You are on page 1of 159

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS


DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Trabajo de Tesis Doctoral

Estudios de biocompatibilidad de
polímeros sintéticos y su aplicación
en Ingeniería de tejido óseo.

Lic. en Bioquímica Fernández Juan Manuel

Directora: Dra. Cortizo Ana María


Co-Directora: Dra. Cortizo María Susana

2011
El presente trabajo desarrollado bajo la Dirección de la Dra. Ana M.
Cortizo y la Codirección de la Dra. M. Susana Cortizo, en el GIOMM (Grupo de
Investigación en Osteopatías y Metabolismo Mineral) y en el Grupo
Macromoléculas del INIFTA, constituye la Tesis Doctoral que elevo a
consideración de las autoridades correspondientes, para optar al grado de
Doctor de la Facultad de Ciencias Exactas, Facultad de Ciencias Exactas,
Universidad Nacional de La Plata.

La Plata, noviembre de 2011.


Resumen de Tesis Doctoral.

El tejido óseo es el único capaz El objetivo de este trabajo fue

de repararse por sí mismo sin dejar obtener y caracterizar diversas

cicatrices. Sin embargo, existen matrices (utilizando polímeros

algunas afecciones, como las sintéticos e hidroxiapatita) para

grandes fracturas o las fabricar implantes que ayuden en la

osteonecrosis, en las que el tejido reparación del tejido óseo.

óseo no puede repararse. A lo largo


Para cumplir con tales
de la historia de la humanidad, se
objetivos, se desarrollaron y
han diseñado distintas estrategias
caracterizaron membranas de los
para reparar el hueso dañado. Las
polímeros poli--caprolactona (PCL)
terapias usadas en la actualidad,
y poli fumarato de di-isopropilo
como los injertos o implantes, tienen
(PFIP). Además, se preparó una
varias desventajas, como la baja
membrana a partir de la mezcla de
disponibilidad de dadores de
ambos polímeros. Esta mezcla de
injertos, problemas de
homopolímeros fue estabilizada
osteointegracion de implantes y los
mediante aplicación de ultrasonido,
grandes costos en el sistema de
para obtener un mejor material.
salud. Para subsanar estos
Dicha mezcla mostró tener una
problemas nace Ingeniería de Tejido
buena biocompatibilidad respecto a
Óseo (ITO). El objetivo de esta
las membranas de ambos
disciplina es obtener sustitutos que
homopolímeros.
restauren, mantengan o mejoren la
La hidroxiapatita (HAP) fue
función del tejido.
obtenida a partir de la incineración
Para lograr tal objetivo, la ITO
de hueso bovino en nuestro
utiliza principios de varias
laboratorio. Se obtuvo una HAP con
disciplinas, como la Ingeniería, la

Biología y la Medicina.
1% de impureza en carbonato de tóxicas durante los tiempos

calcio. estudiados.

La incorporación de esta HAP Finalmente, se prepararon

a las membranas de los polímeros membranas porosas de la mezcla

mejoró significativamente tanto las compatibilizada, utilizando un

propiedades mecánicas como la equipo de electrospray. El material

biocompatibilidad, utilizando para poroso ha mejorado sustancialmente

su evaluación dos tipos de células la biocompatibilidad respecto de la

osteoblásticas: MC3T3E1 y UMR membrana no porosa.

106.
Todos estos resultados

Mediante ensayos in vitro demuestran que los materiales

utilizando células de macrófagos obtenidos y estudiados podrian ser

(RAW 264.7) se demostró que las aplicados en la reparación de tejido

membranas con y sin HAP no son óseo.


A mis padres,
por sus grandes esfuerzos en mi educación y crianza y por tanto cariño.

A Naty,
por su incalculable paciencia y amor
e incondicional y constante apoyo.

A Juan Santino Fernández,


por mostrarme otra forma de vivir la vida.

“Hasta mi último aliento siempre estarás en mis recuerdos…”


Rubén D Sequera
Esta Tesis Doctoral es el resultado de varios años de constante trabajo y
estudio, en los cuales he encontrado gente de grandes valores que me han
brindado su apoyo, compañía y conocimiento. Por esto, quisiera expresar mi
má profundo agradecimiento a todos los que, de alguna forma u otra, me han
ayudado a llevar a cabo mi trabajo.

En primer lugar, a la Dra. Ana Cortizo y a la Dra. Susana Cortizo (Directora y


Co-Directora de mi tesis, respectivamente) no solo por ser las guías de esta tesis,
y abrirme las puertas de sus grupos de trabajo, brindandome la oportunidad de
crecer, sino también por sus constantes palabras de apoyo.

Agradezco también a: Fernando Amarilla, Carla Berghoff, Marcos Coustet,


Juan Giussi, Tamara Oberti, Magali Pasqualone, Adolfo Pesce del Grupo
Macromoléculas del INIFTA y a Verónica Arnol, Gimena Correa, Sara
Chuguransky, Virginia Gangoiti, Juan Ignacio Felice, Antonio McCarthy, Silvina
Molinuevo, Maria L. Sbaraglini y Maria J. Tolosa del GIOMM de la facultad de Cs.
Exactas. Todos ellos han sido grandes compañeros y de cada uno he aprendido
algo.

A la Dra. Monica Mele, por permitirme usar el microscopio de


fluorescencia.

Al Dr. Javier Amalvi y al Dr. Pablo Peruzzo, por ayudarme a realizar las
pruebas de PFIP y WCA.

A la facultad de Ciencias Exactas, U.N.L.P, por brindarme un espacio.

A todo el personal del INIFTA.

A los compañeros de la cátedra de Bioquímica Patológica de la carrera Lic.


en Bioquímica de la Facultad de Cs. Exactas, U.N.L.P.

A la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (Agencia) y


al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) por
financiar mis estudios.

“Muchas veces al día me doy cuenta de la gran cantidad de mi vida interior y exterior que se
construyen con base en el trabajo de mis colegas tanto de los vivos como de los muertos, y de
que tan intensamente debo esforzarme para poder devolverles lo mucho que he recibido”
Albert Einstein
Índice.
Capít ulo 1: Introducción 1
1.-Tejido Óseo 2
1.1.-Introducción 2
1.2.-Composición 2
1.2.1.-Componentes Inorgánicos 3
1.2.2.-Componentes Orgánicos 3
1.2.3.-Células Óseas 6
1.2.3.1.-Células Mesenq uimáticas 6
1.2.3.2.-Osteoblastos 7
1.2.3.3.-Osteocitos 8
1.2.3.4.-Osteoclastos 8
1.3.-Organización Ósea 9
1.4.-Embriología Ósea 12
1.4.1.-Osificació n Intramembranosa 12
1.4.2.-Osificació n Endocondreal 12
1.5.-Remodelado Óseo 15
1.6.-Modelado Óseo 20
1.7.-Reparación ósea 20
2.-Ingeniería de Tejido Óseo 22
2.1.-Introducción 22
2.2.-Terapias act uales 23
2.2.1.-Metales y Cerámicas 23
2.2.2.-Injertos 23
2.3.-Epidemiología 25
2.4.-Ingeniería de Tejido Óseo 27
2.4.1.- Matriz tridimensional (3D) 29
2.4.1.1.-Requisitos 29
2.4.1.1.1.-Biocompatibilidad 29
2.4.1.1.2.-Porosidad 30
2.4.1.1.3.-Tamaño de poro 30
2.4.1.1.4.-Biodegradabilidad 30
2.4.1.1.5.-Propiedades Mecánicas 31
2.4.1.1.6.-Osteoinduccio n 32
2.4.1.1.7.-Factibilidad 32
2.4.1.2.-Materiales 32
2.4.1.2.1.-Cerámicas 32
2.4.1.2.2.-Vidrios bioactivos 33
2.4.1.2.3.-Polímeros 33
2.4.1.2.4.- Composites 34
2.4.1.3.-Células 34
2.4.1.4.-Factores de crecimiento 35

Capít ulo 2: Hipótesis y Objetivo 41


1.-Hipótesis 42
2.-Objetivo 42

Capít ulo 3: Materiales y Métodos 44


1.-Matrices poliméricas 45
1.1.-Materiales 45
1.2.-Obtención de PFIP 45
1.3.-Obtención de la Mezcla PCL-PFIP compatibilizada 46
1.3.1.-Obtencio n de membranas porosas 46
1.4.-Obtención de Hidroxiapatita 47
1.5.-Modificació n de las partículas de Hidroxiapatita 48
1.6.-Preparación de las pelíc ulas de polímero 48
1.7.-Evaluación de la distribució n de las HAP en las Matrices 49
poliméricas
2.-Estudios in Vitro 49
2.1.-Cultivo Celular 49
2.1.1.-MC3T3-E1 (ATCC CRL 2593) 50
2.1.2.-UMR-106 (ATCC CRL 1661) 50
2.1.3.-RAW 264.7 (ATCC TIB-71) 50
2.2.-Adhesión y Proliferació n 51
2.3.-Actividad de la enzima Fosfatasa Alcalina (ALP) 52
2.4.-Produccio n de Colágeno tipo 1 (COL t1) 52
2.5.-Producció n de proteínas totales 53
2.6.-Diferenciación de las células MC3T3-E1 53
2.6.1.-Expresión de RUNX-2 54
2.7.-Inmunofluo rescencia para fibras de Actina 55
2.8.-Producció n de Oxido Nítrico (NO) 55
2.9.-Producció n de Citoquinas 56
3.-Degradación 57
4.-Propiedades Mecánicas 58
5.-Tensión Superficial 59
6.-Análisis Estadístico 60
7.-Equipamiento 60

Capít ulo 4: Resultados 62


1.-Obtenció n de las membranas PCL y PFIP 63
1.1.-Caracterizació n 63
1.2.-Biocompatibilidad 65
1.2.1.-Adhesió n y Proliferación 65
1.2.1.1.-Células UMR-106 65
1.2.1.2.-Células MC3T3-E1 67
2.-Obtenció n de Mezcla Compatibilizada 68
2.1.-Degradación de los Homopolímeros y de la Mezcla 69
2.2.-Caracterizació n 72
2.2.1.-Microcopia electrónica 72
2.2.2.-Pruebas Mecánicas 73
2.2.3.-Hidrofobicidad/Hidrofilicidad 75
2.3.-Biocompatibilidad 75
2.3.1.-Adhesió n y Proliferación 75
2.3.1.1-Células UMR-106 76
2.3.1.2.-Células MC3T3-E1 78
2.3.2.-Inmunofluo rescencia 79
2.3.3.-Marcadores de diferenciació n osteoblástica 81
3.-Obtenció n de Hidro xiapatita 83
3.1.-Caracterizació n 84
3.2.-Disminución de tamaños de partículas de Hidro xiapatita 85
4.-Obtenció n de películas con Hidroxiapatita 87
4.1.-Caracterizació n 87
4.1.1.-Microscopia Electrónica 87
4.1.2.-Pruebas Mecánica 90
4.1.3.- Hidrofobicidad/Hidrofilicidad 91
4.2.- Biocompatibilidad 92
4.2.1.-Adhesió n y Proliferación 92
4.2.1.1-Células UMR-106 92
4.2.1.2.-Células MC3T3-E1 95
4.2.2-Marcadores osteoblástica 97
4.3.-Degradación 99
5.-Ensayos de Citotoxicidad 101
5.1.-Producció n de Oxido Nítrico (NO) 101
5.2.-Producció n de Citoquinas 102
6.-Membranas Porosas 103
6.1.-Caracterizació n 103
6.2.-Estudios in vitro 104

Capít ulo 5: Discusio nes 108

Capít ulo 6: Conclusio nes 124

Capit ulo 7: Bibliografía 128


Capítulo 1

Introducción

“En el campo de la observación, la oportunidad sólo favorece a la mente preparada…”


Louis Pasteur
Capítulo 1: Introducción.
1. Tejido Óseo desde su desarrollo. Esta

característica le otorga la propiedad


1.1.- Introducción:
de ser el único tejido capaz de
El tejido óseo es un tejido repararse a sí mismo sin dejar
conectivo especializado que forma cicatrices.
el esqueleto1. Este sirve al cuerpo
1.2.- Composición:
con varios propósitos, entre ellos el

de soporte, otorgándole un estructura El hueso esta compuesto por

rígida a los músculos; el de diversas células y por una matriz

movimiento, la inserción de los extracelular, cuyos principales

músculos a los huesos por medio de componentes son Colágeno tipo I,

los tendones permite los Hidroxiapatita y agua [Rizzoli,

movimientos; el de protección, pues 2010]. A pesar de que la

el esqueleto forma cavidades composición del hueso depende de

protegiendo a distintos órganos varios factores (edad, variabilidad

internos y el de homeostasis mineral, genética, efectos ambientales y

pues los huesos sirven como localización del hueso en el

depósito de minerales, esqueleto), en promedio (Figura 1)

fundamentalmente de Ca y P dos tercios de sus componentes

[Duplomb, 2007]. corresponden a la fase mineral y el

resto a la fase orgánica y agua.


El tejido óseo esta sujeto

constantemente al remodelado

1
Esqueleto: deriva del griego que significa
“seco”, debido a que históricamente se creía que
el hueso era un tejido estático, nada mas alejado
de la realidad!

Cap. 1: Introducción. 2
Figura 1: Composición Ósea. Adaptado de Rizzoli, 2010.

1.2.1.- Componentes por los osteoblastos, y tienen un

Inorgánicos: tamaño aproximado de 30 nm, y

conforman una red cristalina


El componente inorgánico,
imperfecta, favoreciendo la
constituyente mayoritario del hueso,
adsorción de iones y su disolución
esta compuesto en un 95 % por
por los osteoclastos. Se depositan
cristales de una apatita análoga de
entre las fibras de colágeno,
la Hidroxiapatita geológica (HAP,
otorgándole rigidez al hueso.
(PO4)6(OH)2Ca10). Esta apatita ósea

es una hidroxiapatita deficiente en 1.2.2.- Componentes

calcio e hidróxido conteniendo Orgánicos:

además un 5 % de impurezas como


El mayor de los componentes
sodio, potasio, estroncio, fluoruros,
orgánicos en el hueso es el colágeno
citratos, carbonatos, pirofosfatos y
tipo 1. Sintetizado por los
cloruros, entre otras [Bigi, 1997;
osteoblastos, esta proteína le
Boskey, 2006; Holden, 1995; Loong,
confiere al hueso resistencia a la
2000]. Estos cristales, producidos
tracción, elasticidad y flexibilidad.

Cap. 1: Introducción. 3
Además, ofrece un sitio adecuado derecha, integrada por tres cadenas

para la nucleación y el crecimiento polipeptídicas llamadas cadenas .

de los cristales de HAP [Rho, 1998;


Cada cadena  está compuesta
Landis, 1993, Cooper, 1998]. Si bien
por una estructura característica
existen varios tipos de colágeno, un
repetitiva a lo largo de la cadena de
95 % del colágeno óseo es del tipo I
tres aminoácidos, “glicina-X-Y”,
mientras que el 5 % restante
donde X e Y son mayormente
corresponde al tipo V.
prolina e hidroxiprolina,

Las moléculas de colágeno respectivamente [Rho, 1998].

están compuestas por una triple

hélice de aproximadamente 1.5 nm

de diámetro con giro hacia la

Figura 2 Esquema de ensamble del Colágeno t I y HAP [adaptado de Rho, 1998]

Además del colágeno tI y de la sialoproteínas, la fibronectina, la

HAP, otras proteínas no colágenas trombospondina, la vitronectina y

forman la matriz extracelular ósea factores de crecimiento [Clarke,

(Tabla 1), como: los Proteoglicanos, 2008; Cooper, 1998; Fernández-

la osteocalcina (OCN), la Tresguerres, 2006; Gundberg, 2003;

osteonectina, la osteopontina, la Reddi, 1997; Salgado, 2004,].

Cap. 1: Introducción. 4
Proteina (Cromosoma) Función
La proteina más abundante en la matriz
tipo I (17q21.23, 7q22.1)
extracelular ósea.

tipo X (6q21) Encontrada en cartílago hipertrófico.


Colágeno
Pequeñas cantidades en los huesos, puede
tipo III (2q31)
regular el diametro del colágeno fibrilar.
tipo V (9q34.2-34.3; Pequeñas cantidades en los huesos, puede
2q24.3-31; 19q13.2) regular el diametro del colágeno fibrilar.
Proteinas de suero en la matriz ósea (4q11-13) Decrease el crecimiento de cristales de HAP
Organicacion de la matriz; retencion de
Agrecano (15q26.1)
calcio y fosforo.
Proteinas que Define el espacio destinado a convertirse en
Versicano (5q14.3)
contienen huesos.
Glicoaminoglicano y Regula el diametro de las fibras de colágeno;
Decorina (12q21.3)
proteinas que union a TGF-.
contienen regones Union a colágeno, union a TGF-;
ricas en leucina Biglicano (Xq28)
determinante genético de masa ósea máxima.
Hialuronano (complejo Puede trabajar con Versicano en definir el
multigenico) espacio destinado a la formacion ósea.
Fosfatasa álcalina (1p36.1- Hidroliza inhibidores de la deposición de
Glicoproteinas p34) minerales.
Osteonectina (5q31.3-32) Regula el diametro de las fibras de colágeno.
Inhibe la mineralizacion y el remodelado
Osteopontina (4q21)
Proteinas SIBLING óseo.
Sialoproteina ósea (4q21) Inicia la mineralización.
MEPE (4q21.1) Regulador del metabolismo del fosfato.
Trombospondinas (15q15,
6q27, 1q21, Adhesion celular.
5q13, 19p13.1)
Glicoproteinas
Fibronectina (2q34) Union a Celulas.
conteniendo RGD-
Vitronectina (17q11) Adhesion celular.
Fibrilina 1 and 2 (15q21.1,
Regula la formacion de fibras elasticas.
5q23-31)
Proteina de matriz Gla
Proteinas que Inhibe mineralizacion.
(12p13.1-p12.3)
contioenen -
Regulador del osteoclasto; inhibe
Carboxy acido Osteocalcina (1q25-q31)
mineralizacion.
glutamico
Producto del hígado, puede ser realizada por
Proteina S (3p11.2)
los osteoblastos.

Tabla 1: principales proteínas constituyentes del matiz extracelular óseo y sus funciones.
Adaptado de Clarke, 2008.

Cap. 1: Introducción. 5
1.2.3.- Células Óseas: regeneración de tejido [Morrison,

2006].
Las células implicadas en el

metabolismo óseo son: Células Las células mesenquimales

Mesenquimales, diferenciándose a (MSC: mesenchymal stem cells), se

Osteoblastos, siendo estas ultimas las pueden diferenciar en distintos

células responsables de la formación linajes [Aubin, 1998; Potier, 2010;

de tejido óseo, Osteocitos y Yin, 2006] celulares como ser los

Osteoclastos (proveniente de la línea osteoblastos, condroblastos,

monocítica) encargados de la adipocitos, miocitos y

reabsorción ósea. cardiomiocitos (figura 3).

1.2.3.1.- Células El factor de trascripción

Mesenquimaticas: Cbfa1/Runx-2 es un factor especifico

para la diferenciación a osteoblastos


Constituyen un tipo de stems
[Komori, 2002], que aumentan la
cells o también llamadas células
expresión de la enzima fosfatasa
progenitoras o troncales. Toda
alcalina (ALP), colágeno tI (COL1),
célula troncal se define por sus
osteopontina (OPN), osteocalcina
características funcionales, que son:
(OCN), sialoproteina ósea (BSP) y la
indiferenciación, auto-
calcificación de la matriz
mantenimiento, producción de
extracelular [Potier, 2010].
progenies indiferenciadas y

Cap. 1: Introducción. 6
Figura 3: [A] potenciales linajes de células en las cuales puede diferenciarse las células stem cells

mesenquimales. [B] principales cascadas de señales involucradas en los distintos potenciales


linajes celulares. [Adaptdo de Potier, 2010].

1.2.3.2.- Osteoblastos: de 25 m de diámetro y una forma

poliédricas. Poseen un citoplasma


Los Osteoblastos son células
altamente basófilo debido a la alta
que se encuentran en la superficie
producción de ARN, un retículo
del tejido óseo, cuya función es
endoplasmatico extenso y un
formar tejido óseo produciendo
aparato de Golgi muy desarrollado,
colágeno tipo I y luego calcificarlo
como evidencia de su gran actividad
[Anderson, 2005]. Se producen a
sintética [Duplomb, 2007; Bielby,
partir de la diferenciación de las
2007].
MSCs, tienen un tamaño promedio

Cap. 1: Introducción. 7
Muestran además, gran citoplasmáticas. Estas

actividad de la enzima fosfatasa prolongaciones se introducen en

alcalina en la membrana canalículos del hueso y mantienen

citoplasmática. Esta enzima contacto con otros osteocitos y con

desempeña un rol clave en la los osteoblastos vecinos, formando

mineralización del hueso [Clarke, una red celular y permitiendo una

2005; Orimo, 2010]. comunicación entre células del seno

del hueso y las que se encuentran en


1.2.3.3.- Osteocitos:
la superficie [Bonewald, 2008]. La
Luego de la formación de
nutrición de estas células depende
hueso, entre un 10% y un 20% de los
de las conexiones entre ellas a través
osteoblastos quedan alojados en el
de los canalículos
seno del hueso y se diferencian
Los osteocitos pueden censar
paulatinamente en Osteocitos
cambios mecánicos y traducirlos en
[Duplomb, 2007; Franz-Odendaal,
señales bioquímicas que actúan
2006].
sobre el hueso. De esta forma la red
Los Osteocitos son las células
de osteocitos puede direccionar la
más abundantes del tejido óseo. Su
remodelación ósea y reparar micro-
población puede llegar al 90% del
fracturas [Burr, 2002; Bonewald,
total de los constituyentes celulares
2006].
[Bozal, 2006; Bonewald, 2008].
1.2.3.4.- Osteoclastos:
Ubicados en las lagunas osteocíticas,

estos son algo más alargados que los Los Osteoclastos son las únicas

osteoblastos, con un núcleo más células conocidas capaces de

grande y con el retículo degradar el hueso. Se originan

endoplasmático algo menos gracias a la fusión de monocitos que

desarrollado. Su citoplasma han debido abandonar la sangre

continúa siendo basófilo, además circulante, y por lo tanto derivan de

tienen prolongaciones las células madres hematopoyéticas

Cap. 1: Introducción. 8
y no de las mesenquimales. Estas le confiere una isotropía mecánicas

células poseen varias características al tejido. En cambio, el hueso

citológicas como ser: gran número laminar se crea sobre el fibrilar,

de mitocondrias y lisosomas, son siendo mas maduro que el anterior,

multinucleadas, y estan altamente formándose a partir del proceso de

polarizadas. Ellas disuelven los remodelación del hueso inmaduro.

cristales de HAP y digieren la Este tipo de hueso se encuentra en

matriz orgánica a partir de la todo el esqueleto maduro tanto en el

secreción de diversas enzimas, entre esponjoso como en el cortical. Todas

las cuales las más importantes son la sus fibras de colágeno se encuentran

proteasas, cuya función es degradar organizadas y orientadas con el eje

y reabsorber el hueso [Duplomb, mayor del hueso. Esto le otorga una

2007]. anisotropía mecaánica al tejido que

muestra una resistencia a la


1.3.- Organización Ósea
deformacion cuando la dirección de
El hueso se puede clasificar
la fuerza es paralela al eje mayor del
según varios puntos de vista. Uno
hueso que cuando se ejerce de otra
de ellos es su grado de madurez,
forma.
distinguiendose el hueso Fibrilar del
Según su estructura, el hueso
Laminar. El hueso fibrilar es aquel
se puede clasificar en esponjoso (o
hueso inmaduro que se encuentra
trabecular) y compacto (o cortical)
en los embriones y recién nacidos,
(figura 4). Estos tipos óseos se
en los callos formados en el período
encuentran en una proporción 1:4
de reparación de las fracturas y en
trabécular:cortical, aunque distintos
las metáfisis en crecimiento. Este
huesos o distintas porciones de un
tipo de hueso se caracteriza por su
mismo hueso, pueden poseer
gran número de células por
distintas relaciones [Clarke, 2008].
volumen y por poseer fibras gruesas

y no orientadas de colágeno tI, que

Cap. 1: Introducción. 9
El hueso trabecular, posee una denso que el trabecular, con una

estructura altamente porosa con una porosidad promedio de 5 % y se

porosidad variable entre 50 y 90 % encuentra en la superficie de los

con sus poros interconectados. El huesos, variando su espesor según

hueso compacto o cortical es más su localización.

Figura 4: Esquema de corte longitudinal de un hueso, mostrando sus componentes. 1.

Lamina circunferencial externa, 2. Lámina intersticial, 3. Lámina circunferencial interna, 4.

Endostio, 5. Trabéculas del hueso esponjoso, 6. Sistema de Havers (a. Canal central, b. Lamina,

c. Laguna del Osteocito, Canalículos), 7. Periostio (a. Capa fibrosa externa, b. Capa osteogénica

interna), 8. Vasos sanguíneos y recubrimiento endostico del canal de Havers, 9. Conducto de

Volkman. [Adaptado de Yokochi, 1991].

El hueso esponjoso consiste en Sistema de Havers. Las paredes de

una serie de trabéculas formadas este sistema estan formadas por

por placas y varillas entre las cuales láminas concéntricas (figuras 4 y 5).

queda contenida la médula ósea. El


El hueso cortical esta limitado
hueso cortical está compuesto por
en su superficie externa, por
una disposición paralela al eje
periostio y en su superficie interior
mayor del hueso de estructuras
por endostio. La actividad celular en
cilíndricas llamadas osteonas o
la superficie del periostio es

Cap. 1: Introducción. 10
importante para el crecimiento adjudicar para su estudio una

aposicional y la reparación de organización jerárquica [Meyers,

fracturas. La superficie del endostio 2008; Rho, 1998; Liebschner, 2003]

tiene una actividad de remodelación cuyo nivel más alto (figura 5) es el

mayor que la superficie perióstica, hueso-órgano. Este se da como

probablemente debido a una mayor resultante de las sumatoria de los

exposición a citoquinas por la niveles constituyentes inferiores,

proximidad de la médula ósea obteniendo así, un hueso funcional,

[Clarke, 2008]. articulando con otros huesos. Los

cambios de estructura en este nivel


Mas allá de la clasificación
son mínimos, produciéndose la
según la estructura macromolecular,
remodelación ósea en los niveles
a la estructura ósea se le puede
inferiores.

Figura 5: niveles jerárquicos de la estructura ósea [adaptado de Rho, 1998].

La figura 5 muestra una nanoscópica hasta una

representación esquemática de los macroscópica. En ella se pueden

constituyentes del tejido óseo, observar la organización y los

abarcando desde una escala sub- niveles jerárquicos de su estructura.

Cap. 1: Introducción. 11
Cada nivel depende de los niveles mineralizan (Figura 6). Durante el

inferiores para contribuir a la crecimiento, el hueso membranoso

arquitectura final de cada hueso. crece por un fenómeno llamado

crecimiento aposicional, el cual


1.4.- Embriología Ósea:
consta de deposito por medio de
No todos los huesos del
osteoblastos de nuevas capas de
esqueleto humano poseen un origen
hueso en la superficie externa,
embrionario común. Hay dos
mientras los osteoclastos absorben
formas de osificación , ellas son2
las capas internas [Morriss-Kay,
osificación intramembranosa y
2001; Ornitz, 2002].
endocondral [Franz-Odendaal, 2006;
1.4.2.- Osificación
Shapiro, 2008].
Endocondreal:
1.4.1.- Osificación
Este tipo de osificación da
Intramembranosa:
lugar a la formación de la mayoría
La osificación
de los huesos del cuerpo (huesos
intramembranosa da lugar a los
cortos y largos, columna vertebral y
huesos planos del cráneo, a parte de
huesos de la base del cráneo)
la mandíbula inferior y a partes de
[Teixeira, 2008]. Si bien estos huesos
las clavículas. Este tipo de
comienzan en la membrana
osificación se origina en membranas
mesenquimática, en lugar de
mesenquimáticas [Franz-Odendaal,
osificarse, la mesénquima pasa a un
2006; Ornitz, 2002; Morriss-Kay,
estadio intermedio el cual produce
2001; Shapiro, 2008].
un cartílago hialino a partir de la
Las células mesenquimáticas diferenciación de las células
en estas membranas se diferencian a mesenquimales en Condrocitos3
osteoblastos, luego elaboran matriz [Kanczler, 2008; Olsen, 2000; Ortega,

extracelular, que posteriormente


3
Condrocitos: células derivadas de células
mesenquimales capaces de generar tejido
2
Osificación: proceso de formación ósea. cartilaginoso.

Cap. 1: Introducción. 12
2004; Shapiro, 2008; Shum, 2002; En los extremos del cartílago se

Teixeira, 2008] formando así, un forman los centros de osificación

molde cartilaginoso del futuro secundaria entre epífisis y diáfisis4,

hueso. En el centro del molde se constituido por una placa de

hipertrofian los condrocitos y crecimiento formada por cartílago.

comienza a calcificarse la matriz, en En ellos se da una secuencia

tanto factores angiogénicos como el coordinada de proliferación de

VEGF (vascular endothelial growth condrocitos, hipertrofia y apoptosis,

factor) inducen la formación de que resulta en un crecimiento

vasos sanguíneos en el pericondrio. longitudinal del hueso (Figura 7).

Estos procesos se encuentran


Con estos vasos vienen los
coordinados con el crecimiento de
osteoblastos, osteoclastos y células
las epífisis y el ensanchamiento de
hematopoyéticas, dando lugar a
las diáfisis. [Kanczler, 2008; Olsen,
centros de osificación primaria.
2000; Ornitz, 2002; Ortega, 2004;
Dentro de estos centros, la matriz de
Shapiro, 2008; Shum, 2002; Teixeira,
cartílago se degrada, los condrocitos
2008; Villemure, 2009].
entran en apoptosis y los

osteoblastos reemplazan la matriz

cartilaginosa por hueso trabecular,

dando espacio también a la

formación de médula ósea.

Al mismo tiempo, los

osteoblastos forman un collar de

hueso compacto en el pericondrio,

alrededor de la parte media del

cartílago, quedando localizado

dentro de un tubo de hueso, el 4


Diáfisis: zona media de los huesos largos.
Epífisis: extremos de los huesos largos.
centro primario de osificación. Metáfisis: zona intermedia entre la diáfisis y la
epífisis.

Cap. 1: Introducción. 13
Figura 6: Esquema del desarrollo óseo endocondreal (A) e intromembranosa (B).

[Adaptado de Ornitz, 2002].

Figura 7: esquema de desarrollo endocondral mostrando centros de osificacion secundaria,

platos de crecimiento, collar óseo. [Adaptado de Kanczler, 2008]

Cap. 1: Introducción. 14
1.5.- Remodelado óseo: pequeñas porciones óseas debido a

la actividad osteoclástica, luego se


El remodelado óseo es un
deposita matriz extracelular, que
proceso que se lleva a cabo en todos
posteriormente se mineraliza debido
los huesos del organismo a lo largo
a la actividad osteoblástica (figura
de toda la vida, demostrando que el
8). En el proceso final, durante la
tejido está muy lejos de ser un tejido
remodelación se reabsorbe hueso
estático.
viejo y luego se forma hueso nuevo.
Los principales objetivos del
El proceso puede reparar
proceso son mantener la fortaleza
microfracturas, evitando su
ósea y la homeostasis mineral. En el
acumulación [Lerner, 2006].
remodelado óseo se reabsorben

Figura 8: Esquema de la remodelación ósea. [Adaptado de Lerner, 2006]

Cada proceso puntual de BMU) [Bain, 1993; Clarke, 2008;

remodelado se lleva a cabo por Krane, 2005].

ciclos secuenciales de activación


La primera fase consta de
osteoclástica- osteoblástica,
reclutamiento y activación (figura 9)
formando una Unidad Multicelular
de los precursores mononucleares
Básica (Basic Multicellular Unit:

Cap. 1: Introducción. 15
de la circulación para formar osteoclastos [Feng, 2011; Lian, 2006].

Figura 9: Regulación de la Osteoclastogenesis. A. Estados de progresión de la

diferenciación osteoclástica mediada por distintos factores. B. Marcadores usados para


determinar fenotipo del linaje osteoclástico. [Adaptado de Lian, 2006]

Los osteoclastos llegan a la Como se ve en las figuras 9 y 10,

superficie del hueso, uniéndose varios factores regulan la actividad

mediante la receptores de integrina de los osteoclastos, tomando un rol

a proteínas de la matriz que central el RANKL (Receptor

contienen la secuencia RGD Activator for Nuclear Factor κ B

(arginina, glicina, ac. aspártico), Ligand) y la OPG

formando una zona sellada entre el (Osteoprotegerina), ambos

hueso y el osteoclasto. Esta etapa producidos por los osteoblastos

dura alrededor de 3 semanas en [Bain, 1993; Boyce, 2008; Clarke

cada ciclo de remodelado [Clarke, 2008; Gallagher, 2010; Lerner, 2006;

2003; Feng, 2011; Zernicke, 2006]. Martin, 1998].

Cap. 1: Introducción. 16
Figura 10: Interacción osteocitos, osteoclastos, osteoblastos en la remodelación ósea. CA
(Anhidrasa Carbonica iso-enzima 2), Cl channel (Canales de Cloro), TRAP (Fosfatasa ácida
tartrato resistente), Trph1 (Triptofano hidrolasa 1), CREB (proteinas respondedora de cAMP
(mono fosfato ciclico de adenosina)), Wnt (familia de factores Wingless), Dkk (Dickkopf-1),
WIF (factor inhibitorio de WNT), sFRP (Proteinas relacionadas a frizzled secretadas), Lrp5/6
(Receptor relacionados a lipoproteinas de baja densidad) [Adaptado de Gallagher, 2010].

Una vez unido el osteoclasto al ácida tartrato-resistente, catepsina

hueso comienza la erosión del K, matriz-metaloproteinasa 9 y

tejido, para ello el osteoclasto libera gelatinasa de lisosomas

H+ mediante bombas de protones citoplásmicos, formando por

ATP-dependientes (H+ ATPasa) con reabsorción las lagunas de Howship

el fin de bajar el pH a 4,5 en el [Clarke, 2003; Zernicke, 2006]

compartimiento de reabsorción para (figura 10).

facilitar la remoción de HAP.


Una vez finalizada la
Además, el osteoclasto libera una
reabsorción, los osteoclastos son
serie de enzimas que degradan la
eliminados mediante apoptosis
matriz extracelular, como fosfatasa
celular.

Cap. 1: Introducción. 17
Luego de la fase de involucra distintos factores como

reabsorción, el remodelado entra en TGF-β (Transforming growth factor

una fase de formación, en la cual los beta), IGF-1 and lGF-2 (Insulin-like

osteoblastos se diferencian a partir growth factor 1 and 2), BMPs (bone

de sus precursores (Figura 11) [Lian, morphogenetic proteins) y PDGF

2006]. Si bien el acoplamiento entre (fibroblast growth factor) [Boyce,

el final de la reabsorción y el 2009; Clarke, 2003; Lerner, 2006;

comienzo de la formación no está Lian, 2006; Martin, 1998].

aclarado, se cree que el mismo

Figura 11: Regulación de la osteoblastogénesis. A. Estados de progresión de la diferenciación

osteoblástica mediada por distintos factores. B. Marcadores de fenotipo de linaje osteoblástico


(colágeno tI, fosfatasa alcalina, sialoproteina ósea, osteopontina y osteocalcina). C. Progresión

de factores de trascripción que regulan la diferenciación. [Adaptado de Lian, 2006].

La formación del hueso dura células osteoblásticas secretan

entre 4 a 5 meses [Clarke, 2003; matriz extracelular y vesículas

Zernicke, 2006]. En este tiempo, las conteniendo altas concentraciones

Cap. 1: Introducción. 18
de Ca+2 y fosfatos para lograr la El proceso de remodelación es

mineralización del colágeno básicamente el mismo [Clarke, 2008;

producido. A medida que crece la Dempster, 2006; Eriksen, 2010;

matriz extracelular y su posterior Steiniche, 2003;] tanto en el hueso

mineralización progresa, algunos cortical como en el trabécular

osteoblastos quedan atrapados en el (Figura 12). En la remodelación del

hueso, diferenciándose a osteocitos, hueso compacto los osteoclastos

formando así una extensa red de excavan túneles de sección circular a

canalículos en los cuales los partir de un canal de Havers o de

osteocitos se conectan entre ellos y Volkmann. Debido a esto, las

con el exterior del hueso [Bozal, osteonas resultan de forma

2006; Franz-Odendaal, 2006]. cilíndrica. En la remodelación del

hueso esponjoso, los osteoclastos


Al finalizar el proceso de
erosionan la superficie de las
formación, un 50-60% de los
trabéculas, produciendo
osteoblastos entran en apoptosis, y
excavaciones poco profundas y de
el resto se convierte en osteocitos o
base ancha. Por esta razón, los sitios
en células que recubren el hueso
remodelados de las trabéculas
(bone-lining cells). Las linning cells
tienen forma de lente plano-convexa
funcionan como una barrera sangre-
[Clarke , 2008].
hueso, pero poseen la capacidad de

re-diferenciarse a osteoblastos

mediante estímulos mecánicos u

hormonales.

Cap. 1: Introducción. 19
Figura 12: Secuencia de remodelación en hueso cortical y trabécular [Adaptado de Dempster,
2006]

Si bien la remodelación se El proceso de modelado se da

produce al azar, existe hay una con el objetivo de adaptar

mayor probabilidad de mecánicamente al hueso a las cargas

remodelación [Martin, 2000; mecánicas alterando la forma del

Zernicke 2006] en lugares con mismo [Bain, 1993; Boskey, 2006;

micro-daños. Boyce, 2008, Clarke, 2008;

Księżopolska‑Orłowska, 2010;
1.6.- Modelado óseo:
Speaker, 2006]
El proceso de modelación se
1.7.- Reparación ósea:
lleva acabo con mayor frecuencia

durante el crecimiento. A diferencia El tejido óseo es el único tejido

del de remodelación, no involucra capaz de repararse a sí mismo desde

un proceso de acoplamiento cíclico el momento en que se produce el

de resorción-formación ósea. Es así daño y sin dejar cicatrices [Brighton,

que la resorción y la formación ósea 1991; Liu, 2010; McKibbin, 1978].

son eventos separados [Speaker,


La reparición de los daños se
2006].
puede dividir en etapas secuenciales

Cap. 1: Introducción. 20
que involucran varios tipos mesenquimales. Si la fractura es

celulares y de factores de mecánicamente estable, las MSCs se

crecimiento. Una primera etapa diferencian a osteoblastos para

involucra una repuesta inflamatoria, regenerar el hueso pero si la fractura

con liberación de distintos tipos de es inestable se diferencia a

citoquinas pro-inflamatorias de condrocitos para formar una capa

manera temporal y espacialmente de colágeno que actúa como puente

regulada durante la primer semana entre los extremos de la fractura,

post injuria como ser IL-1, IL-6 y constituyendose así lo que se conoce

TNF- [Mountziaris, 2008]. Células como callo blando (figura 13). Este

osteoprogenitoras que se es luego calcificado para formar un

encontraban en el sitio de lesión, callo óseo, que luego es remodelado

expresan y liberan proteínas para formar hueso laminar

morfogenéticas óseas (BMPs), que, [Brighton, 1991; Liu, 2010;

junto con la liberación de las McKibbin, 1978, Sikavitsas, 2001].

citoquinas pro-inflamatorias,

reclutan más células

Figura 13: esquema de un callo en una reparación ósea [Adaptado de Brighton, 1991].

Cap. 1: Introducción. 21
quirúrgicamente para reparar los
2. Ingeniería de Tejido Óseo:
huesos dañados [Khan, 2008].
2.1- Introducción:
La utilización de materiales
Si bien el hueso es el único artificiales para realizar prótesis
tejido capaz de reparase a si mismo parece una estrategia muy antigua
sin dejar cicatrices, existe un gran para reponer el miembro dañado. La
numero de situaciones en las cuales Dra Jacqueline Finch [Finch, 2011]
los mecanismos de reparación ósea de la Universidad de Manchester ha
no pueden llevarse a cabo. Ejemplo demostrado que la prótesis más
de ellos son grandes fracturas, antigua es egipcia y data del año
osteonecrosis, tumores o 1.500 a.C. Esta prótesis, realizada a
malformaciones congénitas. En esos base de madera, cuero y lino,
casos, se debe intervenir demostró ser una prótesis funcional.

Figura 14: prótesis egipcia. [Adaptado de Finch, 2011].

Este caso no es el único, en materiales como madera, metales y

1858 se encontró en la ciudad de cuero para producir prótesis (patas

Capua, Italia, una prótesis de una de palo o manos de gancho)

pierna que data del año 300 a.C. prolongándose esta técnica hasta la

hecha de madera, cubierta con primera parte del siglo XX. Debido a

bronce y ataduras de cuero [Finch, la falta de anestesias, las

2011; Thurston, 2007]. Durante la amputaciones producían mucho

Edad Media, se utilizaban dolor, con alto riesgo de

Cap. 1: Introducción. 22
hemorragia, infección y muerte debido a una falta de

[Thurston, 2007]. Con el osteointegracion5. Por otro lado, la

advenimiento de buenas prácticas utilización de placas de osteosíntesis

de medicina, anestésicos, y tornillos hace necesaria una

bactericidas y manejos de materiales segunda intervención quirúrgica

se han desarrollado técnicas que para la extracción de ellos [Estrada,

disminuyen significativamente la 2006].

mortalidad post-quirurgica.
Las cerámicas tienen la

2.2.-Terapias actuales: desventaja de presentar una baja

resistencia a la tensión y de ser


Actualmente, se utilizan
frágiles, por lo que no puede ser
distintas terapias para las diversas
usada en sitios donde se
lesiones óseas. Entre ellas se
manifiestan altos valores de strees.
encuentran la utilización de

diversos materiales e injertos 2.2.2.-Injertos:

[Estrada, 2006].
Los injertos actúan mediante

2.2.1.-Metales y Cerámicas: tres tipos de mecanismos biológicos,

ellos son osteogénesis,


Distintas aleaciones metálicas
osteoconducción y osteoinducción.
se han usado con el fin de producir
La osteogénesis es la capacidad de
prótesis, placas, tornillos y clavos,
generar hueso a partir de las células
pero la utilización de estos metales
contenidas en el injerto y por lo
presentan varias desventajas. Por
tanto depende exclusivamente de la
ejemplo, los implantes metálicos no
supervivencia de las células
pueden cambiar su forma a través
transplantadas. La osteoconducción
del modelado y remodelado óseo
es la capacidad de servir como
para poder adaptarse a las nuevas
molde para la incorporación de
necesidades del cuerpo. Además, las
5
prótesis suelen aflojarse de su sitio Oseointegración (Definido por Per-Ingvar
Branemark): formación de una interfase estable
entre el hueso y el implante metálico.

Cap. 1: Introducción. 23
capilares y células osteoprogenitoras infecciones y costos de las

de la zona receptora. La operaciones. Además la cantidad de

osteoinducción es la capacidad de hueso a que se puede extraer del

reclutar células mesenquimales del sitio dador es limitada.

entorno del implante y de


El segundo tipo es el aloinjerto,
diferenciarlas en osteoblastos
estos son extraídos de cadáveres.
debido a distintos factores de
Este posee la ventaja de no necesitar
crecimiento (TGF-, BMPs, IGF).
abordajes quirúrgicos extras al

Los Injertos se clasifican según paciente y se pueden almacenar.

su procedencia en: autoinjerto, Antes de ser implantados estos

aloinjerto (homólogos), xenoinjerto tejidos deben ser sometidos a una

(heterólogo) y un cuarto grupo serie de tratamientos para evitar

llamado isoinjerto [Benito, 2000; reacciones inmunológicas o la

Estrada, 2006; Valle-Ortiz, 2000]. contaminación cruzada debida a

virus alojados en el tejido a


El autoinjerto suele ser el más
implantar. Estos tratamientos
exitoso de los cuatro debido a que se
incluyen radiación , liofilización,
realiza un transplante desde otro
lavado en ácido y otros tratamientos
sitio esqueletico del mismo paciente.
de tipo químico. Las desventajas son
La clave de su éxito radica en que el
las trasmisiones de enfermedades y
tejido está vivo ya que sus células se
el posible rechazo que ocurren entre
encuentran intactas y no intervienen
un 30-60% de los implantes (Tabla
rechazo ya que no hay reacciones de
2). Los autoinjertos son
naturaleza inmunológicas. Aun así
incorporados más completamente y
posee ciertas desventajas, como una
más rápido que los aloinjertos. Esta
segunda intervención quirúrgica
diferencia se debe a la ausencia de
compleja y costosa para extraer el
respuestas inmunes, ya que esta
material a injertar, aumentando el
respuesta disminuye la
dolor del paciente, el riesgo a

Cap. 1: Introducción. 24
neovascularizacion y retrasa la generalmente es hueso

osteoinduccion. Los injertos desproteinizado y por lo tanto no

xenogenicos son los injertos suele generar reacción inflamatoria.

obtenidos a partir de otras especies,

Tipos de
Mecanismos Desventajas
implantes

Osteoconducción +++

Limitada disponibilidad,
Autoinjerto Osteoinducción +++ Morbilidad de las áreas donadoras,
no se puede almacenar.

Osteogénesis +++

Osteoconducción ++

Transmisión de enfermedades,
Aloinjerto Osteoinducción ++ elaboración costosa, poder
antigénico, lista de espera.

Osteogénesis -

Osteoconducción +++

Posible transmisión de
Xenoinjerto Osteoinducción - enfermedades, elaboración costosa,
no posee osteoinduccion

Osteogénesis -

Tabla 2: tabla comparativa de los tres tipos de injertos.

El isoinjerto es el injerto cuyo diferencias genéticas [Benito, 2000;

donante es genéticamente idéntico Estrada, 2006; Malloy, 2002; Valle-

como se da en hermanos gemelos. Ortiz, 2000].

Aunque puede poseer las ventajas y


2.3.-Epidemiología:
desventajas del autoinjertos, pueden
El impacto de los tratamientos
transmitir enfermedades y algún
en los defectos óseos desde el punto
rechazo debido a pequeñas

Cap. 1: Introducción. 25
de vista clínico y económico es Una disminución en la calidad

sumamente grande [Porter, 2009]. y/o densidad mineral ósea (DMO)

Por ejemplo, en el caso de puede incrementar la incidencia de

artroplatías6 y revisiones de estas, fracturas óseas debido a la

desde el año 1998 al 2005, han osteoporosis, siendo esta la

aumentado de 700.000 a 1.100.000 enfermedad ósea metabólica mas

casos solo en Estados Unidos. En frecuente [Morosano, 2005]. La

2003, se estimaron gastos médicos reparación de dichas fracturas

en más de 20.000.000 de dólares puede verse comprometida cuando

relacionados con las fracturas, co-existen patologías que afectan el

reinserciones y reemplazos de metabolismo óseo. A nivel mundial,

cadera y rodilla, previéndose para el la osteoporosis afecta a más de

año 2015 más de 74.000.000 de 200.000.000 de personas,

dólares. En cuanto a fracturas estimándose que 30-50% de las

traumáticas, en el año 2005 se mujeres post-menopáusicas la

realizaron 8.500.000 visitas médicas desarrollarán, con un consecuente

de las cuales se requirieron aumento en la incidencia de

hospitalización en casi 1.000.000 de fracturas óseas. En Estados Unidos

casos [Porter, 2009]. se producen aproximadamente

6.500.000 de fracturas por año, de las


Nuestro país no esta exento de
cuales se estima que 15% son
estos problemas. Solo en la Clínica
difíciles de sanar [Braddock, 2001].
Güemes, de Luján [Prina, 2009], se

efectuaron entre los años 2005 y En nuestro país se ha estimado

2007 un total de 35 artroplastías por estudios densitométricos sobre

cervicales en 27 pacientes. columna lumbar y cuello femoral,

que en mujeres mayores de 50 años

sólo un 25% poseen DMO normal,


6
La artroplastía consiste en una cirugía
ortopédica que busca reemplazar de forma total mientras que 50% presentan
o parcial la articulación con un implante
artificial.

Cap. 1: Introducción. 26
osteopenia y 25% osteoporosis costos directos e indirectos para la

[Schurman, 2007]. Las fracturas sociedad en su conjunto.

osteoporóticas de mayor prevalencia


2.4.-Ingeniería de Tejido Óseo:
son las fracturas de cadera, columna
Las distintas alternativas que
vertebral y radio distal. En la ciudad
existen como opción en el
de Rosario, en el año 2001 a 2002 se
reemplazo y restauración de tejido
registraron 763 fracturas de caderas
óseo no son eficaces. Los metales
en personas mayores de 50 años de
poseen una baja osteointegracion,
edad, siendo el 75 % de los casos
las cerámicas son frágiles y los
mujeres. Esta incidencia se triplica
injertos poseen distintas desventajas
cuando la edad etárea es 65 en lugar
donde las principales son escasez de
de 50 años.
donantes y rechazo.
Además, se estima que las
En paralelo al aumento de la
incidencias de fracturas de caderas
población global y expectativa de
debido a osteoporosis se
vida, las frecuencias antes descriptas
incrementará en un 100 % hacia el
irán en aumento. En vista de esto es
año 2050 [Morosano, 2005]. Se ha
que nace la Ingeniería de Tejido Óseo
demostrado que para un paciente
(ITO), que fue definida como
que sufre una fractura de cadera,

además del incremento en la “un campo interdisciplinario de


investigación que aplica los principios
mortalidad (20% más alta en el
de la ingeniería y las ciencias de la vida
primer año), existe un importante hacia la tarea de desarrollo de
efecto de dependencia post-fractura: sustitutos biológicos que restauren,
20% requieren cuidados mantengan o mejoren la función del
tejido” [Langer, 1993].
domiciliarios y menos del 50%

retornan a sus actividades En el pasado, cuando una parte

habituales, lo cual genera altos del cuerpo estaba muy

comprometida por algún accidente,

Cap. 1: Introducción. 27
se llegaba a la amputación del esterilización y control de los

miembro afectado. En el presente pacientes durante las intervenciones

(figura 15), gracias a adecuada quirúrgicas, se han desarrollado

selección de materiales y técnicas de transplantes e implantes.

metodologías, así como anestesias,

Evolución

Pasado Presente Futuro

Extirpación Sustitución Tisular Regeneración


Tisular

Ingeniería de
Implantes
tejidos
Transplantes de
Injertos Materiales
Bioactivos

Figura 15: evolución de procedimientos ante una alteración ósea.

material bioactivo forma una unión


El desarrollo se encuentra
interfacial de carbo-hidroxiapatita
centrado los materiales biactivos y
con tejidos adyacentes. El tiempo de
en la Ingeniería de Tejidos. El
unión, la resistencia de la unión, el
termino material bioactivo se suele
mecanismo de unión y el espesor de
aplicar a materiales tales como
la zona de unión difiere según el
cerámicas y bio-vidrios. Estos
material.
proporcionan una respuesta

biológica específica en la interfase La Ingeniería de tejido óseo

del material con el tejido [Barrios de (figura 16), que tiene como misión la

Arena, 2001; Hench, 2002]. Todo regeneración del tejido, utiliza

Cap. 1: Introducción. 28
matrices 3D, también llamados crecimiento [Salgado, 2004].

Scaffolds, células y factores de

Ingeniería de Tejido

Matriz 3D Células Factores de crecimientos

Regeneración
Tisular

Figura 16: Componentes utilizados en Ingeniería de Tejido óseo.

2.4.1.-Matriz 3D: que las variables de cada uno de los

requisitos varían dependiendo en


Tienen como función,
que hueso será utilizado la matriz.
proporcionar apoyo necesario para

que las células proliferen, 2.4.1.1.-Requisitos:

produzcan matriz extracelular y


2.4.1.1.1.-Biocompatibilidad:
vasos sanguíneos y así poder
Es la integración al tejido
regenerar el tejido. Al mismo tiempo
huésped sin presentar efectos
los materiales utilizados debe tener
tóxicos o reacciones inmunes. La
la capacidad de ser reabsorbibles.
biocompatibilidad permite que el
Para esto hay una serie de requisitos
material sea aceptado por el
que se deben cumplir [Chen, 2008;
organismo aun cuando no
Estrada, 2006; Ma, 2004; Salgado,
interactúe con él (o sea, que sirva
2004] para poder así garantizar la
solamente como matriz) y que por lo
regeneración del tejido. Antes de
tanto no haya rechazo del material o
listar los requerimientos, vale decir

Cap. 1: Introducción. 29
de sus productos de degradación Los poros no deben tener

[Estrada, 2006; Hutmacher, 2000; cualquier tamaño, pues si el tamaño

Salgado, 2004]. promedio es chico, habrá un efecto

tapón por parte de las células que


2.4.1.1.2.-Porosidad:
crecen dentro de ellos y disminuye
Los scaffolds deben ser porosos,
la tasa de ingreso de ellas al seno de
siendo estos abiertos e
la matriz, así también como la
interconectados; es decir que todos
limitación de influjo y exflujo de las
los poros, sin importar su ubicación
sustancias. Si son muy grandes
en el scaffolds, deben estar
afectan drasticamente a las
conectados con los poros de la
propiedades mecánicas, así el rango
superficie. Esto es necesario para la
de tamaño debe ser entre 200 y 700
difusión de nutrientes y gases y
m. Tanto la porosidad como el
remoción de desechos metabólicos
tamaño promedio de los poros
como resultado del metabolismo
afectan la osteoconducción de la
celular. Por otro lado, la porosidad
matriz [Burg, 2000; Estrada, 2006;
permite la angiogénesis necesaria
Karageorgiou, 2005; Leong, 2003;
para la regeneración del tejido.
Reswan, 2006; Salgado, 2004].
La porosidad, si bien es muy
2.4.1.1.4.-Biodegradabilidad:
necesaria, influye drásticamente en
Los materiales utilizados deben
otros dos requisitos muy
poseer una tasa de degradación
importantes, estos son las
adecuada. Asi, mientras el tejido
propiedades mecánicas del scaffold y
óseo se regenera, las cargas
la tasa de degradación [Burg, 2000;
producidas sobre el hueso serán
Estrada, 2006; Karageorgiou, 2005;
soportadas por el scaffold, pero éste
Salgado, 2004].
debe degradarse a medida que el
2.4.1.1.3.-Tamaño de poros:
hueso se regenera. Es por esto que la

tasa de degradación debe ser

Cap. 1: Introducción. 30
controlada de forma que cuando el scaffold [Estrada, 2006; Hutmacher,

hueso este regenerado, no haya 2000; Reswan, 2006; Salgado, 2004].

vestigios del scaffolds [Estrada, 2006;


En la figura 17 se puede
Hutmacher, 2000; Reswan, 2006;
observar la diferencia que hay entre
Salgado, 2004].
la resistencia a la compresión y el

2.4.1.1.5.-Propiedades modulo elástico de distintos tipos de

mecánicas: huesos y materiales. Se observa

como estas propiedades son


El scaffold debe tener una
afectadas paralelamente cuando el
adecuada resistencia mecánica para
material posee poros [Estrada, 2006;
garantizar el espacio entre las
Reswan, 2006; Salgado, 2004].
células necesarias para la posterior

formación de la matriz extracelular.

Esta propiedad varia según el tipo

de hueso y del lugar dentro del

mismo hueso donde será colocado el

Figura 17: resistencia a la compresión y el modulo elástico de hueso cortical, trabecular y

distintos materiales utilizados en Ingeniería de Tejido Óseo [Adaptado de Rezwan, 2006]

Cap. 1: Introducción. 31
2.4.1.1.6.-Osteoinduccion: Son compuestos inorgánicos,

no metálicos que presentan


Las matrices deben tener
estructura cristalina. Las más
factores de crecimientos que
utilizadas son las apatitas, siendo la
recluten e induzcan a las MSCs a
mas conocida la hidroxiapatita cuya
diferenciarse a osteoblastos, así
formula es Ca10(PO4)6(OH)2, fosfato
también como factores angiogénicos
tricálcico Ca3(PO4)2 y alumina
[Hutmacher, 2000; Khan, 2008].
(Al2O3).
2.4.1.1.7.-Factibilidad:
Las Apatitas se integran
Un requisito no menor para los
rápidamente al hueso y si bien no
scaffolds debe ser su accesibilidad de
son degradables, se pueden tener
fabricación, con la posibilidad de
apatitas con baja tasa de
darle una arquitectura
degradación dependiendo de los
tridimensional y factible de
tamaños de partículas, cristalinidad
esterilizar, al mismo tiempo poseer
y trazas de otros elementos, tales
potencial comercialización.
como ser Na, Sr o aniones como Cl-,
2.4.1.2.-Materiales: CO3- que interfieran en la estructura

cristalina de la apatita. El fosfato


Los materiales que se pueden
tricálcico es bioabsorbibles y es
utilizar para el desarrollo de las
reemplazado temporalmente por el
matrices son muy diversos, como
tejido natural. Su tasa de
ser: cerámicas, vidrios bioactivos,
bioabsorción depende sobre todo
polímeros naturales o sintéticos y
del estado cristalino; por ejemplo la
composites (o materiales
tasa de degradación de -TCP es
compuestos).
mayor que la de β-TCP. Estas
2.4.1.2.1.-Cerámicas:
cerámicas poseen una tasa de

degradación difícil de predecir y si

Cap. 1: Introducción. 32
esta es muy rápida, puede mezcla de óxidos de Si, Ca, P, Na y

comprometer la estabilidad y en algunos casos B y K. El mas

aumentar la concentración de PO4-3 conocido es Bioglass® 45S5. Poseen

y Ca+2 extracelular local y puede una alta bioactividad, integrándose

producir la muerte celular [Jones, en forma excelente al hueso

2003; Khan, 2008; Salgado, 2004; mediante la formación de una capa

Rezwan, 2006; Vallet-Regi, 2003]. de carboxiapatita en la interfase de

Así, ordenados en velocidad de unión al hueso.

disolución creciente se obtiene el


En estos últimos años, se ha
siguiente orden:
descubierto que se liberan algunos

HAP cristalina << β-TCP << -TCP óxidos constituyentes del biovidrio

<< HAP amorfo en baja concentración aumentando

la expresión de ciertos genes y


La alúmina es muy estable ya
promoviendo la osteogénesis de las
que no reacciona con el ambiente
células [Hench, 2002; Hench, 2009;
tisular y por lo tanto presenta gran
Peitl, 2001]. Dos características
estabilidad química.
comparten con la cerámica, ambos
A pesar de mostrar una
poseen excelente biocompatibilidad
buena resistencia a la compresión,
pero muy baja resistencia a la
las cerámicas poseen una baja
fractura [Chen, 2008; Jones, 2003;
resistencia a la fractura respecto del
Karlsson, 2008; Khan, 2008; Salgado,
hueso, limitándose su uso a
2004; Rezwan, 2006; Vallet-Regi,
odontología.
2003].
2.4.1.2.2.- Vidrios bioactivos:
2.4.1.2.3.-Polímeros:
También conocidos como
Son un gran grupo de
biovidrios, son compuestos
materiales y se clasifican en
inorgánicos no metálicos y amorfos.
naturales o sintéticos. Costituye el
Estos están compuestos de una
grupo más diverso debido a su

Cap. 1: Introducción. 33
variada naturaleza, ya que requeridas. Es así que se suele usar

dependiendo de su química e combinación de materiales donde la

incluso de su forma de preparación, estrategia más común es la mezcla

se puede tener una gran gama de de algún polímero con alguna

materiales con distintas cerámicas o algún bioglass donde

propiedades, a su vez, se pueden cada componente aporta sus

modificar por distintos métodos propiedades con el fin de cubrir las

físico o químicos. Algunos falencias del otro [Hench, 2009; Ma,

polímeros naturales son: quitina, 2004; Salgado, 2004].

quitosano (un derivado del


2.4.1.3.- Células:
anterior), almidón, colágeno y los
Debido a que las matrices
polihidroxialcanoatos. Algunos
carecen de la propiedad de
polímeros sintéticos usados son
osteogénesis, a los scaffolds se les
policaprolactona, acido polilactico,
pueden agregar células como ser
acido poliglicolico y su copolímeros
MSCs u Osteoblastos propios del
y policarbonatos [Chen, 2008;
paciente. Para esto se crecen las
Karlsson, 2008; Khan, 2008; Liu,
células en la matriz en bioreactores
2004; Salgado, 2004; Rezwan, 2006;
y luego se lo implanta en el sitio
Vallet-Regi, 2003].
óseo a reparar. El problema de este
2.4.1.2.4.-Composites:
método es el tiempo que requiere el

Los “composites” o crecimiento de las células en el

materiales compuestos, son una scaffold. Esto puede solucionarse con

combinación de al menos dos células xenogénicas, pero se necesita

materiales distintos. Desde el punto un estricto sistema de control para

de vista de la ciencia de los evitar infección o contagio de virus

materiales, un simple material no y rechazos [Ma, 2004; Salgado,

provee usualmente todas las 2004].

necesidades mecánicas y/o químicas

Cap. 1: Introducción. 34
2.4.1.4.-Factores de La metodología para la

Crecimiento: obtención de las matrices porosas,

así como los polímeros, cerámicas o


Como se describió antes, es
biovidrios a usar depende no solo
muy importante que estos posean
del hueso donde será implantado
efecto osteoinductor. Para lograr tal
sino también de la sección del
cometido, a las membranas se les
mismo. Por ejemplo, la resistencia
puede agregar distintos factores de
mecánica que soportaran los
crecimiento como BMPs, TGF-1,
implantes en los huesos planos
VEGF, IGFs, RGD, integrinas y
como en el cráneo no serán las
factores angiogenicos [Rezwan,
mismas que en un hueso largo como
2006; Salgado, 2004]
el húmero. No solo variarán en la
La necesidad de obtener
resistencia mecánica sino también
matrices porosas ha impulsado a los
en la porosidad. Además, los
investigadores a diseñar distintos
requerimientos para las matrices,
sistemas o métodos.
también variarán según la ubicación
En la literatura se puede dentro del mismo hueso. Estas
encontrar una gran cantidad de diferencias se pueden notar en la
métodos de obtención de matrices supuesta necesidad de implantes en
porosas para regeneración de tejido la zona media de un hueso largo,
óseo [Chen, 2008; Hutmacher, 2000; como la diáfisis de fémur y la cabeza
Khan, 2008; Liu, 2004; Ma, 2004; del mismo, donde las estructuras
Mano, 2004; Rezwan, 2006; Salgado, del hueso varían a lo largo del
2004]. En la figura 18 se detallan mismo.
algunos de los métodos

[Hutmacher, 2000].

Cap. 1: Introducción. 35
Figura 18: Tabla detallando algunos métodos de obtención de matrices porosas
[Adaptado de Hutmacher, 2000].

Cap. 1: Introducción. 36
Electrospraying es un método de mismo que el del electrospinning. En

fabricación basado en la un proceso típico, una solución se

electrohidrodinámica, permitiendo alimenta mediante una boquilla y se

la construcción de scaffolds con una forma una gota en la salida de esta.

microestructura controlables en la Cuando la gota está expuesta a un

escala micro y/o nanométrico [Wu, fuerte campo eléctrico, la superficie

2008]. de esta es cargada. Influenciado por

el campo electrostático, la gota en la


Esta técnica produce partículas
punta de la boquilla adopta una
con dimensiones que van desde los
forma cónica. Desde la punta del
micrómetros a nanómetros en
cono, un chorro de la solución
función de los parámetros de
cargada es impulsado a un colector.
procesamiento, y representa una

gran oportunidad para la Debido a la tensión superficial

fabricación de scaffolds para de este se fragmenta, adquiriendo

aplicaciones biomédicas. así una forma esférica, antes de ser

depositado sobre el colector (figura


El principio de la técnica de
19).
electrospraying es esencialmente el

Figura 19: Esquema del principio básico de la técnica de electrospraying [Adaptado de Wu, 2008]

Estos procesos molecular del polímero, la

electrohidrodinámicos se concentración de solventes,

encuentran afectados por una conductividad, tensión superficial),

multitud de variables, tales como las y los parámetros de procesamiento

propiedades físico-químicas (peso (tensión aplicada, distancia entre la

Cap. 1: Introducción. 37
aguja-colector y el caudal de utiliza en electrospinning

solución). La variable más [Chakraborty, 2009; Arya, 2009].

importante para distinguir entre


La figura 20 muestra un
electrospraying y electrospinning es la
diagrama esquemático del proceso
concentración de la solución del
de electrospraying. La tecnología de
polímero utilizada en el proceso. La
deposición del electrospray se puede
generación de las gotas es una
utilizar para diseñar materiales que
consecuencia de la utilización de
imiten la matriz extracelular para
una menor concentración (y por lo
guiar el crecimiento celular o
tanto menor viscosidad) de la
generación de tejidos.
solución de polímero que lo que se

Figura 20: Diagrama esquemático de un sistema experimental del método de electrospraying.

También se ha informado que propiedades de la superficie de los

la técnica de Electrospraying sirve implantes utilizando revestimientos

como un método alternativo útil superiores [Kumbar, 2007]. Esta

para modificar la superficie de los técnica también es atractiva para las

implantes biomédicos y cambiar las aplicaciones de administración de

Cap. 1: Introducción. 38
fármacos, lo que permite la Peter Ma [Ma, 2004] ha

liberación de agentes bioactivos con propuesto un scaffold biomimético

una gran variedad de perfiles de (figura 21) en el cual se tienen en

liberación [Kumbar, 2007]. cuenta los requerimientos antes

propuestos.

Figura 21: esquema de un scaffold biomimetico. [Adaptado de Ma, 2004]

Su estructura (figura 21) vasta para obtener buenas

muestra una matriz polimérica propiedades mecánicas.

formada por macroporos


Además, se plantea la
interconectados para permitir la
necesidad de incorporar en la matriz
migración celular hacia el interior de
un sistema formado por
la matriz y la angiogénesis y por
microesferas degradables que
microporos para favorecer la
contengan en su interior los factores
difusión de nutrientes. También
de crecimientos que se irán
contienen compuestos inorgánicos
liberando al medio extracelular a
como apatitas, para mejorar las
medida que estas se degradan.
propiedades mecánicas, ya que
En resumen, la ingeniería de
como se ve en la figura 17, la
tejido óseo es un campo
utilización de polímero solo, no
interdisciplinario que aplica los

Cap. 1: Introducción. 39
principios de la ingeniería y las El material ideal debe ser fácil

ciencias de la vida, hacia el de fabricar y controlar en una

desarrollo de un sustituto biológico arquitectura deseada, debe ser

que combina materiales biocompatible, poseer propiedades

biodegradables, células y factores de mecánicas óptimas y no debe ser

crecimiento para reparar tejido óseo tóxico.

dañado. La elección de los


Hasta el presente no existe
materiales adecuados y su
ningún material que reúna todos
arquitectura son de máxima
estos requerimientos, por lo que el
importancia, tales propiedades
diseño de nuevos materiales
afectan no únicamente a la
continúa constituyendo un desafío.
supervivencia de las células,

señalización, crecimiento,

propagación y reorganización, sino

también su expresión de genes y

preservación del fenotipo.

Cap. 1: Introducción. 40
Capítulo 2

Hipótesis y Objetivos

“Hay algo más importante que la lógica: es la imaginación.”


Alfred Hitchcock
Capítulo 2: Hipótesis y Objetivos.
1. Hipótesis: mejorar tanto las propiedades

mecánicas como biológicas de las


Se propone el uso de
membranas, que podrán ser
biomateriales o matrices basados en
utilizados en el desarrollo de tejido
polímeros o copolímeros sintéticos,
óseo y posterior aplicación en
combinados o no con hidroxiapatita,
implantes óseos.
podrán ser usados para implantes

óseos. Estos materiales tendrán Con el fin de abordar el

aplicación en la reparación de problema planteado, se proponen

fracturas de diversos orígenes y el los siguientes objetivos específicos:

tratamiento de enfermedades 1.-Sintetizar matrices


inflamatorias óseas. utilizando los polímeros sintéticos

PCL y PFIP combinados con HAP.


2. Objetivos:
2.-Caracterizar en forma
En el presente trabajo de tesis
fisicoquímica las matrices obtenidas
se planteó el objetivo general de
a partir de los polímeros puros o sus
desarrollar biomateriales que
mezclas, utilizando diversas
estimulen la formación ósea
técnicas: espectroscopia infrarroja,
mediada por los osteoblastos. Para
cromatografía de exclusión
ello se propone el desarrollo de
molecular, microscopía electrónica
sistemas basados en los polímeros,
de barrido, pruebas de degradación,
poli-ε-caprolactona (PCL)
ángulo de contacto y ensayos
polifumarato de diisopropilo (PFIP),
mecánicos.
con o sin el agregado de partículas

de hidroxiapatita (HAP, 3.-Analizar la

Ca10(PO4)6(OH)2), con el fin de biocompatibilidad de las matrices

Cap. 2: Hipótesis y Objetivos. 42


utilizando osteoblastos en cultivo 6.-Caracterizar las matrices

MC3T3-E1 y UMR-106. porosas obtenidas mediante SEM y

WCA y realizar sobre ellas estudios


4.-Investigar la posible
de adhesión, proliferación y
citotoxicidad de los biomateriales
actividad de ALP de las células
utilizando cultivos de macrófagos
UMR-106 y MC3T3-E1.
murinos RAW 264.7.

5.-Obtener una matriz porosa

de la mezcla compatibilizada

mediante la técnica de electrospray.

Cap. 2: Hipótesis y Objetivos. 43


Capítulo 3

Materiales y Métodos

“La situación ejemplific ada es típic a. Muchas clases de proc esos están ocurriendo en el mundo
que nos rodea; se superponen e interaccionan unos c on otros de maneras complejas. Una hoja
que cae esta sometida a la acción de la gravedad, a la resistenc ia del aire y a la fuerza del viento,
y se pudrirá también en alguna medida muy pequeña mientras cae. No es posible llegar a la
comprensión de los distintos proc esos c on solo observar cuidadosamente los ac ontec imientos
tal como ocurren típica y naturalmente. La observación de la hoja cayendo no produc irá la ley
de caída de Galileo. La lección a aprender en este caso es bastante senc illa. Con el fin de recoger
hechos relevantes para la identificac ión y espec ificac ión de los diversos procesos que oc urren en
la naturaleza, es en general necesario intervenir prácticamente para tratar de aislar los procesos
que se investigan y eliminar los efectos de otros. En pocas palabras, es necesario hacer
experimentos.”
Alan F. Chalmers.
Capítulo 3: Materiales y Métodos.
1. Matrices poliméricas: hidroxiapatita (HAP) para agregar

en las matrices poliméricas.


1.1.- Materiales:
La PCL (Figura 1A) fue
Todos los productos químicos
adquirida comercialmente de
y reactivos fueron adquiridos
Sigma-Aldrich y tiene un peso
comercialmente y son de grado
molecular promedio en peso (Mw) e
analítico.
índice de polidispersidad (IP) de 65
Los polímeros utilizados para kg/mol y 1,53 respectivamente,
obtener las matrices fueron poli- según lo indicado por el fabricante.
caprolactona (PCL) y
El PFIP (Figura 1B) y la HAP
polifumarato de di-isopropilo
fueron obtenidos en el laboratorio.
(PFIP). Además se utilizó

A B

Figura 1: poli-ε-caprolactona (PCL) [A], polifumarato de di-isopropilo (PFIP) [B]

1.2.-Obtención de PFIP: radicalaria asistida por microondas,

utilizando peróxido de benzoilo


El PFIP fue sintetizado
como iniciador de la reacción
mediante una polimerización
[Cortizo, 2007; Cortizo, 2008]. En un

Cap. 3: Materiales y Métodos. 45


matraz cónico de vidrio Pyrex se utilizó polimerización radical con

agrego 1 g de monómero (fumarato calentamiento térmico, utilizando

de di-isopropilo) y una cantidad peróxido de m-fenilazobenzoilo

previamente pesada del iniciador como iniciador [Cortizo, 1989].

obteniendo así una concentración


1.3.-Obtención de la mezcla
final de este de 30 mM. Luego, bajo
PCL-PFIP compatibilizada:
un baño de hielo y con el matraz
Para la obtención de la mezcla
cerrado a la atmósfera mediante un
compatibilizada se utilizó el PFIP
septum se burbujeó nitrógeno
anteriormente sintetizado y la PCL
durante 30 minutos. La reacción fue
comercial. La degradación de las
sometida a distintos tiempo y a
muestras en cloroformo se realizó
distintos poderes de irradiación en
mediante un equipo de ultrasonido
horno de microondas doméstico.
a distintos tiempos a una potencia
Después de la reacción, los
de 37 watts a una temperatura de
polímeros fueron aislados y
20ºC. Las muestras estudiadas se
purificados por solubilización-
disolvieron en cloroformo a una
precipitación (tolueno / metanol =
concentración de 1 %p/v. La mezcla
1:8) y se secaron hasta llegar a peso
de ambos polímeros se preparó en
constante mediante el empleo de un
una proporción 3:1 de PCL a PFIP.
tambor de vacío. El PFIP utilizado
A distintos tiempos se tomaron
en este trabajo posee un Mw y un IP
alícuotas para su análisis por SEC
de 131 Kg/mol y 2,0,
para evaluar la cinética de la
respectivamente según lo
degradación midiendo los pesos
determinado mediante
moleculares promedio a 25ºC.
cromatografía de exclusión

molecular (SEC). 1.3.1.-Obtención de membranas

porosas:
Para la obtención del PFIP

marcado con el grupo cromóforo se

Cap. 3: Materiales y Métodos. 46


Las películas porosas fueron 1.4.-Obtención de HAP:

obtenidas mediante la técnica de


La HAP fue obtenida por
electrospray. Las soluciones se
incineración [Ooi, 2007] de hueso
prepararon por disolución de la
bovino de la siguiente forma: un
mezcla PCL/PFIP en cloroformo (4%
trozo de hueso fémur de vaca fue
en peso). La solución fue cargada en
exhaustivamente limpiado y
una jeringa de plástico estándar de
triturado en trozos mas pequeños,
10 ml conectada a un tubo de
colocado en un crisol e incinerado
poliamida y este a una aguja
con un mechero tipo Bunsen en
hipodérmica de acero inoxidable de
triangulo de pipa (bajo campana).
calibre 18 (ID = 0,838 mm) que se
Cuando la preparación llegó a
utiliza como boquilla de salida de la
cenizas blancas, fue transportado a
solución. Una bomba de jeringa
una mufla eléctrica y llevado a una
programable (Activa A22 ADOX
temperatura de 900 ºC durante una
SA, Argentina) se conectó a la
hora, con una rampa de
jeringa de control del caudal. Se
calentamiento de 5 ºC/min,
utilizó una fuente de energía de alto
dejándose enfriar luego en un
voltaje (ES30P, Gamma High
desecador. Las cenizas así obtenidas
Voltage Research Inc.) para cargar la
se caracterizaron mediante
solución colocando el electrodo en
espectroscopia infrarroja con
polaridad positiva a la boquilla y el
transformada de Fourier (FTIR)
colector (una placa de aluminio)
También se analizaron las cenizas
conectado a tierra. Sobre esta placa
mediante microscopia electrónica de
colectora se colocaron vidrio de
barrido (SEM) para conocer la
dimensiones 2,6 cm de largo x 1,8
distribución de los tamaños de
cm de ancho para obtener las
partículas y la relación Ca/P
matrices porosas sobre dichos
mediante el análisis de rayos X por
vidrios.
dispersión de electrones (EDAX).

Cap. 3: Materiales y Métodos. 47


1.5.-Modificación de las en su composición y tamaño de

partículas de HAP: partículas.

La HPA anteriormente 1.6.-Preparación de las

obtenida fue sometida a ultrasonido películas de polímero:

con el fin de obtener un tamaño de


Para llevar a cabo
partícula menor. Primeramente, en
experimentos con células
un mortero se trituró la HAP y se la
osteoblásticas en cultivo, se
tamizó por un tamiz numero 200
prepararon matrices de los
con un tamaño de poro 75 m
homopolímeros PCL, PFIP y mezcla
[Handbook of Chemistry and
PCL-PFIP compatibilizada. Este tipo
Physics, 67th edition], luego se
de muestras nos permite evaluar
realizó una suspensión de la misma
con un microscopio óptico la
en cloroformo a una concentración
morfología y el crecimiento de estas
0,7 %p/v. Dicha muestra se sometió
células. Las matrices de polímero
a disgregación mecánica utilizando
fueron preparados por el método de
un equipo ultraturrax a 20500 rpm
colada de soluciones o solvent
durante 10 minutos 3 veces y luego
casting. Para ello, se preparó una
se subió potencia a 24000 rpm
solución de la mezcla de polímeros
durante 5 minutos 3 veces, en todo
(física o compatibilizado) o de los
momento bajo un baño de hielo. A
homopolimeros en cloroformo (5%
continuación la suspensión se volcó
p/v) y se volcó en placas de Petri de
en un cristalizador y el solvente fue
vidrio (19.6 cm2). El solvente se dejo
evaporado y secado hasta peso
evaporar a temperatura ambiente y
constante en vacío.
luego las películas resultantes se

La HAP recuperada fue secaron en un tambor de vacío hasta

caracterizada nuevamente por FTIR, peso constante. Las películas fueron

EDAX y SEM para evaluar cambios esterilizadas por la exposición a luz

Cap. 3: Materiales y Métodos. 48


UV durante 2 h, previa inmersión en teñidas sobre un portaobjeto y se

alcohol etilico al 70 %. observó al microscopio óptico.

De manera similar se 2. Estudios in Vitro:


prepararon matrices PCL y mezcla
2.1.-Cultivo celular:
PCL-PFIP compatibilizada con 1%

en peso de HAP. Para los estudios de

biocompatibilidad y citotoxicidad se
1.7.- Evaluación de la distribución
utilizaron células de tipo
de las partículas de HAP en las
osteoblástico y macrófagos murinos.
matrices poliméricas:
Las células se mantuvieron en
Un hecho muy importante en frascos de 75 cm2 de superficie en
el diseño de las matrices, es conocer atmosfera humidificada
la distribución de las partículas de conteniendo 5% de CO2 y a 37 ºC en
HAP en la matrices poliméricas una medio de cultivo Eagle modificado
vez preparadas las películas. Con por Dulbecco (DMEM, Laboratorio
este fin, las mismas fueron MicroVet S.A., Buenos Aires, Arg.)
sometidas a tinción con el colorante suplementado con 10% de suero
Rojo de Alizarina (1,2- fetal bovino (SFB, GBO Argentina
dihidroxiantraquinona, ICN). Este S.A., Buenos Aires, Arg.), 100 UI/ml
colorante tiene alta afinidad por de penicilina y 100 g/ml de
Ca+2, constituyente de la HAP estreptomicina en estufa de cultivo.
[Ueno, 2001]. Para este fin, un trozo Los cultivos fueron visualizados
de las matrices cortadas se cubrió utilizando un microscopio invertido.
con rojo de alizarina (ver
Cuando las monocapas
preparación en 2.6.- Diferenciación de
celulares llegaron a subconfluencia,
células MC3T3-E1) durante 5
se cosecharon de la superficie del
minutos, luego se quitó el exceso del
frasco con una solución de 0,25 %
colorante y lavó varias veces con
p/v de tripsina en PBS a pH=7.4
agua, se montaron las películas

Cap. 3: Materiales y Métodos. 49


suplementado con 1mM de EDTA. diferencian, pasando de un fenotipo

Las células se resuspendieron en el pre-osteoblástico a osteoblástico,

medio de cultivo DMEM -10%SFB. expresando elevados niveles de

Las células empleadas fueron marcadores típicos del fenotipo

MC3T3-E1, UMR-106 y RAW 264.7. osteoblástico como ser la síntesis de

colágeno tipo 1 y actividad de


2.1.1.-MC3T3-E1 (ATCC CRL-
fosfatasa alcalina.
2593):

2.1.2.-UMR-106 (ATCC CRL-


Las células MC3T3-E1 pre-
1661):
osteoblásticas, corresponden a una

línea celular no transformada Esta línea celular, a diferencia

derivada de calvaria de ratón recién de la anterior, es una línea clonal

nacido (Mus musculus). Su derivada de osteosarcoma de rata

morfología es fibroblástica y (Rattus norvegicus) inducida por

adherente. inyección del radioisótopo 32


P, de

morfología epitelial y adherente


Esta línea celular tiene la
[Forrest, 1985]. Expresa varios
característica de poseer dos
marcadores del fenotipo osteoblasto,
fenotipos secuenciales [Sudo, 1983;
tales como la enzima fosfatasa
Takeuchi, 1993; Quarles, 1992;
alcalina y síntesis de colágeno tipo I.
Franceschi, 1992 y1994; Wang, 1999].

2.1.3.-RAW 264.7 (ATCC TIB-


Una primera etapa
71):
proliferativa, donde las células se

dividen exponencialmente en el Este tipo celular es derivada de

medio de cultivo antes mencionado. macrófagos de ratón (Mus

musculus), establecida a partir de un


Cuando al medio de cultivo se
tumor inducido por el virus de
lo suplementa con -glicerofosfato
leucemia Abselon. Su morfología es
(5 mM) y acido ascórbico (25 mg/L)
monocítica y adherente [Raschke,
[Franceschi, 1992], las células se

Cap. 3: Materiales y Métodos. 50


1978]. Expresa distintos marcadores CO2. Luego de este periodo de

de actividad celular, como síntesis incubación, se sacó el medio de

de interleuquinas, producción de cultivo, se lavaron las matrices con

óxido nítrico (NO), expresión de las células con solución buffer

óxido nítrico sintasas (NOS) fosfato (PBS), se fijó con metanol

[Denlinger, 1996]. Por estas absoluto durante 5 minutos, se lavó

características constituyen un con agua destilada se tiñó con

excelente modelo para estudios de Hematoxilina (Hematoxilina

citotoxicidad de distintas sustancias “activada”, lista para usar, Biopur,

sobre sistemas biológicos. Rosario, Arg.) durante 3 a 5 minutos

y se lavó con agua corriente por 2 o


2.2.- Adhesión y proliferación:
3 minutos para lograr que la
Con el objetivo de conocer la
hematoxilina vire al azul (tiñendo
adhesión y la proliferación de las
estructuras ácidas o basófilas en
células sobre las membranas
tonos azules, por ejemplo los
preparadas en este trabajo de tesis,
núcleos de las células). Finalmente,
se realizó el siguiente experimento.
las celulas se tiñeron con Eosina
Se cortaron membranas de los (Biopack, Arg.) por 1 o 2 minutos
polímeros de dimensiones (tiñendo estructuras básicas o
aproximadas de 3 cm x 3 cm y se acidófilas en tonos rosas como el
colocaron en plato de 6 pocillos. Se citoplasma celular), se lavaron con
esterilizaron como se describió agua destilada y se visualizaron al
anteriormente. A continuación, se microscopio óptico. Se contó la
plaquearon las células MC3T3-E1 ó cantidad de células de alrededor en
UMR-106 en medio de cultivo 15 campos/muestra con un aumento
DMEM-10%SFB y se incubaron de 40X. Los resultados se expresan
durante 1 hora (adhesión) o 24 horas como porcentaje (%) del control ±
(proliferación) a 37 ºC, en atmósfera SEM, donde SEM = Ds x (n-1)-1/2.,
humidificada conteniendo 5% de siendo SEM el Error estándar de la

Cap. 3: Materiales y Métodos. 51


media, Ds el desvío estandar y n el mediante el método de Bradford

número de repeticiones o de [Bradford, 1976].

muestras. El control son las células


La actividad de ALP de los
crecidas durante los mismos
extractos se determinó por
periodos sobre los platos de cultivo.
incubación de una alícuota del

2.3.- Actividad de la enzima mismo con el sustrato p-

fosfatasa alcalina (ALP): nitrofenilfosfato de sodio (Sigma-

Aldrich, Buenos Aires, Arg.) [2,3


La actividad de la enzima
mg/ml] en buffer glicina [glicina 55
fosfatasa alcalina (ALP), un
mM, MgCl2 0.55 mM, pH=10.5] a
marcador del fenotipo osteoblástico
37ºC durante un periodo de tiempo
asociada a la capacidad de
adecuado. La producción de p-
formación ósea, se evaluó sobre
nitrofenol se evaluó mediante
extractos de las células crecidas
espectrofotómetría a longitud de
sobre las diferentes matrices. Para
onda de 405 nm.
este fin las células UMR-106 y

MC3T3-E1 se plaquearon y 2.4.- Producción de colágeno

cultivaron durante 24 hs. A final de tipo I:

este periodo de incubación, se


Otro marcador fenotípico
eliminó el medio de cultivo, se lavó
osteoblástico evaluado sobre las
con PBS y se lisaron las células con
membranas fue la producción de
Triton X-100 (Sigma-Aldrich,
colágeno tipo I.
Buenos Aires, Arg.) 0,1% v/v en
Para ello, se lavaron las
agua destilada. De esta forma se
membranas con PBS luego de
obtuvo un extracto de las células
incubar las células 24 hs sobre ellas.
crecidas sobre las películas de los
Se cubrieron las membranas durante
polímeros. Sobre este extracto, se
30 minutos con solución fijadora de
midió la ALP [Cortizo, 1995] y la
Bouin (Ácido pícrico, formol y Ac.
concentración de proteínas

Cap. 3: Materiales y Métodos. 52


Acético en proporción [15:5:1]) y 1976]. Para esto se uso unas

luego de lavar con agua destilada, se alícuotas del extracto celular total, a

cubrió con Sirius red (Sigma-Aldrich la que se agregaron 2 ml de reactivo

Buenos Aires, Arg.) 0,1% p/v en de trabajo Bradford (reactivo de

solución acuosa saturada con acido Bradford: 100 mg de Coomassie

pícrico durante 60 minutos Brilliant Blue G-250 en 50 ml de

[Junqueira, 1979; Tullberg-Reinert, etanol al 95%, 100 ml de ácido

1999]. Este colorante aniónico tiene fosfórico 85% (w/v). Reactivo de

una alta afinidad a través de sus trabajo Bradford = 1 vol de reactivo

grupos sulfónicos por los grupos de Bradford + 4 vol de agua

básicos de la molécula de colágeno. destilada). A esta preparación se

agregó un volumen de la alícuota y


Trascurrido este tiempo se
se midió la cantidad de proteínas
retiró el exceso del colorante, se lavó
utilizando espectrofotometría a una
con HCl 0,01 N y se extrajo con
longitud de onda de 595 nm.
HONa 0,1 N. De este extracto se

tomó una alícuota para medir 2.6.- Diferenciación de células

concentración de proteínas MC3T3-E1:

mediante el método de Bradford y


Sobre las membranas de los
otra alícuota para evaluar la
polímeros, se cultivaron células
cantidad de colágeno tipo I,
MC3T3-E1 hasta alcanzar la
mediante espectrofotómetría a una
confluencia. A continuación se las
longitud de onda de 550 nm.
indujo a diferenciarse utilizando un

2.5.- Producción de proteínas medio de cultivo osteogénico

totales: [DMEN-10%SFB suplementado con

β-glicerofosfato (5 mM) y ácido


De las alícuotas obtenidas de
ascórbico (25 mg/L)] durante 7 y 15
los ensayos 2.3 y 2.4, se evaluó el
días. Al cabo de estos períodos de
contenido de proteínas mediante el
cultivo, se evaluó la actividad de
método de Bradford [Bradford,

Cap. 3: Materiales y Métodos. 53


ALP y producción de colágeno tipo ambos colorantes debido al

I. contenido de Ca y P.

Los nódulos mineralizados en 2.6.1.- Expresión de RUNX-2:

la matriz extracelular debido


Las células MC3T3-E1 se
osteoblastos MC3T3-E1 se
cultivaron durante un periodo de
observaron [Ueno, 2001] tiñendo
dos o tres semanas sobre las
con Rojo de alizarina S de la
matrices en DMEM 10% FBS,
siguiente forma: luego de lavar las
diferenciándose en osteoblastos
células crecidas sobre las matrices
como se describió anteriormente. Al
con PBS, se fijó las células con
final de los períodos de cultivo, las
formalina al 10 % p/v en PBS
células fueron lisadas en buffer de
durante 10 minutos, luego se lavó
Laemmli [Laemmli, 1970]. Estos
con agua destilada y se coloreó
lisados se calentaron a 100 C
durante 10 minutos con rojo de
durante 3 min y se sembraron 30 g
alizarina (2% p/v en agua, pH=4,2).
de proteínas del extracto a fin
Luego de quitar el colorante, se
separarlas por electroforesis
lavaron las matrices y se solubilizó
mediante un gel de poliacrilamida
el colorante con NaOH 0,1 N. Sobre
con dodecilsulfato sódico (SDS-
este extracto se realizó la
PAGE: sodium dodecyl sulfate
cuantificación de proteínas
polyacrylamide gel electrophoresis)
utilizando espectrofotometría a una
al 12%. Las proteínas separadas
longitud de onda de 548 nm.
fueron transferidas a membranas de

No fue posible evaluar la PVDF (Fluoruro de polivinilideno).

formación de nódulos Después de lavar y de bloquearlas

mineralizados, mediante las técnicas con 1% de albúmina en PBS, las

de rojo de Alizarina ó de von Kossa, membranas fueron incubadas

debido a que algunas membranas durante la noche a 4 °C con un

contienen HAP que se tiñen con anticuerpo dirigido contra Cbfa-

Cap. 3: Materiales y Métodos. 54


1/Runx-2 (Biotecnología de Santa periodo de cultivo se fijaron con p-

Cruz, Santa Cruz, CA, EE.UU.) para formaldehido durante 10 minutos.

la evaluación de osteoblastogénesis Luego de un breve lavado con PBS,

[Molinuevo, 2010]. Con el fin de se permeabilizó las membranas

normalizar los resultados, todas las citoplasmáticas de las células con

manchas fueron despojadas del metanol frío durante 5 minutos y se

primer anticuerpo y re- lavó con PBS. Las uniones

determinadas con un anticuerpo inespecíficas se bloquearon con

anti β-actina (Sigma, St. Louis, MO, albúmina sérica bovina [3% en PBS]

EE.UU.). Las membranas de PVDF durante 30 minutos. Finalmente se

fueron reveladas mediante el agregó la Paloidina–FITC

método de quimioluminiscencia. La (Molecular Probes, Buenos Aires,

intensidad de las bandas específica Arg.) [1:200] durante 1 hora a la

fue cuantificada mediante oscuridad. Con el fin de visualizar

densitometría, tras el análisis de la los núcleos de las células se agregó

película fotográfica. Las imágenes Ioduro de Propidio (Molecular

fueron analizadas utilizando el Probes, Buenos Aires, Arg.).

programa Scion-beta 2. Finalmente, se montaron las

matrices con las células entre porta


2.7.-Inmunofluorescencia para
y cubre objetos utilizando
fibras de actina:
glicerol:PBS (9:1) y se visualizaron
A fin de evaluar la interacción
en microscopio confocal Leica.
de las células con las matrices
2.8.-Producción de óxido
poliméricas, se estudio la
nítrico (NO):
organización de las fibras de actina

de las células crecidas sobre la El óxido nítrico o monóxido de

membrana. Para esto, las células nitrógeno (NO), es un efector de la

UMR-106 y MC3T3-E1 se incubaron respuesta inmune innata, producido

durante 24 hs y luego de este por la enzima NO sintasa-2 (NOS-2)

Cap. 3: Materiales y Métodos. 55


o NO sintasa inducible (iNOS) de cultivo en proporción 1:1 y se midió

los macrófagos en respuesta a la la cantidad de nitrito liberado al

presencia de diversos patógenos medio por las células utilizando

[Lowenstein, 2004]. espectrofotómetría a longitud de

onda de 550 nm.


Se utilizó el método de Greiss

[Tsikas, 2005; Tsikas, 2007] para 2.9.-Producción de citoquinas:

medir la liberación de NO en el
Al igual que la síntesis de NO,
medio de cultivo de los macrófagos
los macrófagos producen y liberan
RAW-264.7 crecidos sobre las
al medio, diversas citoquinas pro
matrices. Para ello, se incubaron
inflamatorias cuando se encuentran
dichas células en medio de cultivo
con sustancias toxicas. Es así, que se
DMEN sin rojo de fenol y durante
midió la liberación al medio de
diferentes períodos de incubación.
cultivo de las citoquinas Factor de
Al cabo de estos tiempos, se tomó el
Necrosis Tumoral  (TNF-) e
medio de cultivo y se dosó el
Interleuquina 1 (IL-1) de las células
producto final estable del óxido
RAW-264.7 cultivadas sobre las
nítrico. El método utiliza como
matrices de los polímeros mediante
agente de diazotación ácido
la técnica de ELISA. Para esto se
Sulfanílico (1 gr en 100 ml de ácido
utilizaron kit comerciales: Mouse IL-
Fosfórico al 5%. Reactivo A) y como
1 ELISA Set, BD Biosciences
agente de acoplamiento el N-1-
OptEIA™ para IL 1 y el kits Mouse
naftilén diamina (100 mg en 100 ml
TNF-α ELISA Set, BD Biosciences
de agua destilada. Reactivo B). El
OptEIA™ para TNF , utilizando 3,3
reactivo de Greiss se prepara
', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) del
mezclando volúmenes iguales de
kits TMB substrate Reagent Set BD
reactivo A y reactivo B. Luego para
Biosciences OptEIATM como sustrato
llevar a cabo la reacción se mezcló el
cromógeno de la reacción de ELISA.
reactivo de Greiss con el medio de

Cap. 3: Materiales y Métodos. 56


La liberación de citoquinas se una concentración de 1:500 en PBS-

midió en los medios de cultivo 10% v/v SFB, incubando durante 1

luego de la medición de NO. Para hs a temperatura ambiente en

esto se utilizó una placa de 96 cámara húmeda. Transcurrido este

pocillos (NUNC Maxisorp®), a la tiempo, se lavó 5 veces con PBS-

cual se agregó el anticuerpo de 0,05% v/v Tween 20 y se agregó el

captura en una concentración de reactivo enzimático provisto por el

1:250 en el buffer específico para kits a una concentración de 1:250 en

cada anticuerpo de captura (TNF : PBS-10% v/v SFB durante 30

buffers 11,8g Na2HPO4, 16,1gr minutos. A continuación se lavó 7

NaH2PO4 en 1 litro de agua veces con PBS-0,05% v/v Tween 20 y

destilada, pH=6,5; IL-1: 7,13gr se agregó la solución sustrato 3,3',

NaHCO3, 1,59gr Na2CO3 en 1 litro 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) del

de agua, pH=9,5 con NaOH 10 N). kits a temperatura ambiente y en la

Se incubó en heladera toda la noche oscuridad. Transcurrido un tiempo

en una cámara húmeda. Luego de adecuado, generalmente de 3 a 30

este período de incubación, se lavó 3 minutos, se agrego la solución de

veces con PBS-0,05% Tween 20. stop (HNO3 8N) y se leyó en un

Luego de esto se bloqueó con PBS- lector de ELISA a las longitudes de

10% v/v SFB durante 1 hora a onda de 450 y 540 nm.

temperatura ambiente en cámara


3. Degradación:
húmeda. A continuación, se lavó 2

veces con PBS-0,05% v/v Tween 20 y Como se explicó en los

se agregó la muestra, incubándose capítulos Introducción y Objetivos,

durante 2 hs a temperatura fue parte de este trabajo desarrollar

ambiente en cámara húmeda. Al materiales que sean reemplazados a

cabo de este tiempo, se lavó 5 veces medida que se regenere el tejido

con PBS-0,05% v/v Tween 20 y se óseo, por lo que es muy importante,

colocó el anticuerpo de detección a conocer los tiempos de degradación

Cap. 3: Materiales y Métodos. 57


de las membranas de los polímeros. Como se explicó en la

Con este fin se realizaron estudios Introducción, un requisito muy

con el objetivo de analizar el grado importante para la aplicación de los

de degradación de las películas en materiales en el área de la Ingeniería

DMEM-10% v/v SFB, cortando las de Tejidos, son las propiedades

muestras y colocándolas en platos mecánicas. Con el fin de evaluar las

de 24 pocillos. Luego de esto, se propiedades mecánicas de las

agregó el medio de cultivo DMEN- distintas membranas, se realizaron

10%v/v SFB y se colocó en estufa de pruebas de tracción.

cultivo a 37 ºC y con una atmósfera


Las muestras (5 muestras por
humidificada conteniendo 5% de
membranas) fueron cortadas con
CO2.
forma de “hueso de perro” (50 x 18

Se tomaron muestras cada mm2). La velocidad de ensayo fue

semana, renovando el medio de de 5 mm/min hasta el punto de

cultivo, durante 10 semanas y se ruptura. Resistencia última a la

calculó el porcentaje de pérdida de tracción, el módulo elástico y

peso según la fórmula (1). deformación en el punto de ruptura

(también llamado, Breaking


%W = (Wo-Wt) x 100/Wo (1)
strength) se calcularon sobre la base
Donde Wo es el peso inicial de de las curvas (figura 2) generadas en
la muestra y Wt es el peso de la las pruebas de tensión-deformación.
muestra a tiempo t de degradación.

4. Propiedades mecánicas:

Cap. 3: Materiales y Métodos. 58


Figura 2: Ejemplo de gráfica de ensayo de tensión (stress) - deformación (strain)
[http://wikitecno.wikispaces.com/TI_diagrama_de_tracción].

diferentes puntos para calcular el


5. Tensión superficial:
ángulo de contacto.
Con el fin de conocer la
En la figura 3 se representa una
hidrofobicidad de las membranas de
gota de agua sobre un material
los polímeros y poderla relacionar
sólido. Se observa la
con los ensayos de
descomposición de fuerzas entre las
biocompatibilidad, se realizaron
distintas interfaces teniendo como
pruebas de tensión superficial sobre
resultante el ángulo  conocido
las matrices, a partir de mediciones
como ángulo de contacto.
del ángulo de contacto (WCA).

Todas las pruebas fueron realizadas

en la interfase superficie-aire. Se

realizaron seis mediciones en

Cap. 3: Materiales y Métodos. 59


Figura 3: Determinación del ángulo de contacto.

3. Equipo Ultraturrax T25

Janke & Kunkel.


6. Análisis estadístico:
4. Cromatógrafo de exclusión
El análisis estadístico de los
molecular LKB-2249. Se utilizó una
resultados fue realizado mediante t-
serie de 4 columnas -Styragel, que
test student de dos muestras
varían en tamaño de poro (105, 104,
asumiendo varianzas iguales y
500, 100 Å) y empleando cloroformo
mediante ensayos de ANOVA
como eluyente. La concentración de
usando un único factor para
polímero fue del orden de 5-7 mg
comparar las muestras. Los datos se
ml-1 y la velocidad de flujo fue de 0,5
consideraron significativos cuando
ml min-1. Se utilizaron 2 detectores
la probabilidad (p) < 0,05.
en serie UV-Visible Shimadzu,
7. Equipamiento: seleccionado a una λ=320 nm para la

detección del grupo cromoforo. El


1. Horno de microondas
segundo detector, es un Infrarrojo
doméstico Zenith, modelo ZVP-
(Miram 1A) fue seleccionado a una
2819, con potencia máxima de 700
=5,75 µm, frecuencia característica
W.
de los grupos carbonílicos del éster.
2. Equipo de Ultrasonido
La calibración se realizó siguiendo
Bandelin HD60.
el procedimiento general con

Cap. 3: Materiales y Métodos. 60


estándar de polimetil metacrilato analizadas con el software Soft

(PMMA) Imaging System ADDAII. Además,

la relación Ca/P fue evaluada


5. Nicolet 380 FTIR entre las
mediante un detector de análisis de
frecuencias 4000 a 400 cm-1 con una
espectroscopia de energía dispersa
resolución de 4 cm-1 y una
de rayos X (EDAX) adicionado al
acumulación de 32 scans. Para el
SEM.
análisis de los espectros obtenidos

se utilizó el software EZ-OMNIC. 9. Microscopio óptico Nikon

Eclipse E400, utilizando una cámara


6. Equipo universal de ensayos
Nikon Cooplix 4500.
de tracción-compresión Digimess

TC500 con una celda de carga 10. Microscopio invertido

("Interface" de Arizona, EE.UU.) de Nikon Eclipse TS100.

capacidad de 50N (SM-50N) a


11. Microscopio Confocal
temperatura ambiente.
LeicaTSC SP5 AOBS, perteneciente

7. Se utilizó un instrumento al consorcio conformado en la

Ramé-Hart Modelo 500 goniómetro Facultad de Cs. Exactas, U.N.L.P.

(Ramé-Hart Instrument co., USA)


12. Estufa de cultivo CO2
para la medición de WCA. Las
Incubator HF 151 UV Heal Force®.
imágenes fueron analizadas con
13. Espectrofotómetro Zeltec
DROP image avanzadas de software
modelo ZL 5000 y PG Instruments
v2.2.
modelo (UV-Visible
8. Microscopio Electrónico de
spectrophotometer).
Barrido Phillips 505, con una
14. Lector de placas de ELISA
aceleración de voltaje de 20 kV. Las
Sirio S SAECS, Radim Company,
imágenes obtenidas fueron
Buenos Aires, Argentina.

Cap. 3: Materiales y Métodos. 61


Capítulo 4

Resultados

“Si buscas resultados distintos, no hagas siempre lo mismo.”


Albert Einstein
Capítulo 4: Resultados.
1. Obtención de las membranas 1.1.-Caracterización:

PCL y PFIP: Ambas membranas fueron

caracterizadas mediante la
Antes de obtener la mezcla
utilización de microscopia
compatibilizada entre PCL y PFIP,
electrónica de barrido (SEM). La
se caracterizaron las membranas de
figura 1 presenta las fotografías en
los homopolímeros por separado,
las que se pueden observar las
evaluando la topografía de las
características de superficie de las
mismas. Luego se realizaron
membranas de los polímeros
ensayos de adhesión y proliferación
obtenidas por el método casting. En
celular para conocer la influencia de
ellas se puede observar las
los homopolímeros sobre el
diferencias topográficas entre las
crecimiento celular.
membranas de los homopolímeros.
De acuerdo al punto 1.6 del
La película obtenida de PFIP, posee
capitulo de Materiales y métodos,
una superficie muy homogénea y
las primeras membranas obtenidas
lisa, mientras que la obtenida a
fueron de los polímeros
partir de PCL presenta algunos
poliepsiloncaprolactona (PCL) y
poros de aproximadamente unos 40
polifumarato de di-isopropilo
a 50 m de diámetro. Se observan
(PFIP), obtenidas mediante el
también estructuras cristalinas con
método de casting usando
forma de esferulitas de diámetros
cloroformo como solvente.
variables.

Cap. 4: Resultados. 63
A D

B E

C F
Figura 1: Micrografías de SEM de las membranas PFIP [A, B y C] y PCL [D, E y F]

En la figura se muestran además, que hay algunos poros

también los perfiles transversales de dentro de ella al igual que en su

las membranas (Figura 1 C y 1F). Se superficie. Vale aclarar que para

puede notar que las membranas son obtener estas últimas fotografías, las

homogéneas no sólo en la superficie películas no fueron cortadas con

sino también en el seno de ellas. En tijera para evitar alteraciones de los

la membrana de PCL se observa,

Cap. 4: Resultados. 64
perfiles por efectos de las presiones proliferación usando como control

durante el corte. (en los mismos períodos de tiempo)

las células crecidas sobre un disco


1.2.-Biocompatibilidad:
de plástico de cultivo de tejido
1.2.1.-Adhesión y proliferación:
estándar.

Para estos estudios las células


1.2.1.1-UMR-106:
UMR-106 y MC3T3-E1 fueron
La figura 2 muestra los
crecidas sobre las matrices, fijadas
resultados del ensayo de adhesión y
con metanol y teñidas con
proliferación de las células UMR-
Hematoxilina y Eosina a los tiempos
106 crecidas sobre las membranas de
de 1 hora de incubación celular para
los homopolímeros PCL y PFIP.
evaluar adhesión y 24 horas para

Figura 2: Adhesión y proliferación de las células UMR-106 en las membranas de PCL y PFIP.

Los resultados se expresaron como la media  SEM.

p<0,001) sobre la membrana de PFIP


Se puede observar una menor
al igual que con las matrices de PCL
adhesión de las células UMR-106
(33±8 % respecto al control; X:
(36±5 % respecto al control; X:
p<0,001). No se encontraron

Cap. 4: Resultados. 65
diferencias significativas en la puede observar el aspecto de las

adhesión celular entre los células teñidas con Hematoxilina y

homopolímeros. Eosina al microscopio óptico. Las

células adheridas a estas matrices


En cuanto a la proliferación
poliméricas muestran una
celular, se puede observar también
morfología redondeada con
un menor crecimiento celular sobre
extensiones de filopodios. Algunas
ambos homopolimeros (PCL: 62±5
parecen estar incluidas dentro de las
% respecto al control; #: p<0,05 y
películas. Por otro lado, los
PFIP: 45±3 % respecto al control; X:
osteoblastos adheridos a la matriz
p<0,001). Por otro lado, encontramos
de PFIP se ven más picnóticos, de
que las células proliferaron
forma redondeada y se distribuyen
alrededor de 40% más sobre las
en forma aislada o formando grupos
películas de PCL que sobre las de
de células en la superficie.
PFIP (&: p<0,01). En la figura 3 se

A C

B D
Figura 3: Células UMR-106 crecidas en PCL y PFIP. A, B Adhesión. C y D Proliferación. A y C
PFIP. B y D, PCL. Obj 40x

Cap. 4: Resultados. 66
1.2.1.2.-MC3T3-E1: evaluando su adhesión y

proliferación (figura 4) después de


Al igual que las UMR-106, se
ser teñidas con Hematoxilina y
sembraron células MC3T3-E1
Eosina.

Figura 4: Adhesión y proliferación de las células MC3T3-E1 en las membranas de PCL y PFIP.

La figura 4 muestra los de PFIP (alrededor de 40% del PFIP;

resultados de los ensayos de &: p< 0,01).

adhesión y proliferación de las


En cuanto a proliferación, tanto
células MC3T3-E1 crecidas sobre las
en PFIP (44±3 %; #: X<0,001) y como
membranas, en donde la adhesión
en PCL (43±3 %; &: X<0,001) las
fue significativamente menor en las
células proliferaron menos que el
membranas de PFIP (38±5 %; X:
control. No se observaron
p<0,001) y PCL (54±5 %; &: p<0,01)
diferencias significativas en la
respecto al control. La adhesión en
proliferación entre las células
PCL fue mayor que sobre los films
MC3T3-E1 crecidas en PCL y PFIP.

En la figura 5 se observa el aspecto

Cap. 4: Resultados. 67
de las células MC3T3-E1 crecidas sobre las membranas.

A C

B D

Figura 5: Células MC3T3-E1 crecidas en PCL y PFIP. A, B Adhesión. C y D Proliferación. A y C


PFIP. B y D, PCL.

2. Obtención de Mezcla poliester, posee una capacidad de

biodegradación mayor que PFIP.


Compatibilizada:
Esta diferencia es consecuencia de la
En esta etapa se consideraron
naturaleza de su correspondiente
el hecho de la diferente naturaleza
estructura catenaria. En el caso del
química y propiedades de ambos
PFIP la cadena polimérica está
homopolímeros (PCL y PFIP). Por
constituida exclusivamente por
ejemplo, el PFIP se caracteriza por
uniones C-C, mientras que el PCL
ser más vítreo que PCL, haciéndolo
posee en su estructura puentes éster,
por lo tanto un material más rígido,
C-O-(O)C, lo que le confiere, sitios
frágil y quebradizo que este último.
factibles de ruptura hidrolítica.
A su vez, debido a que PCL es un
Estas diferencias estructurales

Cap. 4: Resultados. 68
explican la mayor hidrofobicidad un copolímero de tipo block7 útil

del PFIP respecto a PCL. Como para la compatibilización de la

consecuencia de tales diferencias mezcla. Por este motivo, se utilizó la

una mezcla física de tales polímeros degradación por medio de la

presentará separación de fases y un aplicación de ultrasonido para

deterioro de sus propiedades producir una mezcla

mecánicas. Por este motivo es muy compatibilizada entre ambos

importante poder realizar una homopolímeros.

mezcla compatibilizada entre ambos


2.1.-Degradación de los
polímeros con el fin de lograr una
homopolímeros y de la mezcla:
combinación deseable de las
Como se explicó en el punto
propiedades que están a menudo
1.3 del capítulo Materiales y
ausentes en los homopolímeros.
métodos, se utilizó un equipo de
Sin embargo, en la mayoría de
ultrasonido para degradar las
los casos la simple mezcla de dos
soluciones de los polímeros (1% en
polímeros no produce buenos
cloroformo). Se tomaron muestras
resultados, debido a la
en el proceso de degradación a
incompatibilidad de la misma.
distintos períodos de tiempos y se
Algunos estudios han demostrado
evalúo la disminución en el peso
[Lebovitz, 2003; Oh, 2003] que
molecular promedio empleando un
debido a la aplicación de
cromatógrafo de exclusión
ultrasonido se forman
molecular (SEC).
macroradicales por escisión de las
El estudio de degradación se
cadenas poliméricas. Las reacciones
realizó sobre los homopolímeros
pueden llevar a la formación de

interpolímeros debido al 7 Un copolímero block es un polímero


constituido por dos monómeros distintos, en los
acoplamiento de dichos cuales todos los monómeros de un mismo tipo
se encuentran agrupados entre sí, lo mismo para
macrorradicales y a la obtención de el otro tipo de monómeros. Se puede imaginar a
un copolímero block como dos homopolímeros
unidos.

Cap. 4: Resultados. 69
PCL y PFIP* (PFIP contiene un los pesos moleculares promedio en

grupo final fluorescente 3- peso (MW) expresado como

phenylazobenzoilo) y sobre la MWT/MWO, donde MWT es el peso

mezcla PCL-PFIP* en una molecular promedio en peso del

proporción en peso de 3:1. polímero luego de la degradación a

tiempo t (minutos) y MWO es el peso


En la figura 6 se pueden
molecular promedio en peso inicial
observar la disminución relativa de
del polímero (tiempo t = 0).

Figura 6: Degradación de los homopolímeros y de la mezcla a distintos tiempos por ultrasonido.

acuerdo con otros estudios de


Tanto la mezcla como el PFIP*
ultrasonido [Lebovitz, 2003; Oh,
fueron degradados más rápido que
2003], que han informado que la
PCL, aunque en todos los casos se
escisión de la cadena alcanza un
observó una disminución de la tasa
peso molecular limite, por debajo
de degradación después de 10
del cual no se produce una mayor
minutos. Este resultado está de
degradación.

Cap. 4: Resultados. 70
En la figura 7 se puede minutos de exposición a

observar los elugramas de la mezcla ultrasonido.

PFIP*/PCL a los tiempos 0 y 60

A B

Figura 7: Elugramas de la mezcla degradada a tiempo 0 min [A] y tiempo 60 min [B]. (Ve:
volumen de elución)

La formación de productos de grupo cromóforo derivado del

interpolímero por acoplamiento de iniciador. El segundo detector (en

los macroradicales formados por serie con el anterior) es un detector

ultrasonidos se comprobó mediante infrarrojo, seleccionado a la

el análisis de SEC de una mezcla frecuencia específica de los grupos

que incluía PFIP* (Figura 7A y 7B). carbonilo de los esteres (5,75 m o

1720 cm-1), que permite la detección


En el elugrama la señal de este
de ambos polímeros (PCL y PFIP).
polímero, obtenido por

polimerización radicalaria con El cromatograma centrado en

peróxido de 3-fenilazobenzoilo 27,8 ml (figura 7A), representa la

como iniciador, se registró mezcla de los polímeros PCL y

empleando doble detección El PFIP* en el momento inicial de la

primer detector, UV-visible degradación por ultrasonido.

seleccionado a 320 nm es indicativo


La figura 7B presenta el
de las cadenas terminadas en el
cromatograma correspondiente a

Cap. 4: Resultados. 71
dicha mezcla luego de los 60 2.2.-Caracterización:

minutos de sonicación. Después de


2.2.1.-Microscopia Electrónica:
exponer la solución de la mezcla a la
Las figuras 8 A-D muestran las
fuente de ultrasonido de alta
imágenes de SEM de las películas
intensidad, el cromatograma
obtenidas a partir de la mezcla
presentó una distribución bimodal
compatibilizada (A), una mezcla
de los pesos moleculares: se
física, mezcla de PCL/PFIP 3:1 sin
observan dos picos: el primero,
compatibilizar por ultrasonido (B) y
centrado a un volumen de elusión
los dos homopolímeros, PCL (C) y
de 28,8 ml, y el segundo a un
PFIP (D). La mezcla compatibilizada
volumen de elución mayor (33,5 ml)
de PCL/PFIP (Figuras 8A) presenta
que corresponde a un menor peso
una superficie más homogénea que
molecular. Este segundo pico puede
la mezcla física. En la figura 8B se
ser atribuido a productos de
observa que en la mezcla física
reacción de los radicales generando
existe separación de fases, con una
así interpolímeros de tipo block.
superficie irregular y rugosa que
Aunque los productos finales no
corresponde a la fase de PFIP
fueron aislados, la detección por UV
dispersa en la fase continua de PCL.
pone en evidencia la presencia de

nuevas especies conteniendo mayor

relación de cromóforo por unidad

repetitiva.

Cap. 4: Resultados. 72
A B

C D
Figura 8: Microscopía electrónica de barrido de la mezcla compatibilizada [A], mezcla física [B],

película de PCL [C] y PFIP [D].

Estos resultados sugieren que ser adecuadas para que no se

el tratamiento por ultrasonido es colapsen durante las actividades

una técnica eficaz para la generación normales de los pacientes [Rezwan,

de una mezcla compatibilizada de 2006].

dos polímeros no miscibles entre si.


Se sabe que el PFIP es un

2.2.2.-Pruebas mecánicas: material frágil con una alta

resistencia a la tracción, pero estas


Como se describió en el
características se pueden mejorar
capitulo Introducción, uno de los
mediante la mezcla con otros
requisitos importantes para el uso
polímeros [Koinuma, 1997]. La tabla
de los materiales como matrices en
1 muestra las propiedades
regeneración de tejido óseo son sus
mecánicas evaluadas para mezcla
propiedades mecánicas. Estas deben

Cap. 4: Resultados. 73
compatibilizada, la mezcla física y PCL.

Resistencia última Alargamiento en el


Modulo elástico
Muestra a la tracción punto de ruptura
(MPa)
(MPa) (%)

Mezcla
143 ± 12 7,5 ± 0,7 60 ± 12
Compatibilizada

Mezcla Física 96 ± 16 # 6,4 ± 1,7 75 ± 4

PCL 161 ± 12 15,2 ± 1,7 # 366 ± 96 #

Tabla 1: Propiedades mecánicas de las películas mezclas PCL / PFIP compatibiliza, mezcla física

PCL/PFIP y PCL.

Los datos presentados en la disminución de 84% y 62% en las

tabla 1 indican que la mezcla física mezclas compatibilizadas y física,

de los polímeros PCL y PFIP posee respectivamente (#: p<0,05) respecto

un modulo elástico menor (#: de PCL.

p<0,05) respecto a la mezcla


El alargamiento al punto de
compatibilizada y que el film de
ruptura, una estimación de la
PCL. También se encontró una
ductilidad de un material, mostró
disminución de casi un 50% en la
una disminución estadísticamente
resistencia ultima a la tracción (#:
significativa en ambas mezclas,
p<0,05), en las mezclas física y
debido al agregado de PFIP, dado
compatibilizada respecto de PCL.
que este polímero es más rígido que
Respecto del Alargamiento en el
PCL.
punto de ruptura, se observó una

Cap. 4: Resultados. 74
obtenidas a partir de un biomaterial
2.2.3.-Hidrofobicidad-
es un dato muy importante para el
hidrofilicidad:
diseño de las matrices y selección de
Muchos autores [Harnett, 2007;
materiales.
Jansen, 2004; Liu, 2010;
Por este motivo se determinó el
Tangpasuthadol, 2003; Williams,
ángulo de contacto de las películas
1995; Zanchetta, 2001] sugieren que
(figura 9) de los homopolímeros y
la interacción entre las membranas
de la mezcla compatibilizada.
de los materiales y las células, en

una primera instancia, depende de PFIP posee un ángulo de

interacciones débiles, por ejemplo contacto mayor (92,6º ± 0,2º; X:

dipolo-dipolo, entre las distintas p<0,001) que PCL (70,5º ± 0,2º),

estructuras de la membrana mientras que la mezcla

citoplasmática y el material. compatibilizada (75,4º ± 0,2º; X:

p<0,001 respecto PCL y PFIP)


Es así que la hidrofobicidad o
muestra un mayor equilibrio entre
hidrofilicidad de las películas
los dos homopolímeros.

A B C

Figura 9: fotografías de ángulo de contacto de Mezcla compatibilizada [A], PCL [B] y PFIP [C].

de las células UMR 106 y MC3T3 E1


2.3.- Biocompatibilidad:
así como la diferenciación de las
La biocompatibilidad de la
células MC3T3 E1 osteoblásticas.
mezcla compatibilizada PCL/PFIP
2.3.1.-Adhesión y Proliferación:
fue evaluada por su capacidad de

soportar la adhesión y proliferación

Cap. 4: Resultados. 75
2.3.1.1.-Células UMR-106: células UMR-106 en las membranas.

Los resultados se expresan como


La figura 10 muestra los
porcentaje de células adheridas o
resultados de los ensayos de
proliferadas respecto a la mezcla
adhesión y proliferación de las
compatibilizada.

Figura 10: adhesión y proliferación de las células UMR-106 en las membranas de PCL, PFIP y

mezcla compatibilizada.

De la figura anterior, se puede En la figura 11 se pueden ver la

observar un aumento significativo morfología de las células sobre las

(#: p<0,05) tanto en la adhesión diferentes membranas. Se puede

como en la proliferación de las observar la opacidad de la

células UMR-106 plaqueadas sobre membrana de la mezcla

la mezcla compatibilizada respecto a compatibilizada y la del PCL.

los homopolímeros.

Cap. 4: Resultados. 76
A D

B E

C F
Figura 11.: Células UMR-106 crecidas en Mezcla compatibilizada, PCL y PFIP. A, B y C

Adhesión. D, E y F Proliferación. A y D, Mezcla compatibilizada. B y E, PCL. C y F, PFIP. Barra


de referencia: 50 m.

homopolímeros, estas observaciones


En el caso de la proliferación, sugieren que las células
las células en la mezcla osteoblásticas crecen mejor en la
compatibilizada mostraron un mezcla de polímeros que en las
mayor número de filopodios que en películas de cualquiera de los
las membranas obtenidas de los homopolímeros.

Cap. 4: Resultados. 77
2.3.1.2.-Células MC3T3-E1: E1 y se evaluó adhesión y

proliferación. En la figura 12 se
Al igual que las células UMR-
puede observar los valores relativos
106, se plaquearon células MC3T3-
a la mezcla compatibilizada.

Figura 12: adhesión y proliferación de las células MC3T3-E1 en las membranas de PCL, PFIP y

mezcla compatibilizada.

En la figura anterior se puede mediante microscopia óptica. Las

observar un aumento tanto en la células adheridas y proliferadas

adhesión como en la proliferación sobre las matrices mostraron un

(#: p<0,05) de las células MC3T3-E1 buen desarrollo y difusión de sus

cultivadas sobre la membrana de la prolongaciones.

mezcla compatibilizada respecto a

los homopolímeros.

En la figura 13 se muestran las

células sobre las membranas

Cap. 4: Resultados. 78
A D

B E

C F
Figura 13: Células MC3T3-E1 crecidas en Mezcla compatibilizada, PCL y PFIP. A, B y C

Adhesión. D, E y F Proliferación. A y D, Mezcla compatibilizada. B y E, PCL. C y F, PFIP.

2.3.2- Inmunofluorescencia: actina. Después de 24 horas de

cultivo se evaluó la organización del


La interacción de los
citoesqueleto y los núcleos de las
osteoblastos con las diferentes
células UMR-106 cultivadas en las
películas poliméricas fue
diferentes películas (figura 14). Las
investigada mediante la evaluación
células previamente fijadas se
del desarrollo del citoesqueleto de
tiñeron para actina (verde) con FITC

Cap. 4: Resultados. 79
phalloidin y los núcleos (azul) con de actina con filamentos bien

DAPI, observándolas luego por desarrollados. Las células crecidas

microscopía de fluorescencia. sobre los homopolímeros

presentaron una morfología


Las células crecidas sobre la
diferente, mostrando un esqueleto
mezcla exhibieron un citoesqueleto
de actina desorganizado.

A D

B E

C F

Figura 14: Células UMR-106 crecidas en Mezcla compatibilizada, PCL y PFIP. A, B y C DAPI. D,

E y F FITC phalloidin. A y D, Mezcla compatibilizada. B y E, PCL. C y F, PFIP.

Cap. 4: Resultados. 80
2.3.3.-Marcadores de horas de cultivo de las células UMR-

diferenciación osteoblástica: 106. Este parámetro no se vio

afectado por la naturaleza de las


Se evaluó la capacidad de las
matrices investigadas. Por el
células crecidas sobre las diferentes
contrario, se observó una mayor
matrices de expresar dos
producción (#: p<0,05) de COL t1,
marcadores de diferenciación
producido por células UMR-106 que
osteoblastica: la síntesis de colágeno
crecieron en la mezcla
tipo 1 (COL t1) y la actividad de la
compatibilizada de los polímeros,
enzima fosfatasa alcalina (ALP).
sugiriendo una mayor
La figura 15 muestra la
biocompatibilidad con esta película.
expresión de ALP después de 48

Figura 15: Producción de marcadores Osteoblásticos durante 48 horas de las células UMR-106

sobre las membranas de PCL, PFIP y mezcla compatibilizada.

También se evaluó la preosteoblastica MC3T3-E1. La

producción de los marcadores figura 16, muestra la producción de

osteoblástico en la línea dichos ALP y Col t1 luego de 2

Cap. 4: Resultados. 81
semanas de cultivo en un medio ALP, mientras que si hay un

osteogénico. En este grafico, se aumento (#: p<0,05) en la

observa que no hay cambios producción de COL t1 en las

significativos en la expresión de membranas de PCL.

Figura 16: Producción de marcadores Osteoblásticos durante 2 semanas de las células MC3T3-

E1 sobre las membranas de PCL, PFIP y mezcla compatibilizada.

Finalmente se evaluó la deposición en los nódulos

capacidad de las células MC3T3-E1 mineralizados según la evaluación

para mineralizar la matriz de la tinción con rojo de alizarina S,

extracelular en las diferentes en comparación con las películas de

membranas poliméricas después de los homopolímeros.

tres semanas de cultivo en presencia

de de β-glicerol fosfato y ácido

ascórbico.

La figura 17 muestra que la

mezcla promueve fuertemente la

Cap. 4: Resultados. 82
A B

Figura 17: fotografías de nódulos de mineralización teñidos con Rojo de Alizarina .A: Mezcla

compatibilizada, B: PCL y C: PFIP. Barra de referencia: 100 µm.

3. Obtención de Hidroxiapatita: En la literatura [Cao, 1996;

Jarcho, 1976; Toriyama, 1996;


Con el fin de mejorar las
Otsuka, 1994], se pueden encontrar
propiedades tanto mecánicas como
distintas formas de obtener HAP.
osteogénicas, se suelen agregar a la

matrices poliméricas partículas de En la presente sección, se

distintas sustancias inorgánicas tales mostrarán los resultados de la

como partículas de hidroxiapatita obtención y caracterización de HAP

(HAP), componente inorgánico de obtenida a partir de hueso bovino.

los huesos. Como se explicó en el capítulo

Materiales y métodos, la HAP se

Cap. 4: Resultados. 83
obtuvo incinerando [Ooi, 2007] Fourier (FTIR) con el fin de conocer

trozos de huesos bovino a 900ºC el espectro infrarrojo mientras que

durante 1 hs. por espectroscopia de energía

dispersa de rayos X (EDAX) es


3.1.-Caracterización:
posible conocer la composición
Con el fin de caracterizar las
química. En la figura 18 se puede
cenizas obtenidas y comprobar que
observar el espectro FTIR de HAP
se ha obtenido HAP, se realizaron
obtenida con indicación de las
medidas de Espectroscopia
principales bandas.
infrarroja con transformada de

Figura 18: espectro FTIR de HAP.

los cristales de HAP [Joschek, 2000;

Walters, 1990]. Las bandas a 1.090,


Las bandas a 3.572, 3.409 y 632
1.047, 602 y 570 cm-1 indican la
cm-1 corresponden a los grupos OH
presencia de los grupos PO43-.
estructurales (libre y asociado) en
Además, se observan dos bandas en

Cap. 4: Resultados. 84
1.456 y 1.412 cm-1 que corresponden La figura 19 muestra el

a al componente CO32-. espectro EDAX de HAP obtenida.

Figura 19: espectro EDAX de HAP.

De la figura anterior se puede observan las bandas características

observar que en la HAP analizada del grupo carbonato (1.456 y 1.412

existen los elementos constituyentes cm-1), así como los obtenidos por

O, P y Ca, siendo estos EDAX para la relación C/P,

constituyentes de dicho material. A demuestran que si bien existe una

partir de la integración de áreas de pequeña impureza de 1,07 % de

CO32-, la obtención de HAP pura a


los picos característicos se calculó la
partir de hueso bovino ha sido
relación molar Ca/P dando el
altamente eficiente.
resultado de 1,67; mientras que el

teórico es 1,66 para la HAP mineral. 3.2.-Disminución de tamaño de

Además, se encuentra trazas del las partículas de HAP:

elemento C, dando una relación La reducción de tamaño


molar C/P de 0,03. promedio de las partículas de HAP

Los resultados conjuntos obtenidas es importante por varias

obtenidos mediante espectroscopía razones. En particular, ayuda a

FTIR (figura 18) en el que se mejorar la integración de las mismas

Cap. 4: Resultados. 85
en la matriz poliméricas y permite tamaño de poro 75 m [CRC

una suspensión estable cuando se Handbook of Chemistry and

disuelven las mismas con el Physics, 67th edition], luego se

polímero en el cloroformo. Además, disgregaron mecánicamente

el tamaño de las partículas de HAP utilizando un equipo de

presentes en el hueso, como se degradación mecánica Ultra-turrax

describió en Introducción, son del T25 como se describió en el capitulo

orden de 50 nm. de Materiales y métodos. La figura

20 muestra las fotografías de SEM


Las partículas obtenidas en este
de las partículas de HAP antes y
trabajo de tesis, fueron tamizadas
después del tratamiento.
con un tamiz numero 200, con un

A B

C D
Figura 20: fotografías de SEM de HAP antes [A y B] y después [C y D] de la aplicación de

ultrasonido.

En la figura anterior se puede partículas entre las no tratadas y las

observar la diferencia de tamaño de tratadas por ultraturrax.

Cap. 4: Resultados. 86
En la figura 21 se representa tamaños de las partículas y la

mediante un histograma los dispersidad de las mismas.

A B

Figura 21: distribución de tamaños de la partícula de HAP, tratadas con ultraturrax [A] y

no tratadas [B].

Así, se obtuvo por este disolviendo la mezcla polímero-

tratamiento, un tamaño de HAP (1 % p/p de HAP en polímero)

partículas de 225 ± 4 nm frente a las en cloroformo, homogenizada y

no tratadas de 48.639 ± 1.886 nm. Es vertida sobre placa de petri,

decir, el tamaño de partículas de secándose a temperatura ambiente y

redujo a un 0,46 % del tamaño luego en tambor de vacío hasta

tamizado. llegar a peso constante.

4. Obtención de películas con 4.1.-Caracterización:

HAP: 4.1.1.-Microscopia Electrónica:

Una vez caracterizada la HAP Las películas obtenidas, de

obtenida a partir de hueso vacuno, PCL y de Mezcla compatibilizada

se obtuvieron membranas de PCL y PCL/PFIP (mezcla) con y sin HAP

de mezcla compatibilizada de 1% p/p, fueron caracterizadas

PCL/PFIP conteniendo HAP. Como mediante SEM con el fin de conocer

se explicó en el capítulo Materiales y su topografía. Además, se tiñeron

métodos, las películas se obtuvieron con rojo de Alizarina (este colorante

Cap. 4: Resultados. 87
tiene alta afinidad por Ca+2, En la figura 22 se observan las

constituyente de HAP) para conocer fotografías de SEM de las películas

las distribución de las partículas de obtenidas.

HAP en las membranas.

A B

C D
Figura 22: imágenes de SEM de la superficie de Mezcla [A], Mezcla-HAP [B], PCL [C] y PCL-

HAP [D].

Las membranas muestran la esferulitas. Esto también se asoció

morfología típica tipo esferulitas con un aumento de la rugosidad de

similar a la descripta previamente la superficie del polímero-HAP.

para PCL pura. La adición de un


En la figura 23 se pueden
pequeño porcentaje de HAP a la
observar las membranas teñidas con
matriz induce una pequeña
rojo de alizarina.
disminución en el tamaño de las

Cap. 4: Resultados. 88
A B

C D

E F

G H
Figura 23: Microscopia óptica de las membranas teñidas con rojo de alizarina: Mezcla a 40X [A]

y 10X [B], Mezcla con HAP 1% p/p a 40X [C] y 10X [D], PCL a 40X [E] y 10X [F] y PCL con HAP
1% p/p a 40X [G] y 10X [H].

Cap. 4: Resultados. 89
En la figura 23 se puede más grandes en la Mezcla-HAP.

observar una distribución Además, no se encontraron regiones

homogénea de las partículas de teñidas en los controles de PCL y

HAP en la matriz de PCL-HAP, Mezcla.

mientras que las partículas son algo


4.1.2.-Pruebas mecánicas:

Resistencia última Alargamiento en el


Modulo Elástico
Muestra a la tracción punto de ruptura
(MPa)
(MPa) (%)

Mezcla 143 ± 12 7,5 ± 0,7 60 ± 12

Mezcla-HAP 182 ± 6 # 7,4 ± 0,7 20 ± 1 #

PCL 161 ± 12 15,2 ± 1,7 x 366 ± 96 x

PCL-HAP 249 ± 12 # 16,5 ± 0,5 x 210 ± 21

Tabla 2: Propiedades mecánicas de las películas Mezcla, Mezcla-HAP, PCL y PCL-HAP.

La Tabla 2 muestra las con las matrices sin el agregado de

propiedades mecánicas evaluadas HAP. No se observaron cambios en

de las diferentes matrices. La la resistencia última a la tracción por

adición de HAP aumenta el módulo la adición de hidroxiapatita a las

elastico de las matrices PCL y matrices. Sin embargo, HAP indujo

Mezcla. El módulo de PCL-HAP y una reducción en el alargamiento en

Mezcla-HAP exhiben un incremento el punto de ruptura del 43% para

del 55% (#: p<0,05) y 27% (#: p<0,05) PCL (x: p<0,001) y del 67% para la

respectivamente en comparación Mezcla (#: p<0,05), una medida de la

Cap. 4: Resultados. 90
ductilidad de un material. En significantemente mayor que PCL

conjunto estas observaciones con HAP (66,8º ± 0,3º). En la figura

sugieren que las propiedades 24 C, se puede observar la diferencia

mecánicas de las matrices-HAP han producida en el ángulo de contacto

mejorado significativamente de las membranas de los polímeros

obteniéndose, como era de esperar, con el agregado de HAP. Dicho

un material más rígido. agregado de HAP disminuye el

ángulo de contacto de las matrices


4.1.3-Hidrofobicidad-
poliméricas (PCL: 70,5º ± 0,2º vs PCL
hidrofilicidad:
HAP: 66,8º ± 0,3º; X: p<0,001 y
En la figura 24 se pueden
Mezcla: 75,4º ± 0,2º vs Mezcla HAP:
observar los ángulos de contacto de
70,5º ± 0,2º; X: p<0,001), haciéndolas
las membranas polímeros PCL y
mas hidrofílicas.
Mezcla compatibilizada con el

agregado de HAP. El valor de

ángulo de contacto para la mezcla

compatibilizada con HAP (70,5º ±

0,2º; X: p<0,001) fue

A B

Cap. 4: Resultados. 91
C
Figura 24: fotografías de ángulo de contacto de Mezcla-HAP [A] y PCL-HAP [B]. C presenta las
medidas experimentales de los ángulos de contactos de las matrices obtenidas.

4.2.-Biocompatibilidad: membranas de PCL y Mezcla sin el

agregado de HAP.
4.2.1.-Adhesión y proliferación:

4.2.1.1.-UMR-106:
Al igual que el punto 2.3.1 del

presente capítulo, se evalaron la En la figura 25 se puede

adhesión y la proliferación de las observar los resultados de adhesión

células UMR-106 y MC3T3-E1 sobre y proliferación de las células UMR-

las membranas PCL-HAP Mezcla- 106 crecidas sobre las membranas.

HAP, usando como control las

Cap. 4: Resultados. 92
Figura 25: Adhesión y proliferación de células UMR-106 sobre las membranas de Mezcla-HAP,

Mezcla, PCL-HAP y PCL.

De la figura anterior, se puede el PCL-HAP (x: p<0,001). En cuanto

observar el aumento significativo de a la proliferación, hay un

adhesión y proliferación con el comportamiento similar al de la

agregado de HAP de las células adhesión. El agregado de HAP

UMR-106 sobre las membranas con aumenta la proliferación sobre la

el agregado de HAP. Observando Mezcla-HAP respecto a la Mezcla (x:

los resultados de adhesión, el p<0,001), así como sobre PCL-HAP

agregado de HAP produce un respecto a PCL (&: p<0,01) con

aumenta la adhesión sobre la diferencias entre la Mezcla-HAP y

Mezcla-HAP respecto a la Mezcla (x: PCL-HAP (x: p<0,001).

p<0,001) y también sobre de PCL-


En la figura 26 se observan las
HAP respecto al PCL (#: p<0,05),
imágenes de las células teñidas
además, existe una diferencia
sobre las membranas.
significativa entre la Mezcla-HAP y

Cap. 4: Resultados. 93
A E

B F

C G

D H
Figura 26: Microscopia óptica de células UMR-106 crecidas sobre las membranas. A-D:

adhesión. E-H: proliferación. A y E: Mezcla-HAP. B y F: Mezcla. C y G: PCL-HAP. D y H: PCL.

Cap. 4: Resultados. 94
4.2.1.2.-MC3T3-E1:

En la figura 27 se observan los células MC3T3-E1 crecidas sobre las

resultados de los ensayos de membranas.

adhesión y de proliferación de las

Figura 27: Adhesión y proliferación de células MC3T3-E1 sobre las membranas de Mezcla-HAP,
Mezcla, PCL-HAP y PCL.

De la figura anterior, se puede respecto del PCL (&: p<0,01), no

ver que el agregado de HAP habiendo diferencia significativa

aumenta la adhesión celular sobre la entre los resultados encontrados

Mezcla-HAP respecto a la Mezcla (#: sobre películas de Mezcla-HAP y

p<0,05) y sobre PCL-HAP respecto PCL-HAP. En la figura 28 se pueden

al PCL (x: p<0,001). No hay observar las células MC3T3-E1

diferencia significativa entre el crecidas sobre las membranas. En

comportamiento de adhesión celular general, las células desarrollaron

sobre Mezcla-HAP y PCL-HAP. En buenas extensiones citoplasmáticas,

cuanto a proliferación, el agregado tanto las adheridas como las que

de HAP aumenta la proliferación de proliferaron. Además, el agregado

las células sobre las películas de de HAP a las membranas pareció

Mezcla-HAP respecto a Mezcla (&: aumentar el número de estas

p<0,01), así como sobre PCL-HAP prolongaciones

Cap. 4: Resultados. 95
A E

B F

C G

D H
Figura 28: Microscopia óptica de células MC3T3-E1 crecidas sobre las membranas. A-D:

adhesión. E-H: proliferación. A y E: Mezcla-HAP. B y F: Mezcla. C y G: PCL-HAP. D y H: PCL.

Cap. 4: Resultados. 96
4.2.2.-Marcadores de las células sobre la Mezcla-HAP

Osteoblásticos: (#: p<0,05) respecto de la Mezcla

pero no produjo cambios en PCL-


Se evaluó en las células UMR-
HAP respecto de PCL.
106 crecidas sobre las diferentes

matrices, la capacidad de expresar En cuanto a la producción de

los marcadores de diferenciación COL t1, el agregado de HAP indujo

antes descriptos, la síntesis de un aumento en la expresión del

colágeno tipo 1 (COL t1) y la COL t1 para las células crecidas

actividad de la enzima fosfatasa sobre la Mezcla-HAP y la PCL-HAP

alcalina (ALP). La figura 29 muestra respecto de la Mezcla (&: p<0,01) y

la expresión de ALP y la producción respecto del PCL (#: p<0,05).

de COL t1 después de 48 horas de

cultivo de células UMR-106. En ella

se puede ver que el agregado de

HAP aumentó la expresión de ALP

Figura 29: Producción de marcadores Osteoblásticos durante 48 horas de las células UMR-106
sobre las membranas Mezcla-HAP, Mezcla, PCL-HAP y PCL.

Cap. 4: Resultados. 97
También se utilizaron células p<0,05) la expresión de ALP cuando

MC3T3-E1 (figura 30) para evaluar las células MC3T3-E1 fueron

los marcadores osteogénicos, en un inducidas a diferenciarse durante 2

cultivo de 2 semanas en un medio semanas. En cuanto a la producción

de diferenciación osteogénico. de COL t1, sólo hubo un aumento

significativo (#: p<0,05) cuando las


El agregado de la HAP a las
células crecieron sobre la Mezcla-
matrices de la Mezcla y de PCL,
HAP respecto a de la Mezcla.
inhibió significativamente (#:

Figura 30: Producción de marcadores Osteoblásticos durante 2 semanas de las células MC3T3-

E1 sobre las membranas Mezcla-HAP, Mezcla, PCL-HAP y PCL.

Dado que las membranas en el punto 2.3.4 de este capítulo o

contienen Ca y P provenientes de la con von Kossa (colorante espeíifico

HAP, no es posible evaluar la para P). Por este motivo se evaluó la

mineralización (deposición de Ca/P) expresión de Runx-2, uno de los

en la matriz por técnicas clásicas principales factores de transcripción

como la tinción con Sirius red expresados durante la osteogénesis.

(colorante específico para Ca) como La expresión de Runx-2 y la actina

Cap. 4: Resultados. 98
se determinaron mediante la técnica Runx-2 se expresó mayormente

de Western blot. (figura 31) cuando las células fueron

cultivadas sobre scaffolds que


Después de tres semanas
contenían HAP (#: p<0,05).
(período de mineralización) del

cultivo en un medio osteogénico, la

línea de células osteoblástica

MC3T3-E1 se han diferenciado y

mineralizado la matriz. El factor

Figura 31: Efecto de los andamios sobre la expresión de Runx-2 en células MC3T3-E1.

4.3.-Degradación:

La tasa de degradación de las los requisitos para su utilización

membranas de los polímeros es un como scaffolds en el área de la

dato muy importante, ya que uno de regeneración de tejido óseo es que

Cap. 4: Resultados. 99
los polímeros se degraden a medida %W = (Wo-Wt) x 100/Wo

que el tejido óseo se encuentra en


fórmula 1
proceso de regeneración.
Wo es el peso inicial de la
Los estudios de degradación se muestra y Wt es el peso de la
llevaron a cabo como se mencionó muestra a tiempo t de degradación.
en el capítulo de Materiales y
En la figura 32 se presentan los
métodos. Brevemente, se analizó la
resultados del ensayo de
degradación de las películas en
degradación de las diferentes
DMEM-10%SFB a 37ºC, calculando
membranas: PCL, PCL-HAP,
el porcentaje de pérdida de peso
Mezcla y Mezcla-HAP.
según la fórmula 1.

Figura 32: degradación de las membranas de PCL, PCL-HAP, Mezcla y Mezcla-HAP en DMEM-

10%SFB.

A partir de los 50 días de rápido (#: p<0,05) que las

incubación se puede observar que membranas de Mezcla y Mezcla-

las membranas de PCL y PCL-HAP HAP. Esto se debe a la naturaleza

se degradan significativamente mas química de los polímeros, dado que

Cap. 4: Resultados. 100


la mezcla contiene PFIP, un nítrico (NO), IL-1 y TNF- al medio

polímero con estructura catenaria C- de cultivo de macrófagos RAW

C. Además, el agregado de HAP en 264.7 crecidos sobre las membranas

las películas, no produce cambios de los polímeros PCL, PCL-HAP,

significativos durante el periodo de Mezcla y Mezcla-HAP.

tiempo analizado.
5.1.- Producción de óxido

5. Ensayos de Citotoxicidad: nítrico:

Debido a que los scaffold Como se explicó en el capítulo

eventualmente serán introducidos de Materiales y métodos, la

en pacientes, es sumamente determinación de NO en el medio

importante que estos materiales no de cultivo se realizó mediante la

induzcan efectos tóxicos para el técnica de Greiss. En la figura 33 se

organismo. A fin de investigar la presentan los resultados del ensayo

posible toxicidad de las membranas, de la liberación de NO en el medio

se midió la liberación de óxido de cultivo a diferentes tiempos: 24,

48 y 72 Hs.

Figura 33: liberación de NO al medio de cultivo por las células RAW 264.7 crecidas sobre plato
de cultivo (control), PCL, PCL-HAP, Mezcla y Mezcla-HAP durante 24, 48 y 72 Hs.

Cap. 4: Resultados. 101


Se puede observar que produciendo un aumento (x:

ninguno de los polímeros p<0,001) estadísticamente

investigados indujo liberación de significativo en la producción y

NO cuando se lo comparó con la liberación de NO al medio.

respuesta de células crecidas sobre


5.2.-Producción de Citoquinas:
un disco de cultivo de tejidos
Una vez evaluada la
estándar (control). Cabe destacar
producción de NO por las células
que, además del control, sobre el
RAW 264.7, se analizó la producción
plato de cultivo se hicieron controles
de dos citoquinas pro-inflamatorias:
positivos agregando al medio de
IL-1 y TNF . En la figura 34 se
cultivo lipopolisacárido (LPS) en
puede observar los resultados de
una concentración de 0,1 ug/ml,
producción de citoquinas.

Figura 34: producción de citoquinas de células RAW 264.7 crecidas sobre plato de cultivo como
control, PCL, PCL-HAP, Mezcla y Mezcla-HAP durante 24, 48 y 72 Hs.

En la figura anterior se puede crecidas sobre los polímeros

ver que no hay diferencia respecto al control. Las células

significativa en los niveles de respondieron en presencia de LPS

producción y liberación de las aumentando la producción de las

citoquinas TNF  e IL 1 liberadas al dos citoquinas después de 24 a 72h

medio de cultivo de las células de cultivo.

Cap. 4: Resultados. 102


6. Membranas porosas: obtenidas por electrospraying

también fue examinada por SEM


6.1.-Caracterización:
(Figuras 35C y 3D). El electrospraying
Las figuras 35a y 35b muestran produjo una película caracterizada
la morfología de la superficie de las por micropartículas homogéneas y
películas obtenidas por el método uniformes sobre los vidrios
de casting. Las micrografías colectores. En las condiciones
revelaron una superficie lisa con la experimentales de este trabajo, se
presencia de huecos y la morfología obtuvieron micropartículas de
típica de esferulita, tal como se polímero de un tamaño uniforme
describió anteriormente. La (6,7 ± 0,1 m de diámetro).
morfología de las estructuras

A B

C D
Figura 35: micrografías electrónicas de barrido que muestra la morfología de la superficie de
PCL/PFIP: a) y b) películas obtenidas por casting con un aumento de 1000x y 100x,
respectivamente, c) y d), placas de vidrio cubiertas con múltiples capas de micropartículas
formadas por electrospraying, en 1000x y 400x.

Cap. 4: Resultados. 103


La evaluación del WCA reveló muestran en la figura 36. Después

una diferencia significativa de una hora de incubación, los

(p<0,001) entre los valores de ángulo osteoblastos presentan un aspecto

de contacto de las membranas no en forma redondeada y aparecen en

porosas (74º ± 1º) y de las matrices áreas discretas de las películas. Sin

porosas (132º ± 1º). embargo, en el caso de las células

que fueron sembradas en las


6.2.-Estudios in vitro:
matrices porosas, se puede observar
Con el fin de investigar la
un mayor número de células
biocompatibilidad respecto de la
adheridas. La cuantificación de estas
topografía de las matrices porosas y
observaciones se muestra en el
no porosas, dos líneas celulares
panel inferior de la figura 36, lo que
osteoblásticas se sembraron sobre
demuestra que las células se
las matrices. Se estudiaron su
adhirieron estadísticamente en
adhesión y proliferación y la
mayor proporción (alrededor de 3
expresión de la enzima fosfatasa
veces) a las matrices porosas.
alcalina, un marcador de
Estas observaciones sugieren
diferenciación de los osteoblastos.
que una matriz porosa y más
El aspecto y el análisis
hidrofóbica está promoviendo o
cuantitativo del número de
favoreciendo una fuerte adhesión de
osteoblastos adheridos a las
los osteoblastos.
matrices porosas y no porosas se

Cap. 4: Resultados. 104


Figura 36: Adhesión de UMR-106 y células MC3T3-E1 sobre la matrices porosas y no porosas.
&: p <0,01. A y B: UMR-106, C y D: MC3T3-E1.A y C: matrices no porosas. B y D: matrices

porosas.

Además de la adhesión celular, tanto sobre las matrices porosas

se evalúo la proliferación de ambas como sobre las no porosas luego de

líneas celulares sobre las matrices. 24 h de cultivo. Se puede ver que las

La Figura 37 muestra la morfología células UMR-106 y MC3T3-E1

y el número de osteoblastos crecidos muestran spreading (extensiones) y

Cap. 4: Resultados. 105


conexiones entre sí en ambas mayor en comparación con la

superficies. Sin embargo, en las células crecidas sobre las membrana

matrices porosas obtenidas no porosa (2 y 3,7 veces con las

mediante el método de electrospray, células MC3T3-E1 y UMR-106,

el número de células que han respectivamente).

proliferado fue significativamente

Figura 37: Proliferación de las células UMR-106 y MC3T3-E1 sobre las matrices porosas y no
porosas. &: p <0,01. A y B: UMR-106, C y D: MC3T3-E1. A y C: no porosas. B y D: porosas.

Cap. 4: Resultados. 106


Por último, la capacidad de de matrices. Las dos líneas

diferenciarse y expresar ALP, un osteoblásticas fueron inducidas a

marcador de la actividad expresar más ALP, cuando se

osteoblástica, fue investigada en los cultivaron sobre las matrices

cultivos de células UMR-106 y porosas respecto de las no porosas,

MC3T3-E1 durante 2 o 7 días, como se muestra en la figura 38.

respectivamente, en ambos sistemas

Figura 38: Actividad ALP del células UMR-106 y MC3T3-E1 sobre las matrices porosas y no

porosas. &: p <0,01; #: p <0,05.

Cap. 4: Resultados. 107


Capítulo 5

Discusiones

"S
Si tú tienes una manzana y yo tengo una manzana e intercambiamos las manzanas, entonces
tanto tú como yo seguiremos teniendo una manzana. Pero si tú tienes una idea y yo tengo una
idea e intercambiamos ideas, entonces ambos tendremos dos ideas."
George Bernard Shaw
Capítulo 5: Discusiones.
El tejido óseo es un tejido desarrollo de prótesis, tornillos y

capaz de repararse a sí mismo sin placas.

dejar ninguna cicatriz. Sin embargo,


Sin embargo, como se ha
existen algunas situaciones, como
descripto en el capítulo
fracturas traumáticas, osteonecrosis,
Introducción, las metodologías
tumores o malformaciones
usadas actualmente presentan
congénitas, en las que la reparación
varias desventajas.
del hueso puede no llevarse a cabo.
Las distintas alternativas que
Es así que en la historia de la
existen como opción en el
humanidad se han planteado
reemplazo y la restauración de
distintas estrategias para subsanar
tejido óseo no son eficaces. Los
estas patologías.
metales poseen bajo
Antiguamente, los miembros
osteointegración, las cerámicas son
afectados eran amputados. Con el
frágiles y los injertos poseen
advenimiento de buenas prácticas
distintas desventajas,
quirúrgicas de la mano del
principalmente escasez de donantes
desarrollo de los antibióticos,
y rechazo.
analgésicos y sobre todo anestésicos,
Con la necesidad de resolver la
el objetivo del tratamiento ha
problemática planteada, nace la
evolucionando tendiendo a
Ingeniería de Tejido Óseo. Esta área
mantener el miembro afectado
interdisciplinaria utiliza conceptos
utilizando distintos tipos de injertos.
fundamentales de Ingeniería,
Además, el uso de metales y sus
Medicina, Química, Física,
aleaciones ha permitido el
Bioquímica, etc, para desarrollar

Cap. 5: Discusiones. 109


materiales que reviertan la casting muestran una gran diferencia

necesidad de utilizar las en sus estructuras superficiales. En

metodologías antes mencionadas. el caso del PFIP, se ve una

estructura lisa y homogénea. Para


En este capitulo se discutirán
realizar la fotografía de perfil, fue
los resultados encontrados en esta
necesario cortar la membrana por
tesis, cuyo objetivo principal fue
quiebre siguiendo las líneas de
desarrollar y caracterizar
fractura, las fotos así obtenidas
biomateriales que estimulen la
muestra un corte recto, típico de un
formación ósea a partir de dos
material vítreo. No hay referencias
polímeros, poli-ε-caprolactona
bibliográficas sobre el uso de este
(PCL) polifumarato de diisopropilo
material o su aplicación en
(PFIP) y de una cerámica,
ingeniería de tejidos.
Hidroxiapatita (HAP).

En cuanto a la estructura de la
En este trabajo, las matrices se
membrana de PCL se observan
obtuvieron utilizando el método de
algunas estructuras cristalinas
casting. Este método consiste en
llamadas esferulitas. Este tipo de
disolver el polímero en un solvente
estructura ha sido descripta
volátil, luego, esta solución se vierte
previamente por otros autores que
en una caja de petri y se evapora el
usaron este polímero para obtener
solvente para obtener así una
diferentes scaffolds [Beekmans, 200].
membrana del polímero. Bajo estas
Además, en esta membrana se
condiciones las membranas
observan algunos poros de un
obtenidas se caracterizan por
diámetro aproximado de unos 50
presentar una superficie lisa e
m. Sin embargo, observando la
internamente son no porosas.
cantidad de poros por área y la
Las imágenes de SEM de las
imagen de perfil de las películas,
membranas de PCL y PFIP,
hay que destacar que dichas
obtenidas mediante el método de

Cap. 5: Discusiones. 110


películas no exhiben una estructura degradación hidrolítica

porosa. relativamente más rápida, debido a

la naturaleza de su cadena
Analizando los resultados de
polimérica. En el caso del PFIP, la
biocompatibilidad, se puede ver que
cadena principal está constituida
las películas de PFIP y PCL
por enlaces C-C mientras que, en el
sintetizadas por método de casting,
caso de PCL, la existencia de enlaces
mostraron buena biocompatibilidad.
éster en la cadena polimérica [-C-O-
Estos resultados sugieren que
(C=O)-] hace a este material
la mezcla de los dos polímeros
susceptible a degradaciones
podría presentar mejores
hidroliticas [Más Estellés, 2008].
propiedades y por lo tanto ser de
Con el fin de generar un
interés para la ingeniería de tejido
material que combine las mejores
óseo.
características de cada uno de los
Ambos polímeros tienen
homopolímeros individuales
algunas desventajas, en el caso de
(elasticidad y resistencia a la
PFIP, es un material vítreo, por lo
tracción, biodegradabilidad,
que presenta una baja resistencia a
biocompatibilidad, etc) se ha
la tracción, por a lo cual es un
buscado compatibilizar una mezcla
material muy difícil de manejar y
de ambos polímeros. Los resultados
utilizar en forma de membranas
(figuras 6 y 7 del capítulo
debido a su gran fragilidad. En
Resultados) de la obtención de la
cuanto a PCL posee una menor Tg 8
mezcla PCL/PFIP empleando
(-60 ºC), por lo que sus películas son
ultrasonido, demuestran que una
menos frágiles que las de PFIP. Por
mezcla compuesta por estos
otro lado, exhibe una tasa de
homopolímeros puede ser

compatibilizada a través de la
8
Tg: temperatura de transición vítrea,
temperatura en la cual ocurre un cambio de formación de un conjunto de
estado reversible entre vítreo o cristalina y
amorfo.

Cap. 5: Discusiones. 111


copolímeros de tipo block creados la tracción, pero estas propiedades

durante la aplicación de ultrasonido. se pueden cambiar mediante la

Lebovitz et al. [Lebovitz, 2003] mezcla con otros polímeros

también han demostrado la [Koinuma, 1997], tal como se ha

presencia de copolímero en bloque realizado en el presente estudio. La

utilizando un procedimiento similar Tabla 1 muestra las propiedades

sobre mezclas de poliestireno y mecánicas evaluadas para la mezcla

poli(n-butil) metacrilato. Observando compatibilizada, la mezcla física y

las figuras de SEM (figura 8) de la PCL. Es posible ver que la adición

mezcla así obtenida, se puede ver de PFIP a PCL no afecta

que dicho material no presenta la significativamente la resistencia de

separacion de fases, típicas de dos las matrices según lo evaluado por

sustancias inmiscibles, como en la el módulo de elasticidad. La

mezcla física PCL/PFIP (figura 8B). Elongacion al punto de quiebre es

una medida de la ductilidad de un


En conjunto, estos resultados
material y mostró una disminución
sugieren que la mezcla
estadísticamente significativa en
compatibilizada mediante
ambas mezclas, debido al efecto del
ultrasonido consigue una
agregado de PFIP a PCL. Diferentes
integración adecuada de los
autores han evaluado las
homopolímeros. Esta metodología
propiedades mecánicas del hueso
parece ser un procedimiento
cortical y trabecular [Linde 1989;
sencillo, accesible y que consume
Poumarat, 1993; Rohlmann, 1980].
relativamente poco tiempo para
En particular, el hueso trabecular
obtener la mezcla compatibilizada
tiene una resistencia última a la
de dos polímeros no miscibles entre
tracción que es muy similar a la de
si.
la mezcla compatibilizada de
Se sabe que PFIP es un material
PCL/PFIP (alrededor de 10 MPa),
más frágil con una alta resistencia a
aunque con un módulo elástico tres

Cap. 5: Discusiones. 112


veces mayor, lo que indica que el óptico las células que se adhieren a

hueso trabecular es mucho más las matrices poliméricas. Éstas,

rígido que nuestra mezcla presentan una morfología circular

polimérica. Esta diferencia en las con extensión de filopodios. Las

propiedades mecánicas sin células plaqueadas en estas matrices

embargo, podría ser superada también parecen estar incluidas

mediante la incorporación de un dentro de las películas. Por otro

aditivo inorgánico y osteoinductivo lado, los osteoblastos adheridos a la

al polímero, tal como la matriz de PFIP se observan más

hidroxiapatita. Se retomará este picnóticos y de forma redondeada

punto de la discusión cuando se distribuidos en forma aislada o

traten los resultados del agregado formando grupos o acúmulos de

de HAP a las membranas células en la superficie. El hecho de

poliméricas. que las células se vean incluidas

dentro de la mezcla y las matrices


Se evaluó la biocompatibilidad
de PCL puede ser ventajoso para la
de la mezcla compatibilizada
diferenciación osteoblástica
PCL/PFIP mediante los ensayos de
indicando un ambiente propicio
adhesión, proliferación de las
para el crecimiento de los
células UMR-106 y MC3T3-E1 y la
osteoblastos.
evaluación de los marcadores

osteoblásticos en dichas líneas La posible interacción de los

celulares. También se estudio los osteoblastos con diferentes películas

posibles cambios en la morfología poliméricas también fue investigada

osteoblástica y el citoesqueleto. A a través de la evaluación de los

pesar de que las membranas de las cambios en el citoesqueleto de

mezclas de los polímeros, así como actina luego de 24 horas de cultivo.

las películas de PCL son opacas, se En los osteoblastos, crecidos en las

pueden observar al microscopio películas de los polímeros, se

Cap. 5: Discusiones. 113


identificaron los núcleos mediante osteoblásticas UMR-106 se puede

tinción con DAPI (azul). Las células unir a un sustrato de colágeno tipo 1

exhibieron un citoesqueleto de a través de receptores de la

actina bien desarrollado, con las integrina mediante las vías 1,5β1 y

fibras de estrés que se observan en 2β1 [McCarthy, 2004]. Sin

verde gracias a la tinción con FITC- embargo, cuando las células se

phalloidin. Las células que crecieron siembran en una superficie que no

en las películas de PFIP y PCL está cubierta por proteínas de matriz

mostraron una morfología diferente, extracelular (MEC), tales como los

con un anillo de actina polímeros evaluados en el presente

desorganizado, periférico y de estudio, la adhesión celular depende

forma redondeada. Estos resultados del tiempo de secreción de ECM

son de esperar en el contexto del [Kawano, 2001]. Esta secreción

equilibrio entre la hidrofobicidad y habria sido mayor en nuestros

la hidrofilicidad de los diferentes experimentos con la mezclas

polímeros. El PFIP es más compatibilizada PCL/PFIP, y

hidrofóbico y por lo tanto induce probablemente explica el aumento

aglutinación de células mientras que observado en la adhesión

el PCL es más hidrofílico. Así, la osteoblástica y la organización del

mezcla compatibilizada posee un citoesqueleto de actina. Estas

buen balance hidrofobico/hidrofílico observaciones sugieren que las

entre ambos polímeros, que células osteoblásticas crecen mejor

favorece una eficiente adhesión en la mezcla de polímeros que en las

celular con abundantes extensiones películas de los correspondientes

celulares o philopodia y la homopolímeros.

formación de un citoesqueleto de
También se evaluó la
actina más organizado. Trabajos de
capacidad de las células que crecen
nuestro grupo han demostrado
en diferentes matrices para expresar
previamente que las células

Cap. 5: Discusiones. 114


dos marcadores de actividad Además, el efecto de los

osteoblásticas. En la figura 15 se diferentes scaffolds poliméricos en la

muestran los resultados de la capacidad de las células MC3T3-E1

expresión de fosfatasa alcalina para mineralizar la matriz se evaluó

después del cultivo de osteoblastos después de 2 semanas de cultivo en

por 48 horas. Este parámetro no se presencia de fosfato de β-glicerol y

vió afectado por la naturaleza de la ácido ascórbico. La figura 17

matriz investigada. La producción muestra que la mezcla promueve

de Colágeno tipo I, la principal fuertemente la deposición en los

proteína de la matriz extracelular nódulos mineralizados, según la

expresada en los huesos, también se evaluación mediante tinción con

evaluó. Como se puede observar en rojo de alizarina S, en comparación

la figura 15, una mayor cantidad de con los homopolímeros.

colágeno fue producido por las


Una estrategia muy utilizada
células UMR-106 que crecieron en la
para mejorar las diversas
mezcla de polímeros, lo que sugiere
propiedades de los scaffolds, como
una afinidad mayor con este
las propiedades mecánicas y de
material. Sin embargo, cuando la
osteoinducción, es el agregado a las
línea MC3T3-E1 se cultivó durante
matrices poliméricas de distintas
dos semanas en un medio
sustancias inorgánicas, como por
osteogénico, las células produjeron
ejemplo alúmina, biovidrios,
más colágeno en la matriz de PCL
fosfatos de calcio o hidroxiapatita
(figura 16). Estas observaciones
(HAP), entre otros [Cao, 1996];
sugieren que un cierto grado de
obteniendo así, materiales
especificidad en el desarrollo
compuestos también llamados
osteoblástico es dependiente de la
composites. En este capítulo se
línea celular utilizada en los
discutirá la obtención y
estudios.
caracterización de HAP y como su

Cap. 5: Discusiones. 115


agregado a las películas de Nuestros resultados

polímeros mejora las propiedades empleando tinción con rojo de

de los scaffolds. alizarina demuestran que la forma

irregular de la HAP obtenida


Existen varias formas de
interactúa adecuadamente con el
obtención de HAP [Cao, 1996;
polímero, mostrando una
Jarcho, 1976; Toriyama, 1996;
distribución de tamaño bimodal de
Otsuka, 1994], empleandose
la misma en la membrana. Supova
distintos ácidos y bases, solventes
et. al. [Supova, 2009] sugiere que
orgánicos, control estricto de pH y
esta distribución bimodal mejora
temperaturas durante la reacción,
aún más las propiedades de los
con una posterior purificación y
composites ya que partículas de
secado de la HAP obtenida.
menor tamaño ocupan espacios
Como se comentó en los
libres entre partículas más grandes.
capítulos anteriores, la HAP en este
En relación con el tamaño de las
trabajo fue obtenida incinerando
partículas de HAP, algunos
hueso bovino [Ooi, 2007].
investigadores [Webster, 2000; Li
En las figuras 18 y 19 se (2009)] han mostrado un aumento
pueden ver los espectros de FTIR y significativo en la adhesión celular y
EDAX respectivamente de la HAP la proliferación mediante la
obtenida. Estos resultados indican inclusión de nano-HAP (tamaño
que se obtuvo una HAP con una promedio de partículas <100 nm) en
impureza del 1,07% de CO32- los scaffolds poliméricos.
respecto al producto final lo que
Se ha demostrado que, debido
demuestra que se puede obtener así,
a las características de su superficie,
una HAP de buena calidad en forma
los cristales de nano-HAP tiene una
mas económica que los métodos
mayor capacidad para absorber
antes mencionados.
ciertas proteínas que a su vez

Cap. 5: Discusiones. 116


promueven la adhesión celular sugiere que la inclusión de este

[Webster, 2000; Li (2009)]. Aunque cerámico mejora su rigidez. El estrés

la HAP obtenida en esta tesis tiene causado por la rotura por tracción

un tamaño en el rango del de Mezcla-HAP de compuestos es

nanómetro (225 nm), su morfología muy similar al del hueso trabecular

y buena compatibilidad entre la fase [Rohlmann, 1980], mostrando

del material compuesto ofrecen diferencias significativas con

resultados promisorios, además de respecto a la PCL-HAP.

un bajo costo en la metodología de


La resistencia última a la
obtención.
tracción de HAP-mezcla es muy

Como se mencionó similar a la del fémur de ratónes

anteriormente un requisito (alrededor de 10 MPa) [Ding, 2010],

importante para los materiales de mostrando diferencias significativas

los scaffolds son sus propiedades con respecto a la PCL-HAP.

mecánicas, teniendo en cuenta que


La disminución en el
como sustitutos temporales del
alargamiento a la rotura inducida
hueso estos deben fomentar la
por HAP en PCL y mezcla sugiere
reparación del tejido prestando
que el compuesto obtenido es
apoyo mecánico hasta que el tejido
menos dúctil. El aumento en el
se regenere y ocurra la
módulo elástico como la
remodelación de forma natural
disminución en resistencia última a
[Prabhakaran, 2009]. Nuestros
la tracción de los compuestos
resultados muestran que los
polímero-HAP puede ser explicado
composites obtenidos de polímero-
por la rigidez y una menor
HAP presentan un aumento en el
plasticidad de la deformación
módulo de elasticidad en
producida por la incorporación del
comparación con los polímeros
mineral de HAP que es típico de las
(PCL o Mezcla) sin HAP, lo que
fases duras inorgánicas.

Cap. 5: Discusiones. 117


En el presente estudio se han produce aumentos en

evaluado diferentes parámetros con osteogenicidad in vitro de las

el fin de conocer la películas PCL y Mezcla.

biocompatibilidad y la citotoxicidad
En una primera etapa
de los scaffolds para las dos líneas
desarrollamos una mezcla
osteoblásticas UMR-106 y MC3T3-
compatibilizada, que fue capaz de
E1. Hemos encontrado que la
estimular en mayor medida el
adición de HAP a PCL y a Mezcla,
crecimiento y la diferenciación de
mejora en forma significativa la
los osteoblastos en comparación con
biocompatibilidad y la
los homopolímeros. Otros autores
osteogenicidad de los scaffolds. La
han propuesto matrices PCL-HAP
evidencia de esta idea se basa en
para la ingeniería ósea. Por ejemplo,
varias observaciones, a saber: a) la
Choi [Choi, 2004] preparó un
inclusión de HAP en los polímeros
compuesto de PCL-HAP con un
aumenta la proliferación de las
apatita sintética que se incluyó en el
células osteoblásticas, b) la HAP
10-40% en peso en el polímero. Se
incluida en la mezcla aumenta la
propuso que este material era
expresión de ALP en las células
adecuado como sustituto óseo o
UMR-106, c) la Mezcla-HAP
scaffolds, aunque los autores no
aumenta la producción de COL tipo
investigaron su biocompatibilidad
I en los dos líneas celulares, y d) se
y/o sus propiedades sobre la
detectaron mayores niveles del
osteoinducción. Además, Kim [Kim
factor de transcripción osteogénico
2004] desarrolló un material
Runx-2 cuando los osteoblastos
compuesto PCL-HAP poroso para la
MC3T3-E1 fueron inducidos a
liberación de drogas. Recientemente,
diferenciarse y a mineralizar las
Scaglione [Scaglione, 2009] ha
matrices polímero-HAP. Estas
diseñado y desarrollado una malla
observaciones indican que la
tridimensional osteoconductiva
incorporación de la hidroxiapatita

Cap. 5: Discusiones. 118


basada en un amplia red de mejor sustrato para la diferenciación

polímeros usando PCL y HAP. Ellos osteoblástica y la mineralización, y

demostraron que los scaffolds poseen la expresión de factores de

una adhesión celular preferencial en transcripción osteogénico que son

las fibras de PCL con HAP en cruciales para la formación de

comparación con la fibra pura de hueso. Dado que el material

PCL, así como el mejor crecimiento contiene hidroxiapatita, no fue

del hueso en ensayos in vivo y la posible evaluar la mineralización

colonización de vasos sanguíneos (deposición de Ca y P) en la matriz

(vascularizacion). Por lo tanto, por técnicas de tinción clásicas como

nuestro compuesto actual tiene la Sirio rojo (para el Ca) o von Kossa

ventaja de utilizar un poliéster (para el P). Así, se evaluó la

caracterizado previamente (PCL), expresión de Runx-2, uno de los

así como un polímero sintetizado en principales factores de transcripción

nuestro laboratorio (PFIP). Este expresados durante la osteogénesis

polifumarato es un material más [Komori, 2002]. Después de tres

frágil con una alta resistencia a la semanas (período de

tracción, que compatibilizada con mineralización) de cultivo en un

PCL da lugar a un material con medio osteogénico, la línea de

mejores propiedades mecánicas. La células MC3T3-E1 pre-osteoblástica

adición de HAP a la mezcla mejora se ha diferenciado y la mineralizado

aún más sus propiedades mecánicas la matriz, expresando Runx-2 más

y su capacidad osteoinductiva, fuertemente cuando las células son

avalando su posible uso como cultivadas sobre scaffolds de

sustrato para el reemplazo de tejidos polímero-HAP.

duros.
En cuanto a la degradación, las

Nuestros resultados muestran matrices obtenidas, PCL y Mezcla

también que la Mezcla-HAP es un con y sin el agregado de HAP,

Cap. 5: Discusiones. 119


fueron incubadas en DMEM-10% dipolo-dipolo. Es así que, si bien

v/v SFB en la estufa de cultivo. Este todavía no se entiende como la

ensayo demostró que las matrices de hidrofobicidad o hidrofilicidad de

PCL con y sin HAP, tuvieron una los materiales a usar regularían la

tasa de degradación mayor que las actividad celular y posterior

de las mezcla con o sin HAP; regeneración del tejido, es

mostrando una diferencia importante conocer estos

significativa luego de la 7º semana parámetros. Con el fin de investigar

de incubación. Esto se debe a la estos aspectos, se determinó el

estructura de PCL, la cual poseen ángulo de contacto de las

grupos esteres en su cadena membranas.

polimérica susceptibles a ser


En las matrices obtenidas en
hidrolizados, hecho que no ocurre
esta tesis, se observó que las
con el PFIP. El agregado de HAP no
películas de PFIP poseen un ángulo
modificó la degradación de las
de contacto mayor que PCL,
membranas.
mientras que el valor obtenido para

Existen muchos trabajos la Mezcla es intermedio entre ambos

[Harnett, 2007; Jansen, 2004; Liu, polímeros. Estos datos se condicen

2010; Tangpasuthadol, 2003; con la estructura de los polímeros.

Williams, 1995; Zanchetta, 2001] que PFIP es un polímero constituido por

intentan dilucidar sobre cuán una cadena carbonada teniendo a su

hidrofóbicas deben ser las vez grupos pendientes alifáticos

membranas para considerarse secundarios, siendo este polímero

buenos scaffods. Esto se debe a que, más hidrofóbico que PCL.

en una primera instancia las Notablemente, el ángulo de contacto

interacciones entre las membranas y disminuye con el agregado de HAP,

las células dependen de indicando que las películas

interacciones débiles, por ejemplo obtenidas son más hidrofílicas

Cap. 5: Discusiones. 120


Un hecho muy importante es de IL-1, TNF- α y NO durante los

que los materiales no deben ser períodos de tiempo ensayados.

tóxicos ya que van a ser Estos resultados sugieren una baja

incorporados en el organismo. Por toxicidad de las matrices

eso, los materiales desarrollados en desarrolladas en este trabajo. Si bien

esta tesis fueron evaluados para son necesarios estudios adicionales

conocer la posible toxicidad de los in vivo, estos resultados parecen

mismos. prometedores en la aplicación de las

matrices en futuros usos en


En las matrices formadas a
ingeniería del tejido óseo.
partir de los polímeros PCL y

Mezcla con y sin agregado de HAP En esta tesis se han mostrado

se sembraron células del linaje resultados con matrices porosas

macrofágico RAW 264.7. Estas obtenidas mediante la técnica de

células expresan distintos electrospray. Estas matrices porosas

marcadores de actividad celular, fueron obtenidas por la deposición

tales como, síntesis de de microgotas. La concentración y la

interleuquinas, producción de óxido viscosidad de la solución PCL/PFIP

nítrico (NO), expresión de óxido utilizados en el proceso

nítrico sintasas (NOS) [Denlinger, electrospraying fue lo suficientemente

1996]. baja como para evitar la formación

de micro o nanofibras.
Se evaluó la liberación de

óxido nítrico (NO) y de dos Las capas de las gotas

citoquinas TNF α e IL-1 [An, 2002; depositadas al azar generaron un

Bixby, 2005; Blonska, 2003; scaffolds tridimensional de alta

Huttunen, 2000; Maldovan, 2005; porosidad, con una estructura de

Olszanecki, 2002; Sakata, 2003]. Se poros interconectados. Este hecho es

observó que las membranas no de suma importancia, debido a que

producen una cantidad significativa en otras estructuras porosas, tales

Cap. 5: Discusiones. 121


como scaffolds de nanofibras 2003], análisis que están fuera del

obtenidas por electrospinnig, la alcance de este trabajo. Sin embargo,

infiltración de células o la estas superficies aparentemente más

permeabilidad es difícil de lograr y hidrofóbica podría afectar, al menos

se requiere de estrategias al principio la unión de las células a

adicionales para permitir la la matriz. En consecuencia, es de

incorporación de células [Beachleya, esperar que el crecimiento y

2010]. desarrollo de los osteoblastos sea

modulado por las características de


La determinación del ángulo
hidrofobicidad y topografía de las
de contacto (WCA) es dificultosa
superficies.
por la presencia de arquitecturas

porosas o de la textura [Bico, 2002; El comportamiento celular en

Hołownia, 2008; Mamur, 2003]. La biomateriales es un factor crucial

rugosidad y porosidad afecta de para la evaluación de su

forma importante las medidas del biocompatibilidad. Esta estructura

ángulo de contacto. Se ha descripto de las membranas obtenidas por el

que durante estos ensayos, debajo método de electrospray se caracteriza

de la gota de agua quedan por una superficie rugosa y porosa,

atrapadas bolsas de aire. La gota aunque más hidrofóbica. Sin

queda así sobre un mosaico de embargo, estas propiedades son

sólidos y aire, dando lugar a la capaces de mejorar la adhesión,

medida de un ángulo de contacto proliferación y diferenciación de los

aparente con carácter más osteoblastos en cultivo. Otros

hidrofóbico. Los detalles autores han relacionado

cuantitativos de este anteriormente la porosidad o la

comportamiento son muy complejos hidrofobicidad a la

debido a la estructura compleja de biocompatibilidad de los materiales.

los medios porosos reales [Mamur, Nuestros resultados actuales, sin

Cap. 5: Discusiones. 122


embargo no están de acuerdo con la autores han demostrado que,

conclusión general de que los incluso cuando los materiales son

materiales hidrofóbicos no son relativamente hidrofóbicos, los

compatibles con la adhesión y la osteoblastos pueden crecer,

propagación de las células [Webb, diferenciarse y mineralizar la matriz

1998]. De todos modos, otros [Liu, 2010].

Cap. 5: Discusiones. 123


Capítulo 6

Conclusiones

"La ciencia siempre se equivoca. Nunca resuelve un problema sin crear otros diez."
George Bernard Shaw
Capítulo 6: Conclusiones.
3.-Los estudios de
En este trabajo de tesis se han
biocompatibilidad no mostraron
desarrollado y caracterizado,
evidencia de efectos citotóxicos
matrices poliméricas con y sin
cuando las células fueron cultivadas
agregados de HAP con el fin de ser
en la mezcla PFIP/PCL. Por el
utilizadas en la reparación de tejido
contrario, las células fueron capaces
óseo y para su posterior aplicación
de crecer, de desarrollar las
en implantes óseos.
extensiones que se comunicaron con
1.-Se obtuvieron matrices de
la superficie de la mezcla y expresar
PCL, PFIP y mezcla compatibilizada
diferentes marcadores de fenotipo
entre estos homopolímeros
osteoblástico en este nuevo material.
mediante la aplicación de
4.-Por otra parte, las células
ultrasonido. Se logró obtener una
MC3T3-E1 fueron capaces de
mezcla compatibilizada mediante la
depositar más minerales en la
generación de copolímero de tipo
membrana de la mezcla.
block, permitiendo así estabilizar la

mezcla. La mezcla obtenida mostró 5.-Se obtuvieron además

mejores características superficiales partículas de Hidroxiapatita (HAP)

respecto a la mezcla física. a partir de la incineración de hueso

bovino. Estas fueron caracterizadas


2.-El análisis de sus
por distintas técnicas demostrando
propiedades mecánicas sugiere una
la obtención de HAP con muy baja
similitud con el hueso trabecular y
cantidad de impurezas. Estas
una posible aplicación en la
partículas fueron sometidas a un
ingeniería de tejido óseo.
tratamiento mecánico para

Cap. 6: Conclusiones. 125


disminuir su tamaño promedio. Es tóxicas en el período de tiempo

así que se obtuvo un tamaño de evaluado.

partículas semi-nano, mejorando


9.-La degradación de las
también la dispersión de los
matrices en el medio de cultivo
tamaños.
demostró que la mezcla posee una

6.-Se sintetizaron nuevas tasa de degradación menor respecto

matrices mediante la incorporación a PCL. Además, el agregado de

HAP a la mezcla PFIP/PCL y PCL. HAP no produce modificación en la

Las partículas de HAP mostraron degradación de las matrices.

una dispersión uniforme en las


10.-Matrices con alta porosidad
matrices poliméricas con una buena
de la mezcla compatibilizada de los
compatibilidad entre las fases.
polímeros PCL y PFIP, se

7.-Las propiedades físicas, produjeron por la deposición de

mecánicas y biológicas de las micropartículas mediante la técnica

matrices se compararon con las de de electrospraying. Estas matrices

mezcla y PCL sin apatita. La presentan una característica

inclusión de HAP mejora topográfica diferente en

sustancialmente las propiedades comparación con las películas

mecánicas de la mezcla y PCL. Los obtenidas mediante la técnica de

experimentos en cultivos celulares casting, así como con matrices

in vitro sugieren que la Mezcla-HAP porosas obtenidas por otras técnicas

posee un efecto más osteogénico que clásicas. Los experimentos de

las matrices de mezcla o PCL. cultivo celular sugieren que las

matrices tridimensionales ofrecen


8.-Los resultados con las
una topografía superficial y un
células macrofágica Raw 264.7
medio ambiente favorable,
demostraron que las matrices PCL y
osteoinductivo y osteoconductivo,
Mezcla, con y sin HAP no son
para la fijación y crecimiento de las

Cap. 6: Conclusiones. 126


células como osteoblastos, siendo la potencialmente pueden ser

matriz porosa más osteogénica que utilizadas en la ingeniería de tejido

las matrices no porosas de la misma óseo.

mezcla. Estas estructuras porosas

Cap. 6: Conclusiones. 127


Capítulo 7

Bibliografía

"No hay propiamente historia, sólo biografias."


Emerson
Capítulo 7: Bibliografía.

1. An S.J., Pae H.O., Oh G.S., Choi B.M., Jeong S., Jang S.I., Oh H., Kwon T.O.,

Song C.E., Chung H.T. Inhibition of TNF-α, IL-1 , and IL-6 productions and

NF-B activation in lipopolysaccharide-activated RAW 264.7 macrophages by

catalposide, an iridoid glycoside isolated from Catalpa ovata G. Don

(Bignoniaceae). International Immunopharmacology 2 (8) (2002) 1173.

2. Anderson H. C., Garimella R., Tague S. E. The role of matrix vesicles in

growth plate development and biomineralization. Frontiers in Bioscience 10

(2005) 822.

3. Arenas G.N., Cañas L.A. Procedimiento para medir ángulos de contacto en

sólidos particulados finos. Scientia et Technica Año XIII 36 (2007) 833.

4. Arya N., Chakraborty S, Dube N, Katti D.S. Electrospraying: A Facile

Technique for Synthesisof Chitosan-Based Micro/Nanospheres for Drug Delivery

Applications. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied

Biomaterials 88B (2009) 17.

5. Aubin J.E. Bone Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry - Supplement.

30/31 (1998) 73.

6. Bain S.D., Watkins B.A. Local Modulation of Skeletal Growth and Bone

Modeling in Poultry. Journal of Nutrition. 123 (1993) 317.

7. Barrios de Arenas I., Schattner C., Vásquez M. Bioactividad de vidrios

modificados del sistema Na2O·CaO·SiO2·P2O5. Revista Latinoamericana de

Metalurgia y Materiales. 21 (2) (2001) 90.

Cap. 7: Bibliografía. 129


8. Beachleya V., Wen X. Polymer nanofibrous structures: Fabrication,

biofunctionalization, and cell interactions. Progress in Polymer Science 35(7)

(2010) 868.

9. Beekmans L.G.M., Vancso G.J. Real-time crystallization study of poly(e-

caprolactone) by hot-stage atomic force microscopy. Polymer 41 (2000) 8975.

10. Benito J.C., Puig A.G. La repuesta inmunitaria en el transplante de aloinjertos

óseos. Inmunologia 19(4) (2000) 148.

11. Bico J., Thiele U.,Quéré D. Wetting of textured surfaces. Colloids and

Surfaces A: Physiochemical and Engineering Aspects 206 (2002) 41.

12. Bielby R., Jones E., Mc Gonagle D. The role of mesenchymal stem cells in

mantenance and repair of bone. Journal of Trauma-Injury Infection & Critical

Care 38S1 (2007) S26.

13. Bigi A., Cojazzi G., Panzavolta S., Ripamonti A., Roveri N., Romanello M.,

Noris Suarez K., Moro L. Chemical and Structural Characterization of the

Mineral Phase from Cortical and Trabecular Bone. Journal of Inorganic

Biochemistry 68 (1997) 45.

14. Bixby J.,Ray T.D.,Chan F.K.M. TNF, Cell Death and Inflammation. Current

Medicinal Chemistry - Anti-Inflammatory & Anti-Allergy Agents 4 (6)

(2005) 557.

15. Blonska M., Czuba Z.P., Krol W. Effect of Flavone Derivatives on Interleukin-

1 (IL-1 ) mRNA Expression and IL-1 Protein Synthesis in Stimulated RAW

264.7 Macrophages. Scandinavian Journal of Immunology 57 (2) (2003) 162.

16. Bozal C. Biología del Osteocito. Actualizaciones en Osteología 2(1) (2006)19.

17. Bonewald L.F. Osteocytes as multifunctional cells. Journal of Musculoskeletal

and Neuronal Interactions 6 (4) (2006) 331.

Cap. 7: Bibliografía. 130


18. Bonewald L.F., Johnson M.L. Osteocytes, mechanosensing and Wnt signaling.

Bone 42 (2008) 606.

19. Boskey A.L. Chapter 12; Mineralization, Structure and Function of Bone en

Dynamics of Bone and Cartilage Metabolism. Editado por Seibel M. J., Robins

S.P., Bilezikian J.P. 2º edicion (2006).

20. Boyce B.F., Xing L. Functions of RANKL/RANK/OPG in bone modeling and

remodeling. Archives of Biochemistry and Biophysics 473 (2008) 139.

21. Braddock M., Houston P., Campbell C., Ashcroft P. Born Again Bone: Tissue

Engineering for Bone Repair. News in Physiological Sciences. 16 (2001) 208.

22. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramo

quantities of protein utilizing the principie of protein–dye binding. Analytical

Biochemistry 72 (1976) 248.

23. Brighton C.T., Hunt R.M. Early Histological and Ultrastructural Changes in

Medullary Fracture Callus. Journal of Bone and Joint Surgery 73 (1991) 832.

24. Burg K.J.L., Porter S., Kellam J.F. Biomaterial developments for bone tissue

engineering. Biomaterials 21 (2000) 2347.

25. Burr D.B., Robling A.G., Turner C.H. Effects of Biomechanical Stress on Bones

in Animals. Bone 30 (2002) 781.

26. Cao W., Hench L.L. Bioactive Materials. Ceramics International 22 (1996)

493.

27. Chakraborty S., Liao I.-C., Adler A., Leong K.W. Electrohydrodynamics: A

facile technique to fabricate drug delivery systems. Advanced Drug Delivery

Reviews 61 (12) (2009) 1043.

28. Chen Q., Roether J. A., Boccaccini A. R. Chapter 6; Tissue Engineering

Scaffolds from Bioactive Glass and Composite Materials en Topics in Tissue

Engineering, Vol. 4 (2008). Eds. Ashammakhi N., Reis R., Chiellin F.

Cap. 7: Bibliografía. 131


29. Choi D., Marra K.G., Kumta P.N. Chemical synthesis of hydroxyapatite/poly(e-

caprolactone) composites. Materials Research Bulletin 39 (2004) 417.

30. Clarke B. Normal bone anatomy and physiology. Clinical Journal of the

American Society of Nephrology 3 (2008), S131.

31. Clarke H., Garimella R., Tague S. E. The role of matrix vesicles in growth plate

develpment and biomineralization. Frontiers in Bioscience 10 (2005) 822.

32. Cooper L.F. Biologic determinants of bone formation for osseointegration: Clues

for future clinical improvements. Journal of Prosthetic Dentistry 80 (1998)

439.

33. Cortizo A.M., Etcheverry S.B. Vanadium derivatives act as growth factor--

mimetic compounds upon differentiation and proliferation of osteoblast-like

UMR106 cells. Molecular and Cellular Biochemistry. 145 (2) (1995) 97.

34. Cortizo M. S., Andreetta H. A., Figini R.V. Molecular Characterization of

Poly(diisopropylfumarate) by the Absolute Calibration Method in Molecular

Exclusion Chromatography (GPC). Journal of High Resolution

Chromatography & Chromatography Communications 12, (1989) 372.

35. Cortizo M.S. Polymerization of diisopropyl fumarate under microwave

irradiation. Journal of Applied Polymer Science, 103(6) (2007) 3785.

36. Cortizo M.S., Molinuevo M.S., Cortizo A.M. Biocompatibility and

biodegradation of polyester and polyfumarate based-scaffolds for bone tissue

engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2

(2008) 33.

37. CRC Handbook of Chemistry and Physics, 67th edition. CRC Press, pag

F110.

Cap. 7: Bibliografía. 132


38. Dempster D. W., Zhou H. Chapter 22; New Concepts in Bone Remodeling en

Dynamics of Bone and Cartilage Metabolism. Editado por Seibel M.J., Robins

S.P., Bilezikian J.P. 2º Edition (2006).

39. Denlinger L.C., Fisette P.L., Garis K.A., Kwon G., Vazquez-Torres A.,

Simon A.D., Nguyen B., Proctor R.A., Bertics P.J., Corbett J.A. Regulation of

inducible nitric oxide synthase expression by macrophage purinoreceptors and

calcium. The Journal of Biological Chemistry 271(1) (1996) 337.

40. Ding W.G., Jiang S.D., Zhang Y.H., Jiang L.S., Dai L.Y. Bone loss and

impaired fracture healing in spinal cord injured mice. Osteoporos International

22 (2) (2011) 507.

41. Duplomb L., Dagouassat M., Jourdon P., Heymann D. Concise Review:

Embryonic Stem Cells: A New Tool to Study Osteoblast and Osteoclast

Differentiation. Stem Cells 25 (2007) 544.

42. Erben R.G:Trabecular and Endocortical Bone Surfaces in the Rat: Modeling or

Remodeling? The anatomical record 246 (1996) 39.

43. Eriksen E. F. Cellular mechanisms of bone remodeling. Reviews in Endocrine

& Metabolic Disorders 11 (2010) 219.

44. Estrada C., Paz A.C., López L.E. Ingeniería de tejido óseo: consideraciones

básicas. Revista EIA 5 (2006) 93.

45. Feng X., McDonald J.M. Disorders of Bone Remodeling. Annual Review of

Pathology: Mechanisms of Disease 6 (2011) 121.

46. Fernández-Tresguerres-Hernández-Gil I., Alobera Gracia M.A., del Canto

Pingarrón M., Blanco Jerez L. Physiological bases of bone regeneration I.

Histology and physiology of bone tissue. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 11

(2006) E47.

Cap. 7: Bibliografía. 133


47. Finch J. The ancient origins of prosthetic medicine. The Lancet 377 (9765)

(2011) 548.

48. Forrest S. M., Ng K.W., Findlay D.M., Michelangeli V.P., Livesey S.A.,

Partridge N.C., Zajac J.D., Martin T.J. Characterization of an osteoblast-like

clonal cell line which responds to both parathyroid hormone and calcitonin.

Calcified Tissue International 37 (1) (1985) 51.

49. Franceschi R.T, Iyer B.S. Relationship Between Collagen Synthesis and

Expression of the Osteoblast Phenotype in MC3T3-El Cells. Journal of Bone and

Mineral Research 7 (2) (1992) 235.

50. Franceschi R.T, Iyer B.S., Cui Y. Effects of Ascorbic Acid on Collagen Matrix

Formation and Osteoblast Differentiation in Murine MC3T3-E 1 Cells. Journal

of Bone Mineral Research 9 (6) (1994) 843.

51. Franz-Odendaal T.A., Hall B.K., Witten P. E. Buried Alive: How Osteoblasts

Become Osteocytes. Developmental Dynamics 235 (2006) 176.

52. Gallagher J.C., Sai A.J. Molecular biology of bone remodeling: implications for

new therapeutic targets for osteoporosis. Maturitas. 65 (4) (2010) 301.

53. Gundberg C.M. Matrix proteins. Osteoporos Internatinal 14 (5) (2003) S37.

54. Harnett E.M., Alderman J., Wood T. The surface energy of varius biomaterials

coated with adhesion molecules used in cell culture. Colloids and Surface B:

Biointerface 55 (2007) 90.

55. Hench L.L. Third-Generation Biomedical Materials. Science 295 (2002) 1014.

56. Hench L.L. Genetic design of bioactive glass. Journal of the European Ceramic

Society 29 (7) (2009) 1257.

57. Hochedlinger K., Jaenisch R. Nuclear reprogramming and pluripotency.

Nature 441 (2006) 1061.

Cap. 7: Bibliografía. 134


58. Holden J.L., Clement J.G., Phakey P.P. Age and Temperature Related Changes

to the Ultrastructure and Composition of Human Bone Mineral. Journal of Bone

and Mineral Research 10 (9)(1995) 1400.

59. Hołownia D., Kwiatkowska I., Hupka J. An investigation on wetting of porous

materials. Physicochemical Problems of Mineral Processing 42 (2008) 251.

60. Hutmacher D. W. Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage.

Biomaterials 21 (2000) 2529.

61. Huttunen K., Ruotsalainen M., Iivanainen E., Torkko P., Katila M.-L.,

Hirvonen M.-R. Inflammatory responses in RAW264.7 macrophages caused by

mycobacteria isolated from moldy houses. Environmental Toxicology and

Pharmacology 8 (4) (2000) 237.

62. Jansen E.J.P., Sladek R.E.J., Bahar H., Yaffe A., Gijbels M.J., Kuijer R.,

Bulstra S.K., Guldemond N.A., Binderman I., Koole L.H. Hydrophobicity as

a design criterion for polymer scaffolds in bone tissue engineering. Biomaterials

26 (21) (2005) 4423.

63. Jarcho M., Bolen C.H., Thomas M.B., Bobick J., Kay J. Hidroxyapatite

synthesis and charectization in dense plycristalline form. Journal of Materials

Science 11 (1976) 2027.

64. Jones J.R., Hench L.L. Regeneration of trabecular bone using porous ceramics.

Current Opinion in Solid State and Materials Science 7 (2003) 301.

65. Joschek S., Nies B., Krotz R., Gofpferich A. Chemical and physicochemical

characterization of porous hydroxyapatite ceramics made of natural bone.

Biomaterials 21(2000) 1645.

66. Junqueira L. C. U., Bignolas G., Brentani R. R. A simple and sensitive method

for the quantitative estimation of collagen. Analytical Biochemistry 94 (1)

(1979) 96.

Cap. 7: Bibliografía. 135


67. Kanczler J.M., Oreffo R.O.C. Osteogenesis and angiogenesis: the potencial for

engineering bone. European Cells and Materials 15 (2008) 100.

68. Karageorgiou V., Kaplan D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and

osteogenesis. Biomaterials 26 (2005) 5474.

69. Karlsson K.H., Hupa L. Thirty-five years os guided tissue engineering. Journal.

of Non-Crystalline Solids 354 (2008) 717.

70. Kawano K., Kantak S. S., Murai M., Yao C. C., Kramer R. H. Integrin

alpha3beta1 engagement disrupts intercellular adhesion. Experimental Cell

Research. 262 (2001) 180.

71. Khan Y., Yaszemski M.J., Mikos A.G., Laurencin C.T. Tissue Engineering of

Bone: Material and Matrix Considerations. The Journal of Bone & Joint

Surgery. 90 (1) (2008) 36.

72. Kim H.W., Knowles J.C., Kim H.E. Hydroxyapatite/poly(epsiloncaprolactone)

composite coatings on hydroxyapatite porous bone scaffold for drug delivery.

Biomaterials 25 (2004) 1279.

73. Koinuma Y., Murata Y., Otsu T., GototK., Fujiwarah H., Takita Y. Thermal

and Mechanical Properties of Poly (diisopropyl fumarate) Blends with Various

Polymers. Kobunshi Ronbunshu 54 (1997) 301.

74. Komori T. Runx2, A Multifunctional Transcription Factor in Skeletal

Development. Journal of Cellular Biochemistry 87 (2002) 1.

75. Krane S.M. Identifying genes that regulate bone remodeling as potencial

therapeutic target. The Journal of Experimental Medicine 201(2005) 841.

76. Księżopolska‑Orłowska K. Changes in bone mechanical strength in response to

physical therapy. Polskie archiwum medycyny wewnerznej 120 (9) (2010)

368.

Cap. 7: Bibliografía. 136


77. Kumbar S.G., Bhattacharyya S., Sethuraman S., Laurencin C.T. A

preliminary report on a novel electrospray technique for nanoparticle based

biomedical implants coating: precision electrospraying. Journal of Biomedical

Materials Research Part B: Appl Biomater 81B (2007) 91.

78. Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of

bacteriophage T4. Nature 227 (1970) 680.

79. Landis W.J., Song M.J., Leith A., McEwen L., McEwen B.F. Mineral and

organic matrix interaction in normally calcifying tendon visualized in 3

dimensions by high-voltage electron-microscopic tomography and graphic image-

reconstruction. Journal of Structural Biology. 110 (1) (1993) 39.

80. Langer R., Vacanti J. P. Tissue Engineering. Science 260 (1993) 920.

81. Lebovitz A. H., Gray M. K., Chen A. C., Torkelson J.M. Interpolymer radical

coupling reactions during sonication of polymer solutions. Polymer 44 (2003)

2823.

82. Leong K. F., Cheah C. M., Chua C. K. Solid freeform fabrication of three-

dimensional scaffolds for engineering replacement tissues and organs.

Biomaterials 24 (13) (2003) 2363.

83. Lerner U.H. Bone Remodeling in Post-menopausal Osteoporosis. Journal of

Dental Research 85 (7) (2006) 584.

84. Li J., Dou Y., Yang J., Yin Y., Zhang H., Yao F., Wang H., Yao K. Surface

characterization and biocompatibility of micro- and nano- hydroxyapatite/chitosan

gelatin network films. Materials Science and Engineering: C-Bio S 29 (2009)

1207.

85. Lian J.B., Stein G.S. Chapter 14; The cells of bone en Dynamics of Bone and

Cartilage Metabolism. Editado por Seibel M. J., Robins S.P., Bilezikian J.P. 2º

edicion (2006).

Cap. 7: Bibliografía. 137


86. Liebschner M.A.K., Wettergreen M.A. Chapter 6. Optimization of Bone

Scaffold Engineering for Load Bearing Applications. Topics in Tissue

Engineering. Eds. N. Ashammakhi & P. Ferretti (2003).

87. Lievers W.B., Waldmana S.D., Pilkey A.K. Minimizing specimen length in

elastic testing of end-constrained cancellous bone. Journal of the mechanical

behavior of biomedical materials 3 (2010) 22.

88. Linde F., Hvid I. The effect of constraint on the mechanical behaviour of

trabecular bone specimens. Journal of Biomechanics. 22 (1989) 485.

89. Liu R., Schindeler A., Little D.G. The potential role of muscle in bone repair.

Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions 10 (1) (2010) 71.

90. Liu X., Ma P.X. Polymeric Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Annals of

Biomedical Engineering 32 (3) (2004) 477.

91. Liu Z-M., Gu Q., Xu Z.-K., Groth T. Synergistic effect of Polyelectrolyte

Multilayers and Osteogenic Growth Medium on Diferentation of Human

Mesenchymal stem cells. Macromolecular Bioscience. 10 (2010) 1043.

92. Loong C.-K, Rey C., Kuhn L. T., Combes C., Wu Y., Chen S.-H., Glimcher

M. J. Evidence of Hydroxyl-Ion Deficiency in Bone Apatites: An Inelastic

Neutron-Scattering Study. Bone 26 (6) (2000) 599.

93. Lowenstein C.J., Padalko E. iNOS (NOS2) at a glance. Journal of Cell

Science 117 (2004) 2865.

94. Ma P.X. Scaffolds for tissue fabrication. Materials Today (2004) 30.

95. Malloy K.M., MD; Hilibrand A.S. Autograft versus Allograft in Degenerative

Cervical Disease. Clinical orthopaedics and related research 394 (2002) 27.

96. Marmur A. in Contact Angle, Wettability and Adhesion, Edited Mittal K. L.,

VSP, Utrecht 3 (2003) 373.

97. Martin R.B. Toward a unifying theory of bone remodeling. Bone 26 (1) (2000) 1.

Cap. 7: Bibliografía. 138


98. Martin T.J., Udagawa N. Hormonal Regulation of Osteoclast Function. Trends

in Endocrinology & Metabolism 9 (1) (1998) 6.

99. Más Estallés J., Vidaurre A., Meseguer Dueñas J.M., Castilla Cortázar I.

Physical characterization of polycaprolactone scaffolds. The Journal of Materials

Science: Materials in Medicine 19 (1) (2008) 189.

100. McCarthy A. D., Uemura T., Etcheverry S. B., Cortizo A. M. Advenced

glycation endproducts interfere with integrin-mediated osteoblastic attachment to

a type-1 collagen matrix. The International Journal of Biochemistry & Cell

Biology. 36 (2004) 840.

101. McKibbin B. The biology of fracture healing in long bones. The Journal of Bone

and Joint Surgery. 60-B (2) (1978) 150.

102. Meyers M.A., Chen P.Y., Lin A.Y.M., Seki Y. Biological materials: Structure

and mechanical properties. Progress in Materials Science 53 (2008) 1.

103. Moldovan N.I. Emerging roles of reactive oxygen and nitrogen species in

setm/progenitor cells. Antioxidants & Redox Signaling 7 (11&12) (2005) 1409

104. Molinuevo M.S., Schurman L., McCarthy A.D., Cortizo A.M., Tolosa M.J.,

Gangoiti M.V., Arnol V., Sedlinsky C. Effect of Metformin on bone marrow

progenitor cell differentiation: In Vivo and In Vitro Studies. Journal of Bone and

Minerals Research 25 (2010) 211.

105. Morrison S., Kimble J. Asymmetric and symmetric stem-cell divisions in

development and cancer. Nature 441 (2006) 1068.

106. Morriss-Kay G. M. Derivation of the mammalian skull vault. Journal of

Anatomy 199 (2001) 143.

107. Morosano M., Masoni A., Sanchez A. Incidence of hip fractures in the city of

Rosario, Argentina. Osteoporosis International 16 (2005) 1339.

Cap. 7: Bibliografía. 139


108. Mountziaris P.M., Mikos A.G. Modulation of the Inflammatory Response for

Enhanced Bone Tissue Regeneration. Tissue Engineering: Part B 14(2) (2008)

179.

109. Oh J.S., Isayev A.I., Rogunova M.A. Continuous ultrasonic process for in situ

compatibilization of polypropylene/natural rubber blends. Polymer 44 (2003)

2337.

110. Olsen B.R., Reginato A.M., Wang W. Bone development. Annual Review of

Cell and Developmental Biology 16 (2000) 191.

111. Olszanecki R., Gebska A. Kozlovski V.I., Gryglewski R.J. Flavonoids and

nitric oxide synthase. Journal of Physiology and Pharmacology 53 (4) (2002)

571.

112. Ooi C.Y., Hamdi M., Ramesh S. Properties of hydroxyapatite produced by

annealing of bovine bone. Ceramics International 33 (2007) 1171.

113. Orimo H. The mechanism of mineralization and the role of alkaline phosphatase

in Health and disease. Journal of Nippon Medical School 77 (1) (2010) 4.

114. Ornitz D.M., Marie P.J. FGF signaling pathways in endochondral and

intramembranous bone development and human genetic disease. Genes &

Development 16 (2002) 1446.

115. Ortega N., Behonick D. J., Werb Z. Matrix remodeling during endochondral

ossification. Trends in Cell Biology. 14(2) (2004) 86.

116. Otsuka M., Matsuda Y., Hsu J., Fox J., Higuchi W. Mechanochemical

synthesis of bioactive material: effect of environmental conditions on the phase

transformation of calcium phosphates during grinding. Bio-Medical Materials

and Engineering. 4 (5)(1994) 357.

117. Peitl O., Zanotto E.D., Hench L.L. Highly bioactive P2O5-Na2O-CaO-SiO2

glass-ceramics. Journal of Non-Crystalline Solids 292 (2001) 115.

Cap. 7: Bibliografía. 140


118. Porter J.R., Ruckh T.T., Popat C.K. Bone Tissue Engineering: A Review in

Bone Biomimetics and Drug Delivery Strategies. Biotechnology Progress 25

(2009) 1539.

119. Potier E., Noailly J., Ito K. Directing bone marrow-derived stromal cell function

with mechanics. Journal of Biomechanics 43 (2010) 807.

120. Poumarat G., Squire P. Comparison of mechanical properties of human, bovine

bone and a new processed bone xenograft. Biomaterials 14 (5) (1993) 337.

121. Prabhakaran M.P., Venugopal J., Ramakrishna S. Electrospun nanostructured

scaffols for bone tissue engineering. Acta Biomaterials 5 (2009) 2884.

122. Prina R., Rubino P., Gutiérrez R., Cassini F. Resultados tempranos de la

artroplastia cervical utilizando PRODISC-C. Revista Argentina de

Neurocirugia 23 (2009) 5599.

123. Quarles L.D., Yohay D.A., Lever L.W., Caton R., Wenstrup R.J. Distinct

proliferative and differentiated stages of murine MC3T3-E1 cells in culture: an in

vitro model of osteoblast development. Journal of Bone and Mineral Research 7

(1992) 683.

124. Raschke W. C., Baird S., Ralph P., Nakoinz I. Functional Macrophage Cell

Lines Transformed by Abelson Leukemia Virus. Cell 15 (1978) 261.

125. Reddi A.H. Bone Morphogenesis and Modeling: Soluble Signals Sculpt

Osteosomes in the Solid State. Cell 89 (1997) 159.

126. Rezwan K., Chen Q.Z., Blaker J.J., Boccaccini A.R. Biodegradable and

bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue

engineering. Biomaterials 27(2006) 3413.

127. Rho J.Y., Spearing L.K., Zioupos P. Mechanical properties and the hierarchical

structure of bone. Medical Engineering & Physics 20 (1998) 92.

Cap. 7: Bibliografía. 141


128. Rohlmann A., Zilch H., Bergmann G., Kolbel R. Material properties of femoral

cancellous bone in axial loading. Part I: Time independent properties. Archives

of Orthopaedic and Trauma Surgery 97 (1980) 95.

129. Rizzoli R. Atlas of Postmenopausal Osteoporosis. Third edition (2010).

130. Sakata K., Hirose Y., Qiao Z., Tanaka T., Mori H. Inhibition of inducible

isoforms of cyclooxygenase and nitric oxide synthase by flavonoid hesperidin in

mouse macrophage cell line. Cancer Letters 199 (2003) 139.

131. Salgado A.J., Coutinho O.P., Reis R.L. Bone Tissue Engineering: State of the

Art and Future Trends. Macromolecular Bioscience 4 (2004) 743.

132. Scaglione S., Ilengo C., Fato M., Quarto R. Hydroxyapatite-coated

polycaprolactone wide mesh as a model of open structure for bone regeneration.

Tissue Engineering Part A 15 (2009) 155.

133. Shapiro F. Bone development and its relation to fracture repair the role of

mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts. European Cells and Materials

15 (2008) 53.

134. Shum L., Nuckolls G. The life cycle of chondrocytes in the developing skeleton.

Genes and Development 16 (2002) 1446.

135. Schurman L., Bagur A., Claus-Hermberg H., Messina OD., Negri A.,

Sánchez A. Guías para diagnóstico, prevención y tratamiento de la osteoporosis

2007. Revista Argentina de Osteología 6 (2007) 27.

136. Sikavitsas V.I., Temenonoff J.S., Mikos A.G. Biomaterials and bone

mechanotransduction. Biomaterials 22 (2001) 2581.

137. Speaker B.L. Influence of rapid growth on skeletal adaptation to exercise. Journal

of musculoskeletal & neuronal interactions 6(2) (2006) 147

Cap. 7: Bibliografía. 142


138. Steiniche T., Hauge E.M. Chapter 3; Normal Structure and Function of Bone en

Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. Editado por An Y. H.,

Martin K. L. (2003).

139. Sudo H., Kodama H.A., Amagi Y., Yamamoto S., Kasai S. In vitro

differetianton and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from

newborn mouse calvaria. The Journal of Cell Biology 96 (1) (1983) 191.

140. Supova M. Problem of hydroxyapatite dispersion in polymer matrices: a review.

The Journal of Materials Science: Materials in Medicine 20 (2009) 1201.

141. Takeuchi Y., Matsumoto T., Ogata E., Shishiba Y. Effects of transforming

growth factor beta 1 and L-ascorbate on synthesis and distribution of

proteoglycans in murine osteoblast-like cells. Journal of Bone and Mineral

Research 8(7) (1993) 823.

142. Teixeira C.C., Agoston H., Beier F. Nitric oxide, C-type natriuretic peptide and

cGMP as regulators of endochondral ossification. Developmental Biology

319(2) (2008) 171.

143. Thurston A.J. Paré and prosthetics: the early history of articial limbs. ANZ

Journal of Surgery. 77 (12) (2007) 1114.

144. Toriyama M., Ravaglioli A., Krajewski A., Celotti G., Piancastelli A.

Synthesis of hydroxyapatite-based powders by mechno-chemical method and their

sintering. Journal of the European Ceramic Society. 16 (1996) 429.

145. Tsikas D. Methods of quantitative analysis of the nitric oxide metabolites nitrite

and nitrate in human biological fluids. Free Radical Research. 39(8) (2005) 797.

146. Tsikas D. Analysis of nitrite and nitrate in biological fluids by assays based on

the Griess reaction: Appraisal of the Griess reaction in the l-arginine/nitric oxide

area of research. Journal of Chromatography B 851 (2007) 51.

Cap. 7: Bibliografía. 143


147. Tullberg-Reinert H., Jundt G. In situ measurement of collagen synthesis by

human bone cells with a sirius red-based colorimetric microassay: effects of

transforming growth factor beta2 and ascorbic acid 2-phosphate. Histochemistry

and Cell Biology 112 (1999) 271.

148. Ueno A., Kitase Y., Moriyama K., InoueH. MC3T3-E1-conditioned medium-

induced mineralization by clonal rat dental pulp cells. Matrix Biology 20 (5-6)

(2001) 347.

149. Valle-Ortiz M., Crespo Romero R., Garcia G.V., Gonzalez Roldan C.J,

Sanchez-Cruzado B., Martinez B.T. Aloinjertos óseos. Acta Ortopedica

Castellano-Manchega 1 (1) (2000) 59

150. Vallet-Regi M. Biocerámicas. Anales de la Real Sociedad Española de

Química 2 (2003) 167.

151. Villemure I., Stokes I.F. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey

of present understanding. Journal of Biomechanics 42 (2009) 1793.

152. Walters M.A., Leung Y.C., Blumenthal N.C., LeGeros R.Z., Konsker K.A. A

raman and infrared spectroscopic investigation of biological hydroxyapatite.

Journal of Inorganic Biochemistry 39 (1990) 193.

153. Wang D., Christensen K., Chawla K., Xiao G., Krebsbach P. H., Franceschi

R.T. Isolation and Characterization of MC3T3-E1Preosteoblast Subclones with

Distinct In Vitro and In Vivo Differentiation/Mineralization Potential. Journal

of Bone and Minerals Research 14 (6) (1999) 893.

154. Webb K., Hlady V., Tresco P. Relative importance of surface wettability and

charged functional groups on NIH 3T3 fibroblast attachment, spreading and

cytoskeletal organization. Journal of Biomedical Materials Research 41 (1998)

422.

Cap. 7: Bibliografía. 144


155. Webster T.J., Ergun C., Doremus R.H., Siegel R.W., Bizios R. Specific

proteins mediate enhanced osteoblast adhesion on nanophase ceramics. Journal of

Biomedical Materials Research 51 (2000) 475.

156. Williams D.F. , Zhong S.P. Biodeterioration/Biodegradation of polymeric

medical devices In Situ. Internatinal Biodeterioration & Biodegradation 130

(1994) 95.

157. Wu Y., Clark R.L. Electrohydrodynamic atomization: a versatile process for

preparing materials for biomedical applications. Journal of Biomaterials

Science, Polymer Edition 19 (5) (2008) 573.

158. Yin T., Li L. The stem cell niches in bone. J. Clin Invest. 116 (2006) 1195.

159. Yokochi C., Rohen J.W., Weinreb E.L. Atlas fotografio de anatomia del cuepo

humano. 3era Edicion. 1991.

160. Zanchetta P., Guezennec J. Surface thermodynamics of osteoblasts: relation

between hydrophobicity and bone active biomaterials. Colloids and Surface B:

Biointerfaces 22 (2001) 301.

161. Zernicke R., MacKay C., Lorincz C. Mechanims of bone remodeling during

weigth-bearing excercise. Applied Physiology, Nutrition and Metabolism 31

(2006) 655.

Cap. 7: Bibliografía. 145


Nunca llega el momento en que puedas decir: he trabajado bien, y mañana es domingo. En
cuanto te detienes, vuelves a empezar otra vez desde el principio. Puedes dejar de lado un
cuadro y decir que no lo vas a tocar más. Pero nunca podras ponerle debajo la palabra… FIN.
Pablo Picasso