urinei trebuie • Produce acetoină.'Mni-' f. cât medii multi test (TSI. tură). coaglutinare sau latex aglutinare. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie • Alte caractere biochimice şi de mobilitate se. este ieftin şi per­ laboratoare de referinţă. sânge etc.01 ml urină iar în frotiul rezul­ tat identificăm cel puţin 1-2 bacterii/cânip (în microscopia optică cu imersie) acest rezultat 5..' V. se pot practica în microscopic al urinei este foarte important pentru că este uşor de realizat. produc fenil-alanin-dezaminază. ' apar în afara tractului digestiv (fac parte din flora microbiană intestinală).. imobilă..>¥\y: ■ tnrJ-. din etapa de izolare pe mediul MacConkey. . Prezenţa a cel puţin 1 leucocit/câmp microscopic la examinarea cu obiectivul de • Caractere testate prin metode ale biologiei moleculare. vezi şi capitolul 29. în mod frecvent se discută despre • Caractere de Cultură: Produc colonii lactozo pozitive. . respectând toate normele de de tip API. MacConkey). Pe mediile solide Klebsiella pneumoniae formează colonii lactozo poziti­ ve. Proteus spp. DIN GENUL PRO TEUS la 35-37C.24 de infecţiile tractului urinar (ITU). se pot recolta urină. de tip M bombate. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea unui preparat siella. Se poate realiza şi un frotiu colorat • Testarea sensibilităţii la bac’teriofagf (unele dintre scheme au'fost stabilifeîn! Insti­ Gram din urina omogenizată. materii fecale. lactozo pozi. (( ''„ a' Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic. Identificarea microorganismului-implicat patogenic se va. în „picătură de miere". în con­ ’ tivă.reacţii. reactivi şi materiale.realiza. punct de vedere macroscopic. realizat rapid. urează pozitivă. • Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de Kleb­ 2. asepsie şi antisepsie etc). peste 4 nun la 48 ore).. Există totuşi şi toxiinfecţii alimentare de tip infecţios cu Proteus spp. Antibiograma (verificarea sensibilităţii ia antibiotice şi chimîoterapice în vederea sta­ sugerează prezenţa a IO5 bacterii (unităţi formatoare de colonii)/ml şi respectiv. Klebsiella pneumoniae se poate dezvolta pe medii de cultură obişnuite în 18-24 ore. cu tendinţă de confluare. 'cu dimensiuni ’mări/*lcapsuldţi. cocobacili. înainte ca pacientului să fi primit antibiotice. puroi. diferite exsudate purulente. tului urinar. Proteus mirabilis. care într-un context clinic sugestiv ajută la definirea ITU. urina ar putea fi tulbure. nesporulaţi. indql negativă. ceea ce se poate evidenţia încă toarele etape. foarte 4. pe mediul Simmons sau în sisteme multi test comerciale mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate. în „picătură de miere". vâscoase. din sedimentul rezultat după centrifugarea urinei... -Aceste.realiza pe‘baza mai-multor mobili. prezintă un mare număr de cili peritrichi care con­ • Alte caractere/teste utilizate în identificare Care se' pot utiliza (în centre de referinţă): feră mobilitatea caracteristică (există şi tulpini aciliate).şi inocularea la animale de laborator sensibile (şoarecele alb). în cazul midie cu identificarea plaşmidelor. vezi îşi c a p i t o l u l . • Caractere antigenice: trebuie transportat „la rece" (+ 4°C). • Caractere morfotirictoriale: Sunt bacili' grăm-iiegatiVi. Germenii au un accentuat polimorfism pe frotiu putându-se tutul Cantacuzino) . perechi 's‘au izolaţi. incluzând urmă­ • Klebsiella este un microorganism lactozo pozitiv. \ sporulaţi. Klebsiella pneumoniae nu se dezvoltă pe medii înalt selective şi este parţial inhibată pe cele moderat selective. cu ore. cu tendinţă la confinatei 1*\ ' infecţii nosocomiale).1 80 ( \ Diagnosticul de laborator în microbiologie 3. de tip:M. cremoase. forme filamentoase de până la 30 pm. care nu fermentează lactoza. dar sunt posibile şi alte infecţii (tegumentare. infecţia trac­ bilirii tratamentului) este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzitnetriee. cremoase. Examenul de tipuri de antigen K ia Klebsiella pneumoniae. genitale. . . Cultivarea pe medii de cultură a' produsului patologic seîreălizează îniaşa fel încât să se DIAGNOSTICUL DE LABORATOR poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură. purulentă.

ioy . MIU). să se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cidţură pură.'t.. „«•»?•..'ipe mediiJiselectivovdifefdnţiale fexiiMaciConkey sau.care.. r! ... . juciim-n.. .m :.' -jf.' -. • . Este * Caractere antigenicc: necesară realizarea uroculturii cantitative şi demonstrarea prezenţei a peste 105 bacterii/ml de urină.'ipp. ' t p a . necapsuiâţt şV'tiesponilâţi.itwlni u oi>ih. pe agar-sânge.. este glucozo pozitiv (uneori cu producere de gaz).la bacteriofagi .. dacă pe o placă cu mediu solidtoultivăm 2 tulpini diferitei în 2 puncte opuse.spp.uvi «nrfi «iu ' j ■}ni * Alte caractere1biochihiice şi de mobilitate-se studiază..invazisj.dacă tulpinile nu sunt diferite. m.xy.i>.FenomenuPlipoateifi.^ ■ .cu. -ji.'-!. preliminară pentru Proteuş spp.) la'dbţirief^âîn^.2 tulpini (distanţă deil -2 milimetri). Acest aspect sugerează tulpinilor de Proteus. pe toata suprafaţa mediului .dez­ volta invadând până la un punct în apropierea liiiiei de întâlnire. . include. nubocf Avi.ţjosulfat de sodiu etc). Determinarea CMI ’şi CMB poate fi necesară (vezi capitolul 14). ( • Pe anumite.. .alttjoM. .o.& re-a'uneî'cdri^H ^ur^dd Proteus. -„i '1. p. u. epidemio­ logies* în cazul înicare tulpinile. tulpină ..UIu iimnij tfl'flioj. iy.i. Suportă mari variaţii de temperatură şi de pH.-....»»:»».?. identificare. j __ j . .-.„demarcaţie".!J « Caractere biochimice: . • ..p. 4... ■ .Iacţpzp.pe.j 5. lactozo negativ.• Caracter? deţ^ulfui-ă:..•. dezvoltarea unei „pânze de cultură" continuen:-.îri' valuri suprapuse" până Iâ'partea superioară ărne- diului de cultură’’" '• . Pe mediile simple uzuale.i .ţ .de tip S .i îo-.'it vl.A'. săruri.sensibilităţii.. iwr. c'âre'se dezvoltă Y.oV.DCt. * < .test-(TSI. • Proteps.'. Ci q «• .repiezintă-<un.de cultură acizi sau. reprezintă un caracter util în studii.- Proteus spp..ua ■wjţi'rj'i lur-'i^ -nil» ck»i -itru—< < ..-care şe(. j. i ' .aşe. .n.. ..negaţjyi.. .-mediul Simmorts sau în-Sisteme multi testicomerciale. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea sta­ ’■ ' • 'Caractere inoffdtinctqriâie': Sunt bâcili ‘Iram -'n^⪠vi/cu ’un’ ăccentââţ'ppiimodtsm bilirii tratamentului) este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice.’nu se pot obţine colonii • Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi (anti-0 şi anti-H) pentru identificarea izolate. I 182 Diagnosticul de laborator în microbiologie Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Proteus \33 B o m ’Q s j y :3 a m r m m m . Fenomenul de „căţărare". 1...1 vi.» Testarea .r.vă bSâliia pe baia mâi multor • Gruparea în funcţie d e‘rezistenţa la antibioticeşi chimioterapice. ui'. ■'••up • Fenomenul „liniei de: demarcaţie". •:r . vîlr • Fenomenul de.după repicarea ■unoneolopii pe medii multi. . Itiiv. u ^ t i v i o ■.v»-avea loc „creşterea în valuri" fără.. caracter.r. ..şPe aceste • Alte caractere/teste utiljzaţe în identificare (jn centre de referinţă). prin tehnici de aglutinare (ia nivelul laboratoarelor de refe­ prezenţă Pmteys-bppjîn produsultpatftlogia'v'. .. (bacili.. selective^ invazia este inhjbată şi şe poţ obţine coloşii izolate i (adăugăm la piediul.foarte mobţl|ţjf|acă .. produce H2S...’ unui miros caracteristic de putrefacţie.. .'. o bactprie.. . lui..de.?t «" .'.«ij:oanmai!} r. de la jocul însământării cultura se „dezvoltă în valuri concentrice" (se întinde in aproape în :... .iiiniicf.)i.însămânţăm . da-tipSttvibmintilr. . Identificarea microorganismului implicat patogenii?'Se’. urează pozitiv. .. mobil. însămânţarea p..iunde se Va crek b „linte de demarcaţie" între cele.i. r ’jiţţ..ir ..va..■ .fC. medii.şi. se poate dezvolta folosind titratul ca unică sursă de carbon.(•■ ii.apţiţţine acestui gen la periferia unei plăci Petri cu mediu simplu (agarizat 2%). Cresc pe medii simgle inciâMv pe’îrt^dll pjrfonate libhide cu degajarea Proteus vulgaris este indol pozitiv şi ornitin decarboxilază negativ. ■Oi'.-n oicjifo'!. cocobacili.u liii patblpgicftrebuierealizată.implicate aparţin genului Proteus.în aşa fel încât • Proteus sppr produce Fenil-aianin-dezaminază. tulpinile *se vor. mediii/îrafeMs'A'p/jdpfbduce^colonii lactozo negative. reprezintă o variantă-de'izolare' în-bultură-pură-a udei 'tulpini de Proteus: cultivarea unui produs' pafologiC'în lichidtilVde COndens-al uritii tub cu geloză înclinată incubat în poziţie verticală va' cohduce'ţîn-cazul'în ’care în 1 ‘jj. aproaţje). bili.). ■: -I . : caractere. I îi. Cultlvarea?^ n i^ jŞ 4 e î5 iil^ ^ 9 'P t^ ffs. ivn.u< . ibnne filâmentoâse de până lâ 3(1 ptnj.nvicrporganjşiiie.it.. aces­ te colonii sunt lactozo negative. fiind cunoscut fenomenul de invazie (vezi şi capitolul 11).>. inhibat dacă^Se realizează rinţă). e'xistă o:tulpină de >PtbiHus./ 5 . 3. identifica (vezi şi • Proteus mirabilis este indol negativ şi ornitin decarboxilază pozitiv în timp ce capitolele 9 şi 10). pe AABTL etc..

eritemului BDA. oxidazţb-negativi. de ex.. Este recomandată testarea serurilor pereche. ating valoarea maximă după circa 14 zile şi persistă câteva luni. enterocolitica se pot utiliza diferite medii selective clasice (MacConkey. ultimele 2 specii sunt mobile la ■• sunt imobile la 37°C şi mobile la 22°C. . riu produc indol. irgasari.tm/1-2 pm. enterocolitica repre­ • se utilizează. Se consideră că valoarea litrului examinează la microscopul optic cu obiectivul 40x. inocularea p.5 mm (2-3 mm după 48 ore) Genul Yersinia include 1. produc urează 22-30°C. 4..• tolele 9 şi 10). Se poate folosi mediul de transport Cary-Blair.tehnici. Anticorpii apar la circa 4-7 zile de la 2. nu produc H2S pe medii simple şi produc colonii de tip S în 24-48 de ore. datorită 3. Nu formează spori. prin reacţii de aglutinare pe lamă zintă o cauză destul de frecventă a BDA. Este recomandată realizarea antibiogramei (verificarea sensibilităţii Ia antibiotice şi riologic. • Caractere antigenice: în continuare vom discuta despre yersiniozele cu poartă de intrare digestivă. / Trebuie să fie luată în considerare posibilitatea apariţia unor reacţii încrucişate. Poate determina infecţii cu caracter invaziv localizate pe ileonul ter­ sau în scop de cercetare.p. în tampon fosfat salin cu incubare la 4°C timp de 1-3 săptămâni urmată de treceri pe mediile menţionate mai sus.catalazo-pozitivi. care se va identifica (vezi şi capi­ Salmonella. fiind rezervată laboratoarelor de referinţă minal. Produsul patologic poate fi reprezentat de m aterii fecale.. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea unui preparat debutul bolii. cu „prinderea" ganglionilor mezenterici şi apariţia unor dureri în fosa iliacă dreaptă • Alte caractere/teste utilizate în identificareîa nivelul centrelor de referinţă: ceea ce . ulile cunoscute (vezi capitolul 6). novobiocină). nu fermentează iactoza. pentru bacili Gram negativi.j nodos sau în cazul altor manifestări extra-intestinale. Există diferite metode . enterocolitica produc infecţii umane. Vom evidenţia prezenţa celulelor semnificativ este . Sunt enterobacterii de dimensiuni mici. Sunt aerobi facultativ anaerobi. • bacteriocinotipiu nale. Se pot utiliza şi sisteme automate. în Caractere biochimice şi de mobilitate: produsul patologic prezintă un pleomorfism accentuat.. exemplu trusa automată ATB G -5. posibil pleomorfi • Caractere de cultură: ţ. • Pe mediul CIN coloniile sunt semitransparente. în cazul m anifestărilor extra-intestinale poate fi util diagnosticul sero­ chimioterapice). pot apărea enterite subacute. . electroforeza în câmp pulsatil. Preparatuljse tica diferite. Bolile produse de Y. mai ales la ® teste biochimice suplimentare copii. seruri specifice mli-Yersinia.poate conduce ia punerea eronată a diagnosticului de apendicită acută. pseudotuberculosis. eventual cu incubare la temperatura camerei (20-30°C). în continuare vom discuta diagnosticul unjbi Diagnosticul serologic este util în determinarea etiologiei artritelor reactive.5-3 j. ţ f .. cel puţin din datele prezentate în literatura de spe­ • Testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza în studii epidemiologice cialitate internaţională.1 specii dintre care Yersinia peştii (cauza ciumei).. direct.. Y pseudo- { .. pseudotuberculosis sau Y. ganglioni recoltaţi intraoperator. prin metoda difuzimetrică standardizată. de ex. pot prezenta struc­ «i • • se pot investiga folosind mediile multi-test clasice sau galeriile API . cu aspect de bacili sau cocobacili gram negativii care prezintă coloraţie bipolară. în dinamică. care pot avea drept agenţi etiologici V enterocolitica sau Y. ribotipia. Identificarea se va realiza pe baza mai multor caractere: « Caractere morfolinctoriale: Sunt cocobacili sau bacili gram-negativi cu dimensiuni de 0. pentru tipuri mai puţin frecvent întâlnite tive sau a eriternului nodos cu dificultăţi în ceea ce priveşte diagnosticul diferenţial. adenopatie mezenterică etc. al. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să existenţei unor antigene asemănătoare la microorganisme din genurile Brucella sau se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură. Y. Coloniile suspecte se repică pe mediile multitest clasice sau pe galerii API.. de 1-1.prac­ proaspăt între lamă şi lamelă (nu se efectuează frotiuri din materiile fecale). cu citire şi interpretare după 18-24 ore de incubare (21 1. sânge etc. reacţia de aglutinare în tuburi. de logic.. uneori în cadrul unei infecţii generalizate.> 1/160. La pacienţii cu variate grade de imunodepresie boala enterică poate fi urmată de manifestări extra-intesti. enterocolitica în declanşarea unor artrite reac­ • reacţii de aglutinare cu alte seruri imune. în special recoltarea cfit mai rapid după debutul bolii şi Diagnosticul serologic înainte de iniţierea antibioterapiei. pseudotuberculosis au o • tehnici ale biologiei moleculare (digestia endoiutcieazică a ADN-ului cromozomi- incidenţă mai redusă. Se pot.■ 34 Diagnosticul de laborator în infecfiile produse de Yersinia 185 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR 4 • ÎN INFECŢIILE PRODUSE IVIICROORGANISIVIE DIN GENUL YERSIN IA de îmbogăţire. Cresc • fermentează glucoza fără producere de gaz. ADCL) sau mediul CIN (cefsulodină. Diagnosticul de laborator în yersiniozele cu poartă de intrare digestivă este bacte­ 5. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând reg­ antibiotice). cu margini clare şi centrul roşu tuberculosis şi Y. . • Produc colonii de tip S. în (cazul adulţilor s-a dovedit implicarea Y. inflamatorii. turi de tip capsular. PCR etc). în vederea izolării Y.

. infecţii oculare etc). oxidazo pozitivi. ca al florilor de tei sau iaso­ specia cea mai impbrtantă a genului. care se va identifica (vezi şi capi­ tolele 9 şi 10). procesul poate progresa în • Produc colonii de tip S care se pigmentează în mod specific. Pseudomonas aeruginosa poate produce infecţii foarte • Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativi cu cu dimensiuni de 1-5 pm/ 0. Pot apărea colonii (de La persoanele spitalizate. sub „membrană" se poate evidenţia prezenţa pigmentului produs. m entarea mediului (albastru sau galben-verde fluorescent). . t . Pe mediile solide i î“tf H :. preparatul proaspăt. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu permiţând nu numai încadrarea în genul Pseudomonas.p. Pseudomonas aeruginosa tulbură reactivitate scăzută. perechi.-'r vi Pseudomonas aeruginosa formează colonii de tip S care se. sepsis) este foarte important... Coloniile pot prezenta o suprafaţă iridescentă. De men­ Genul Pseudomonas. precum şi în infecţii nosocomiale (infecţii „de spital")..5-1 pm. Pseudomonas diferite. precum şi datorită fac­ caractere: torilor de virulenţă pe care îi deţine. în medii lichide. leucocite. cu dezvoltare optimă la 30-37°C. Sunt bacili mediul însă în timp duce la apariţia unei „membrane" aderentă. dar potenţialul diseminării şi apariţiei unor com­ autoliză.. După 18-24 de ore.5-1 pm. aspect sugestiv (culoare albastră sau galben-verzui fluorescentă). puroi (vezi şi capitolul 6). infecţios poate fi gravă sau deosebit de gravă.implicată în infecţii la’ persoane cu mie. infecţios poate avea şi o evoluţie gravă.'relativ frecvent . cu luciu metalic şi plaje de aeruginosa poate produce infecţii localizate.• '£-•P. dând impresia prezenţei concomitente a unor bacterii rurgicale invazive (intubaţii. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va reaiiza pe baza mai multor Datorită capacităţii de adaptare şi supravieţuire în diferite medii. . cit pioverdina sau fluoresceină (galben-verzui fluorescent)...face parţe diţi familia|. 3. Pe agar-sânge produce hemoliză. Cultura poate avea un miros aromat.' otite. în culturi mai vechi pot tă. cocoide). 2. cu reactivitate diminuată şi supuse unor manevre medico-chi. mai multor flageli. care se vor colorai cu sisteme comerciale care verifică în acelaşi timp numeroase caractere biochimice albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram.( •••». evoluţia procesului ducerea de fluoresceină) şi King P (stimulează producerea de piocianină). . infecţiile! sunt de obicei localizate (foliculite. dispuşi în lanţuri scurte. şi include mai multe ţionat că pot apărea colonii (de tip S) cu aspecte diferite. izolaţi. însoţindu-se de pig­ profunzime (ecthyma gangrenosum). cu următoarele etape. Se preferă utilizarea unor medii de ? . 35 Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Pseudomonas 18 7 f d ia g n o s t ic u l de l a b o r a t o r 3 3 ® ÎN INFECŢIILE PRODUSE MICROORGANISME _________ DIN GENUL PSEUDOMONAS . la 5-42°C. nesporulaţi. Pseudomonas aeruginosa se poate dezvolta pe medii de cultură obişnuite în 18-24 ore. Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic. „bacilul puroiului albastru") reprezintă tente a unor bacterii diferite. • Caractere biochimice: 1.5-1 variate. Un fenotip particular al speciei Pseudomonas • Cultura poate avea un miros aromat. . cu • Caractere de cultură: apariţia de vezicule care se sparg. Uneori cultivarea se realizează pe agar-sânge. • Caractere de patogenitate: . bază necrotică. la suprafaţa aces­ tuia. procesul. prezenţa celulelor inflamatorii (ex. perechi.. dintre care mai importanţi sunt piocianina (albastru) şi de reguli (cât mai aproape de debutul bolii... mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate. piocite) şi prezenţa barililor gram- negativi cu cu dimensiuni de !-5 pm/ 0. între lamă şi lamelă. aeruginosa produce o infecţie pulmonară cronică la pacienţiiicu fibroză chistică (mucovisci-. Pseudomonas aeruginosa (baciluî piocianic. deoarece poate avea un • Se poate realiza testul de oxidare-fermentare a glucozei.V i cultură selective.i • -n-v ir i-i '•* a■ u "■■■''■ . Dintre entităţile clinice menţionate mai sus. cenuşie. mobili datorită prezenţei unuia sau. meningită. .Pseudonionodaceae. cu identificarea speciei în 4-48 de ore). cateterizări etc) precum şi la persoanele cu arsuri. osteomielită. King F (stimulează pro­ în lipsa tratamentului adecvat (dificil datorită rezistenţei la antibiotice). ‘M l v«‘îl -t / j 't u . Pentru stimularea sintezei plicaţii grave (bacteriemie. i 4. doză). Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o scrib • Produce diferiţi pigmenţi. este reprezentat ţie tează lactoza (atât coloana cât şi panta mediului TSI au culoare roşie).. în continuare vom discută‘cazul în care p. din punct de vedere al diagnosticului de laborator vom discuta infecţiile supurative ale tegumentelor şi mucoaselor. de la infecţii tegumentare superficiale până la stări de sepsis cu evoluţie fulminan­ pm. f. în momentul actual anumite laboratoare utilizează frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător. . dar şi identificarea precisă imersie şi se notează prezenţa celulelor de la nivel tegumentar (eventual modificate faţă de a speciei (de exemplu Rapid NTF. gram-negativi aerobi...1.(polari).. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două • Pentru studii mai aprofundate.. normal). . direct.'dif'i-pţ-' • Bacilul piocianic este oxidazo pozitiv (vezi capitolul 12).{»_>•-{• ! '!'. ... degajând o aromă pătrunzătoare particulară. dând impresia prezenţei concomi­ specii. şi se refac-pe o. • Pe mediile cu sânge produc hemoliză. Mobilitatea se poate examina pe La persoanele cu reactivitate normală. ca al florilor de tei sau iasomie. . pigmenţi lor se poate folosi repicarea pe medii speciale. izolaţi.ţ|i . relativ polimorfi. pigmentează în mod specific. înainte câ pacientului să fi primit antibiotice. La nivel dermic. apărea diferite forme (filamentoase.. Prezenţa piocianicului af'putea fi semnalată de culoarea albastră verz'uie a pansamentelor.. endocardită. tip S) cu aspecte diferite. dispuşi în lanţuri scurte.' cu dimensiuni de 1-5 pm/0. Puroiul trebuie examinat macroscopic.•însoţindu-se de pigm entarea mediului (albastru sau galben-verde fluorescent). • Multiplicarea la 42°C poate fi utilă pentru identificare. . Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură. respectând toate norţnele de • Este un germen catalazo pozitiv care degradează oxidativ glucoza şi nu fermen­ asepsie şi antisepsie etc).

în cazul unor infecţii grave antibiograma rapid posibil (urgenţă din punct de vedere epidemiologie) şi include etapele cunoscute. Pseudomonas aeruginosa (atunci când s-a dovedit că acest microorganism este agentul eti­ Diagnosticul de laborator în holeră este bacteriologic. necapsulaţi. cu miros fetid. ticarcilină. Diagnosticul unui caz grav de holeră este uşor de realizat. Vibrionii sunt barili gram-negativi. colaps circulator şi anurie.'fiind"rezervate''laboratoarelor de . .q . .endoiiucleaze. . u . . .1.. . : . analiza ADN după utilizarea. Doza infectantă este bilirii tratamentului) este obligatorie şi se realizează de. se.■. Esenţial este faptul că nu se evidenţiază prezenţa leucocitelor.ci rămân cantonaţi la nivelul tractului intestinal. Transportul trebuie să fie realizat rapid.determinări (vezi capitolul 14). se multiplică şi eliberează toxina holerică. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea unui preparat iii. Germenii nu ajung în toren­ Pseudomonas aeruginosa reprezintă unul dintre microorganismele care pot crea dificultăţi tul circulator. riziforme („apă de orez“) conţin mucus.. Bile Salts Agar/BSA) cât şi a unui mediu înalt selectiv (ex. riziforme („apă de orez“). respectiv prezum­ • . de IO8—IO10 microorganisme. După o perioadă de tre antibioticele uzuale! Cil toate'că anumiţi autori indică faptul că barilul piocianic âr fi sen­ incubaţie de 1-4 zile apar brusc greaţă. p..„ iii ric produce o enterotoxină şi determină holera. . 5.. Rata mortalităţii în lipsa tratamentului este 25-50%. anumite aminoglicozide.. drepţi sau uşor încuibaţi. v i i . : |. ar putea fi „tratat1* cu Ac specifici...zbtipiă) şi respectiv piocinopia Sepot utiliza în studii epidemiologi'ce sau în sdop de cercetare. . Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de materii fecale. ■ ' .-•!(. i stopată.1.. cazurile uşoare sau cazurile izolate sunt relativ dificil de dife­ renţiat de al te boli diareice acute. aerob • Teste de biologie molecţilaţă(sonde nucleotidice. .. . Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile cunoscute (vezi capitolul 6). Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură.1 examinează la microscopul optic cu obiectivul 40x. Scaunele apoase. . datorită rezistenţei la foarte multe din­ a celulelor epiteliale. în special în contextul unei epidemii..•ic. Abordarea diagnosticului de holeră se realizează în mod diferenţiat. oxidazo pozitiv. tîcârcilină-acid riâvillanicVpiperac'iîină.. Thiosulphate-Citrate-Bile salts-Sucrose/TCBS).j . dar s-ar putea recolta şi lichid de vărsătură.-... I• l" tiv (la nivelul unui laborator periferic) şi de certitudine (la nivelul laboratorului de referinţă). r> . difuzimetrică. . .. dacă mobilitatea este .. foarte mobili. ■' • Alte teste ce potifr studiate în scopul identificării germenilor. aztreonam. . J * utilizat atât în calitate de mediu de transport cât şi de mediu de îmbogăţire. Vibrionii sunt în număr mare şi prezintă mişcări active. . referinţă : :^ .. . P C R ) : . fliiorocHinolone său cefalosporine mare număr de vibrioni.. ■ :!!.i t <■' t • Testarea caracterelor antigenice "' ' : • Testarea . Este recomandata utilizarea atât a unui mediu moderat selectiv (ex. 188 Diagnostic de laborator în microbiologie DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN INFECŢIILE • Se pot studia în anumite situaţii (inoculăm 4 şoareci cu cantităţi fixe de germeni PRODUSE MICROORGANISME DIN GENUL V IBRIO cultivaţi pe geloză înclinată 2% şi urmărim supravieţuirea acestora timp de patru zile). diaree abundentă (20-30 litri/zi) şi crampe sibil la mezlocilină..trebuie să fie însoţită de alte. ■ .5) poate fi .... ■ "'(}■■' ' ■î”.în. Vibrionul hole­ . obicei prin metode difuzimetrice.-e u. Din punct de vedere macroscopic materiile fecale sunt apoase. celule epiteliale şi un bactam.. imipenem. rezistent la pH alcalin şi săruri biliare. care se va identifica (vezi şi capitolele 9 şi 10). Ui. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice1şi chimioterapice. .vederea sta­ în condiţii naturale vibrionul holeric este patogen numai pentru om. Specia principală este reprezentată de Vibrio cholerae (vibrionul holeric). Există o pierdere rapidă de fluide şi electroliţi care duce la de generaţia a HI-a. ■b!. ■ : /Iţ'T' if.de. direct..p. . -• 3. I-lolera nu este o boală invazivă.. ■ . în maxim 1-3 ore.. . piperacilină-tazo. abdominale. L ..*. Mediul apă peptonată alcalină (pH 9-9... colonizează mărginea în perie deosebit de mari în alegerea tratamentului etiologic.’ Suplimentar..de r e s t r i c ţ i e .. conţin flocoane de mucus. proaspăt între lamă şi lamelă (nu se efectuează frotiuri din produsul patologic). considerăm că principiul care trebuie reţinut este că în orice infecţie cu deshidratare..sensibilităţii la bacteriofagi (îi. Cu toate acestea. facultativ anaerob.confirmă diagnosticul. nesporulaţi. •. trebuie realizat cât mai ologic al! infecţiei) antibiograma este obligatorie. 2. :i •. vărsături.'• ■. de rostogolire sau mişcări haotice.’*■vy. Preparatul se . . Se poate folosi ca mediu de transport mediul bacteriostatic Cary-Blair.„. Genul Vibrio include mai multe sperii dintre care 12 sunt potenţial patogene pentru om. 1. în special recoltarea cât mai rapid după debutul bolii şi înainte de iniţierea antibioterapiei. de culoare verzuie.

. aerobi.. . între lamă şi lamelă: vibrioni foarte mobili. în vederea pozitive şi formează colonii cu'aspect asemănător (V. 1.îîj ! acute).>• • ■>•*. Aşa cum am mai menţionat. .a mai. de importanţă maximă fiind recoltarea şi transportul rapid al LCR nivelul centrului de referinţă se confirmă reacţia pozitivă şi Se identifică serotipu! către laborator.T. cholerae 0:139 este un mutant ■. . choierae. „ ■. influenzae diagnosticul este urgent (risc de evoluţie cu • Se utilizează ser ânti-holeric 0:1 şi se practică reacţia de aglutinare peTamăJLa sechele şi/sau deces). direct. recoltarea LCR prin ®tehnici de tip ELÎSA pentru identificarea unor structuri 'caracteristice V. înainte ca pacientului să fi primit antibiotice.u utilizând galeriile manualp.A laţi.biochimice.lşp efectuează la. pe o lamă de microscop. i şi biochimică a LCR este utilă în stabilirea-etiologiei. Boala debutează ca o rinofaringită acută. K cholerae produce colonii de tip S rotunde. mai rar de.. cholerae este oxidazo pozitiv (vezi capitolul 12) _7. . />>•. • Caractere de cultură: ' •• -ioi-m . Microorganismul pătrunde pe cale respiratorie. chiar dacă (Ogawa. rostogolire sau haotice) precum şi utilizarea unor anticorpi j.qv du. . prezenţi în sânge (de unde şi numele genului).! ■’*■ •*h i-.copiii mici preşcolari. Examenul microscopic al „vălului" (preparat proaspăt. Există de reguli (cât mai aproape de debutul bolii. imobili.: mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate. ' ochi) trebuie făcută pe cât posibil la patul bolnavului. /. cultivarea pe diferite medii de cultură. '. . respectând toate normele de • Alte caractere/teste. influenzae sunt capsulate. I. repartizarea unei can­ prin metoda difuzi metrică standardizată.care este vorba. în special în scopul supravegherii. laboratoarelor de referinţă. • Testarea sensibilităţii la bacteriofagi-(lizotipia) se poate utiliza în 1studii epidemîb. . cât sisteme de lizotipare care definesc peste 140 de. facem trecerea pe mediul selectiv (TCBS şi/sau BSA) luând 2 anse de Ia suprafaţa APA (în acest interval. Identificarea micrpprganismuiui ţmplicat patogenic se va realiza pe |baz.. dintre care cele mai cunoscute . în acest scop suspensionăm o colonie suspectă într-o picătură de soluţie 0i5% dezoxîcolat discutării examenului de laborator vom-avea în vedere meningita produsă de H. 7 .suspiciunea unei.8ptm Haemophilus ducreyi: multe dintre tulpinile de H. direct sau după transportul îri mediui Gary Blair.ICi J U 2 ţ f 3 0 i t r M U U ÎN IN F E C Ţ IIL E P R O D U S E M IC R O O R G A N IS M E Luând în:considerare situaţi? în care se ridică.■ j.el supe­ extensie locală (se poate nota faptul că Haemophilus influenzae tip b şi pneumococul se rior sau la nivelul centrului naţional de referinţă.trans- 1 parente câ picăturile tie 1rouă (spre deosebire de coloniile de Entioli care sunt mate)..-în infecţiile produse de Haemophilus influenzae se pot recolta • testul sensibilităţii la agentul vibriostatic'cu 0/129 (10 pg şi 50 jig) 11 . / reprezentat de LCR (vezi şi capitolul 6). sinuzită. Este de preferat realizarea unei cultivări „la patul bolnavului". cholerae puncţie (după verificarea presiunii din artera centrală a retinei prin examinarea fundului de • tehnici ale biologiei moleculare (ribOtipie. de sodiu. respectiv cultura de vibrioni).-.sie etc). Haemophilus influenzae este patogen prin multiplicare şi invazivitate. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimidterapice) se realizează pentru pregătirea frotiurilor.'B'q. facultativ anaerobi. gram negativi.5-0. Inaba sau Hikojima). . este (latex aglutinare pasivă inversată) . PCR etc). iar în cazul unei reacţii negative se realizează o pentru concentrarea germenilor ar putea fi: necesară centri frigarea LCR. v. « p f f ’-l secreţii:de Ia nivelul tractului respirator superior sau inferior.v7 < >7 laringotraheită.-.• . prin metpde clasice şa.p. .lizotipuri diferite. influenzae poate duce la o laringotraheită obstructivă • Testul „şuviţei" de ADN se poate utiliza pentru a diferenţia tulpini care sunt oxidazo- fulminantă care necesită traheotomie sau intubare. . caractere: < j . API 20E. • Caractere antigenice: . .:-«j ui .-. . pneumonie dar şi de celulita sau de meningită • alte teste. Sunt germeni pretenţioşi. la suprafaţa APA poate să apară un „văl“. mari* cu diametrul de 2-4 mm'(pe TCBS) Haemophilus influenzae 1 ’ « P e mediul :BSA.4. • V.>•• i v • o .sunt Haemophilus influenzae şi • Caractere morfotinctoriale: Sunt bâcili gram-negativi cu cu dimensiuni de 1-3 pm /0. Ocazional infecţia cu Ii. fiind rezervată. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie logice sau în scop de cercetare.vibrioni. Există mai multe specii. După incubare pentru o durată de 6-8 ore Ia 35-37°C. cholerae şi Aeromonas spp'. în continuare vom discuta cazul în care p.'V.promptă a copilului respectiv. '7• ■i' T-d'■’iC'Ptusii cu o infecţie virală la nivelul tractului respirator. ID 3. utilizate în identificare la nivelul centrelor de referinţă: --.de o colonie:de. se recomandăînsămânţarea p. LCR etc. . în cazul în care tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene. în apă pep.nivelul unui laborator de niv. cholerae prin reacţia' 'VET-RPIiA recoltate prin puncţie. lichide « determinarea toxinogenezei tulpinilor de V. incluzând etapele care vor fi prezentate în continuare. “ . Analiza citologică reacţie de aglutinare pe lamă folosind ser anti-holeric-Oi 139 . Dacă microorganismul pătrunde în torentul sanguin. .•<■>■■/■■ asepsie şi-antisep. strălucitoare. ' . multor au nevoie de prezenţa factorilor de]creştere.). ( ( 190 Diagnosticul de laboruior în microbioiogie D IA G N O S T IC U L D E L A B O R A T O R i Bi f i i i A flO & iU . otită.pot diferenţia numără printre agenţii etiologici foarte-comuni ai-otitei medii bacteriene şi ai sinuzitelor biotipul clasic de biotipul Ef Tor (se apreciază dă V.. Aceasta poate fi urmată de epiglotită.7 . secreţii din sfera ORL.i. sau. . infecţii.2E). cu mişcări de. sânge. .. pentru a se dezvolta . probabil în asociere • Caractere biochimice:'. în m eningita produsă de H. Microorganismele-din genul Haemophilus sunt cocobacili polimorfi. având la dispoziţie tot ce este necesar 5. pe această cale poate infecta al biotipulm El Tor) meningele. Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu Haemophilus influenzae este aceştia sunt lizaţi şi eliberează ADN-ul care poate fi „tras" cu -ansa ca o şuviţă bacteriologic. u i x m ţ a i- • Produc colonii de tip S. testele biochimice.-. cu V. Sinusurile sau urechea medie pot fi afectate prin mate (ex. galbene. o v . D IN G E N U L HAEM OPHILUS tonată alcalină (APA). nesporu- specifici (reacţie antigen-anticorp) pot grăbi diagnosticul) ^ / î. influenzae.p.auto­ acută purulentă la. în cazul în. apariţiei 'unor tităţi de LCR pentru examenul citolpgic şi biochimic (vezi şi capitolul 6 ).

lanţuri scurte.gai:e) prin contraimunoelectroforeză. Necesită prezenţa îh mediul de cultură a factorilor de creştere (X şi V). şancrul moale. ■'i.negativi. Factorul V. în culturile vechi. şi o durată de minim 24-48 de ore.Tulpinile capsulate (Ag K) se pot identifica îh p. influenzae ar putea fi dp. ■ '■ ’ ■■■.eliberarea conţinutu­ bilirii tratamentului) este necesară şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. astfel că pe geloză sânge coloniile' de 1. influenzae ar putea fi utilă pentru verifi­ 4. în regiunea genitală apare şancrul moaie prin pleoffiorfism şi pierderea capsulei (dificultăţi de diagnostic. la 35-37°C. infecţia cu virusul Herpes simplex şi limfogranulomatoza veneriană. (LCR sau urină după centrifu- se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură. urmată de apariţia unei pustule şi logic).p. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Haemophilus 193 p. însă este. Dacă-.încât şă -> . Haemophilus ducreyi este strict patogen pentru specia umană fiind agentul patogen al predomină formele eocobacilare. Frbtiurile se exa­ * ' a putut fi împărţită în biotipuri.'recdîorarea mophilus influenzae. situaţi intră său extra- . :/ ••%. j.. foarte pretenţios'care nu se poate dezvolta pe medii de cultură obişnuite.p. în medii complexe.X) şi factorul V care poate fi înlocuit prin NAD. H a e m o p h i l u s influenzae este un microorganism.factori de • Alţă.’L CR este franc purulent’frbtitifile’sd pot • Fermentează inconstant diferiţi carbohidraţii. CMÎ şi GMB poate fi necesară şi se realizează prin metode clasice sau cu ajutorul testului Coloniile sunt de tip S sau M şi ating. fini. leucocite) şi prezenţa cocobacililor gram. mici (1-1.. în caz contrar fesilizăm iniţial centrifugarea LCR. caracteristice. care în primele 24 ore prezintă irizaţii puternice. de tip S. în acest scop au fost utilizate RIA şi ELISA. picături de rouă. respectând toate normele de .. rotunde. şi truse automate pentru testare (ex.:!. caracteristice. Factorul V este sintetizat şi de stafilococul auriu. Datorită faptului că aceste microorganisme se colorează relativ slab în coloraţia • Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de Hae­ Gram ar putea fi necesară colorarea frotiului de rezervă printr-6 alt'â' mfeiodă i’au. urmează a fi transportat către laborator. Pe baza unor teste biochimice specia executa direct din p. direct).diferenţial microbio­ (iniţial se formează o papulă sensibilă. capsulaţi.5-0. con­ izolat şi prin hemocultură. Din punct de vexe. respectiv Haemophilus test medium (HTM). Tipurile (a-f) se prelungită cu fucsină.un diametru de 0. respectiv 1-2 mm la 48 de ore. albăstrii de rhetilen (AM) şi respectiv’ Gram. . aşa fel. rotunde. prin tehnici imunologice. iatex aglutinare sau ELISA. grămezi „aranjate în âce'elişi direcţie".. Determinarea fost însămânţată o tulpină hemolitică de Staphylococcus aureus (fenomenul de satelitism). Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător'. Antjbiograina (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea sta­ alte coenzime. sau prin digestie peptică). • Utilizând galeria API NH (manuală) putem identifica specii de Neisseria. minează la microscopul optic cu imersie şi se: notează prezenţă Celulelor inflam atorii (ex. dispuşi Haemophilus ducreyi separat sau în grămezi.. Pentru cultivare sunt necesari . 192 Diagnosticul de laborator în microbiologie y 8 ir . Nu apare hemoliză. Ambii factori se obţin din eritrocite. influenzae.patologic se realizeazăîn.pentru incubareţ o atmosferă umedă.p. Este lui acestora în mediu (de exemplu prin căldură. care au şi capsulă. Haemophilus şi Branhamella catarrhalis. H. dureroşi şi pot supura. Se sintetizat şi de stafilococul auriu. 3. este recoinaniată utilizarea unui mediu special...necesară.irn/0. Diagnosticul de laborator este în special microbiologic (bacteriologic. • Caractere biochimice: 2. convexe.. ^'Electrophoresis (MLEE). Este necesară . uneori dispuşi' în lanţuri scurte.. astfel că pe geloză sânge coloniile-de Haemophilus pot utiliza. înainte ca pacientului să fi primit antibiotice. refrigerarea este contraindicată). creştere precum hemina (factor. care se vor colora cu ” * Majoritatea tulpinilor (70%) simt indol pozitive (transformă triptofanul'în indol). uneori'dispuşi în . pe geloză chocolat aspeciui unor sifilisul. Pot exista şancre multiple. Pe geloză- sânge cu infuzie dc inimă-creier apar colonii mici. vedere macroscopic.' NADP sau 5. cultivarea secreţiilor nazale sau faringiene etc. .ot diferenţia prin reacţii de umflare a capsulei şi de imunofluorescenţă.se va identifica (vezişi capi­ . Nu apare hemoliză. care. care în pri­ Identificarea răspunsului imun faţă de Haemophilus influenzae mele 24 ore prezintă irizaţii puteriiice. transportul trebuie irealizat fără întârziere (la o temperatură apropiată de 37°C. cu eritem în jur. Cultivarea pe medii de cultură a produsului. . cât linii pe care a fost însămânţată o tulpină hemolitică de Staphylococcus aureus (fenomenul mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate.3 pm).în apropierea. caractere: / •: ’ • Caractere morfotinctoriale: Sunt cocobacili gram negativi.Unele tulpini de Haemophilus influenzae nece­ i*(Fulpinile necapsulate se pot identifica şi tipiza prin Muitilocus Enzyme sită pentru iniţierea creşterii 5-10% CO2.5-0'. având aspectul unor picături de rouă pe geloză chocolat. dureros. 1-2 mm la 48 de ore.5 f.p.în funcţie de Ag K. identificarea prezenţei de anticorpi faţă de H. având.dimensiuni mai. la 6-8 ord.'dispuşi separat sau în . . • Caractere antigenice: leucocitar. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor carea ris'punsului imun în urma vaccinării.şptelitism).8 mm după 24 de ore. • Caractere de cultură: Produc coloniile de tip S sau M tiare ating un diametru de 0. cu eritem şi edem. Pe geloză-sânge cu infuzie de inimă-creier apar colonii mici. mari. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie Haemophilus influenzae sunt mai numeroase şi de dimensiuni mai mari în apropierea unei de reguli (cât mai aproape de debutul bolii.unei linii pe care a 18-24 ore’sau rapid ATB E 4 cu citire şi interpretare după 4-5 ore incubare).se caracterizează unei boli cu transmitere sexuală. de tip S. respectiv E (vezi capitolul 14). în numai 4 ore. tolele 9 şi 10). ATB HAEMO cu citire şi interpretare după influenzae sunt mai numeroase şi de. Diagnosticul diferenţial se face cu mm după 24 de ore. LCR poate avea aspect purulent.ţeste: există sonde nucleotidice produse comercial pentru identificarea H. apoi a unei eroziuni care ulcerează).8 Ganglionii regionali sunt măriţi.

Transmiterea se realizează în spe­ • Caractere de cultură: Produc coloniile de tip S de dimensiuni mici. diagnosticul serologic este tardiv şi a r putea fi util pentru un diag­ în care diagnosticul serologic ar putea fi util. Substanţele toxice elaborate (şi în special toxi­ na. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât mai aproape de debutul bolii. apar primele • Necesită prezenţa în mediul de cultură a factorului de creştere (X). care..reşpectjv.. 4. ÎN INFECŢIILE PRODUSE MICROORGANISME 2. Contagiozitatea este maximă în cultivare...b tiu itu ri albastru de nieţijen'”(AM) şi. pentru a se dezvolta au nevoie de medii de cultură îmbogăţite. . Identificare prezenţei anticorpilor este utilă şi nosticul diferenţial (post-factum) sau în scop epidemiologie. Microorga­ • Caractere biochimice: nismul aderă. Identificarea microorganismului se va realiza pe baza mai multor caractere:' • Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili de dimensiuni mici. . respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc). citotoxina traheaiă are efect citotoxic pe Diagnosticul ide laborator iniunologic celulele ciliate etc. Specia..colora cu V.tip tolele 9 şi.ii.se vor. Pe geloză-sânge pot produce hemoliză. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două DIN GENUL■BORDETELLA ________ ______ ■ ■ . dispuşi în perechi sau lanţuri paralele. în infecţiile produse de Bordetella pertussis st pot recolta secreţii de la nivelul tractului respirator superior (nazal.1gram negativi. pieomorfi. citeior. >. foarte puţin rezistent în mediul extern).. nesporulâţi. faringian). care se va identifica (vezi şi capi­ capsulaţi. în infecţiile produse de Haemophilus ducreyise pot recolta secreţii DIAGNOSTICUL DE LABORATOR de la nivel genital (raciarea secreţiei de sub marginea şancrului.. pertussis/TF*) au următoarele acţiuni: TP conduceîa hipogiicemie. frecvent în asociere'cu alte microorganisme. pertussis agentul etiologic al tusei convulsive. la aproxima­ tiv 20 cm în faţa gurii bolnavului în timpul accesului de tuse). ii. interfera cu activitatea inudociliarâ normală.'ţ. Diagnosticul dc laborator microbiologic în infecţiile cu Bordetella pertussis este bac­ Şancrul moale este singura afecţiune produsă de microorganisme din genul Haemophilus teriologic. manifestări clinice care se agravează treptat. se nlultiplicâ rapid. 10). ':. Necesită pentru cultivare factorul X.ir -t t . după 3-7 zile de la cial pe cale aeriană (picături Pfltigge) într-un acces de tuse. Se' este reprezentată dt.10. metode difuzimetrice.încât să 1 Microorganismele dih genul Bordetella sunt cocobacili polimorfi.1DR cu Ag extrasedin cultură de bacili Ducreyi.. tice). dacă este posibil la patul bolnavului (microorganismul fiind.. strict aerobi. diminuarea răspunsului imun umoral (sinteza de 5. ______________ _______ ■■■:.Gi:am! Putem vizualiza inţra.. gram negativi. sensibilizare la hista- • Haemophilus ducreyi este catalazo negativ. reducerea activităţii macrofagelor. direct.(se expune o placă Petri cu mediul Bordet-Gerigou la care s-a adăugat antibiotic. ‘ ' " :l >* primul stadiu de boală şi la începutul stadiului al doilea (de tuse paroxistică). înainte ca pacientului să fi primit antibiotice.p>.de!5. Cultivarea H. deschisă..-B. asemănători celor din genul Haemophilus. Diagnosticul etiologic este foarte util în primul stadiu ai tusei convulsive (pacientul este foarte contagios iar evoluţia bolii poate fi influenţată pozitiv prin administrarea de antibio­ Este încă în discuţie utilitatea. sunt poate dezvolta dacă produsul patologic este recoltat de la baza şancrului şi cultivat pe geloză reprezentate de Bordetella parapertussis şi Bordetella bronchiseptica.cejular bacili de ■' '■ •' < ■!■ : ' -o ' . atunci când .CQ 2.'Se pot colora b îp o îâ n ' 1 ' • 3. ■ . Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel. ( ( 1 94 _________________ • ______ ■ Diagnosticul de laborator în microbiologie asepsie şi antisepsie etc). ■' mină. Nu există o metodă perfectă pentru recoltarea p. 'Jţ'-M Bordetella pertussis este patogenă numai pentru om.şau extra. Se pot colora bipolar. pertussis la persoanele asimptomatice şi respectiv la contacţi ar per­ mite aplicarea unor măsuri preventive..:. adenilatciclaza pertussis diminuă activitatea fagocitară a macrofagelor şi leitco- bilirii tratamentului) este necesară şi poate realiza prin. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea sta­ anticorpi).p. pieomorfi. ducreyi tste (dificilă. alte exemple. 1. A' " dimensiuni mici. Bordetella pertussis j . Supt germeni pre­ chocolat plus vancomicină 3 |tg/m l la 3ŞÎGîn atmosferă. cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate. Este recomandată prelucrarea imediată a p.'J A frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător. pertussis (bumbacul inhibă dezvoltarea microorganismelor) sau prin I i aspirarea secreţiilor traheobronşice. în scop epidemiologie: Se . toxina letală produce necroze locale. ducreyi. se poată obţine colonii izolate şi reşpeţkiyo cultură pură. Este descrisă şi metoda „plăcilor tuşite". dispuşi în perechi sau lanţuri paralele (în şiruri).pot utiliza tehnici de tip EL1SA pentru identificarea anticorpilor IgG sau IgM care apar faţă de H. vom realiza recoltarea cu aju­ torul tam ponului din alginat de calciu care se lasă pe loc 30-60 de secunde pentru a favoriza adsorbţia B. ‘■'■". imobili.%‘.i!u ş J tenţioşi. ■ . identificarea B. gram negativi. puroi din abces etc).. .

196 Diagnosticul de laborator în microbiologie
38 Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Bordetella
19 7

se suspicionează o,infecţie cu B. pertussis (toate metodele'au diferite limite atât din punctul til cu cărbune activat coloniile apar mai repede, sunt tot de tip S, mici, convexe, negre,
de vedere al sensibilităţii sau specificităţii cât şi din punct de vedere practic). cu suprafaţa perlată.
2. Examinarea microscopică a produsului patdlogic 1include realizarea a minim două • Caractere biochimice:
frotiuri din produsul patologic, care se vor coloră cu albastru de metilen (AM)'şi respectiv • Bordetella pertussis este hemolitică, oxidazo pozitivă, ureazo negativă.
Gram. Examinăm frotiurile la microscopul optic cu imersie şi notăm prezenţa celulelor • Se pot utiliza truse comerciale manuale care identifică specii de bacili gram nega­
inflamatorii (ex. leucocite) şi prezenţa cocobacililor gram- negativi, dispuşi separat sau în tivi (ex. API 20 E, API 20 NE), fiind de regulă necesare şi teste adiţionale de iden-
perechi, rareori ,în lanţuri scurte. Datorită faptului că aceste microorganisme se colorează i tificare. i
relati v slab în; coloraţia .Gram ar putea fi n e ţ c e ş ^ ţ v t ^ l Q r c M ^ ş a ţ - p j r i ^ t F ţ p , altă „ • f
• Caractere antigemce:
metodă'(irnunofluorescenţăidirectă): sau recolprarea prelungiţâ eţi fucşină. sau .şafranină, •,.,
• Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de Borde­
- Ji-Cultivâreăpe medii de cultură d-prdduăului patologic se realizeâM'înlâşa'fel încât sfi.se
tella pertussis, prin reacţia de aglutinare pe lamă.
poâtă'obţirifc"cbIOriii izolate şi't'eSpfectiV'o'cUltură pură; care'Seva iidentificâ:(vezi: Şi capitolele
9 şi 10). Bonletella pertubiis^ste iih 'mietobrgâniăm’,foarte 'pwtbnţlosicare.'nu! se poate dez­ • Alte teste de identificare utilizate în laboratoare de referinţă: Se poate utiliza amplificarea
volta pe medii de,cultură obişnuite; este inhibat de acizi graşi, peroxizi organici etc. Izolarea 11; genetică folosind diferite amorse (primeri); tehnica PCR are o bună specificitate şi sensi­
B. pertussis în culturi este dificilă, dar eforturile sunt necesare pentrma putea^firevaluatăv^varia­ bilitate dezavantajul principal fiind reprezentat de costul ridicat.
ţia genetică (de fază) şi respectiv pentru a putea, supraveghea fenomenul apariţiei rezistenţei la 5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea sta­
antibiotice şi chimioterapice. - , , ■ bilirii' tratamentului) poate fi necesară în scopul supravegherii apariţiei fenomenului de
la'ii.-.-ji:: ■■-■■■■■ i r h t u - y i h j f tul» .; n -riOJi’. ' i i r : ; . p . ,i|BJ£;iri
rezistenţă lâ antibiotice şi se realizează prin metode difuzi metrice.
Bordetella perfussis necesită pentru cultivare.nicotmamţda şau acid nicotimc.şi .o,tem­
peratură optimă de 35-37°C, cu.jncubare tim p d ^ ^ .z ile ,' în .aerpbioză.şi, atmosferă tirneda. Diagnosticul serologic este tardiv. Din punct de vedere tehnic au fost utilizate RFC,
Cel mai cunoscut mediu de cultură este mediul Bordet-Gengou care conţine agar, macerat reacţiile de aglutinare, hemaglutinare şi hemaglutinoinhibare sau tehnicile de tip EL1SA.
de cartof,.sânge', glicerol şi deyinej seî^ctijvj prin adăugare.de ppmcilţnă/meticiljpă şau ’cefa- Anticorpii apar din a 2-a sau a 3-a săptămână de boală. Diagnosticul serologic ar putea fi
lexină,. Albuminele. plasmaţice^din, acest, mediu leagă acizii ..graşi ( şi permit dezvoltarea util pentru un diagnosticul diferenţial (retrospectiv) Sau din punct de vedere epidemiologie.
microorganismelor. Dezavantajul principaial mediului clasjp B.ordetrGengou este reprezen­
tat de timpul scurt în care poate fi utilizat (1-7.zile). . v ,. , ........
Actualmente se recomandă utilizarea unui mediu folosit iniţial ca niediuude transport,
care include.geloză nutritivă, cărbune activat şi este suplimentat cu,tG% sânge de,cal., Acest
mediu, poate fi,utilizat pe.parcursul a ,1.-2 luni, ţar,coloniile de.B, pertussis apar mţii rapici.
în vederea izolării primare este necesar mediul B.ordetfGengou sau.,mediul,icuj'pfirbu.ne
activat, însă prin treceri repetate coloniile se pot dezvolta şi pe geloză-sânge sau chiar şi pe
geloză simplă. Microorganismul se va multiplica mai rapid, coloniile vor fi mai opace şi vor
apărea modificări morfologice (pleoraorfişm), alterări structurale, virulenţa fij.hcj scăzută. i;.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza-imatjinultor
caractere: .... t
« Caractere morfotinctoriale: Sunt; cocobacili gram negativi, mici, curiimensiunea de 0,2-
0,5 pm/0,5-2.,um, imobili, dispuşi separat sauumperechi, rareori.în\lanţuri,,scurte,;.cu ţen-
' dinţa de a deveni pleomorfi în urma subculti-vărilori (potîâpărea.şi fonneifil.amentoa.se,).
Utilizând coloraţii speciale;’îmcoloniile.rezuitate.din.primoculturi. se .pot- evidenţia struc­
turile capsulam. Dacă frotiul.se colbrează cu albastru de tolui.dinăjişe pun. înfeyidenţăigra- j
nule metacromatice situate bipolar. Imtindfluoresbenţă directă este utilă şi pentru jdentifw
carea microorganismului după cultivare:'. ■ •. ,\i\nu : i; •. >->„
• Caractere de cultură1: Produc’''colonii de tiip S sâu’M1. După-3-7 ziie de incubafe îa37°G
pe mediul Bordet-Gengou Se pot'dezvolta colonii de tip S mici, conVexe;nşor trans­
parente, tu strălucire metalică ,1foarte addfehte, înconjurate tie utţ halotfde hfetrtoliză
(faza I).‘în lumina transmisă oblic'Coloniile seamănă cu picăturile de mercur. Pe rnedi-

Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Brucella

D IA G N O S T IC U L D E L A B O R A T O R ÎN IN F E C Ţ IIL E
J ir ® P R O D U S E M IC R O O R G A N IS IV IE D IN G E N U L BRUCELLA s-ar putea recolta şi prin puncţie gangiionară, puncţie medulară (rata de izolare creşte),
puncţie hepatică sau splenică, sau ar putea fi reprezentat de LCR, urină, bilă, lapte, materi­
ale necroptice etc în funcţie,de simptomatologie şi stadiul bolii. în continuare vom discuta
situaţia în, care se realizează o hem ocultură prin metode clasice sau în sisteme de cultivare
.y.'N't »* -U :/■ . ; *::<«t K ' te'» y-iV ,-iY *•• . A •
rapide, de. tipul BacTAlert, Bactec sau Septi-Chek .(vezi şi capitolul 31). .
m. 1 li • i ! : ;l, ;*f ::Zw
2. Examinarea microscopică a produsului patologic nu aduce de regulă informaţii utile
diagnosticului, în special dacă este vorba de sânge. Se poate folosi tehnica imtinofluores-
Genu! Brucella cuprinde 7 specii, cu numeroase biotipuri, care infectează animalele şi se centă care uneori duce la rezultate pozitive. .
pot transmite de cele mai multe ori accidental omului de ex. Brucella m elitensis (capre, oi), 3. Cultivarea pe medii de cultură a.produsului patologic se realizează’în aşa fel încât să se
Brucella abortus (vaci), Brucella suis (porci), Brucella caniş (câini). Sunt cocobacili gram ne­ poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi capitolele
gativi (de multe ori coloraţi bipolar), cu dimensiuni de 0,5-0,6 pm/ 0,6-1,5 pm, imobili, prezen­ 9 şi 10). Toate speciile au cerinţe. nutritive complexe necesitând pentru dezvoltare medii
tând eventual o structură capsulară, pesporuiaţi, localizaţi. în mod .caracteristic intracqluiar, ae­ îmbogăţite cu substanţe nutritive (aminoacizi, proteine serice, glucoză, săruri, vitamine, ser,
robi facultativ anaerobi, catalazo pozitivi, relatiy inactivi metabolic, care,se.dezvoltărelativ difi­ sânge'etc). Se recomandă efectuarea hemoculturilor în mediul bifazic (solid-lichid), ex. tip
cil pe mediile de cultură intrând în categoria, bacteriilor pretenţioase cu necesităţi; nutritive com­ Castaneda. Cultura se incubează îp atmosferă de 5-10% CO2, la 37°C pentru o perioadă de
plexe, sunt bacterii fastidioase (mai ales atunci când se realizează cultivarea iniţială, clin p.p.), minim 2-3 zile; culturile negative trebuie urmărite până la 4 săptămâni. în cazul mediului
Brucelele sunt microorganisme parazite penţrp o serie de animale stţu pentru om, capabile să bifazic, vom însămânţa panta de mediu solid la fiecare 2-3 zile, fără a deschide flaconul.
determine infecţii acute, cronice sau infecţii inaparente, Cronicizarea.depincle.de capacitatea de
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor
multiplicare în celule fagocitare. Formele cele mai grave apar ca urmare a infecţiei cu Brucella
caractere:
melitensis, urmată de infecţia cu Brucella suis, Brucella abortus şi respectiv Brucella caniş.
• Caractere moifotinctoriale: Suni cocobacili gram-negativi cu cu dimensiuni de 0,5-0,6
Transmiterea la om poate fi realizată pe cale digestivă, .cutanată şi mai. rar pe cale respira­
■um/0,6-1,5 pm, dispuşi izolat sau în perechi, lanţuri scurte, grupat, Se pot colora bipolar.
torie. De la nivelul porţii de, intrare, microorganismele ajung la nivelul ganglionilor limfatici
Poate fi necesară o prelungire a timpului de recolorare cu fucsină, altfel sunt palid coloraţi.
regionali, depăşesc această barieră şi pe calea duetului toracic ajung în sânge, iar pe cale sang­
vină în organele cu sistem reticulohistiocitar şi la nivel osos. Incubaţia este în medie de 2-3 săp­ • Caractere de cultură:
tămâni/ însă uneori pot trece câteva luni între momentul infectării şi apariţia fenomenelor clini­ • Pe mediile îmbogăţite corespunzătoare nutritiv, pot produce după 2-3^rte-colonii
ce. Debutul este de obicei insidios, manifestat prin astenie, indispoziţie, cefalee, artralgii, febră de tip S, cu un diametru de circa 1 mm; dimensiunea coloniilor se măreşte astfel încât
moderată, transpiraţii abundente. în perioada de stare simptomele sunt polimorfe, bruceloza la 1 săptămână de incubare diametrul poate fi de 6-7 mm; pot fi, identificate (în special
fiind una din bolile extrem de greu de recunoscut clinic. Febra ondulantă (care creşte în cursul după incubare prelungită) colonii de tip R sau M
după amiezii şi scade în timpul nopţii) însoţită de frisoane are o valoare istorică. în realitate, * Examinate folosind o sursă de lumină la 45°, coloniile apar transparente, galben-
curba febrilă are un aspect variabil. Transpiraţiile abundente nocturne, cu un miros caracteris­ deschis, asemănător „picăturilor de miere*' în timp ce în lumina reflectată prezintă
tic, astenia, durerile sub diverse forme reprezintă alte elemente care pot fi comune în cursul o transparenţă cenuşiu-albăstruie
bolii. S-au descris circa 200 de semne clinice care pot apare în bruceloză.
• Caractere biochimice:
Durata bolii poate fi'de 3-4 săptămâni, dar cel mai frecvent depăşeşte 3 luni, ajungând
• B rucella spp. după repicare pe un mediu neselectiv prezintă un metabolism oxidativ
în formele cronice la ani de zile. în formele cronice diagnosticul se stabileşte foarte dificil.
• Microorganismele sunt cataiazo pozitive, în timp ce testarea reacţiilor oxidazei,
Diagnosticul brucelozei ureazei şi producerii de H2S pot da rezultate variabile; se pot utiliza sisteme clasice
în principiu, în realizarea diagnosticului se porneşte de Ia aspecte clinice şi epidemio- de testare, dar este posibilă şi utilizarea galeriilor API (ex. APi 20E)
logice, însă diagnosticul de laborator este esepţial, reprezentând unica metodă certă pentru • Testăm necesitatea în CO 2, pentru izolare
un diagnostic pozitiv. | • Se mai pot verifica metabolizarea glucozei, lactozei precum şi sensibilitatea la
Diagnosticul de laborator în bruceloză poate fi bacteriologic (direct) sau serologic. diferiţi coloranţi incluşi de ex. în medii de cultură (ex. tionină sau fucsină bazică)
Diagnosticul bacteriologic include urm ătoarele etape. • Caractere antigenice:
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând re­ « Utilizăm seruri imune anti -Brucella absorbite, prin reacţii de aglutinare pe iarnă
gulile cunoscute (vezi capitolul 6 ), în special cât mai rapid după debutul bolii şi înainte de (există reacţii încrucişate); în cazul unei reacţii pozitive, ia nivelul laboratoarelor de
iniţierea antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de sânge, dar

200 Diagnosticul de laborator în microbiologie 39 Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Brucella 201

referinţă se pot realiza-reacţii de aglutinare pe Iarnă cu seruri imund monospecifice Diagnosticul imunobiologic
(anti-A, M sau anti-R în cazul coloniilor de tip R)
• Testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza în studii epidetnio- Datorită faptului că în infecţia cu Brucella spp, este stimulat în special răspunsul imun
Iogice sau în scop de cercetare, fiind rezervată laboratoarelor- de referinţă; spre mediat celular, diferiţi autori menţionează utilizarea intradermoreacţiei cu brucelină în
investigarea unui caz suspect de bruceloză. IDR cu brucelină poate identifica existenţa unei
exemplu fagul Tbilisi Uzează tulpinile 'de B. abortus;-poate’liza ]&'concentraţii cres­
stări de hipersensibilitate de tip IV, faţă de antigenul brucelos.
cute tulpinile de B. suis, dar nu lizează tulpinile de B. melitensis. B. caniş sau
tulpinile în formă R u - ^ -.>i !•.. ;•
• Alte teste utilizate în identificare la nivelul centrelor de referinţă:1
• tehnici ale biologiei moleculare (există sonde-nflcleotidice'spe'cifice pentril diferite
biotipUri izolate'mai frecvent, de ex. 1 şi 3 âpşuţinâiitf B. se;încearcă
1punerea la punct'a PCR, pentru diagnosticuKbrucelozei)1. 1
5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice) se realizează
prin metoda difuzi metrică standardizată, şi este utilă atât în scopul supravegherii apariţiei
unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene cât şi pentru stabilirea tratamentu­
lui corespunzător în cazul unei maladii infecţioase în general dificil de tratat. ,

Diagnosticul serologic ^ , - -.
Este de multe ori necesar, ţinând cont de dificultăţile întâlnite în cursul diagnosticului bac­
teriologic. Utilizăm antigene cunoscute şi încercăm să determinăm prezenţa anticorpilor speci­
fici în sângele pacientului, valoarea titrului anticorpilor şi respectiv evoluţia acesturtitru în
dinamică, Trebuie să menţionăm că anticorpii de tip lgM cresc îh infecţia acută (hi Câteva săp­
tămâni) dar persistă şi în infecţia cronică sau chiar şi după tratamentul antibiotic realizat core-
spunzătpr (timp de 1-2-ani).•Anticorpii de tip IgG apar după circa 3 săptămâni.de-la,debutul
bruceloiei, ating o valoare maximă la 6-8 săptămâni şi persistă în cazul unei infecţii cronice.
în special din punct de vedere istoric discutăm şi putem practica în cadrul lucrărilor prac­
tice, aglutinarea pe lamă (Huddleson, reacţie calitativă, de screening). Cea mai cunoscută şi
utilizată tehnică de diagnostic serologic este reacţia de aglutinare,în,tuburi (Wright) prin
care putem determina atât litrul anticorpilor de tip IgM cât şi,cel al anticorpilor de tip IgG.
Având în vedere faptul că în bruceloză apar şi anticorpi blocanţi (Ac de tip IgA care
blochează activitatea aglutinantă a Ac IgM sau IgG), care pot persista,ani de zile, există difi­
cultăţi şi în ceea ce priveşte interpretarea rezultatelor obţinute în diagnosticul serologic;
Pentru a simplifica, considerăm că un titru > 1/160 este sugestiv, în timp ce o creştere de1
ir •
4 ori în dinamică a titrului, poate confirma diagnosticul de bruceloză.
■ i;
Există o serie de variante tehnice.care permirireducerea eroriloridednterpretare: , I jj.
j :' ■ ,,
• diluarea suplimentară a serurilor de cercetat • * s\. . ■; .■ t,nâf 1 > ■j I1.! O' >! .
• testul de- blocare (adăugăm tuburilor în care reacţia Wright,este negativă câte-, I pică­
tură de ser imun anti-Brucella; dacă reacţia rămâne negativă şi nici în acest caz (iu
apare aglutinarea, concluzionăm că în serul de cercetat există anticorpi blocanţi) j
• testul Coombs /
• utilizarea unei tehnici de tip ELISA pentru detectarea Ac de, tip IgM şi IgG care apar
faţăde proteinele membranei externe etc.

polimorfi. 1. suprarenalian. ou- gravis. I u ’ 1I . al doilea se va utiliza pentru cultivare pe diferite medii de cultură solide. există riscul nerecu. L. eritrocite. Realizăm minim xina induce apariţia unei „structuri" compuse din fibrină. c). renal (ne­ 2 . Prezenţa unor liale respiratorii moarte şi bacterii.‘b ■: X m . în mici grămezi neregulate sau în pali­ detaşarea cu precauţie a acesteia şi recoltarea secreţiei aflate sub această structură. d). de înghiţire etc). diametrul coloniei fiind Diagnosticul de laborator în difterie este bacteriologic. util. nervos (demieiinizare). L sau „sub sau se pciaie extinde. prelevării p. în cazul prezenţei „falsei membrane" se recomandă neuniform). de culoare cenuşie sau neagră. urmează multiplicarea şi inducerea unei inflamaţii locale. Se porneşte de la un diagnostic prezumtiv bazat pe următoarele belfanti formează colonii opace de tip S. C. Examinarea microscopică a produsului patologic poate fi decisivă (în context clinic croză tubulară). cu dimensiuni de 1-8 jim/' . intermedius şi belfanti. vom utiliza minim patru tampoane diferite. • Caractere morfolinctoriale: Se examinează cel mai bine atunci când frotiul este reali­ gastrice în momentul efortului respirator). în câteva zile de la debutul infecţiei. Biotipul gravis formează colonii opace de tip noastră. i ‘■ tru confirmare şi în scop epidemiologie. diametrul coloniei semne. din toate punctele de vedere (clinic..5-2 mm (dar se recunoaşte prezenţa unor colonii de dimensiuni diferite). ser-telurit). adenopatie şi edem cervical. două frotiuri. a).. mai ales dacă se asociază cu faringită mem­ 4. catalază pozitivi.n. faringian. asfixie mecanică). epi. b).prim frotiu. dar cele face o repicare pe mediul Tinsdale şi se începe identificarea pe baza caracterelor biochimice. fiind de 1. cu margini crenelate. amigdaiită şi/sau faringită cu dureri de intensitate medie plus asocierea unei „false fiind de 1. Loeffţer va fi incubat pentru 4-8 ore la 35-37“G după care se va realiza un. formează colonii de tip S care pot trece în forma R prin „îmbătrânire". . este. din p. celule epite. colorat nazal). 3. geloză sânge.). Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de secreţii de Genul Corynebacterium include'mai multe specii de bacili gram-pozitivi (se pot colora la nivelul faringelui şi de secreţii nazale. fără a aştepta finalizarea diagnosticului bacteriologic. muscular şi hepatic.noaşterii acestei patologii de către medicii care nu au văzut R. diphtheriae.i .■■■ ■' y : . nesporulaţi. . Biotipul mitis urgent. Pentru fiecare cultivare în parte există un anumit algoritm. paralizia pălatuiui moale. tiraj (depresiunea părţilor moi suprasternale. poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură. e)./ mamelonul. diametrul coloniei fiind de 0.5-2 mm. Hoyle etc). care se va identifica (vezi şi capitolele 9 şi 10). bacilii îşi continuă multiplicarea şi putea remarca prezenţa granulelor metacromatice poate conduce la administrarea de anti­ sinteza de toxină care difuzează pe cale sanguină şi conduce la apariţia unor tulburări la dis­ toxină difterică. respectiv falsa m em brană de culoare gri-maronie (diph. dificultăţi vizuale.p. t ’ i . nazal etc) şi a unor bacili gram-pozitivi (la limită). Dacă rezultatul este negativ tubul se reincubează timp de 18 ore iar dacă este pozitiv se tate cu bacteriofagi tox+) sintetizează toxina care poate afecta orice tip de celulă. epidemiologie etc). acoperind faringele. Tulpinile lizogene (infec­ Gram.■ . Tratamentul specific (administrare de antitoxină) se instituie fără întârziere. Sunt bacili gram-pozitivi (Ia limită). Biotipul impun cu maximă urgenţă. diametrul coloniei să fie în permanenţă pregătit pentru a reacţiona prompt. Riscul apariţiei cazurilor există iar sistemul de sănătate trebuie levate cu ansa. La adăpostul falsei membrane. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile cunoscute (vezi capitolul 6). relativ dificil de emulsionat. ■i ' ! A U -i'v 1 . to­ şi/sau epidemiologie sugestiv) pentru începerea tratamentului specific. ■.. miocardită. unui colorat Gram iar celălalt colorat cu albastru de metilen. după 24-48 de ore. precum mediui Tinsdale).. ^ .0 Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Corynebacterium diphtheriae ' 203 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN INFECŢIILE Mm PRODUSE DE CO RYNEBACTERIUMDIPHTHERIAE Se adaugă din punct de vedere bacteriologic examinarea frotiurilor realizate din produsul patologic colorate Gram şi cu albastru de metilen. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor branoasă şi semne de toxicitate sistemică. măciucaţi. C.1. Loefiler şi medii cu telurit de potasiu. de vorbire. de culoare cenuşie sau neagră cu margine transparentă. tanţă (tulburări de ritm cardiac. ■ 1 •. uşor incurbaţi. diphtheriae include patru biotipuri: în timp ce al treilea şi al patrulea tampon vor fi introduse într-un mediu de îmbogăţire (OST. plate. cu tendinţa de a se desface în fragmente atunci când sunt pre­ niciodată un caz de difterie.5-1 mm. cu suprafaţă lucioasă. si f 1 '„J. supraclaviculare. intercoslale. există anum ite particularităţi care trebuie menţionate. aşezaţi în V. aşezaţi în V. Aspectul cel mai caracteristic se înregistrează pe mediile cu telurit de potasiu (ex. pseudotuberculosis şi C. diagnosticul de certitudine urmează a fi stabilit ulterior.p. Spre exemplu. ' membrane". ■ i’ ■i . cu atât rata mortalităţii prin difterie creşte. pen- 1 ■! . de culoare cenuşie sau neagră. Datorită faptului că în ultimii 15 ani nu au mai fost înregistrate cazuri de boală în ţara Gundel-Tietz. în cazul suspicionării unui caz de difterie diagnosticul şi instituirea tratamentului se culoare cenuşie sau neagră. ■. formă de litere chinezeşti" în timp ce ta coloraţia cu albastru de metilen (modificată) am gian.membrană). trei pentru recoltarea secreţiilor Studii recente au delimitat grupul Corynebacterium diphtheriae în care se regăsesc speciile făringiene şi al patrulea pentru recoltarea secreţiilor nazale. cu adaos de ser sau sânge). uşor incurbaţi. leucocite.5-2 mm (dar se recunoaşte prezenţa unor colonii de dimensiuni diferite). Diagnosticul direct (bacteriologic). selec­ Cultivă mai bine pe medii îmbogăţite (de ex. Această structură. plate cu centrul terapeutic. semne clinice sugestive la care se adaugă vizualizarea pe frotiul colorat Gram a leucociteior thera . mediul După pătrunderea care are loc cel mai frecvent la nivelul tractului respirator (faringian. necapsulaţi. realizarea frotiurilor. cazul conversiei genetice) de a elabora exotoxină. imobili. secreţie nazală zat din colonii apărute pe mediul Loeffler (aspecte „tipice" apar şi în cazul frotiurilor serosanguinolentă asociată cu prezenţa unor „false membrane" ia nivelul mucoasei.ui •. Au capacitatea (în tive şi neseiective (ex. măciucaţi.se poate forma local (amigdalian. w i >i : i i 11 v'. translucide. direct şi trebuie realizat de 1. ulcerans (ultimele două fiind urează pozitive). cornaj şi stridor (respiraţii zgomotoase şi caractere: şuierătoare). • !' S. cu realizarea etapelor corespunzătoare. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se Cu cât diagnosticul este mai tardiv. în vederea sade. aerobi şi facultativ anaerobi. diagnostic. initis. Primul tampon va fi utilizat pentru C. obstrucţionând arborele traheobronşic (crup larin.:V ■■■ . mai importante efecte sunt la nivel cardiac (miocardită). Biotipul intermedius formează colonii opace de tip S.

alimente. Diagnosticul de laborator se bazează pe izolarea şi identificarea • teste biochimice suplimentare . diphthe­ frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător. tulpinile de C. Asocierea unor epidemii de listerioză cu consumul de alimen­ inoculată subcutanat la un lot de cobai neprotejaţi şi un lot de cobai protejaţi ţcu anti­ te contaminate sugerează calea gastrointestinal drept cea mai importantă cale de pătrun­ toxină difterică). iriitis şi belfanti produc o zonă mică de P'-hembţîză... cu efect hemolitic). • ELISA. uşor incurbaţi. La adulţi pot apărea meningoencefalită. Testul catalazei este pozitiv.. .de spermanţet.Culoa­ rea fiind albă ăaivgri perlat. Mâi rar au fost izolate maro. care se dezvoltă preferenţial la 30°C dar se poate multiplica şi la temperatura frigiderului („îmbogăţire la rece"). după amplificare geriică etc)'. Dintre manifestările clinice grave amintim listerioza perinatală. cât logice sau în scop de:cercetare. Sunt bacili fini gram pozitivi.. Ib • Caractere de patogenitate: .mioterapice) se poate rea­ din mediul extern etc.. diphtheriae de alte specii ale gfenului se practică testul. placentă. Dintre toate tipurile antigenice. monocytogenes. . în cazul în care cultura testată include microorganisme toxigene.lucioase. precum galeriile API CORYNE card se bazează Ltsterioza este o zoonoză. bombate.. inclusiv lecitinaza. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chi. *'1 . Biotipurile intermedius. şi IVb.nitraţilor şi.. în infecţiile produse de Listeria • tehnici ale biologiei moleculare (ribotipie. pifazi. ' f asepsie şi antisepsie etc). . Listeria monocytogenes • Caractere biochimice: . ureazei (negativ).. pe cobai. este un test zate. i • în scopul diferenţierii. . care poate produce'infecţii variate.... umane şi animale. diferite infecţii focali­ I tul ELEK (vezi şi capitolul 16). sepsis cu deces înainte sau relativ • Caractere antigenice: repede după momentul naşterii etc). •. . • Pe mediul Loeffier (mediu electiv) coloniile apar în 18 ore fiind albe. Infecţia umană apare accidental şi foarte frecvent evoluează I pe cothbinarea testelor biochimice du testele enzimatice (20 teste) inaparent. simplu şi precis. Pe mediile de tipul gelozei-sânge aspectul morfologic este aproape similar. logice contaminate cu alţi germeni precum materii fecale. ivanovii şi sau L seeligeri. respectând toate normele de • Alte caractere/teste utilizate în identificare la’ hivdluj centrelor de referinţă. direct. Testul poate fi interpretat la 24-48 ore.. . care se vor colora cu albas- ria*.i . L sau „sub formă de litere chine­ INFECŢIILE PRODUSE DE MICROORGANISME DIN GENUL LISTERIA zeşti". ( 204 Diagnosticul de laborator în microbiologie DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN 0. probabil o infecţie intrauterină (avort spontan.. bacteriemie / • Se utilizează ser antitoxină dlfterică pentru identificarea producerii toxinei prin teş- urmată de metastaze septice (mai ales la imunodeprimaţi) şi mai rar. probe 5..8 (im. eritromicină). . asemănătoare picăturilor.. mobili la 25°C. Listeria monocytogenes este patogenă prin multiplicare şi invazivitate (prezintă o struc­ namidazei (negativ) şi cistinazei (pozitiv).. poate utiliza în studii epidemic-1 cunoscute (cât mai aproape de debutul bolii.. . V Genul cuprinde mai multe specii dintre care cea mai importantă specie este Listeria • Pe mediul Tinsdale coloniile sunt negre'(datorită producerii'di 'H2Ş) cu halo gri. ţesut fetal. ceea ce ar permite realizarea unui diagnostic mai rapid. . . dere. reducerea. fosfolipaza C şi Iisterioiizina O.. ■ ! tură asemănătoare proteinei M streptococice.ţ mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate.fermentarea unor probabil iniţial celulele intestinale. . la nivelul centrului de referinţă. 1 ‘ v'". . PCR pentru subunităţi ale genei tox+ etc) 1 .. bacteriologic. ■' ■■ macfofagic. fiind fezbfvată idbbratbăreldf de refdrinţă. în specia) din sânge şi/sau din LCR. aerobi faculta- dezvoltate pe acest mediu permit. r . produc colonii de tip S sau R. înainte ca pacientului să fi primit antibiotice. ţ microorganismului. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile • Testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) se. secreţii genitale. cobaii neprotejaţi mor în 24-48 ore cu evidenţierea semnelor de intoxicaţie difterică. în special în scopul supravegherii apariţiei 2.. De regulă.. produce diferite substanţe cu rol în invazivi­ • Diferenţierea’biotipurilor şi confirmarea diagnosticului de specie se realizează prin tate.- 1. . Infectează testul catalazei (pozitiv). Există recomandarea realizarea unor frotiuri „colorate" imunofiuorescent. C. semicremoase. profilul de restricţie al unei regiur^.. . sunt sensibile la antibioticele folosite uzual în tratament (penicilină. A . 90% dintre tulpinile izolate la om aparţin tipurilor la. . ca­ monocytogenes se mai pot recolta lichid amniotic. .. supravieţuieşte intracelular şi se multiplică intra- zaharuri. menţionează că frotiuriie realizate pornind de la coloniile tulpini din speciile!.' aşa cum am menţionat mai sus. măciucaţi.. • Caractere de cultură: '' • în funcţie de biotip. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două unor tulpini rezistente la medicamentele antimicroblene. dar şi prelevate pato­ racteristice.. . . . cultura este făcută din lapte nepasteurizat.evidenţierea granulelor metacromatice. Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu Listeria monocytogenes este • Testarea producerii de toxină pe celule Vero sau prin alte metode (Western-blot. Putem menţiona că tipul IVb a fost mai frecvent asociat cir consumul de brânză • Testarea toxigenezei in vivo.5-0. • » Se pot utiliza sisteme comerciale. liza prin metoda difuzimetrică standardizată. tiv anaerobi. naştere prematură. Anumiţi autori. aşezaţi în V.

ti • Utilizarea unor tulpini standard de Staphylococcus aureus (pentru L. monocytogenes.. care se va identifica (vezi şi capitolele majoritatea tulpinilor izolate la om aparţinând tipurilor Ia.i..5 mm (mai mici pe agarul triptozat).. dispuşi separat sau grupaţi în palisade. RFLP sau RAPD-PCR.. vechi se caracterizează prin pleomorfism şi pot apărea forme filamentoase.5-5 pm/0.. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se Serotiparea este utilă în scop epidemiologie. ivanovii) în cadrul testului CAMP este utilă pentru identificare.. acriflavină. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor macrorestricţiei ADN. Multiplicarea la temperaturi extreme (2-45°C) poate fi utilă pentru identificare. coloniile ating un diametru de 1-1. monocytogenes. tolerează o aţmoşferă.5-0. există ratura optimă fiind de 20-3QÎC).. în laboratoare de referinţă pot fi efectuate însă şi teste de pato- în cazul p.8 pm.COj ... ■/..ţie. în culturile tinere predomină fomiele cpcobacilare în timp ce în Culturile.. agar.L.8 pm.. în funcţie de Ag somatice sau flagelare.' 1 11 j I • L. incubăin încă 18-24 de ore la 35-37°C.pre..(„îmbogăţire la rec... prin tehnici imutiologice. uni de 0.. în special dacă s-a menţinut cultura la 18-25°C (sau la temperatura camerei). Dintre acestea o variantă este reprezentată de cultivarea în bulion timp de 24 tozat. în 9 părţi de bulion peptonă-triptonâ Alte modalităţi de studiere a virulenţei tulpinilor izolate sunt reprezentate de inoculări cu extract de carne şi drojdie..să aibă aspect de picături de rouă. fayprizează njtjlti.. materii fecale etc) este necesar să folosim medii de cultură cobai. dispuşi izolat. formă. 1 • Caractere biochimice: • L monocytogenes produce q zonă discretă de Prhemolizg. pîicarea L.-Jj' i f '•( î V ... urmată de inocularea unei picături de cultură în sacul conjunctival la iepure sau de la p... După 1-2 zile de incubare la 35-37°C pe agar glucozat..:. Există 13’ serotipuri (serovaruri) poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură. chorioalantoidiană a oului embrionat de găină.miros . caracteristică pentru L monocytogenes.de litere" (asemănător corynebacteriilor). V .... Ib şi IVb. contaminate (alimente.5-5 pm/0. —■. . selective spre exemplu însămânţăm iniţial o parte p. datorită mobilităţii va apărea creşterea „în umbrelă". Atunci când dorim să realizăm(izolarea pornind de ore.p. tulpinile de Listeria monocytogenes izolate de la cum şi concentraţii. intra sau extracelular. caractere: 5. Listeria monocytogenes se prezintă ca bacili sau • Caractere antigenice: cocobaciii gram pozitivi.... : '<ri *-■■’ 1 ■■.p. genitate. De menţionat că se poate multiplica la temperaturi ce variază între 2-45°C (tempe­ • Sensibilitatea la bacteriofagi: Lizotiparea este foarte utilă în scop epidemiologie.. . Există şi alte'strategii folosite -pentru Izolarea L. .206 Diagnosticul de laborator în microbiologie Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Listeria 20 7 yY s . Ulterior realizăm o repicare pe medii selective (ex. morwcytoget^eş formează colonii de tip S. analiza 4. „ • Se pot utiliza truse comerciale manuale (ex.. necontaminate (sânge. ppţ.’ 9 şi 10)..! mono­ cytogenes în 4-24 de ore. de peste 5% NaCl. monocytogenes şi L.lQfp. • Caractere de cultură: Cultura degajă un . . în funcţie de trusa utilizată. tulpina virulentă va determina apariţia unei conjunctivite purulente în 1-3 zile. tru de metilen (ÂM) şi respectiv Gram.în cadrul unor de litiu. polimixinâ B(‘clorură • Alte teste rezervate centrelor de referinţă: în scop epidemiologie sau..... tulpini care nu pot fi testate prin această metodă..' ceftazidimă etc). Dacâ însămânţăm prin înţepare o coloană de mediu semisolid. . studii taxonomice se pot utiliza Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE).. coloniile sunt înconjurate de o zonă discretă de p-hemoliză. '. acjdulaţ. în perechi şau „în în cazul infecţiilor grave se vor determina CM1 şi CMB (vezi capitolul 14)... . .. suplimentat cu cu acid nalidixic şi acriflavină iar după 2-7 (sau la şoareci imunocompromişi (inoculare intraperitoneală) sau de inocularea membranei chiar 30) zile de incubare ia temperatura frigiderului. pacienţi sunt virulente. în perechi sau • Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de Listeria în lanţuri scurte.. seeligeri) sau de Rhodococcus equi (pentru L. ... cu dimensiuni de 0. rapid ID 32 Strep) care permit identificarea !. temperatura scăzută. Pe agar-sânge. cu dimensi­ bilirii tratamentului) poate fi necesară şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice... monocytogenes este catalazo-pozitivă şi fermentează o serie de carbohiurâţi (fără producere de gaz).5-0. monocytogenes'. suplimentat cu 5% sânge de berbec.’ i ". Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea sta­ • Caractere morfoţinctoriale: Sunt bacili fini sau cocobaciii gram pozitivi.. V . i.de S.. lapte.utiliza spre ex.p..e“). ...„ . • Caractere de patogenitatş: în general. APi Listeria sau API 20 Strep) şi respectiv truse automate (ex.. 3. pj... agar glucozabsau trip. în preparatul proaspăt se poate demonstra mobilitatea.LCR etc) vom. în culturile iniţiale.

Din punct de vedere epidemiologie. 1. atunci când se identifică spre ex.în microscopia optică permite notificarea în buletinul de analiză a unui rezultat cu 3+ considerate anterior saprofite dar care .pro-. Examenul microscopic rămâne o. Mycobacteriile se dezvoltă. prin centrifugare. asepsie şi ântisepsie inclusiv protecţia personalului medical implicat etc). conform recomandărilor .4% piruvat de sodiu a mediului L6wenstein-Jensen. Oi>î 1. dar cea mai frecvent întâlnită este tuberculoza tuberculoză. asparagină şi glicerol. frecvent impli­ (maxim fiind 4+. •. toate celulele şi bacterii­ 4 JL ÎN IN F E C Ţ IIL E P R O D U S E D E M IC R O O R G A N IS M E le non-AAR sunt colorate în albastru. tuberculbsitt. .■„ i:-l»/i / ::r-"•*jî». bulion 7H9). multe dintre'acestea fiind larg indiferent de metoda folosită. LCR. leucocite) şi prezenţa BAAR. probe obţinute prin biopsie. în continuare vom discuta cazul în care p. Cultivarea pe medii. menţionat. 3 grupe principale: medii de cultură lichide (ex. 'l nv ce prezenţa a 10-90 bacili/1 câmp în microscopia cu fluorescenţă şi respectiv a I -9 BAAR/1 în afară de M. făină de cartof.fie'. nes- porulaţi. prezenţa a 1-9 2. „atipice etc). cât zintă elementele de bază ale mediului clasic LOwenstein-Jensen la care se adaugă verde mala- mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate. Gram şi respectiv Ziehl NeelsCn. ■ confirmă (sau infirmă) morfologia şi tinctbrialitatea microorganismelor dintr-o colonie izo­ lată. în funcţie de africamtm precum şi a tulpinilor de M. imersie şi se notează prezenţa celulelor de la nivelul tractului respirator (ex^ macrotage medicamentele anti-mycobacteriene pentru tulpinile izolate.se (mycobacterii ne-tuberculoase. bovis. %£n v -5! * • . (ex. dar trebuie confirmat prin izolarea şi identificarea M.fiind condiţionat patogene. Dacă rezultatul final este (microbiologic) în infecţiile produse de M. este necesar ca mediile de cultură să rală.în generai pe medii com­ Diagnosticul poate fi sugerat de elemente clinice. urină. prezenţa unor acizi mycolici care conţin 60-90 atomi de carbon'şi care pot fi clivaţi piin bâcili/10 câmpuri în microscopia cu fluorescenţă şi respectiv a 1-9 BAAR/100 de câmpuri în piroliză în acizi graşi cu 22 şi respectiv 26 atomi de carbon. animalelor bolnave bucilii tubercuioşi apar ca bastonaşe subţiri.uti­ AM. . puimonară. în România aceste sisteme au început să. Notaţia semicantitativă este obligatorie deoarece exprimă unitar densitatea BAAR pe frotiu Genul Mycobacterium include peste 80 de specii 'diferite. î}fy \ . cate în patologia gazdelor itnunocornpronii. alveolare). înainte ca pacientului să fi primit antibiotice. Aceste substanţe repre­ de reguli (cât mai aproape de debutul bolii. prin tratare cu NaOH 4%) şi neu­ inoculare iar apoi săptămânal până la împlinirea a 6. ' ' ' / / 'J. h . radiologice). (10-30 în zentate de:T. pericardică.Culturile se incubează de rutină la o tempe­ p. lin conţinut procentual de microscopia optică permite notificarea în buletinul de analiză a unui rezultat cu 1+ în timp g +c d e 61-71%. MB-Bact. în continuare vom discuta aspectele legate de diagnosticul de laborator diferiţi şi pentru aceiaşi boinav în momente evolutive diferite. rectilinii. în momentul actual. Mediile pe bază de ouă au ca ingrediente: ouă sau gălbenuş de ouă. medii de cultură pe bază de ou Diagnosticul de laborator microbiologic este în mod esenţial bacteriologic (direct). între bolnavi răspândite în natură. peste 9 BAAR/1 câmp la coloraţia Z-N). ţm fost descoperite o serie de alte mycobacterii câmp. ile tuberculoase au o rată de diviziune de 12-27 ore. leprae.‘i : .p.8-12 săptămâni deoarece mycobacteW- tralizată în vederea baciloscopiei şi cultivării. Atunci când încercăm să realizăm izolarea primară.varietate de medii de cultură.. spălătură bronşică. lichide recoltate prin puncţie articulară. mediul Lowenstein) şi medii de cultură bazate pe compoziţia în agar (tip Middlebrook). permiţând comparaţii între laboratoare diferite. Bactec) cu depistarea frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător. pleu. Baciloscopia negativă nu exclude diagnosticul de Tuberculoza poate avea localizări variate.p. . Sputa trebuie decontaminaţă (de ex. care se vor colora /cu creşterii mycobacteriene. „nedeterminat" trebuie să facem încă un frotiu din acelaşi produs patologic şi să indicăm recoltarea unui nou produs patologic. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim trei Se pot utiliza şi sisteme de cultivare „rapidă" (ex. este reprezentat de spută ratură de 35-37°C. Diagnosticul. . tuberculosis. imobili. 3.m ' Rezultatele examenului microscopic (coloraţie fluorescentă şi Ziehl-Neelsen)'trebuie Elementele minime necesare stabilirii apartenenţei la genul Mycobacterium sunt repre­ cuantificate prin numărul de BAAR în raport cu numărul de câmpuri examinate. tuberculosis şi M. Mediul este solidificat prin coagulare. Frotiurile se examinează la microscopul opţic'cit lizate în uneie centre începând cu anul 1998. cu dimensiunea . sunt relativ. tuberculosis rezistente la HIN este favorizată de supli­ forma clinică de tuberculoză se pot recolta următoarele produse patologice: spută. acid-alcool rezistenţi (apar roşii pe fond albastru. Dezvoltarea M. Mediile de cultură utilizate în diagnosticarea unei infecţii mycobacteriene se împart în mente db laborator.' varianta hominii. care se. respectând toate normele de chit pentru selectivitate (în acelaşi scop se pot adăuga antibiotice). 100-300 în cazul coloraţiei Z-N). prezenţa celulelor inflamatorii (ex.va identifica. în ţesuturile gramului naţional.' 3. :■ •' •• -U: o1. Spre exemplu. mentarea cu 0. din Fiecare grup logic.de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se tratamentul corect şi complet al acestor pacienţi este'esenţial. Mediile de cultură solide se vor examina zilnic în prima săptămână după (vezi şi capitolul 6).i: sî:>»I . există o mare .4pm/3 pm. M. pacienţii cu tuberculoză pulmonară (care elimină prin spută BAAR) reprezintă sursa de infecţie cea mai importarită. la care se pot adăuga datele obţinute în cadrul diagnosticului imunobiologic şi sero­ Pentru izolarea primară a mycobacterîilor se pot folosi medii foarte variate.etapă D IN G E N U L MYCOBACTERIUM esenţială în diagnosticul unei infecţii mycobacteriene atât în momentul examinării unui pro­ dus patologic (examenul microscopic direct) cât şi în momentui când prin microscopie se .în 4-25 de zile. puroi etc. rezistenţa la decolorarea cu acid-alcool (bacili acid-alcool rezistenţi. poată obţine o cultură pură. Diagnosticul tie laborator în infecţiile produse de Mycobacterium 209 $ f | D IA G N O S T IC U L D E L A B O R A T O R de 0. Uneori este necesară concentrarea se incubeze într-o atmosferă de 8-10% COz. peritoneală. lichid de.. BAAR): cazul coloraţiei fluorescente.. Se poate utiliza şi coloraţia fluorescentă. la coloraţia Ziehl-Neelsen). Aceste sisteme permit testarea sensibilităţii la. necapsulaţi. 2. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie săruri. . paraclinice (ex. la nivel mondial. alte ele­ plexe.

mediilor selective. . tuberculosis şţ respectiv M. tuberculosis se. leucocite şi Deşi nu am prezentat elementele necesare identificării mycobacteriilor netuberculpa. Inocularea p. studiul cro-i gulile cunoscute (vezi capitolul 6). . uti­ lizăm etanol steril de 95°. culoare roz. în p.. grunjoaşş. în cazul în care bilirii tratamentului) poate fi necesară şi se realizează conform recomandărilor Progra­ este de presupus că p. tratarea termică sau tratarea cu alcool a p. că B. yezi capitolul 2. paţa- 2.ex. . direct şi .- se. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea unor frotiuri care clinic şi epidemiologie. în perechi sau lanţuri scurte. pentru ambele. dispuşi izolat. neregulate. agentul selectiv mai frecvent utilizat este polimixina B. tuberculosis ţin tim pce (pentru M.hidrpiiza tween'80.5 (. incluşi într-o capsulă comună.C.pot examina în centre de referinţă. subliniem faptul că în diagnosticul tuberculozei nici. anthracis se prezintă sub formă de bacili gram pozitivi. în cazul utilizării unui număr redus de teste. bovis.CG este iphibat de către această substanţă). cel puţin un frotiu se va păstra de rezervă. Sunt aerobi facultativ anaerobi. la temperatura camerei.. (PAS).un /3-10pm). care prezintă reacţii pozitive (sau slab pozitive) ultima perioadă se discută frecvent despre. în special în cazul tulpinilor de M. de dimensiuni mari (1-1. ■ . • . • . L. cu toate că a fost izolată o mycobacterie „atipică". cereus şi B. . j. PCR).. sânge (pentru hemoculturi) etc. spută.ri. testul reduceni ’nitra{ilbr.sensi­ secreţii de la nivelul leziunilor cutanate dar se pot recolta şi aspirat din edemul local şi/sau bilităţii faţă de anumiţi mycobacteriofâgi etc. . . tuberculosis rezistente la H1N pot'forma colonii de tip S. trebuie gia nu este perfect standardizată. * tit .implicarea acestui microorganism în bioterorism. de. Se pot utiliza metoda concentraţiilor absolute.urmate etapele cunoscute dar există anumite particularităţi. Diagnosticul de lab o rato ry antrax este bacteriologic. spre ex. B.. Identificarea microorganismului! implicat paţogenic se-va'realiza pe baza mai multor caractere: ■ INFECŢIILE PRODUSE DE BA CILLU S AN THRACIS • Caractere morfotinctoriale: în frqtiul realizat din colonia izolată se evidenţiază BAAR • Caractere de cultură: M. nepigrnentate.. . cu capetele „tăiate drept!’. • Alte caractere/teste utilizate în ’identificare: Se pot utiliza (la: nivelul unor centre de 1. Examenul bacteriologic va confirma diagnosticul.25 ml din suspensie utilizează intradermoreacţla cu tub