You are on page 1of 24

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) merupakan bakteri nonmotil

penyebab tuberkulosis pada manusia. Bakteri ini berbentuk batang sehingga

disebut juga dengan Bacillus tuberculosis (Gambar 2.1). Berdasarkan struktur

dinding selnya yang mengandung peptidoglikan tebal, M. tuberculosis

diklasifikasikan ke dalam bakteri gram positif. Bakteri bersifat aerob obligatif

sehingga kompleks M. tuberculosis selalu ditemukan di lobus paru bagian atas

yang memiliki sirkulasi udara yang baik (Todar, 2008). Pada manusia, bakteri

dapat mengalami fase dorman atau laten. Laju replikasi yang lambat dan

kemampuan untuk bertahan dalam keadaan laten mengakibatkan infeksi

tuberkulosis bersifat kronis. Waktu replikasi bakteri lambat, yaitu sekitar 24 jam

dan membutuhkan 3-4 minggu untuk membentuk koloni secara in vitro (Uplekar,

2012).

Gambar 2.1 Struktur Morfologi M. tuberculosis (Goldstein, 2011)

6

7

M. tuberculosis memiliki dinding sel yang terdiri dari dua bagian. Bagian

luar membran berupa sel amplop yang mengandung lebih dari 60% lipid. Lipid

tersebut mengandung beberapa komponen, seperti asam mikolat, glikolipid dan

polisakarida (Todar, 2008). Asam mikolat mencapai 50% dari berat kering sel

amplop. Asam mikolat adalah molekul hidrofobik yang membentuk cangkang

lipid di sekeliling sel M. tuberculosis. Komponen ini berpengaruh terhadap

permeabilitas permukaan sel (Todar, 2008). Selain komponen tersebut, terdapat

peptidoglikan (PG) yang berikatan kovalen dengan arabinogalaktan (AG).

Arabinogalaktan melekat pada asam mikolat dengan meromycolate panjang dan

rantai pendek. Kompleks dinding sel ini disebut dengan mycolyl arabinogalactan-

peptidoglikan (mAGP). Selain itu, terdapat komponen lain berupa protein,

phosphatidylmyo inositol mannosides (PIMs), phthiocerol lipid, lipomannan (LM)

dan lipoarabinomannan (LAM). Bagian dalam terdiri dari komponen lipid bilayer,

beberapa mengandung asam lemak dengan rantai pendek dan beberapa asam

lemak pendek dengan rantai panjang (Brennan, 2003) (Gambar 2.2).

Pada saat dilakukan ekstraksi dengan pelarut yang sesuai, dinding sel akan

rusak, sedangkan lipid bebas, protein, LAM serta PIMs akan terlarut. Kompleks

mAGP yang penting untuk kelangsungan hidup sel akan menjadi residu yang

tidak larut. Inti dinding sel diketahui mengandung jembatan diglycosyl-P yang

terletak di antara PG dan galaktan linear. Seluruh unit penghubung, galaktan dan

arabinan disintesis sebagai unit pada polyfrenyl-P pembawa lipid. Polyfrenyl-P

pembawa lipid terlibat dalam penempelan asam mikolat baru pada dinding sel

(Brennan, 2003).

et al.. Kandungan .1 Genomik Whole Genom M. Selanjutnya pembentukan acyl ACP dikatalisis oleh inhA dan elongasi dikatalisis oleh kasA dan kasB (Brennan. tuberculosis H37Rv terdiri atas 4411532 bp (Liu. Acyl CoA maupun malonyl CoA oleh Gen FabH akan diubah menjadi beta ketoacyl-ACP yang merupakan berperan dalam fatty acid synthases (FAS) II sebagai prekursor sintesis asam mikolat. Genom terdiri dari 4000 gen dengan komponen G + C yaitu 65.. Acetyl CoA diubah menjadi acyl CoA pada FAS I. Genom ini merupakan genom terbesar kedua setelah Escherichia coli. et al. 8 Transformasi biokimia M. 2003). Gambar 2. 2014). tuberculosis dikode oleh beberapa gen pada jalur sintesis asam mikolat. Sintesis berlangsung dari acetyl CoA dan malonyl CoA.1. Sedangkan malonyl CoA diubah menjadi malonyl ACP oleh Gen FabD. Beta ketoacyl ACP kemudian direduksi oleh gen mabA.6%. tuberculosis (McLean.2 Struktur Dinding Sel M. 2007) 2.

Mekanisme masuk sel Pada saat kontak dengan makrofag host. 1998). et al. Namun apabila M. M. Sehingga M. tuberculosis yang berkontribusi terhadap virulensinya. tuberculosis berikatan langsung dengan reseptor mannose melalui glikolipid dinding sel alveolar. M. Gen inhA berada pada regio 1674202- 1675011 dan gen katG berada pada regio 2153889-2156111 (Flandrois. yaitu: a. tuberculosis yang terfagositosit berada dalam vacuoule endocytic atau fagosom. 2003). Pada sekuen whole genom.2 Mekanisme dan Faktor-faktor Virulensi Terdapat beberapa sifat umum M. 9 basa tersebut penting untuk produksi enzim yang terlibat dalam lipogenesis dan lipolisis serta produksi protein kaya glisin dengan struktur berulang yang merupakan sumber variasi antigenik (Cole.. 2003..1. et al. . Jika siklus pematangan fagosomal terjadi secara normal. setiap gen memiliki regio tertentu. tuberculosis menyekresi protein maka dapat mengubah membran fagosom sehingga fusi fagosom lizosom akan terhambat (Smith. tuberculosis dengan meningkatkan regulasi reseptor mannose. Todar. Promoter inhA berada pada regio 1673325-1673439. yaitu fusion fagosom lizosom maka bakteri akan lisis karena berada pada lingkungan pH asam atau lisis oleh enzim lizosom. tuberculosis lebih cenderung menyerang alveolar (Smith. Glikoprotein ditemukan pada permukaan alveolar yang dapat meningkatkan ikatan dan penyerapan M. LAM atau secara tidak langsung melalui reseptor komplemen tertentu. 2014). 2008). 2.

2008). 2008). Konsentrasi lipid dinding sel tinggi Konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding sel akan mempengaruhi impermeabilitas dan ketahanan terhadap agen antimikroba. Detoksifikasi radikal oksigen M. (Todar. Lebih dari 200 gen yang diidentifikasi . 525 terlibat dalam dinding sel dan proses sel. Ketahanan terhadap hambatan senyawa asam dan basa baik intraseluler maupun ekstraseluler lingkungan serta ketahanan terhadap lisis osmotik melalui deposisi komplemen dan serangan lizosim (Todar. Glikolipid. 2008) c. detoksifikasi dan adaptasi. 188 gen mengkode protein regulasi dan 91 gen yang terlibat dalam virulensi. sulfatides dan LAM akan mengatur mekanisme sitotoksik oksidatif. Uptake makrofag melalui reseptor komplemen dapat memotong aktivasi respiratory burst. tuberculosis Sekitar 4. yaitu: 1. 10 b. Genom M. tuberculosis. d. Waktu pertumbuhan lambat Waktu pertumbuhan yang lambat mengakibatkan sistem kekebalan tubuh tidak mudah mengenali bakteri atau mungkin kurang sensitif untuk difagositosis (Todar. Oksidatif burst dapat dinetralkan oleh produksi enzim katalase dan superoksida dismutase. tuberculosis dapat mengganggu efek racun dari intermediate oxygen reaktive yang dihasilkan dalam proses fagositosis dengan tiga mekanisme.000 gen dalam genom M. 2. 3. e.

2005). Penambahan LAM pada protein makrofag dapat menekan produksi IFN-gamma. tuberculosis menghasilkan pili yang terlibat dalam kolonisasi awal host. 2008). Mycobacterium tuberculosis Pili (MTP) Selama menginfeksi host-nya. LAM merupakan komponen utama dari dinding sel M. Pili merupakan fibrillar meshwork padat yang terdiri atas gulungan serta serat agregat tipis yang memanjang hingga beberapa mikrometer dari permukaan bakteri. bahkan mungkin mencapai 2 hingga 3 tahun untuk memperoleh uji kultur . LAM juga dapat mengikat radikal oksigen secara in vitro serta dapat melindungi bakteri dari mekanisme berpotensi mematikan seperti burst respiratory (Todar. dengan asam lemak menjadi sumber karbon utama (Todar. tuberculosis yang resisten terhadap minimal rifampisin dan isoniazid (WHO. Kelompok obat ini disebut sebagai obat lini pertama atau primer (Depkes RI. 2008). 2. Pasien dengan MDR-TB membutuhkan waktu beberapa bulan lebih lama. f. Jumlah yang besar ini berkaitan dengan kemampuan patogen untuk tumbuh dalam jaringan host yang terinfeksi. g. LAM LAM adalah kompleks glikolipid yang mengandung pengulangan subunit disakarida arabinosa-mannose. 11 sebagai pengkode enzim untuk metabolisme asam lemak. tuberculosis. M. 2012).2 Multidrug Resistance Tuberculosis (MDR-TB) MDR-TB adalah penyakit tuberkulosis yang disebabkan oleh strain M. Struktur ini diberi nama Mycobacterium tuberculosis pili (Todar. 2008).

Mutasi dalam beberapa gen. peningkatan risiko kegagalan pengobatan atau kematian. Beberapa efek yang potensial terjadi pada pengobatan MDR-TB yaitu pasien mendapatkan pengobatan yang tidak adekuat dalam waktu lama. pasien tetap terinfeksi dan meningkatkan penyebaran penyakit (Tessema. INH memiliki struktur yang sederhana terdiri dari sebuah cincin piridin dan sebuah gugus hidrazid. Frekuensi mutasi penyebab resistensi telah diuraikan . furA. INH memblok biosintesis asam mikolat M. et al. iniC. 12 negatif dibandingkan dengan pasien TB tanpa MDR (Dipiro. meliputi katG.3 Isoniazid Isoniazid (INH) atau asam isonikotinat hidrazid adalah agen bakterisida sintetik pertama yang diproduksi pada awal tahun 1900 tetapi tidak digunakan sebagai antituberkulosis sampai tahun 1952 (Whitney dan Wainberg. kedua komponen ini penting untuk aktivitas melawan M. dan inhA telah ditemukan dan bertanggung jawab terhadap resisten INH. 2011). tuberculosis pada konsentrasi MIC (minimum inhibitor consentration) obat dan mereduksi 99% dari bakteri (Bennerje. seleksi terhadap strain yang resisten OAT. Resistensi OAT disebabkan salah satunya karena adanya mutasi pada target obat sehingga mengurangi pengikatan obat atau mengakibatkan peningkatan produksi target. ndh. et al. tuberculosis yang menunjukkan resisten terhadap INH (Silva and Palomino. tuberculosis. Pada. kasA.. iniB. iniA. 2002). strain M. 1994). 2008). 2. Pengobatan MDR-TB membutuhkan penggunaan jangka panjang OAT lini kedua.. 2012). oxyR-ahpc.

2009). Rozwarski et al. 1994.4 Gen Resisten Isoniazid 2.4. Gambar 2.. 13 dalam beberapa penelitian. Mutasi terjadi pada gen katG sebesar 50-95%. enzim yang terlibat dalam biosintesis asam mikolat yang merupakan target kerja dari INH dan ETH (Banerjee et al. gen inhA sebesar 8-43% dan sisanya pada gen lain (Zhang and Yew. tt) Isoniazid memiliki mekanisme kerja yang sama dengan ethionamide (ETH) yaitu menghambat biosintesis asam mikolat. 2.1 inhA Salah satu target setelah pengaktifan INH adalah protein yang dikode oleh gen inhA. 1998). Adanya kesamaan struktur dan fenomena resistensi silang mengindikasikan bahwa kedua OAT ini memiliki target molekular yang sama (Morlock et al.. . InhA merupakan gen pengkode enzim enoil reduktase. Ikatan INH diaktivasi untuk membentuk kompleks terner INH-NADH sehingga menghasilkan penghambatan biosintesis asam mikolat (Ramaswamy dan Musser..3 Struktur Isoniazid (Kolyva and Karakousis. ETH merupakan analog dari INH yang termasuk dalam OAT lini kedua. 2003). 1998).

2014). Selain itu.. Sekitar 70-80% dari resistensi INH dalam isolat klinis M.1%) sampel dengan titik mutasi pada kodon 94 dengan perubahan asam amino Serin menjadi Alanin (TCG→GCG) (Valvatne.4) (Ramaswamy dan Musser. et al. bermutasi pada open reading frame (ORF) inhA. Mutasi pada gen inhA ataupun pada daerah promoter akan menyebabkan resistensi terhadap INH (Isoniazid) dan ETH (Ethionamide) (Morlock et al. Pada identifikasi mutasi isolat MDR-TB di Bali menggunakan teknik PCR. et al. 2003). Adanya mutasi pada promoter mengekspresikan terjadinya resistensi INH level rendah. 1998). Gambar 2. Isolat yang resisten terhadap isoniazid sebanyak 2 dari 96 (2. -16 (A→G).. (2006). atau -8 (T→G/A) dan -15 (C→T) (Gambar 2. pada penelitian lainnya diketahui adanya jenis dan mutasi di titik yang sama pada 4 strain isolat (Brossier.4 Titik Mutasi pada Promoter inhA (Ramaswamy dan Musser. 0-5% dari isolat M. 14 Berdasarkan penelitian Hazbon et al. Mutasi promoter inhA diketahui terjadi pada posisi -24 (G→T). Berdasarkan penelitian pada isolat di Myanmar. 2009). 2006). dilaporkan adanya mutasi pada gen inhA dari sebagian kecil isolat MDR-TB. 1998) . 1998). tuberculosis dapat dikaitkan dengan mutasi di gen katG dan inhA (Ramaswamy dan Musser.. diperoleh adanya mutasi pada regio promoter inhA pada posisi -15 (C→T) (Kusdianingrum. tuberculosis yang resisten terhadap INH.

Bentuk aktif inilah yang akan menghambat biosintesis asam mikolat. 2009). et al. 1993). Substitusi Serin menjadi Treonin diperkirakan terjadi 30-60% dari isolat resisten INH (Johnson. Silence mutation Silence mutation merupakan jenis mutasi yang tidak dapat dideteksi.2 katG Isoniazid masuk ke dalam sel sebagai prodrug. Terganggunya biosintesis asam mikolat mengakibatkan kehilangan integritas selular dan kematian bakteri (Cardoso. et al. Kebanyakan mutasi hanya mempengaruhi satu nukleotida di lokasi tertentu sehingga disebut mutasi titik. 2. Ada beberapa jenis mutasi titik. Mutasi katG paling sering terjadi pada kodon 315. Hilangnya aktivitas katalase akan mengakibatkan resistensi INH. adanya mutasi pada gen katG juga mengakibatkan resistensi INH (Cardoso.4. Mutasi dapat terjadi dengan tidak mengubah fenotip. Selain itu. INH akan diaktivasi oleh enzim katalase peroksidase yang dikode oleh gen katG. Mutasi . 2004)...5 Mutasi Gen Mutasi atau dalam bahasa latin disebut mutare didefinisikan sebagai perubahan. Peroksidase dibutuhkan dalam mengaktivasi INH menjadi isonikotinat asil. 15 2. 2004). antara lain: a. Perubahan diwariskan dalam urutan nukleotida DNA (Schleif. et al.. Pada awalnya mutasi ditandai dengan adanya perubahan ekspresi fenotip hingga diketahui terdapat perubahan genotip.

16 ini terjadi karena adanya substitusi basa tunggal pada kodon sehingga membentuk formasi baru sebagai asam amino yang sama. Bila tidak ada perubahan protein atau konsentrasi. Meskipun mutasi telah terjadi. Namun kehilangan fungsi normal pasti akan terjadi jika mutasi terjadi lebih dekat ke tengah gen (Schleif. Ekspresi mutasi missense dapat bervariasi. yang merupakan kode untuk valin. 1993). kodon AGG diubah ke CGG dan masih merupakan pengkode untuk Arginin. Nonsense mutation Jenis mutasi ini mengakibatkan terminasi translasi lebih awal sehingga menghasilkan polipeptida lebih pendek. ekspresi mutasi ini sering tidak akan terdeteksi kecuali pada tingkat DNA atau mRNA. tidak akan ada perubahan fenotip organisme (Schleif. d. Missense mutation Tipe mutasi ini melibatkan substitusi basa tunggal dalam DNA yang mengubah kodon untuk satu asam amino menjadi kodon asam amino lain. Tentu mutasi dinyatakan pada tingkat protein struktur (Schleif. Kode terdiri dari urutan yang tepat . Sebagai contoh kodon GAG yang mengekspresikan asam amino Asam glutamat diubah menjadi GUG. Ekspresi fenotip tidak banyak dipengaruhi bila mutasi mengakibatkan satu atau dua asam amino saja yang tersisa setelah kodon stop. Frameshift mutation Mutasi frameshift timbul dari penyisipan atau penghapusan satu atau dua basa nukleotida dalam daerah pengkode gen. Mutasi melibatkan perubahan kodon menjadi kodon stop (UAA. 1993). Sebagai contoh. 1993). UGA). UAG. c. b.

Mutasi Substitusi merupakan adanya perubahan satu basa dengan basa lainnya. sehingga penambahan atau penghapusan kurang dari tiga pasangan basa akan menyebabkan reading frame yang akan bergeser untuk semua kodon hilir. b. 1993) Mutasi frameshift terdiri atas beberapa tipe. Mutasi Delesi merupakan adanya penghilangan atau penghapusan pasang basa. Mutasi frameshift biasanya sangat merusak dan menghasilkan fenotip mutan dari sintesis protein nonfungsional (Schleif. Gambar 2. Mutasi Insersi merupakan adanya penambahan pasang basa di tempat baru DNA.5 Mutasi Titik (Schleif. yaitu: a. tt) . 17 dari kodon triplet. 1993). (UCMP. c.

. 2000). Prinsip isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid adalah pemecahan dinding sel.1 Kode Genetik Universal (Schleif. 1993) Posisi Kedua U C A G UUU Phe UCU UAU Tyr UGU Cys U U UUC UCC Ser UAC UGC C UUA Leu UCA UAA Stop UGA Stop A UUG UCG UAG UGG Trp G CUU CCU CAU His CGU U C CUC Leu CCC Pro CAC CGC Arg C Posisi Pertama Posisi Ketiga CUA CCA CAA Gln CGA A CUG CCG CAG CGG G AUU ACU AAU Asn AGU Ser U AUC Ile ACC AAC AGC C A Thr AUA ACA AAA Lys AGA Arg A AUG Met ACG AAG AGG G GUU GCU GAU Asp GGU U G GUC Val GCC Ala GAC GGC Gly C GUA GCA GAA Glu GGA A GUG GCG GAG GGG G 2. Metode isolasi adalah penyiapan DNA kromosom ataupun DNA plasmid menurut metode standar yang tergantung dari jenis sampel asal DNA tersebut.6 Isolasi DNA Template DNA untuk proses PCR dapat dipersiapkan dengan menggunakan metode isolasi. Metode isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid memerlukan tahapan yang lebih kompleks dibandingkan dengan penyiapan DNA dengan menggunakan metode lisis. yang diikuti dengan pemisahan DNA kromosom atau DNA plasmid dari komponen-komponen lain. Dengan demikian akan diperoleh kualitas DNA yang lebih baik dan murni (Handoyo dan Rudiretna. 18 Tabel 2.

1 Tahapan Siklus PCR Proses PCR melibatkan beberapa tahap. Temperatur annealing yang digunakan biasanya adalah 50°-65°C. Zodar. 2013. pemanjangan primer (elongasi) dan pemantapan (elongasi akhir). Zodar. penempelan (annealing) primer pada template DNA. PCR dapat diaplikasikan dalam penggandaan DNA untuk berbagai keperluan karena memiliki sensitifitas yang tinggi (Handoyo dan Rudiretna. yaitu predenaturasi template DNA. 2013.7. 2. Ikatan hidrogen antar DNA akan terbentuk bila sekuen primer memiliki kecocokan . Suhu yang direkomendasikan adalah 94°-96°C agar proses denaturasi terjadi secara tuntas. 2011). 19 2.7 Polymerase Chain Reaction (PCR) Polymerase Chain Reaction adalah suatu teknik amplifikasi DNA secara in vitro.6. Segmen DNA dapat dikalikan jumlahnya bahkan hingga lebih dari satu juta kali lipat hanya dalam beberapa jam. Optimasi diperlukan agar tidak terjadi mispriming atau kesalahan penempelan (Biolabs. yaitu : 1. 2013). tergantung primer yang digunakan (Biolabs. 2011). 2. denaturasi template DNA. Tahapan proses dapat dilihat pada Gambar 2. Adapun tahapan proses secara lengkap. Temperatur dapat dioptimasi mulai dari 5°C di bawah suhu Tm. Proses denaturasi dilakukan selama 1-2 menit untuk siklus awal dan memerlukan 5-30 detik untuk siklus selanjutnya (Biolabs. 2000). Predenaturasi dan Denaturasi Predenaturasi dan denaturasi dilakukan pada suhu tinggi. Annealing Tahapan annealing atau penempelan memerlukan waktu 20 detik hingga 1 menit. yaitu >90°C.

dkk. Jumlah amplikon pada akhir siklus PCR secara teoritis dapat dihitung menurut rumus: Y = (2n-2n) X Keterangan: Y : jumlah amplikon n : jumlah siklus X : jumlah molekul template DNA semula (Handoyo dan Rudiretna. 2000) . Pada temperatur optimum. 20 dengan sekuen template DNA. 2013. 2011).. DNA polimerase akan mencetak ribuan DNA setiap menitnya. 2013). 3.. Suhu disesuaikan dengan suhu optimum aktivitas Taq polimerase (Biolabs. Jumlah siklus yang umum adalah 30-35 kali. Elongasi dan Elongasi akhir Temperatur yang umum digunakan untuk tahapan elongasi adalah 72°C. DNA polimerase akan mensintesis untaian DNA komplemen pada untai template DNA dengan penambahan dNTPs dari ujung 5’ ke ujung 3’. Laju pemanjangan yang disarankan adalah 1 menit per kilobasa dengan penggunaan <5 pasang primer dan 2 menit per kilobasa untuk lebih dari 6 pasang primer. 2011). Adanya ikatan DNA polimerase pada primer dan template DNA akan memulai sintesis DNA (Zador. Novel. Suhu elongasi akhir yang digunakan adalah 70°-74°C selama 5-15 menit setelah siklus akhir PCR untuk memastikan untaian DNA telah seluruhnya diperpanjang (Novel. dkk. Namun dibutuhkan hingga 40 siklus untuk mendeteksi jumlah amplifikasi rendah (Biolabs. 2011). 2011). Waktu yang dibutuhkan tergantung dari panjang fragmen DNA yang diamplifikasi (Zador.

21 I II II I Gambar 2. Template DNA berfungsi sebagai cetakan untuk sintesis untai DNA yang baru (Handoyo dan Rudiretna. 2000). Template DNA Template DNA merupakan regio DNA yang mengandung fragmen target yang akan diamplifikasi (Zador. 2011).7.2 Komponen Reaksi PCR 1. Primer Primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi. .6 Tahapan Proses Amplifikasi PCR (Zador. primer merupakan penyedia gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan saat proses elongasi DNA (Handoyo dan Rudiretna. 2011). diperlukan satu pasang primer yang merupakan komplemen dari ujung 3’ untai DNA sense dan anti sense DNA target (Zador. 2000). (III) Tahap elongasi primer 2. (II) Tahap annealing primer. 2. Untuk satu regio target. Selain itu. 2011) Keterangan gambar: (I) Tahap denaturasi untai DNA.

Zodar. dNTPs Deoksinukleotida trifosfat merupakan empat nukleotida (dATP. Kation yang umum digunakan adalah Mg2+ (Zador. 2011). Magnesium atau Ion Mangan Kation berfungsi sebagai kofaktor dalam menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Enzim ini digunakan pada tahap elongasi (Handoyo dan Rudiretna. 2000. Larutan Buffer Buffer berfungsi sebagai penyangga pH pada reaksi PCR dan menjaga stabilitas dari DNA polimerase yang digunakan (Handoyo dan Rudiretna. DNA polimerase yang sering digunakan adalah Taq polimerase dengan temperatur optimum berkisar sekitar 70°C (Zador. 6. Kation akan meningkatkan interaksi primer dengan template DNA yang membentuk kompleks larut dengan dNTP (Handoyo dan Rudiretna). 22 3. 2011). . 2000). dGTP dan dTTP) yang mengandung gugus trifosfat. 2011). 2011). 2000). dCTP. DNA polimerase DNA polimerase berfungsi sebagai katalis reaksi polimerisasi DNA. Nukleotida ini berfungsi sebagai building block dalam sintesis untai DNA (Zador. 4. 5. dNTP akan menempel pada gugus -OH ujung 3’ dari primer pada proses elongasi dan membentuk untai baru yang komplementer dengan untai template DNA (Handoyo dan Rudiretna. Kation Divalen.

3. Adanya kontrol internal dari amplifikasi beberapa fragmen sekaligus. yaitu: 1. Keunggulan multiplex PCR bila dibandingkan dengan metode PCR lainnya. 2. Reaksi dapat dikatakan negatif atau gagal apabila seluruh produk tidak tampak pada visualisasi. Penurunan kualitas template DNA akan menunjukkan pita-pita panjang lebih lemah dibandingkan yang pendek. Efisiensi biaya dan waktu persiapan bila dibandingkan dengan multiplex tunggal. Pada metode multiplex PCR digunakan sejumlah pasangan primer untuk mengamplifikasi regio DNA target. (Edwards. 1997). Hal ini berfungsi untuk mengetahui adanya hasil negatif palsu. Henegariu et al. Multiplex PCR lebih mampu mengindikasikan kualitas template DNA dibandingkan pada PCR tunggal. 1994) .3 Multiplex PCR Multiplex PCR atau disebut juga reaksi berantai polimerase adalah suatu metode enzimatis untuk memperbanyak secara eksponensial sekuen nukleotida secara in vitro (Novel. 23 2. Persiapan reaksi amplifikasi untuk beberapa fragmen dapat dilakukan sekaligus.. dkk. dapat dikatakan hasil adalah negatif palsu.7.. Multiplex PCR merupakan salah satu modifikasi atau variasi teknik PCR yang dapat mengamplifikasi dua hingga lebih regio DNA secara simultan (Edwards. 2011). Bila hanya satu atau beberapa produk saja dari seluruh fragmen yang diamplifikasi tidak tampak. 1994. Multiplex PCR merupakan teknik yang dapat dipilih bila ingin mengeluarkan biaya serta menggunakan template DNA yang relatif sedikit.

Dua buah primer PCR merupakan komplemen dari untai tunggal target amplifikasi sehingga tidak saling berhubungan. Pemilihan primer yang digunakan dalam proses PCR sebaiknya memenuhi kriteria sebagai berikut: a. Panjang Primer Panjang primer yang ideal adalah 18-24 bp (Henegariu. b. 2000). Primer dengan panjang kurang dari 18 bp memiliki kemungkinan terjadinya mispriming tinggi. Nukleotida A atau T bersifat lebih toleran terhadap mismatch dari pada G atau C karena memiliki jumlah ikatan hidrogen yang lebih sedikit (Handoyo dan Rudiretna. Namun pada penggunaan primer yang terlalu panjang tidak akan meningkatkan spesifisitas primer secara bermakna melainkan mengakibatkan biaya primer yang lebih mahal (Handoyo dan Rudiretna.. 1997). Hal ini akan mengurangi spesifisitas primer dan berakibat pada efektivitas dan efisiensi proses PCR. Primer dengan % (G+C) rendah diperkirakan tidak akan mampu berkompetisi untuk menempel secara efektif pada target yang dituju sehingga akan menurunkan efisiensi proses PCR. 1997). .8 Desain Primer Primer PCR merupakan oligodioksinukleotida atau oligomer yang didesain sebagai komplemen ujung sekuen amplikon target PCR. 24 2. Persen (%) GC Kandungan basa G dan C pada primer umumnya adalah 35-60% (Henegariu. et al.. Pada ujung 3’. 2000). basa nukleotida sebaiknya G atau C. et al.

8. et al. 1997). 2006). tt).7 dan dimer bagian lain pada Gambar 2. DNA polimerase dapat mengikat spesies yang identik dan memperpanjang di kedua arah. Temperatur Annealing Temperatur annealing yang baik adalah 55°-58°C (Henegariu. Secara teoritis Tm primer dapat dihitung dengan menggunakan rumus [2(A+T) + 4(C+G)] (Handoyo dan Rudiretna. Temperatur yang ideal adalah 55°-65°C. Hal ini dapat mengakibatkan penurunan efisiensi amplifikasi hingga produk yang dihasilkan tidak sesuai dengan keinginan (Yuryev. Interaksi Primer-primer Pada primer forward dan reverse sebaiknya tidak ada dimer maupun hairpin (Henegariu. e. 25 c. d. Dimer menunjukkan adanya hibridisasi antara basa primer yang identik. Melting Temperature (Tm) Melting temperature adalah temperatur ketika 50% untai ganda DNA terpisah. Interaksi hairpin dapat dilihat pada Gambar 2. . namun pada hairpin ujung-ujung primer saling berkomplemen. Primer dengan Tm di atas 65°-70°C akan mudah mengalami mispriming pada temperatur rendah. Dimer pada ujung 3’ dapat dilihat pada Gambar 2. et al. Primer dengan Tm rendah tidak akan dapat bekerja pada termperatur tinggi..9. Temperatur annealing umumnya dapat dihitung 5°C lebih rendah dari perkiraan melting temperature (Judelson. 2000). 1997). Hairpin memiliki kesamaan dengan dimer.. Tm berkaitan dengan komposisi primer dan panjang primer. Pada dua buah primer yang digunakan harus memiliki perbedaan Tm tidak lebih dari 5°C (Judelson. 2006).

maka ikatan ke situs komplemen akan menggantung di tepi. g. 2009). 2009). Jika primer memiliki ujung 3' stabil. 2006) Gambar 2. Hal ini akan mengakibatkan pita sekunder.7 Dimer Primer pada Ujung 3’ (Judelson. Primer tidak diperbolehkan memiliki repeats ataupun runs sebanyak tiga atau lebih (PBI. Repeats dan Runs Repeats merupakan pengulangan dinukleotida secara berurut pada primer.9 Hairpin Primer (Judelson. 2006) Gambar 2. Sedangkan runs merupakan pengulangan nukleotida secara berurut pada primer. Adanya Repeats dan runs akan meningkatkan kemungkinan false priming. Sehingga disarankan stabilitas ujung 5’ lebih tinggi dibandingkan dengan ujung 3’ (PBI. Stabilitas Primer Stabilitas primer menentukan efisiensi false priming.8 Dimer Primer selain pada Ujung 3’ (Judelson. . 2006) f. Primer yang ideal memiliki ujung 5' yang stabil dan ujung 3' yang tidak stabil. 26 Gambar 2.

9 Analisis Produk PCR Produk PCR dapat dilakukan analisis dengan menggunakan elektroforesis dan sekuensing. Yield produk terlalu banyak dapat dilakukan penurunan konsentrasi primer atau untuk produk yang panjang. 3. 27 Hasil amplifikasi dengan primer yang dirancang seringkali kurang sesuai dengan yang diharapan sehingga dianjurkan untuk melakukan optimasi proses PCR. untuk produk yang panjang dapat dilakukan penurunan waktu elongasi. 2.. maka dapat dilakukan peningkatan konsentrasi primer atau penurunan temperatur annealing.1 Elektroforesis Elektroforesis merupakan metode pemisahan yang digunakan untuk menentukan ukuran molekul fragmen DNA (BEC. Yield produk rendah. semakin cepat bermigrasi melalui gel. Prinsip pemisahannya adalah molekul yang lebih kecil akan melewati pori-pori gel lebih mudah daripada yang lebih besar. sedangkan untuk produk yang pendek dapat dilakukan pemanjangan waktu elongasi. dapat dilakukan peningkatan konsentrasi primer. 1999). 2. Ini berarti bahwa semakin kecil fragmen linier. Dalam proses optimasi dapat dilakukan perlakuan sebagai berikut: 1. 2.9. Mobilitas molekul selama . Apabila produk tidak dideteksi. 2003). Tingkat migrasi fragmen DNA linear berbanding terbalik dengan log ukurannya dalam pasangan basa. waktu elongasi diturunkan (Loffert. et al.

. Larutan tersebut kemudian didinginkan sampai sekitar 55°C dan dituangkan ke dalam baki pengecoran yang berfungsi sebagai cetakan. Molekul yang memiliki muatan negatif akan bermigrasi ke arah elektroda positif (anoda) sedangkan molekul bermuatan positif bermigrasi ke arah elektroda negatif (katoda). Elektroforesis horizontal merupakan tipe yang paling umum digunakan untuk memisahkan molekul DNA dibandingkan dengan tipe vertikal (pemisah protein). yang berfungsi sebagai pemberat. Sampel dapat dicampurkan dengan komponen. 2003). Sumber listrik (DC) terhubung ke alat elektroforesis. DNA bermigrasi melalui gel menuju elektroda positif selama elektroforesis (BEC.5% untuk memperoleh pemisahan yang baik. Gel agarosa yang digunakan sebagai media dibuat dengan melarutkan serbuk agarosa dalam larutan buffer mendidih. Buffer berfungsi sebagai konduktor listrik dan untuk mengontrol pH molekul biologis. gel direndam dalam buffer pada alat elektroforesis yang berisi elektroda positif di satu sisi dan elektroda negatif pada sisi yang lain. 2003). Chamber elektroforesis memiliki elektroda pada kedua ujungnya yang memiliki konduktivitas listrik yang baik (BEC. 28 elektroforesis dapat dipengaruhi oleh konsentrasi gel dan volume larutan gel agarosa (BEC. 2003). seperti gliserol atau sukrosa. Setelah gel mengeras. Sumur dibuat dengan cetakan comb saat larutan gel mengeras. Pada beberapa eksperimen diperlukan gel agarosa dengan persentase hingga 1% atau 1. Semakin tinggi tegangan yang diberikan maka semakin cepat sampel bermigrasi.

2 Sekuensing Sekuensing berfungsi untuk memperoleh urutan DNA produk PCR. Sekuen yang diperoleh dapat digunakan untuk dibandingkan dengan sekuen wild type produk sehingga diketahui adanya perubahan urutan nukleotida (Edwards and Gibbs.9. 2. 1994). . 2003). Visualisasi hasil pemisahan elektroforesis membutuhkan sumber cahaya ultraviolet gelombang pendek (transiluminator) (BEC. Pewarna yang paling umum digunakan adalah Etidium bromida atau Methylene blue. 29 Dalam proses elektroforesis diperlukan suatu perwarnaan untuk menentukan secara tepat migrasi sampel.