APORTE NUTRICIONAL DE LAS MACROMOLÉCULAS
María Alejandra Díaz Mejía
1. OBJETIVOS
Cuantificar, cualificar y determinar el punto
isoeléctrico de la caseína aislada de leche entera
Colanta por medio de procesos de centrifugación y
lavados.
Determinar las proteínas presentes en los diferentes
lavados de la extracción por medio de electroforesis
SDS PAGE
Cuantificar el nitrógeno total presente en la muestra
de caseína por medio del método Kjeldahl en escala
micro
2. INTRODUCCIÓN
Unos de los alimentos más importantes para el ser
humano, y para los mamíferos en general es la leche, la
cual aporta los nutrientes necesarios para las crías en la
primera etapa de sus vidas; contiene proteínas de gran
valor biológico, diversas vitaminas y minerales
imprescindibles para la nutrición, aporta muchos
nutrientes, además de agua y minerales, es rica en
proteínas y azúcares, importantes para el organismo.
La leche, además, contiene vitaminas y algunas
enzimas digestivas. Todos esos componentes le
confieren una gran utilidad para el organismo. De los
azúcares, tiene importancia la lactosa, constituida por
glucosa y galactosa (Clínica Universidad de Navarra,
2015). Aporta una gran cantidad de calcio y otros
minerales como el fósforo y potasio.
En la leche hay tres clases de proteínas: caseína,
lacto albúminas y lacto globulinas (todas
globulares). La caseína es una proteína conjugada de
la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la
leche por acidificación y forma una masa blanca.
Las fosfoproteínas son un grupo de proteínas que
están químicamente unidas a una sustancia que
contiene ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de
los grupos fosfato están unidos por los grupos
hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La
caseína en la leche se encuentra en forma de sal
cálcica (caseinato cálcico) y representa cerca del
77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y
el 2,7% en composición de la leche líquida. (Físico-
Química de Biomoléculas)
La propiedad característica de la caseína es su baja
solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6
aproximadamente, estando a ese pH la caseína
cargada negativamente y solubilizada como sal
cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga
negativa de la superficie de la micela se neutraliza
(los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra
precipita
La conformación de la caseína es similar a las
proteínas desnaturalizadas globulares. El alto
número de residuos de prolina en la caseína causa un
especial plegamiento en la cadena de proteína e
inhibe la formación de una fuerte y ordenada
estructura secundaria. La caseína no contiene
puentes di sulfuro. De igual manera la falta de
estructura secundaria es importante para la
estabilidad de la caseína frente a la desnaturalización
por calor.
La carencia de estructura terciaria facilita la situación
al exterior de los residuos hidrofóbicos lo que facilita
la unión entre unidades proteicas y la convierte en
prácticamente insoluble en agua. En cambio es
fácilmente dispersable en álcalis diluidas y en
soluciones salinas tales como oxalato sódico y acetato hidróxido de sodio, se agitó hasta completar una
sódico. (Miller D.D. 2001) disolución completa, cuando se disolvió la caseína se
vertió en un matraz aforado, se añadió 5 mL de ácido
La función biológica de las micelas de caseína es acético 1N y se llevó a un volumen de 50 mL con
transportar grandes cantidades de Ca y P altamente agua destilada, la fracción sobrante corresponde a la
insoluble en forma líquida a los lactantes y formar un solución C.
coagulo en el estomago para favorecer una nutrición
eficiente. Además de caseína, Ca y P la micela Determinación del punto isoeléctrico de la
formada también contiene citrato, iones, lipasa, caseína
enzimas plasmáticos y suero. Estas micelas ocupan del Se tomatón 10 vasos en los que se agregaron los
6-12% del volumen total de la leche. Las proteínas que siguientes volúmenes:
aparecerán en el sobrenadante cuando precipitemos la
caseína en medio ácido son proteínas globulares,
hidrofilicas y fácilmente solubles en agua así como
susceptibles de desnaturalización por calor. Las
principales son ß -lacto globulina, alphalactalbumina,
bovine serum albumin (BSA), y inmunoglobulinas (Ig)
(Miller D.D. 2001)

La caseína se emplea en la industria para la fabricación

de pinturas especiales y en el apresto de tejidos, la
clarificación de vinos, la elaboración de preparados
farmacéuticos y la fabricación de plásticos. La pintura
de caseína ha sido usada desde la antigüedad por los
egipcios (Berobide R.)

3. MATERIALES Y MÉTODOS Se midió el pH de cada vaso que debería estar entre

un 3 y 6,5 aproximadamente. Después a cada vaso se
Aislamiento de caseína le agregó 1ml de la solución de caseína, se agitó y se
midió la absorbancia de la muestra de cada vaso a
Se calentó en un vaso de precipitados 100 mL de agua 640nm.
destilada, se añadieron 50 mL de leche entera Colanta,
se calentó por debajo de los 37°C, se agregó gota a
gota con una bureta ácido acético hasta que se observó Cuantificación de proteínas de la leche
un precipitado indicando que la leche se cortó. Para la cuantificación de las proteínas en la leche se
realizaron las siguientes soluciones
Luego se centrifugó, precipitó y se guardó el
sobrenadante (solución A), luego se lavó el precipitado
con 20 mL de etanol y se centrifugó, se pesó el
precipitado obtenido anteriormente se le adiciono 10
mL de éter etílico se centrifugó (solución B), el
precipitado blanco que se obtuvo corresponde a la
caseína aislada.

Preparación de solución de caseína

Se colocaron aproximadamente 250mg de caseína

previamente aislada en un vaso de precipitado, se
agregaron 20 mL de agua destilada y 5 mL de
 Se agitó suavemente cada tubo, se dejaron en la acético glacial, de agua destilada), se llevó a foto
oscuridad por 15 minutos y se midió la documentador y se observaron las bandas de colores.
absorbancia a 550 nm.
Determinación de nitrógeno total
Electroforesis de las proteínas de la leche Este procedimiento no se pudo realizar por una falla
en el equipo (Equipo Kjeldahl)
Para la electroforesis se prepararon los 2 geles, el de
corrida y el de concentración. El gel de corrida debió 4. ANÁLISIS Y DISCUCIÓN DE
tener una mayor concentración de acrilamida y un RESULTADOS
pH más básico,
4.1 Acidificación de la leche

Lo que conocemos como cortar la leche es como la

El gel de apilamiento tenía menor concentración de
acrilamida con el tampón ligeramente ácido para que
las proteínas sometidas a electroforesis atravesaran
con rapidez el gel debido a la poca resistencia.
formación de un coagulo de la caseína y la
precipitación de sus proteínas a un pH inferior a 4,6
debido a la acidificación del medio, que hace que la
caseína se ionice en este caso en presencia de ácido
acético 1M, para la titulación se necesitaron 3,2 ml
del ácido para precipitar la caseína, esta cantidad
está relacionada con el contenido graso presente en
la muestra, entre más acido se requiera, más grasa
tiene la muestra.
Según lo reportado en la base de datos de alimentos
(MyFitnessPal, 2018) la leche entera Colanta
contiene 6g de contenido graso en una porción de
200 ml.
4.2 Determinación punto isoeléctrico

Una vez realizadas las soluciones se midió el

respectivo pH con el potenciómetro y posteriormente
se midió la absorbancia, en la siguiente tabla se
Una vez polimerizado el gel de corrida se prepara reporta el pH esperado, el pH y la absorbancia
en la parte superior el gel de corrida, se colocó en el obtenida:
casete en el tanque de electroforesis, con el tapón de PH PH
corrida donde se encontraba los electrodos, se quitó TUBO ABSORBANCIA
ESPERADO EXPERIMENTAL
el peine cuidadosamente y se colocaron con una 1 3,2 3,59 0,231
micropipeta las muestras, el colorín con la solución 2 3,6 3,87 0,295
A, B y C, se sometieron a calentamiento por unos 3 3,8 3,97 0,312
cuantos minutos después se sembraron en los 4 4,0 4,07 0,325
pocillos de los geles de electroforesis y se incluyó un 5 4,2 4,30 0,354
estándar de peso molecular en uno de los pocillos y 6 4,5 4,13 0,304
se dejó correr por 40 minutos, finalmente se 7 4,7 4,26 0,314
extrajeron los vidrios del casete, se sumergió al gel 8 5,1 4,37 0,318
en una solución al gel en una solución al gel en una 9 5,5 4,42 0,251
solución al gel en una solución al gel en una solución
10 6,1 5,52 0,200
al gel en una solución colorante (azul de TABLA 5: punto isoelectrico
Coomassie). Transcurrido el tiempo, se sumergió el
gel en una solución decolorante (metanol, ácido Podemos determinar el punto isoeléctrico de la
caseína por medio del gráfico ya que es
aproximadamente el punto de mayor absorbancia,
esto debido que al acidificar la leche, la caseína se Concentración (M) Absorbancia
precipita a un pH muy cercano a su punto
isoeléctrico, la cual se encuentra en forma de 0,000161 -0,007
caseinato de calcio que al reaccionar con el acido
acético aísla la caseína por la disociación de los 0,000347 0,010
iones del calcio, y eliminando el fosfato de calcio, es
decir según va bajando el pH se van rompiendo los 0,000567 0,028
enlaces entre los grupos fosfato y el ion calcio, al
reducirse la ionización de los fosfatos y las 0,000816 0,050
repulsiones entre las micelas se reducen, al acercarse
el pH al punto isoeléctrico de las caseínas 0,001125 0,039
A continuación se presenta la grafica de pH vs TABLA 6: CURVA DE CALIBRACION
absorbancia
El espectro de absorción de la albumina es útil para
hallar la longitud de onda de máxima absorción, que
es, en la que ocurre la transición electrónica, la cual
está relacionada con la concentración de la sustancia
a analizar. Sin embargo como las proteínas no
absorben la energía en la región visible se utilizó el
reactivo de Biuret el cual forma un compuesto que
absorbe la energía en la región UV

A partir de la tabla 6 obtenemos la figura 2, sin

embargo esta tiene un punto que genera una gran
desviación, por lo que se suprime el último punto y
FIGURA 1: grafica ph/ absorbancia
se presenta corregido en la figura 3 en la cual
Según la grafica el punto isoelectrico es 4,3 podemos observar la linealidad y corroborar la
experiemental, en la literatura (Calvo M) en la leche relación entre absorbancia y concentración
bovina existen cuatro caseínas, conocidas como αs1,
αs2, (que son sensibles al calcio, es decir, que pueden Esta desviación se puede deber al tamaño de la
precipitar al asociarse con él) y las β y κ caseína y proteína ya que las soluciones preparadas no tienden
cada una precipita a un pH diferente que en a estar diluidas totalmente diluidas lo que produce
promedio es 4,6, que es su punto isoeléctrico (a imprecisiones en la lectura de las absorbancias.
temperatura ambiente) y alrededor de 4,5 (a una
temperatura superior a 20ºC). Se obtuvo un error de
4,1% que pudo deberse a un exceso de ácido en la
preparación de las soluciones
4.3 Cuantificación de proteínas de la leche

Los datos obtenidos se presentan en la siguiente

tabla, las concentraciones se calculan a partir de las
soluciones de albumina preparadas

FIGURA 2: grafica concentración/absorbancia

FIGURA 3: grafica concentración/absorbancia corregida
MARCADOR MUESTRAS
La ecuación de la recta nos permite calcular la
concentración de proteínas en las muestras ya que se Distancia Distancia
PM(kDa) PM(kDa)
(cm) (cm)
obtuvo un R2 cercano a 1, las concentraciones se
calculan al despejar 𝑥 de la ecuación de la recta 175 0,3 A 13,7 4,9
obtenida en la figura 3.
130 0,6 B1 13,7 4,9

SLN ABS [M] [g/ml] [g/200ml] 95 1,0 9,16 5,7

B2
A 0,032 0,3706 0,0125 2,51
B 0,161 0,0021 0,0199 3,98 70 1,4 C1 26,54 3,6
C 0,724 0,0086 0,0235 4,71
62 2,8 20,60 4,1
C2
Según lo reportado en la base de datos de 51 2,2
alimentos(MyFitnessPal, 2018) la leche entera
Colanta contiene 6g de proteína en una porción de 42 2,7
TABLA 7: ELECTROFORESIS
200 ml, en la leche de vaca, la caseínas representan
alrededor del 80% del total de proteínas, es decir, 4,8 29 3,1
g, al comparar con la solución C tiene un contenido
similar y un error del 2,08% 22 4,1

4.4 Electroforesis
Se realizó un análisis electroforético en gel de
poliacrilamida SDS en la leche, este método es uno
de los más utilizados para la caracterización de las
proteínas y básicamente consiste en la separación de
las proteínas por su peso molecular. Se utilizó un
marcador de gel Tris-Glicina al 15%, a la cual se le
midió la distancia recorrida según el gel por cada
peso molecular reportado.
14 5,1
10,5 5,5
Los pesos moleculares de las manchas visualizadas
en las muestras A, B y C se calculan por medio de
una regresión semi logarítmica de la forma y=a*b^x
que es también representada por la gráfica log del
peso molecular vs distancia recorrida
Las principales proteínas esperadas son la
lactoglobulina(18,5 kDa) y las a, b y k-caseína que
están entre el rango de 20-30 kDa, en este orden de
ideas podríamos estimar que la muestra C2
corresponde a la lactoglobulina o que las muestras
C1 y C2 corresponden a las a, b y k-caseína; en estos
datos influye la toma de datos que fue en su mayoría
“cualitativa” lo que lo hace bastante imprecisa,
además de factores como el tiempo de corrida y la
cantidad de datos del marcador
4.5 CUESTIONARIO
¿Qué sucedería si se representa la transmitancia para
la determinación del punto isoeléctrico de la
caseína?
El punto isoeléctrico de la caseína respecto a la
absorbancia corresponde a su valor máximo, el cual
sería el mismo pH que se encuentra en el valor
mínimo de transmitancia y que debería coincidir con
el PI obtenido en la Figura 1.
¿Cuál es el punto isoeléctrico de la caseína?
Determínelo con los datos de su experimento y
compárelo con el obtenido por bioinformática.
Según la figura 1 el punto isoelectrico es 4,3
experiemental, en la literatura (Calvo M) en la leche
bovina existen cuatro caseínas, conocidas como αs1,
αs2, (que son sensibles al calcio, es decir, que pueden
precipitar al asociarse con él) y las β y κ caseína y
cada una precipita a un pH diferente que en
promedio es 4,6, que es su punto isoeléctrico (a
temperatura ambiente) y alrededor de 4,5 (a una
temperatura superior a 20ºC). Se obtuvo un error de
4,1% que pudo deberse a un exceso de ácido en la
preparación de las soluciones
¿Por qué las proteínas tienen solubilidad mínima en
el pI?
Porque en el punto isoeléctrico la proteína tiene
carga cero lo que produce el precipitado por falta de
fuerzas de repulsión y la estabilización de sus
estructuras terciarias
¿Cuál es el peso aproximado de las proteínas de la
caseína?
Las principales proteínas esperadas son la
lactoglobulina (18,5 kDa) y las a, b y k-caseína que
están entre el rango de 20-30 kDa,
¿Cuál es la concentración de la solución de caseína?
Las caseínas son las principales proteínas de la
leche. Se sintetizan exclusivamente en la glándula
mamaria, y en la leche se encuentran en su mayor
parte formando agregados multimoleculares
conocidos como “micelas de caseína”. En la leche de
vaca, la caseínas representan alrededor del 80% del
total de proteínas, es decir, de 25 a 28 gramos por
litro de leche, en la práctica se obtuvieron 4,71 g de
caseína por cada 200 ml de leche entera
¿A qué se debe la diferencia del pH teórico de las
soluciones preparadas para la determinación del
punto isoeléctrico y el pH medido
experimentalmente?
Esta variación se debe posiblemente a una ligera
variación de la acidez en las soluciones producidas
por su incorrecta elaboración o por contaminación de
la solución de neutralización del electrodo en la toma
de datos
5. CONCLUSIONES
Se determinó el contenido graso de la leche entera,
aproximadamente 6 g/200ml
Se determinó el punto isoeléctrico de la caseína 4,3
que difiere en 4,1% con el reportado en la literatura
de 4,5
Se determinaron las proteínas presentes en la leche
bovina la lactoglobulina(18,5 kDa) y las a, b y k-
caseína que están entre el rango de 20-30 kDa,
La caseína se desnaturaliza fácilmente por factores
como el cambio de pH, de temperaturas y
centrifugaciones, por lo que la buena manipulación
es la garantía de buenos resultados
6. BIBLIOGRAFÍA
*Clínica Universidad de Navarra, 2015 Importancia
de consumir leche, extraído de:
https://www.cun.es/chequeos-salud/vida-
sana/nutricion/importancia-consumir-leche
*Físico-Química de Biomoléculas Práctica 3
EXTRACCIÓN DE LA CASEINA Y
DETERMINACIÓN DEL PUNTO
ISOELECTRICO extraído de:
https://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/b
iotec_FQbiomol/Practica3FQB.pdf
*Miller D.D. 2001. Química de Alimentos, Manual *MyFitnessPal, 2018 Información nutricional
de Laboratorio. Limusa Wiley, México Colanta - Leche Entera, Caja Y Bolsa
*R. Berobide. Proteínas: Leche y caseína extraído MyFitnessPal INC. extraído de:
de:http://liceo6.weebly.com/uploads/7/1/5/4/715433 http://www.myfitnesspal.com/es/food/calories/colant
9/protenas_leche_y_casena.pdf a-leche-entera-caja-y-bolsa-665131845?v2=false
* Miguel Calvo BIOQUIMICA DE LOS A:
LIMENTOS, CASEÍNAS, extraído
dehttp://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/proteins/
caseina.html