You are on page 1of 14

BAB 4.

SPEKTROFOMETRI

Salah satu sifat benda adalah warnanya. Benda dapat berwarna oleh karena
kemampuannya menyerap, meneruskan, atau memantulkan komponen—komponen
warna dan cahaya atau sinar yang melaluinya. Misalnya seseorang melihat satu gelas
sirup berwarna merah. Ini disebabkan oleh karena komponen-komponen biru dan
kuning dan cahaya putih yang melalui sirup tersebut diambil/diserap dan yang
diteruskan hanya komponen merahnya saja. Oleh karena itu sirup lalu berwarna
merah. Sifat demikian juga berlaku untuk komponen-komponen kimiawi penyusun
suatu bahan. Oleh akrena intensitas cahaya dapat diukur, maka atas dasar tersebut
dapat digunakan sebagai dasar untuk analisis suatu komponen baik secara kualitatif
mau pun secara kuantitatif.
Cahaya dapat diartikan sebagai gelombang elektromagnetik. Sebagian (kecil) dapat
ditangkap oleh mata manusia dan sebagian (besar) tidak dapat. Yang dapat ditangkap
oleh mata adalah spektrum cahaya yang berada pada panjang gelombang 400-800nm.
Dekat dengan panjang gelombang 400nm tetapi berada di bawahnya adalah spektrum
ultra violet (UV) yang umumnya berkisar pada panjang gelombang 200-400nm,
sedangkan dekat dengan panjang gelombang 800nm tetapi berada di atasnya
merupakan spektrum cahaya mendekati infra merah (near infra red, NIR). Gambaran
spektrum cahaya kurang lebih seperti berikut mi.

Untuk keperluan analisis panjang gelombang antara 200-800nm adalah yang paling
sering digunakan. Beberapa metoda dan untuk keperluan khusus menggunakan
panjang gelombang infra merah dan NIR.

4-1 TEORI DASAR

Jika cahaya diasumsikan sebagai fenomena gelombang, maka akan tampak gambaran
seperti berikut ini.

Universitas Gadjah Mada

maka sejumlah energi akan dialihkan pada sampel yang akan meningkatkan keadaan elektronnya ke suatu tingkat energi tinggi. Hubungan masing-masing diformulasikan sebagai berikut: Sementara itu hubungan antara energi dan frekuensi adalah: h adalah konstanta Plank. Jumlah gelombang yang melalui suatu titik (interval) per unit waktu adalah frekuensi (v). memerlukan energi yang makin tinggi. Hubungan antara panjang gelombang dengan frekuensi dapat diformulasikan sebagai berikut: c adalah kecepatan cahaya. Perubahan transisi molekular ini bertingkat dan elektronik. Parameter lain yang juga berguna adalah jumlah gelombang cahaya per unit jarak yang diberi simbol . vibrasi sampai pada rotasi. Jika cahaya melalui suatu substansi tertentu.Jarak antara dua puncak dan simpulnya adalah panjang gelombang yang diberi simbol ‫ג‬. Panjang gelombang suatu cahaya mempunyai peranan pada transisi ini dan dapat dikalkulasi melalui formula: Universitas Gadjah Mada .

b adalah panjang cahaya dan c adalah konsentrasi materi yang mengadsorpsi cahaya. Meski pun pada permulaan penemuannya digunakan transmitan (T) untuk pengukuran adsorpsi. konstanta asorpsi tidak digunakan lagi melainkan diganti dengan konstanta ekstingsi Universitas Gadjah Mada . Hal ini diperkenalkan oleh seorang ahli di bidang ini yang bernama Bouquer pada tahun 1729. Selanjutnya pada sel berikutnya hanya 25% yang ditransmisikan (atau 50% dan cahaya yang ditransmisi oleh sel pertama). Eksitasi (perangsangan) dari π elektro tunggal mengabsorpsi sangat sedikit cahaya tampak. Ia mengasumsikan insiden radiasi yang terjadi pada sel pertama mempunyai nilai 1. demikian seterusnya dalam gambar dan formulasi sebagai berikut: a adalah koefisein absorpsi semacam a pada formula sebelumnya. Dengan demikian jumlah energi (panjang gelombang cahaya) yang terabsorbsi oleh suatu molekul dapat digunakan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi secara kualitatif dan kuantitatif. Lima atau lebih dari π elektron dan sistem cincin benzena atau tujuh dan π elektron dan sistem konyugasi tunggal akan menghasilkan absorbansi sinar tampak nyata. Ia menggunakan satu seri tabung yang berisi penuh suatu material yang mempunyai sifat mengadsorpsi dan mengukur jumlah cahaya yang ditransmisikan. maka absorbansinya juga akan meningkat. Hubungan antara absorbansi dengan tranmitansi adalah sebagai berikut: demikian juga dalam pengembangan selanjutnya menjadi absorbansi tersebut. molekul ini meningkatkan sebanyak π elektron.Spektrum tampak (visible) dan ultra violet berasosiasi hanya dengan transisi elektronik. Pada molekul senyawa organik. tetapi dalam pengembangannya digunakan absorbasi (A) dan optical density (OD).5% yang ditransmisikan oleh sel ketiga (atau 50% dan ahaya yang ditransmisi oleh sel kedua). tetapi jika π elektronnya meningkat.0. maka hanya 50% yang ditranmisikan oleh cahaya tersebut. dan hanya 12.

suhu dan panjang gelombang standar (tertentu). Oleh karena merupakan pengembangan antara absorbansi dan tranmitansi.85 pada panjang gelombang 340nm di dalam tabung (sel) 1 cm. yaitu: Penggunaan hukum Bonguer-Beer tersebut dalam contoh sebagai berikut.37x1O-4M memberikan absornasi 0. maka pengembangan formulasi ini dikenal dengan hukum Bonguer-Beer. yaitu besarnya absorbansi 1M larutan suatu komponen murni pada pelarut. Untuk mengidentifikasikan karakteristiknya dapat dikerjakan dengan mengamati besarnya absorbansi pada tiap panjang gelombang pada sinar tampak. Dengan menggunakan A = ε bc akan diperoleh = maka dengan mengsubstitusikan data yang ada akan diperoleh: Tiap bahan (komponen) mempunyai karakteristik serapan warna sinar yang spesifik. Cara ini dinamakan “scanning”.(ε). berbeda antara satu dengan yang lain. Alat untuk scanning ini Universitas Gadjah Mada . Hitung koefisien ekstingsi NADH jika larutan 1.

α adalah konstanta yang besarnya spesifik untuk setiap bahan dan disebut sebagai koefisien absorbsi.T adalah trnasmitan dan I adalah jumlah energi radian (cahaya) yang ditransmisikan oleh sel. Pada akhirnya ahli lain. 449nm. sedangkan xantofil mempunyai karakteristik absorbansi maksimum pada tiga panjang gelombang yaitu 48nm. sedangkan adalah jumlah energi radian yang datang (mengenai) sel. Dengan cara ini. mengembangkan penelitian yang analog tetapi mendiskripsikan dalam ukuran konsentrasi sebagai berikut: sekarang sudah dikembangkan untuk dapat dioperasikan secara otomatik yaitu scanning spectrophotometer. 422 449 480 481 Universitas Gadjah Mada . dan 422nm. karetonoida misalnya mempunyai karakteristik absorbansi maksimum pada panjang gelombang 480nm. Dari berbagai data yang dikumpulkan melalui penerlitian-penelitian. Beer. b adlah panjang gelombang yang melalui material. secara matematik kemudian diperoleh: e adalah angka dasar pada logaritma natur.

…. dan perlu diperhatikan dua hal berikut ini: 1. Dapat pula disebut dengan kalimat lain.Hal tersebut menimbulkan pertanyaan bagaimana dengan absorbansi suatu campuran berbagai komponen. adalah koefisien ekstingsi dari komponen murni yang ke n pada panjang gelombang yang ke n. Universitas Gadjah Mada . Tiap-tiap komponen murni tersebut dapat diketahui katrakteristik absorbansinya dengan menganalisis pada sebanyak panjang gelombang yang berbeda. c2. Simbol c1. Meski pun demikian dalam praktek hal ini jarang dikerjakan. Dan formula di atas dapat dikembangkan: An adalah absorbansi campuran pada setiap panjang gelombang sebanyak n kali. Kemudian setelah itu absorbansi campuran didertminasi pada panjang gelombang yang sama.A2. maka tiap komponen dalam campuran tersebut dapat dianggap sebagai komponen murni. 4-2 SPEKTROFOTOMETER Spektrofotometer adalah alat yang digunakan untuk mendeteksi transmitan atau absorban cahaya yang melewati suatu material (bahan). Kemampuan dapat digunakannya tiap komponen dalam keadaan murni. spektrofotometer adalah instrumen yang digunakan untuk mempelajari absorbsi atau emisi radian elektromagnetik sebagai fungsi dan panjang gelombang. 2.… An dan semua koefisien ekstingsi diukur secara langsung. Ternyata secara matematik: Untuk bahan berupa campuran beberapa komponen. sedangkan b dapat diketahui dengan menggunakan sel yang panjangnya 1 cm. sementara A1. Diperlukan pengetahuan tentang komposisi campuran secara cermat.cn adalah konstanta.

Jika digambarkan dalam bentuk blok (disebut pula black-box atau twiddle-the knobs) adalah sebagal berikut: Sumber cahaya Sumber cahaya dapat merupakan material yang menghasilkan energi tinggi dengan suatu voltase listrik yang tinggi atau dengan pemanasan elektrik. Pada umumnya digunakan lampu hidrogen atau lampu deuterium. Tabung (tempat. Kontinuitas energi yang besarnya konstan adalah yang terbaik karena panjang gelombang yang dihasilkan akan juga tetap. Ada beberapa macam sumber cahaya. Faktor-faktor lain yang berpengaruh adalah besarnya intensitas cahaya. Besarnya energi yang dapat dihasilkan tergantung pada beberapa faktor. wadah) yang tembus cahaya (transparan) untuk menempatkan sampel 4. Sumber energi radian yang stabil 2. Detektor radiasi yang dihubungkan dengan rekorder yang dapat memberikan data yang dapat dibaca. Butir 2 dan butir 3 sering digabung menjadi satu bagain yaitu yang dinamakan monokromator. Lampu ini terdiri atas sepasang elektroda yang ditempatkan dalam suatu tabung kaca yang berisi gas hidrogen atau deuterium pada tahanan rendah. maka panjang gelombang yang dihasilkan juga akan berubah-ubah. dan slit (lubang kecil) dan kolimat (lensa untuk merubah jalannya cahaya menjadi paralel) dan pemfokes cahaya 3. yang populer tiga macam yaitu sumber cahaya radian ultra ungu (violet). Oleh karena itu perubahan energi elektrik yang menghasilkan energi akan dapat merubah besarnya energi yang dihasilkan. Beberapa energi ini akan mempengaruhi panjang gelombang.Spektrofotometer juga sering disebut sebagai sektrofotometer saja. intensitas cahaya yang ditransmisikan (termasuk pula jenis alat) akan menyebabkan error (penyimpangan) pada pengukuran. Komponen- komponen spektrofotometer adalah: 1. Jika energi berubah-ubah. Sistem lensa terdiri atas kaca. Sumber cahaya ultra ungu. waktu pengukuran. Konsekuensinya diperlukan suatu suplai tenaga yang stabil untuk keperluan tersebut. Jika Universitas Gadjah Mada . sumber radian tampak. dan sumber radian infra merah.

jenis lampu ini dapat digunakan pula sebagai sumber cahaya NIR (near infra red). Lampu Nerst berbentuk bulat lonjong dari zirkonium atau yttrium oksida yang dipanaskan pada suhu sekitar 15000C dengan energi listrik. Jika elektron tersebut kembali pada keadaan semula. Jenis lampu ini berbentuk bulat dan silikon karbida yang dipanaskan pada suhu 12000C. Universitas Gadjah Mada . Sumber cahaya infra merah.tinggi serta secara terus menerus dan intensitasnya seragam pada suatu interval panjang gelombang yang dikehendaki.4-2Oµm. Monokromator Telah diketahui bahwa sumber cahaya yang idel adalah yang dapat mengeluarkan suatu spektrum yang. tetapi jenis lampu ini masih mengeluarkan sinai tampak walau pun sedikit dan tidak sestabil lampu hidrogen. Sumber cahaya tampak yang paling banyak digunakan adalah lampu tungsten. Jenis lampu lain yang dapat digunakan sebagai sumber radian ultra ungu adalah lampu xenon. Secara terus menerus cahaya ini dapat terjadi pada daerah panjang gelombang antara 300nm (400nm) sampai dengan 2500nm. maka elektron akan keluar ke dalam molekul-molekul gas pada keadaan tingkat energi tinggi. Lampu Globar atau lampu Nerst adalah jenis yang dapat menghasilkan cahaya infra merah. Cahaya ini dapat timbul pada daerah 1-40µm. Tetapi dalam praktek sukar dijumpai keadaan demikian seperti tampak pada gambar berikut ini.voltase tinggi yang stabil dintroduksikan pada elektrode-elektrode tersebut. maka menimbulkan cahaya yang secara terus menerus dapat terjadi pada daerah panjang gelombang antara 180- 350nm (beberapa ahli berpendapat antara 200-400nm). Lampu Nerst kurang stabil dibandingkan dengan lampu Globar. Daerah radiasinya adalah O.

monokromator harganya mahal sehingga filter Iebih banyak digunakan dalam praktek. b. Oleh karena itu diperlukan sesuatu yang dapat digunakan untuk mengubah radiasi polielektromagnetik suatu cahaya menjadi pita-pita yang pendek atau radiasi monokromatik. Ada dua macam alat yang dapat digunakan. c. sebab hanya radiasi yang diabsorpsi tersebut yang diukur. Meski pun demikian. absorpsi cenderung menunjukkan penyesuaian dengan hukum Beer. Monokromator merupakan alat yang juga dapat memungkinkan transisi harga berada pada daerah panjang gelombang tertentu. Keuntungan yang dimaksud adalah sebagai berikut: a. Interval pendek memungkinkan reduksi pita-pita absorpsi menjadi berdekatan satu dengan yang lain. Komponen-komponen monokromator adalah: a. suatu puncak dapat diukur pada keadaan absorpsi maksimum sehingga menaikkan sensitifitasnya. Slit sebagai jalan masuk radiasi polikromatik dan suatu sumber cahaya Universitas Gadjah Mada . Dengan interval pendek. sementara pada daerah di luar itu radiasinya diserap.Di dalam pemanfaatannya untuk pengukuran interval panjang gelombang yang pendek lebih menguntungkan daripada pada panjang gelombang yang panjang. Filter dibuat dari material spesial yang memungkinkan transmisi hanya berada pada daerah panjang gelombang tertentu. Lebar pita aktiv didefinisikan sebagai interval panjang gelombang yang menghasilkan nilai maksimum pada separuh tranmitan. yaitu filter dan monokromator. Pada umumnya filter mempunyai lebar pita aktif yang lebarnya (intervalnya) antara 20-5Onm. yaitu mengubah radiasi polikromatik menjadi radiasi monokromatik di antara lebar pita aktiv antara O. Dengan interval pendek.1-35nm.

Detektor Detektor adalah alat yang dapat mendeteksi komponen yang diukur secara kualitatif mau pun kuantitatif. Untuk pengujian di daerah ultra violet digunakan kuvet yang Universitas Gadjah Mada . Mempunyai stabilitas panjang pada saat pengukuran kuantitatif d. yaitu wadah untuk sampel. Ada beberapa macam detektor. Kolimat yang berupa lensa atau cermin yang mengubah arah cahaya dan tidak sejajar menjadi sejajar c. Slit sebagai jalan keluar radiasi mokromatik Secara skematik. yaitu detektor ultra violet dan visibel. dan detektor “middle and far infra red”. b. monomromator dapat digambarkan seperti pada gambar berikut ini. Pada umumnya merupakan suatu sinyal elektronik yang diteruskan pada suatu meter atau rekorder. 4-3 PENANGANAN SAMPEL Tiga hal yang perlu diperhatikan pada pengukuran sampel. Mempunyai sinyal elektrik yang mudah dibaca langsung dengan suatu alat.Untuk sampel yang akan diperiksa (diuji) pada daerah ultra violet dan daerah sinai tampak umumnya berupa gas atau larutan yang diletakkan di dalam suatu tabung (sel) atau kuvet. Wadah sampel. detektor tabung foto majemuk (photo multiple tube detector). Mempunyai waktu respon pendek c. Lensa yang berfungsi untuk memfokuskan cahaya e. Detektor yang baik jika: a. dan preparasi sampel. detektor tabung foto tunggal (photo tube detector). detektor ‘near infra red” (NIR). Mempunyai sensitifitas tinggi dengan noise rendah meski pun dengan tenaga radian rendah b. pelarut. Prisma yang akan memisahkan masing-masing panjang gelombang d.

10mm. Bekas jari atau sisa- sisa sampel sebelumnya akan menyebabkan error pada pengukuran. Harus dapat mentransmisikan cahaya pada panjang gelombang yang dikehendaki Untuk keperluan pengukuran pada daerah ultra violet umumnya digunakan pelarut- pelarut seperti pada tabel berikut ini. 1. Universitas Gadjah Mada . Tabung atau kuvet harus dijaga kebersihannya. Untuk sampel berupa gas. sementara untuk sampel berupa larutan diunakan kuvet yang panjangnya bervariasi antara 1-10cm. Pelarut. Harus dapat melarutkan sampel b. digunakan tabung (sel) yang panjangnya bervaniasi antara 0.terbuat dan bahan quartz sedangkan untuk pengujian di daerah sinar tampak digunakan kuvet yang terbuat dan kaca biasa atau dan bahan quartz. Panjang gelombang terendah yang ultra violet dapat ditransmisikan pada daerah ultra violet Sementara pelarut yang digunakan untuk pengukuran di infra merah adalah sebagai berikut. . Tabung atau kuvet harus dicuci sampai bersih dengan aquades atau dengan larutan pencuci larutan asam nitrat panas.Syarat pelarut yang dapat digunakan untuk spektrofotometri adalah: a.

Universitas Gadjah Mada .Preparasi sampel . Konsentrasi yang tinggi menyebabkan hasil transmitan yang rendah atau absorbansi tinggi. Sebaliknya konsentrasi yang terlalu rendah menyebabkan asil tansmitan yang tinggi atau absorbansi rendah. Oleh karena itu harus diusahakan agar supaya konsentrasi sampel dapat memberikan transmitan yang optimal yaitu antara 20-65%.Komponen-komponen yang akan diukur pada daerah ultra violet dan sinar tampak sering menghambat absorpsi molar pada absorbansi maksimum.

spektrofluorofotometer. diperlukan larutan standar bovine serum albumine (BM 68) yang dipreparasi dengan konsentrasi 100mg/ml. Radiasi akan melalui sel dan diteruskan ke detektor b. yaitu single-beam spectrophotometer dan bouble-beam spectrophotometer.5-10% sering digunakan.Konsekuensinya sering sampel harus diencerkan supaya dapat memberikan absorbansi pada daerah optimum. dan infra merah (IR). Pada saat pengukuran dengan spektrofotometer UV-VIS pada Universitas Gadjah Mada . Pada double-beam spectrophotometer: radiasi berasal dan dua alur sinar-. atomic absorption spectrophotometer (AAS). Sementara itu pengukuran pada daerah infra merah. Apa yang mendasari analisis komponen dengan menggunakan metoda spektrofotometri? 2. dikenal tipe-tipe spektrofotometer ultra violet visibel (UV-VIS). Umumnya konsentrasi 0. Pada single-beam spectrophotometer : radiasi berasal dari satu sumber masuk ke dalam monokromator yang akan didispersikan ke prisma. tetapi pengukuran di daerah infra merah secara kuantitatif lebih kurang akurat. 4-4 MACAM-MACAM SPEKTROFOTOMETER Berdasarkan sumber cahaya (energi) yang digunakan dikelompokkan dua macam tipe spektrofotometer. visibel. dan karena hanya menggunakan energi cahaya infra merah yang rendah adalah sukar memperoleh transmitan yang sesungguhnya. Terangkan fenomena yang diperoleh dari percobaan Bouquer! 3. yaitu satu langsung melalui sel blanko dan yang lain melalui sel sampel. ultra violet (UV). 4-5 LATIHAN PEMAHAMAN MATERI 1. Konsekuensinya larutan yang pekat diperlukan untuk dapat diukur absorbansinya. Pada analisis protein larut dengan metoda Lowry. panjang sinar di daerah sel umumnya sangat pendek dan pita absorbsi infra merah mempunyai absorpsifitas molar yang lebih pendek. Berdasarkan kekhususannya dalam penggunaan dikenal pula spektrofotometer emisi pembakaran (flame emmissiori spectrophotometet. dan mass spectrophotometer. Perbedaan antara keduanya adalah: a. nuclear magnetic resonance (NMR) spectrophotometer. Berdasarkan penggunaannya pada daerah pengukuran.

Fasilitas apa saja yang harus ada supaya spektrofotometer dapat dioperasikan? 6.932 jika menggunakan kuvet setebal 1 cm. Scanning larutan bovine serum albumine (BSA) memperoleh spektrogram dengan dua puncak. dan apa saja karakteristikanya? 8. panjang gelombang 690nm menghasilkan absorbansi 0. Kapan filter dan monokromator digunakan? 7. yaitu pada panjang gelombang 500nm dan 690nm. Jelaskan bagaimana sampel diperlakukan supaya dapat diuji dengan metoda spektrofotometeri! 9. Jelaskan arti dari spektrogram tersebut! 5. Apa fungsi AAS dan NMR spectrophotometer? Universitas Gadjah Mada . Sumber cahaya apa saja yang dapat digunakan pada spektrofotometer. Hitung koefisien ekstingsinya! 4.