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La importancia de la densidad del epítopo en la selección de un control de

IHC positivo sensible

Resumen
Los laboratorios de inmunohistoquímica clínica (IHC) se enfrentan a desafíos únicos para la
realización de inmunotinciones precisas y reproducibles. Entre estos desafíos está el uso de
controles caseros derivados de muestras de descarte patológico. Dichos controles positivos tienen
un número desconocido de moléculas de analito por célula (densidad de epítopo). No está claro
cómo la falta de concentraciones definidas de analito afecta el rendimiento del control. Para
abordar esta cuestión, preparamos controles IHC positivos (IHControls) para el receptor del factor
de crecimiento epidérmico humano tipo II (HER-2), receptor de estrógeno (ER) o receptor de
progesterona (PR) con concentraciones de analito bien definidas, homogéneas y reproducibles .
Usando IHControls, examinamos el efecto de la concentración de analito en la sensibilidad de
control de IHC. IHControls y los controles de tejido convencionales se evaluaron en una serie de
experimentos de degradación de reactivos de anticuerpos primarios simulados. Los datos
demuestran que la capacidad de un control IHC positivo para revelar la degradación del reactivo
depende de (1) la concentración de analito en el control y (2) donde esa concentración recae en la
curva de respuesta analítica de la inmunotinción. Los controles IHC positivos más sensibles tienen
concentraciones de analito dentro o cerca del rango de respuesta dependiente de la concentración
del inmunosuero. Los controles positivos fuertemente teñidos que tienen concentraciones de
analito en la meseta de la curva de respuesta analítica son menos sensibles. Estos hallazgos
enfatizan la importancia de seleccionar controles de IHC positivos que son de intensidad de tinción
intermedia (en lugar de fuerte). (J Histochem Cytochem 65: 463-477, 2017)

Palabras clave
IHControl, inmunohistoquímica, péptido, control positivo

Introducción
El campo de la inmunohistoquímica clínica de diagnóstico (IHC) evoluciona desde una colección de
manchas inexacta y cualitativa a un conjunto cuantitativo de ensayos cuyos resultados
puede influir independientemente en el manejo del paciente.
Las revisiones publicadas, los requisitos reglamentarios y las pautas de consenso transmiten un
tema similar: los conceptos generales de validación de los ensayos y protocolos de control que son
un estándar de práctica en otras disciplinas de laboratorio clínico, como la Química Clínica,
generalmente son conceptos para practicar en el laboratorio clínico de IHC. .

Recientemente describimos la observación que las muestras que expresan aproximadamente 104 moléculas del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano tipo II (HER-2) por microperlas pueden ser fuertemente positivas mediante una prueba comercial de HER-2 y completamente negativas por otra. Por ejemplo. un "bajo" en un laboratorio puede ser "alto" en otro. Este concepto es difícil de aplicar a IHC clínico. surgen dificultades para estandarizar los resultados de las pruebas.Los protocolos de validación y control del ensayo que son sencillos cuando se trata de muestras de sangre a veces no son sencillos cuando se aplican al tejido secciones.1202 (c)) exige que los laboratorios clínicos que realizan pruebas moderadamente complejas ejecuten al menos dos controles a diferentes concentraciones de analitos. Estos parámetros no se miden fácilmente en cuanto a las tinciones inmunohistoquímicas. generalmente uno hacia el extremo inferior de ese rango y otro hacia el extremo superior. dos controles separados "altos" pueden producir una tinción fuerte y aún tener concentraciones de analito muy diferentes. Una vez que la concentración del analito está en la meseta de la curva de respuesta del analito. Actualmente no es posible cuantificar rutinariamente un resultado de prueba bajo o alto con unidades de medida trazables a un estándar objetivo. Las diferencias en la sensibilidad analítica entre las pruebas de IHC comercial aprobadas por la FDA se sospechaban previamente en base a estudios de correlación10-16. La Ley de Mejora de Laboratorio Clínico de 1988 (CLIA 88. el laboratorio clínico ejecuta al menos dos controles. no existe una correlación con las concentraciones reales de analito. la concentración del analito y la intensidad de la tinción ya no se correlacionan entre sí. En general. Por ejemplo. los resultados de las pruebas clínicas de IHC se expresan en términos de intensidad de color. Sin embargo. Sin un estándar de calibración externo. En particular. . sin los calibradores. un campo donde los términos como "rango de medición analítico" aún no tienen significado. como el número de moléculas por celda. si una prueba de glucosa en suero tiene un rango analítico de medición (RAM) de 5 a 800 mg / dl. los protocolos de validación de ensayo para un ensayo de suero generalmente implican verificar la calibración y la linealidad. pero nunca antes se habían medido cuantitativamente. los términos bajo y alto son ambiguos porque. Sección §493. se recomienda que los laboratorios clínicos IHC utilicen un control "bajo" y "alto". la selección de controles positivos de IHC. Esta discrepancia se debe a que las dos pruebas HER-2 comercializadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) tienen diferentes curvas de respuesta analítica. En consecuencia. Por ejemplo. Este artículo se centra en uno de los desafíos únicos asociados con IHC.

5 micras de diámetro). Las microperlas recubiertas con analito llevan epítopos peptídicos unidos covalentemente para HER-2. independientemente del procedimiento de tinción IHC. están representados los analitos peptídicos para todas las principales pruebas clínicas de HER-2. procedimientos o condiciones que podrían afectar el resultado de la prueba. no hay datos publicados que describan la relación entre la concentración de analito en un control positivo de IHC y la sensibilidad de ese control en la detección de aberraciones de tinción de IHC. Hasta donde sabemos. Estos han sido descritos previamente.17. Idealmente. desparafinización. la gota puede tratarse como se trataría una muestra de tejido.18 Brevemente. Una vez seco. 2). Cada gota de microlitro seco en el portaobjetos incorpora aproximadamente 5000 microperlas recubiertas con analito (prueba). Las microesferas se suspenden en un líquido claro patentado que se endurece después de la aplicación en el portaobjetos de vidrio. reteniendo así las microperlas en el portaobjetos de vidrio durante la cocción. ER y / o PR. Los IHControls están compuestos por dos microperlas diferentes: microesferas de vidrio recubiertas con analito (7-8 micras de diámetro) y microperlas de colores estándar (4. el control será sensible incluso a aberraciones leves. ER y PR. recuperación de antígenos y tinción de IHC.En este estudio. permitiendo una intervención temprana antes de que los resultados de la prueba del paciente se vean comprometidos. Materiales y métodos IHControls Los IHControls han sido descritos previamente. El propósito de un control de ensayo es detectar aberraciones en los reactivos. receptor de estrógeno (ER) o receptor de progesterona (PR). que son de color marrón oscuro permanentemente. Entre todos los diversos productos IHControls utilizados en este estudio. abordamos la cuestión de cómo estas concentraciones de analitos no controlados afectan la sensibilidad de los controles de IHC en la detección de la degradación primaria de anticuerpos. las microesferas del tamaño de una célula sirven como una superficie sólida sobre la cual se anclan HER-2. La suspensión de microperlas IHControls también incluye microperlas de colores más pequeños. Los IHControls también incluyen un segundo tipo de microperlas de prueba que no es inmunorreactivo con el anticuerpo en cuestión. . 9. Las microperlas antigénicamente irrelevantes sirven como un control negativo interno no teñido (mostrado en la Fig.17 Las microesferas de color estándar sirven como una referencia de intensidad de color para estandarizar las mediciones de intensidad de color mediante análisis de imágenes.

aprendemos la concentración de analito. la abertura del condensador se abre ampliamente porque las microperlas tienen un contraste más que suficiente. usando tiempos de exposición fotográficos manuales (fijos). Brevemente. Los controles tisulares se fotografían con la iluminación de Köhler. Las concentraciones de analito en las microperlas son trazables a un estándar de fluorescencia de microperlas ya existente llamado "moléculas de fluorocromo equivalente" (MEF). Con este ajuste. Modelo 2.0 (Diagnostic Instruments. de 106 / microperlas (la concentración más alta) a 102 (la concentración más baja). Inc. una vez que se estableció la iluminación de Köhler. Las explicaciones detalladas de la cuantificación del analito con IHControls se han descrito previamente. Para la fotomicroscopía de campo claro de IHControls. ER o PR se sintetizan como péptidos con una sola fluoresceína. la óptica del microscopio se configura por primera vez para la iluminación de Köhler. MI). Descubrimos que exagerar un poco las imágenes mejoró la precisión de la cuantificación de las microperlas al crear un fondo ligeramente más blanco.9 En pocas palabras. Para IHControls. El software de la cámara se configuró en una gama de 1. Sterling Heights. la cámara tenía un balance blanco y se realizó una corrección de campo plano.0. . Este aumento en el contraste de la imagen.3. Inc. Para cualquier experimento. las microperlas de prueba no teñidas son levemente visibles junto con las microperlas teñidas.Las microperlas de prueba IHControls se fabrican en una serie de diferentes concentraciones de analitos (péptidos) que difieren en aproximadamente un registro. la misma cámara se utilizó para fotomicroscopía. o (2) un microscopio Zeiss Axioskop equipado con una cámara Spot Imaging Solutions Insight Gigabit CCD (Diagnostic Instruments.). Al determinar el número de moléculas de fluoresceína por perla. Antes de la fotomicroscopía. Fotomicroscopía Las imágenes se adquirieron como se describió previamente. El beneficio del fondo ligeramente más blanco es que el paso de segmentación de imágenes en el programa MatLab se fija más rápidamente en las microperlas relevantes para la cuantificación. cada uno de los analitos HER-2. Estos péptidos están conjugados químicamente con las microperlas. utilizamos (1) un microscopio Nikon Eclipse E400 equipado con una cámara a color con dispositivo de carga refrigerada por enfriamiento (CCD) Spot Imaging Solutions.

Natick. ER o PR. Cada punto de datos en la sección "Resultados" representa la media ± desviación estándar (SD) de las diapositivas por triplicado. son igualmente intensas en color (expresadas en la intensidad media del píxel) que las microperlas estándar de color.17 El algoritmo mide la intensidad de la imagen de las microesferas de prueba en relación con las llantas de microesferas estándar de color. Para los controles de tejido ER y PR.Evitar errores esporádicos ocasionales de segmentación de imágenes mejoró la precisión de la medición de la intensidad de las manchas. Este ajuste no afecta el lectura final porque la intensidad de la tinción se calcula en relación con un estándar óptico interno (la microperlas de intensidad de color). Tufts Medical Center. ya que expresan niveles más bajos de ER y PR que el epitelio glandular. Cuantificación de imagen ER / PR de secciones de tejido La tinción de ER y PR (nuclear) se cuantificó usando un algoritmo personalizado en Image-Pro Premier 9. La intensidad de la mancha de IHControls se expresa como una relación. uno que expresaba HER-2 a un nivel 3+ y otro que expresaba HER-2 a un nivel 1+. . Por consiguiente. como se describió previamente. bajo un protocolo aprobado por el comité de revisión institucional (IRB). como el tiempo de exposición. Rockville. mantuvimos los ajustes de fotomicroscopía constantes dentro de cada experimento. desarrollamos un algoritmo personalizado incrustado en MatLab (MathWorks Corp. Los controles HER-2 estaban compuestos por dos carcinomas de mama diferentes.2 (Media Cybernetics. teñidas para HER-2. se obtuvieron bloques de tejido archivados con formalina. Controles tisulares Para ER y PR. embebidos en parafina (FFPE) del Biorepositorio de Tejidos del Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio. IHControls cuantificación o estadificacion de la intensidad de la tinción Para promover la coherencia. Esto incluye los ajustes ópticos. se usó endometrio uterino normal. La intensidad de color de cada diapositiva se midió promediando tres imágenes por punto (diapositiva). y la configuración de la cámara. Un puntaje ≥1 representa una fuerte intensidad de mancha. No se usaron imágenes de diapositivas enteras. Para la cuantificación de la intensidad de la mancha IHControls. Una puntuación de 1.0 significa que las microesferas de prueba. como el condensador y las aperturas de iluminación. MD). Medimos solo las células estromales. MA).

usando una serie de diferentes imágenes de varias intensidades. inicialmente intentamos aplicar un algoritmo de imagen más sofisticado que aprovechaba la contratinción de hematoxilina (para núcleos sin teñir). Entre paréntesis. utilizando un vector de color para el color marrón de la diaminobenzidina (DAB). las intensidades de tinción más oscuras tenían números más bajos.8. encontramos que esto no afectó materialmente los datos. Antes de usar este algoritmo en estos experimentos. Un número de canal de umbral se identificó manualmente en este histograma que incluía núcleos inmunoteñidos pero no otros elementos no teñidos en la imagen. Todos los ajustes del umbral de segmentación de imágenes que parecían razonables para esas imágenes tenues manchadas produjeron números similarmente bajos. adoptamos el algoritmo antes mencionado que no incorporó la hematoxilina como un factor para la segmentación de imágenes. Sin embargo. . segmentamos los núcleos teñidos de otros elementos de imagen en virtud del grado de tinción marrón. la determinación del umbral más apropiado con un número de canal preciso era impreciso. identificando los núcleos sin teñir. En otras palabras. lo validamos contra el puntaje interpretativo proporcionado por un panel de observadores. En esta escala inicial. Se encontró que el algoritmo de segmentación de imagen de un solo color (marrón) era confiable.Para cuantificar la intensidad de la mancha ER y PR. Cuando los puntajes de cuantificación de imagen se representaron gráficamente frente a las puntuaciones de consenso del panel. Inicialmente esperábamos que la contratinción ayudaría a segmentar las imágenes. Por esta razón. de modo que las intensidades de tinción más oscuras tendrán números más altos y las intensidades de tinción débiles tendrán números más bajos. confundiendo el análisis. en una escala de 0 a 255. medimos la intensidad media de píxeles de esos píxeles. La prueba de validación se repitió en varios experimentos diferentes. Luego restamos la intensidad media de píxeles de 255. primero se aplicó un algoritmo de deconvolución del color a la imagen. Después de la segmentación de los núcleos de imágenes. hubo una fuerte correlación positiva con pendientes de 0. La segmentación apropiada de la imagen se verificó mediante inspección visual. Encontramos que esta escala es más intuitiva.92 a 1. encontramos una variabilidad sustancial en la contratinción de diferentes fabricantes. De todos modos. al menos cuando se usaba con el control de tejido ER / PR (endometrio uterino). El vector de color formaba parte de una subrutina en el software Image- Pro Premier. Con una inmunotinción muy débil o ausente. La intensidad del color de los píxeles de la imagen se trazó en un histograma. La precisión del algoritmo estrechamente alineada con el panel.

PR 16. Pacheco. La desparafinación y la recuperación de antígenos se realizaron en el instrumento usando los reactivos y protocolos del fabricante. realizamos la prueba en un instrumento Bond III. Tinción inmunohistoquímica La tinción de IHC se realizó utilizando tres inmunotincadores automáticos diferentes. Usamos la puntuación de intensidad de la imagen del programa.90. expresada en una escala relativa de 0 a 10. Para inmunotinciones que usan anticuerpos HER-2. CA). creemos que el algoritmo de medición de la intensidad de las manchas nucleares ER / PR es preciso y preciso. El anticuerpo PR 636 se adquirió por separado de Dako y se acopló con el sistema de detección de kit ER / PR PharmDx. Para las inmunotinciones que usan anticuerpos suministrados por Leica Corp. la recuperación de antígeno se realizó en un baño de agua de 97 ° C a 98 ° C durante 40 min. se usó un Dako Autostainer (Dako Corporation. Los portaobjetos se hornearon inicialmente a aproximadamente 57 ° C a 60 ° C durante 40 min. CA). y Anticuerpos HER-2 CB11 con los reactivos de detección del kit. Usamos el Leica ER 6F11. Por estas razones.Los coeficientes de correlación (R2) fueron> 0. se desparafinaron en xileno y luego se hidrataron en grados decrecientes de etanol. y se tiñeron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. ER o PR suministrados por Dako Corp. Estas inmunotinciones incluyen HercepTest. Carpinteria. . IL). se siguieron los reactivos. según las instrucciones del fabricante. los portaobjetos se procesaron durante 25 minutos en una olla a presión de la Cámara médica de Biocare (Biocare Medical. Carpinteria. La recuperación de antígenos se realizó utilizando las soluciones de recuperación de antígenos de Dako provistas con los kits HER-2 o ER / PR. Bethesda.17 El algoritmo incluye la segmentación de color para distinguir el color marrón asociado con DAB del color azul asociado con la tinción de contraste de hematoxilina. Para la recuperación de antígeno de ER / PR. HER-2 Cuantificación de imagen de las secciones de tejido La intensidad de la tinción para HER-2 (secciones de tejido) se midió utilizando ImageJ (Institutos Nacionales de Salud [NIH].19 El programa está disponible libremente. MD) con el plugin ImmunoMembrane./Agilent. Los kits HER-2 y ER / PR PharmDx (Dako / Agilent Technologies. Para todos los pasos posteriores. PR 1294 y ER 1D5 / 2-123. Los portaobjetos se cocieron a 60 ° C a 62 ° C durante 20 a 30 min. CA) se venden con soluciones y reactivos prediluidos. en tres sitios separados. tampones e instrucciones del fabricante. (Leica Biosystems. Los datos de precisión en múltiples experimentos arrojaron coeficientes de variación (CV) que van del 6% al 12%. Para HER-2. Buffalo Grove. PR 636. Anteriormente describimos detalles de su uso.

D. y anticuerpos HER-2 4B5 acoplados con los reactivos de detección del kit. La desparafinación y la recuperación de antígenos se realizaron en el instrumento. Le pedimos a los patólogos que aprobaran o fallaran cada una de las diapositivas numeradas. Como cada grupo experimental está compuesto por portaobjetos por triplicado. El objetivo de la evaluación de los patólogos fue comparar el análisis de imagen (objetivo) con el puntaje manual (subjetivo). realizamos la prueba en un Benchmark XT. según el protocolo habitual para ese laboratorio clínico de IHC. para simular la degradación del reactivo. los portaobjetos se retiraron de los instrumentos.G. . MA). Se le pidió a cada patólogo que revisara primero las diapositivas iniciales. cada dilución) en la evaluación del patólogo también se evaluó por triplicado.. Si. Estas muestras no se hornearon. entonces debería pasar. los anticuerpos se diluyeron en solución salina tamponada con Tris 10 mM (TBS) / 0.34%. Después de que cada uno de los cuatro patólogos revisó el primer conjunto de diapositivas.). Los portaobjetos se cubrieron con una etiqueta adhesiva de 3x1 pulgadas. relacionado con un tipo de control (por ejemplo. a pH 7.C. seguidas de las diapositivas desconocidas. cada grupo experimental (es decir. un control IH). PR 1E2.N.05% ProClin.G. Brij-35 / 0. por el contrario. Inc.05% Tween20 / 0. de modo que solo un solo control era visible en cada diapositiva. M. Evaluación de Controles de los Patólogos Los portaobjetos asociados con las inmunotinciones HercepTest y PR 1294 también fueron evaluados por cuatro patólogos (S. El grupo no diluido representa el anticuerpo primario del fabricante que se proporciona a la concentración recomendada.Para las inmunotinciones que usan anticuerpos suministrados por Ventana Medical / Roche Corp. Se creó un pequeño orificio en la etiqueta. Si la intensidad de la mancha del control (en la diapositiva numerada) es indistinguible de la del control de la línea de base. A los patólogos también se les proporcionó tres diapositivas que muestran el nivel normal ("base") de la intensidad de la tinción para el control particular que se evalúa. utilizando las soluciones y los protocolos del fabricante. y K.P. Tucson.. se cambiaron todas las etiquetas. Waltham. Al diluir anticuerpos primarios. entonces debería fallar.6. Usamos Ventana ER SP1.. Estas diapositivas iniciales demostraron el nivel esperado de intensidad de la mancha si la mancha funciona correctamente. (Ventana Medical Systems. el control tiene una intensidad de tinción visiblemente menor en relación con el control de línea de base. AZ). Al final de cada protocolo de inmunotinción. se sumergieron en xileno y se cubrieron con cubreobjetos usando Permount (Thermo Fisher Corp. J. Las diapositivas se codificaron con un número aleatorio y se organizaron en un orden aleatorio. se deshidrataron a través de grados crecientes de etanol.

suministro incorrecto de reactivo. 1B. Para cuantificar un único punto de control IH. cada uno en una diapositiva separada.). calculamos la intensidad media de la mancha por mancha (diapositiva). . 5B y 5E representan la media ± SD de tres puntos separados de IHControl. esta vez revelando un control diferente (por ejemplo. el resultado es la misma disminución en la intensidad de la tinción. tiempos o temperaturas incorrectos. En este estudio. la dilución y una interacción entre el grupo y la dilución. Esto es análogo al muestreo de tres campos del carcinoma de mama de un paciente para evaluación de HER-2 o ER / PR. un control de tejido) en la misma diapositiva. La sensibilidad de los controles se define como su capacidad para identificar aberraciones en la inmunotinción. Análisis estadístico Cada punto de datos representa la media ± desviación estándar de las diapositivas por triplicado. Para estimar estos parámetros. Independientemente de la aberración de inmunotinción específica (reactivos degradados. El término de interacción nos permite probar la significación estadística de las diferencias entre las pendientes para los tres grupos. etc. Los datos para las Figs. Curvas de regresión en las Figs. La degradación del anticuerpo primario se simula por dilución. 5C y 5F representan la media de dos campos microscópicos separados. Este proceso se repitió hasta que todas las evaluaciones se completaron. Los patólogos evaluaron solo un control de IHC durante cada ronda para que la apariencia de uno no influya en la interpretación de otro en la misma diapositiva. Cada diapositiva lleva un punto IHControl que contiene aproximadamente 5000 microperlas recubiertas de analito. en la que se evaluó un control de tejido. hemos muestreado tres áreas microscópicas diferentes. simulamos una de estas aberraciones. el modelo de regresión incluye covariables para el grupo. 1C. 1 y 5 se calcularon usando la herramienta de regresión lineal de Excel (método de cuadrados mínimos). De estos tres campos.Se aplicaron nuevas etiquetas a la diapositiva. Se realizó otra ronda de revisión. Por lo tanto. expresamos la sensibilidad de los controles de inmunotinción como el grupoespecífico pendiente de la línea de regresión para la intensidad de la mancha frente a la dilución. Cada punto de datos en las Figs.

receptor del factor de crecimiento epidérmico humano tipo II. La concentración de HER-2 (eje x) se expresa en unidades de moléculas por microperlas. trazables a unidades de MEF.Figura 1. moléculas de fluorocromo equivalente. Cada punto de datos es la media ± DE de las láminas por triplicado. MEF. La velocidad de disminución de la intensidad de la tinción es evidente a medida que la pendiente de las líneas de regresión. Abreviaturas: HER-2. (A) Curva de respuesta de HercepTest con IHControls. (C) Representación gráfica de la intensidad de la tinción de control de la sección tisular después de las mismas diluciones de anticuerpos primarios. es decir. Los controles de tejido y IHControls están montados en la misma diapositiva. . tres réplicas de tinción independientes. que correlaciona la intensidad de la tinción inmunohistoquímica (eje y) en función de la concentración de HER-2 (eje x). (B) Representación gráfica de la intensidad de la tinción de IHControls después de diluir el anticuerpo primario HercepTest por el factor indicado en el eje x.

como se explica en la sección "Materiales y métodos" y se publicó anteriormente. protocolo o condiciones que producen atípicamente (baja) intensidad de la mancha Para medir la sensibilidad. utilizando IHControls y controles de tejido. de aproximadamente 100 a 1. ER o PR. colocamos uno o dos controles de tejido en la misma diapositiva que IHControls (consulte la sección "Materiales y métodos"). La concentración de HER-2 se puede rastrear a unidades estandarizadas de MEF. Las concentraciones de HER-2. como se describió previamente. una dilución 1: 2 simula una degradación del 50% de la eficacia del anticuerpo. Datos representativos (para HercepTest) se muestran en la Fig. . 1. Por ejemplo.000 de moléculas por microperlas. medimos y comparamos la sensibilidad de varios controles de inmunotinción. La concentración de HER-2 se representa gráficamente en el eje x. simulamos la degradación primaria de anticuerpos diluyéndola (ver la sección "Materiales y métodos"). Los IHControls están disponibles en una amplia gama de concentraciones de HER-2. La Figura 1A representa la curva de respuesta analítica para la tinción HercepTest en un rango de tres niveles de concentraciones de HER-2 usando IHControls.Resultados Evaluación de la sensibilidad de control de inmunotinción En esta investigación. expresada en moléculas por microperlas. los controles de tejido y los controles IH se vieron expuestos al mismo tratamiento de tinción. medida por análisis de imágenes (ver la sección "Materiales y Métodos"). Para todos estos experimentos. Definimos la "sensibilidad" de un control positivo en términos de su capacidad para revelar una anormalidad en los reactivos. Al estar en la misma diapositiva. Posteriormente. Por lo tanto. ilustramos la curva de respuesta analítica de cada inmunosuero junto con los datos de sensibilidad. Un control que muestra una tinción medible más débil a una dilución 1: 2 es más sensible que un control que requiere una dilución 1: 4 para mostrar una intensidad de tinción débil similar. la intensidad de la tinción se cuantificó mediante análisis de imágenes (ver la sección "Materiales y métodos"). ER o PR en los controles de tejido no se conocen. Análisis de sensibilidad HER-2 (HercepTest) con IHControls Nuestros datos demuestran que la sensibilidad de un control positivo de IHC depende de la concentración del analito y de dónde cae esa concentración en la curva de respuesta analítica de la inmunotinción. ER y PR comerciales. El eje y de la Fig. 1A representa la intensidad de la tinción. La intensidad de la mancha de IHControl (en el eje y) se expresa como una relación (consulte la sección "Materiales y métodos").000. El análisis cuantitativo se realizó usando todos los principales anticuerpos HER-2.

Como se esperaba. dependiendo de sus concentraciones de HER-2. con concentraciones de HER-2 de 1. 1B. sus intensidades de tinción son similares. IHControls o una muestra de paciente en cualquier parte de esta región de la meseta se manchará al mismo nivel máximo. línea roja). dependiendo de la concentración de HER-2. Los diversos HER-2 IHControles (cada uno con diferentes concentraciones) se grafican como curvas separadas en la Fig. La Figura 1B ilustra el efecto de la dilución del anticuerpo primario (eje x) sobre la intensidad de la tinción (eje y).086. Muestra una tasa de disminución mucho más lenta en la intensidad de la tinción (a medida que se diluye el anticuerpo primario) en comparación con las moléculas 8187 HER-2 por microperlas IHControl (Fig. es el más sensible para detectar grados sutiles de falla de reactivo de anticuerpo primario. es el menos sensible para detectar la degradación del reactivo. Sin embargo. Por lo tanto. . línea púrpura). Luego buscamos identificar la concentración óptima de HER-2 IHControl que detectaría con mayor sensibilidad la dilución del reactivo del anticuerpo primario (HER-2). La Figura 1A también ilustra que las muestras con concentraciones de HER-2 entre aproximadamente 1000 y 10. en la porción de meseta de la curva de respuesta analítica (Fig. 1B. El IHControl con la concentración más alta de HER-2.000 moléculas (MEF) por microperlas producen una intensidad de tinción variable. y la tasa más rápida de disminución de la intensidad de la tinción a medida que se diluye el anticuerpo primario. dilución de 0). 1B. Aunque sus concentraciones son más que un logaritmo diferente. 1B.La Figura 1A ilustra que los dos IHControls más altos.658 y 77. se encuentran en la meseta de respuesta analítica. Produce una intensidad de tinción alta en condiciones de tinción normales (es decir. Las diluciones de anticuerpos primarios HercepTest se grafican en el eje x de la Fig. la dilución del anticuerpo primario HercepTest da como resultado una intensidad de tinción más débil. Las moléculas 8187 HER-2 por microperlas IHControl son las más cercanas a la porción dependiente de la concentración de la curva de respuesta analítica. La intensidad de la mancha en esta porción de la curva depende de la concentración.913 moléculas (MEF) por microperlas. existen diferencias significativas entre los diversos IHControls.

La Figura 2A ilustra la apariencia en condiciones normales. La Figura 2B y C ilustran la inmunotinción representativa con el anticuerpo primario indicado dilución. después de la inmunotinción con HercepTest en diversas diluciones de anticuerpos primarios. moléculas de fluorocromo equivalente. S1 se muestra un conjunto similar de imágenes con una exposición fotomicrográfica ligeramente más corta. Barra de escala 10 μm. . Las fotomicrografías también ilustran las microperlas de color estándar más pequeñas a las que se comparan las microperlas de prueba teñidas. receptor del factor de crecimiento epidérmico humano tipo II. no a la tinción.Figura 2. Se destaca un ejemplo de una microperla no teñida que contiene un analito antigénicamente irrelevante. Fotomicrografías de IHControls que portan 8187 moléculas (MEF) HER-2. Los contornos de microperlas débiles de las microperlas no teñidas se deben a la refracción de la luz. En la Fig. Abreviaturas: MEF. sin dilución de reactivo de anticuerpo primario. HER-2. Se destacan los ejemplos de una microperla teñida que lleva HER-2 y una microperla de color estándar.

En tales puntajes de baja intensidad.913 IHControl (pendiente : -0. La pendiente estimada para la intensidad de la tinción (para cada duplicación de la dilución) para el grupo 8187 IHControl (pendiente: -0.08. La razón principal del error es que el programa de análisis de imágenes ImmunoMembrane no puede expresar las puntuaciones de intensidad tisular en números fraccionarios menores que 1. la intensidad de la tinción disminuye progresivamente con diluciones crecientes hasta que no hay tinción detectable en un anticuerpo primario a 1:32 dilución de reactivo Este perfil de curva de dilución se compara más estrechamente con el grupo IHControl 8187 moléculas (Fig. Comparamos cuantitativamente las sensibilidades de los diversos IHControles comprobando si las pendientes de las líneas de regresión difieren significativamente para los tres grupos IHControls. La intensidad de la tinción tisular se mide con el complemento ImmunoMembrane utilizando ImageJ y se expresa en una escala numérica relativa de 0 a 10 (consulte la sección "Materiales y métodos"). los IHControls que tienen concentraciones de antígeno en las mesetas de la curva de respuesta analítica son menos sensibles.19 a -0. La curva de dilución de control de tejido 1+ HER-2 es difícil de cuantificar porque los números de intensidad de la tinción son muy bajos. 1B. se requieren mayores diluciones de reactivos de anticuerpos primarios antes de que la intensidad de la tinción disminuya.En resumen. IC del 95%: -0.11. 1B pero para los controles de sección de tejido que expresan niveles bajos (1+) y altos (3+) de HER-2. p = 0. las concentraciones de HER-2 en estas secciones de tejido tumoral son desconocidas.15. que a su vez es menor que el grupo 1. A diferencia de IHControls. Figura 1C demuestra que para el control 3+.24.28 a -0. Los controles que tienen concentraciones de analito en o cerca de la región dependiente de la concentración son los más sensibles.086.005).015). p = 0. línea púrpura). Análisis de sensibilidad HER-2 (HercepTest) utilizando controles de tejido La Figura 1C ilustra la misma curva de intensidad de la tinción que en la Fig. Estos datos demuestran una aumento progresivo de la sensibilidad a medida que la concentración de HER-2 cayó más cerca de la región dependiente de la concentración de la curva de respuesta analítica.658 IHControl (pendiente: - 0. el error de medición es más significativo (como un porcentaje). IC del 95%: -0. En consecuencia. aunque la intensidad de la tinción en la dilución 1: 2 es subjetivamente más débil . los controles son progresivamente menos sensibles. A medida que la concentración del analito aumenta a lo largo de la región de la meseta.20) es estadísticamente significativamente menor que el grupo 77.03.12 a -0. intervalo de confianza [IC] del 95%: -0.

los puntajes registrarse como 1. Serie sucesiva . Por ejemplo. Las microperlas recubiertas con HER-2 se tiñen fuertemente en el grupo de anticuerpo no diluido (figura 2A). mientras que la otra mitad se registró como puntuación de 1. respectivamente.que el grupo de anticuerpos primarios no diluidos. Imágenes fotomicroscópicas representativas: IHControls and Tissue Controls Las Figuras 2 y 3 representan imágenes representativas del conjunto de datos asociado con la Fig. se calcula que el grupo de dilución 1: 4 tiene una intensidad de tinción de 0.5 porque la mitad de los campos de imagen no tenían tinción detectable. 1B y C. La Figura 2 ilustra la apariencia del 8187 IHControl en tres diluciones de anticuerpos primarios diferentes.

Fotomicrografías de inmunotinción de control tisular con HercepTest después de las diluciones de anticuerpos primarios indicadas. . Los paneles D a F son del control tisular HER-2 bajo (1+). Los paneles A a C son del control del tejido del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano tipo II (HER-2) alto (3+). Las imágenes elegidas para la ilustración se seleccionaron como representativas de las diluciones que muestran los extremos de la tinción y una dilución intermedia.Figura 3. Barra de escala 10 μm. Estas diluciones difieren para los controles de tejido 3+ y 1+. Estas imágenes son ejemplos representativos del conjunto de datos asociados con la figura 1C.