PRACTICA DE LABORATORIO N° 3.

DETERMINACIÒN DE ENDOTOXINAS

OBJETIVOS

 Evaluar el método de lisado de Amebocitos del Limulus (LAL) para la

determinación de endotoxinas bacterianas en medicamentos parenterales.

INTRODUCCIÒN

La fabricación de productos inyectables en la industria farmacéutica y de dispositivos

médicos incluye entre sus requisitos esenciales, minimizar las fuentes de
contaminación de pirógenos durante la fabricación. Para la aprobación y
comercialización de una gran parte de los productos inyectables, las principales
instituciones reguladoras nacionales e internacionales establecen la cuantificación de
endotoxinas bacterianas por el método del lisado de Amebocitos del Limulus(LAL)
como monitor de pirógenos para más del 90% de los parenterales que se regulan,
para detectar la presencia de endotoxinas bacterianas. Esta es una técnica rápida y
confiable obtenida a partir de extractos acuosos de Amebocitos circulantes del
cangrejo de herradura (Limulus polyphemus).
Existen tres Técnicas para la detección de endotoxinas bacterianas:
técnica de coagulación (Gel-clot), basada en la formación de un gel; las técnica
Turbidimétrico, apoyada en la producción de turbidez después de la ruptura de
uniones de un sustrato endógeno y la técnica cromogénica que se basa en el
desarrollo de color después de la ruptura de un complejo sintético péptido-cromógeno.

MATERIALES

Tubos Apirogenicos
Reactivo L.A.L con sensibilidad de 0.25 UE/ml
Endotoxina estándar
Agua apirogénica
Baño Serológico a 37ºC

PORCEDIMIENTO

Verificar el límite de endotoxina

Hallar la MDV: Limite de endotoxina / Sensibilidad del reactivo L.A.L

Prueba de confirmación de la sensibilidad declarada del Lisado (sensibilidad del

rotulo)

Esta verificación se realiza con el fin de constatar la sensibilidad del reactivo de L.A.L
reportada en su respectivo certificado, al igual que la endotoxina utilizada para esta
verificación.

El certificado de la endotoxina es importante para este proceso ya que en él se

encuentra el número de lote y la potencia de la misma, con base en esta potencia se
realizan las diluciones para obtener las concentraciones de 1,(4λ); 05,(2λ), 025, (1λ
);0.125 (0.5λ) y 0.06UE/ml (0.25 λ UE/mL) para la verificación de la sensibilidad del
L.A.L.

Para la Practica se utilizará un vial de Endotoxina cuyo certificado reporta una potencia
de 5000 UE/vial; este se reconstituye con 5ml de LRW o Agua estéril para inyección
USP. Diluyendo a 1000UE/ml

De este volumen sacamos 20uL + 180uL de agua LRW o Agua estéril para
inyección USP, obteniendo 10UE/ml (concentración intermedia)
Agitar en vortex por 1 minuto

Tomamos de la dilución de 10UE/ml 20uL + 180uL de agua LRW o Agua estéril

para inyección USP, en tubos apirogenicos de 7.5cm obteniendo:1UE/ml
Agitar en vortex por 1 minuto

Tomamos de la dilución de 1UE/ml 100uL + 100uL de agua LRW o Agua estéril

para inyección USP, en tubos apirogenicos de 7.5cm obteniendo: 0.5UE/ml
Agitar en vortex por 1 minuto

Tomamos de la dilución de 0,5UE/ml 100uL + 100uL de agua LRW o Agua estéril

para inyección USP, en tubos apirogenicos de 7.5cm obteniendo: 0.25UE/ml
Agitar en vortex por 1 minuto

Tomamos de la dilución de 0.25UE/ml 100uL + 100uL de agua LRW o Agua estéril

para inyección USP, en tubos apirogenicos de 7.5cm obteniendo:0.125UE/ml
Agitar en vortex por 1 minuto

Tomamos de la dilución de 0.125UE/ml 100uL + 100uL de agua ARL o Agua estéril

para inyección USP, en tubos apirogenicos de 7.5cm obteniendo: 0.06UE/ml De
esta última dilución descartar 100uL
Se colocan 2 tubos más para el control negativo al agua.
Control negativo: 100 µL de agua LRW o Agua estéril para inyección USP
Control positivo: 100 µL de agua +10µL de Endotoxina de 40
PRUEBA DE RUTINA
En 2 tubos apirogenicos con 100uL de la MDV, adicionar 100 uL de reactivo L.A.L, en
otro tubo apirogénico adicionar 100uL de la MDV + 10uL de la endotoxina de 10UE/ml
+ 100uL de reactivo L.A.L.

RESULTADOS

Lote de endotoxina: _________________

Lote de Reactivo L.A.L.: _________________________

Hora de Incubación: _____________________________

Replica 1UE/ml 0,5UE/ml 0,25UE/ml O,125UE/ml 0,06UE/ml Control Control

+ -
1

Media geométrica: _____________________

PREGUNTAS

1. Que es un Pirógeno.
2. Dibuje y explique la estructura de las endotoxinas.
3. Mencione y explique las técnicas para determinar endotoxinas de origen
Bacteriano
4. Mediante un dibujo explique el mecanismo de acción biológico de las
endotoxinas
5. Defina y explique el mecanismo de acción del factor C y Factor G
6. Mencione los interferentes de la técnica de gel Clot y como se puede minimizar
el efecto de estos interferentes.
7. Explique la diferencia entre ENDOTOXINA ESTÁNDAR DE REFERENCIA
(RSE y ENDOTOXINA ESTÁNDAR CONTROL (CSE)
8. Enumere y explique brevemente los pasos para realizar la validación de un
medicamento inyectable por la técnica de Gel Clot.
9. Explique cómo se lleva a cabo el proceso de despirogenizaciòn y su
importancia en la industria Farmacéutica
10. que son los B-1,3 glucanos y cómo reaccionan con el Lisado de Amebocitos de
limulus
BIBLIOGRAFIA

 Dawson M.E, 1996 “ Preliminary Testing” Associates of CAPE COD,

incorporated, LAL UPDATE, March volumen 14, Nº1
 Dawson M.E,1997, “Routine testing and retests ”Associates of CAPE COD,
incorporated, LAL UPDATE, June Volume 15 Nº 2
 Agudelo C M . 1999. Valoración de endotoxinas bacterianas en sueros
antiofídicos de origen equino. Optimización de métodos en el control de
calidad. Tesis magíster. Universidad Nacional de Colombia. Facultad de
ciencias. Postgrado Microbiología. Bogotá.