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MISCROSCOPIA MICROBIANA

INTRODUCCIÓN
•El microscopio (de micro, pequeño, y scopio, observar)
es un instrumento que permite observar objetos que son
muy pequeños para ser vistos a simple vista.

•Unidades de medida
•Al ser tan pequeños los microorganismos se miden en
unidades muy pequeñas, como micrómetros (10-3 mm),
nanómetros (10-6 mm) y angstroms (0,1 nm).
UNIDAD

TIPOS DE MICROSCOPIOS
1
•Clasificación:
– Según la fuente de emisión: óptico, o electrónico.
– Según el número de lentes: simple y compuesto.

•Según la fuente de emisión son:


MICROSCOPIO ÓPTICO MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
Según el número de lentes
Rango de trabajo de los microscopios
•El microscopio optico permite observar en terminos
generales objetos tan pequeños como una micra, y el
electronico hasta 1 nm.
•Los aumentos se designan por nX, ejm 10X.
MICROSCOPIOS OPTICOS:
•Pueden ser: Esteroscopio y microscopio
óptico compuesto.

•ESTEREOSCÓPICO
•También llamado «lupa binocular», hace
posible la visión tridimensional de objetos.
•Se fundamenta en la visión binocular
convencional, en la que los dos ojos
observan el espécimen con ángulos
levemente distintos.
•Consta de cuatro espejos, ubicados de
modo que permiten desviar las imágenes
correspondientes a cada ojo, puestas una
al lado de la otra de modo que al verse
montadas dan el efecto tridimensional.
•El óptimo de visión estereoscópica se
encuentra entre 2X y 40X. (aumentos)
MICROSCOPIO ÓPTICO
COMPUESTO
•Posee dos grupos de lentes, el objetivo y el ocular.
•Produce una imagen ampliada hasta 1000 veces, y tiene
un límite de resolución de cerca de 200 nm (0.2 µm).
•El mas conocido es el microscopio de campo claro, o
corriente.
•Además hay otros tipos como:
–De contraste de fases
–De fluorescencia
–De campo oscuro
–Invertido
PARTES DEL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

1 Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Capta


y amplía la imagen formada en los objetivos.
2 Objetivo: lente situada cerca de la preparación. Amplía la
imagen de ésta.
3 Condensador: lente que concentra los rayos luminosos
sobre la preparación.
4 Diafragma: regula la cantidad de luz que entra en el
condensador.
5 Foco: dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
6 Tubo: es una cámara oscura unida al brazo mediante
una cremallera que sostiene al lente ocular y al revólver
porta objetivos.
…Partes del microscopio óptico compuesto
7 Revólver: Tambor que sostiene a las lentes objetivos, y que
rota para utilizar un objetivo u otro.
8 Tornillos macro y micrométrico: Son tornillos de enfoque,
mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macrométrico lo
hace mediante grandes desplazamientos y el micrométrico con
pequeños, permite ajustar el enfoque.
9 Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central,
sobre el que se coloca la preparación, que permite el paso de
los rayos procedentes de la fuente de iluminación situada por
debajo. Dos pinzas sirven para sujetar el portaobjetos sobre la
platina la cual puede tener un mecanismo llamado “charnela o
vernier” guiado por dos tornillos de desplazamiento que permite
mover la preparación de delante hacia atrás o de izquierda a
derecha y viceversa.
10 Base: También llamada Pie es la parte inferior del
microscopio que permite el sostén del mismo.
UNIDAD

Partes del microscopio óptico compuesto


1
•.

Oculares. Lentes a través de las que se


observa la preparación ampliada.

Objetivos. Lentes que aumentan el tamaño


de la imagen.

Platina. Sobre ella se coloca la


preparación, que se sujeta con una pinza.

Iluminación. Espejo o lámpara que ilumina la


preparación.

Tornillos de enfoque. Mueven la platina arriba


o abajo para enfocar la imagen.
Efecto del micrométrico

Moviendo el tornillo micrométrico (nunca más de una vuelta)


alternativamente hacia delante o hacia atrás, se puede apreciar
nuevos detalles.
Sistemas del microscopio óptico

•Lo componentes pueden clasificarse en tres sistemas:

•El sistema mecánico está compuesto por el conjunto de


piezas de sostén y desplazamiento que permiten el enfoque
del objeto a observar, estas son: base o pie, brazo, tubo o
cañón, cremallera, tornillos micro y macrométrico, revólver
portaobjetos y platina.
•El sistema óptico corresponde al conjunto de piezas que
colaboran en la ampliación de la imagen, es decir: objetivos
y oculares que son las lentes del microscopio
•El sistema de iluminación comprende aquellos
componentes encargados de hacer llegar la luz, dosificarla
y dirigirla a través del preparado, estos son: espejo,
condensador y diafragma.
Revolver
•Tambor que sostiene a las lentes objetivos, y que rota
para utilizar un objetivo u otro
Sistema óptico
•El aumento total de la muestra se
calcula multiplicando el aumento
de las lentes del objetivo por el de
las lentes del ocular.
•Se obtiene aumentos totales de
100X a (10X+10X), 400X a
(10X+40X) y 1000X (10X*100X).
•Campo del lente. Area que
observa, es menor a mayor
aumento menor campo.

•Lentes objetivo.
UNIDAD

Imágenes con el microscopio óptico


1
• Este tipo de microscopio permite observar células vivas y
los movimientos que realizan, en su medio.
• Levaduras (100X)

Protozoos (100 X)
Sistema de iluminación
•Espejo o fuente de luz.
•Condensador. Sistema de lentes convergentes que
concentra la luz sobre un punto, de manera que proporciona
mas o menos contraste.
•Diafragma o iris: esta dentro del condensador. Abriéndose o
cerrándose permite graduar la intensidad de la luz.
SISTEMA DE ILUMINACIÓN
Efecto del diafragma
Objetivo mayor  menor campo, menor profundidad de campo o de enfoque

Cerrando el diafragma  Abriendo el diafragma 


mayor profundidad de menor profundidad de
campo, pero menos luz campo, pero más luz

Dependiendo del objetivo escogido, hay mayor o menor campo de visión y,


en correspondencia, mayor o menor profundidad de campo
TINCION
•La mayoría de células microbianas son difíciles de ver con el
microscopio óptico, debido a una falta de contraste con el agua.
•Una forma de mejorar el contraste es mediante tinción. Para eso,
debe usarse tintes específicos.
•Los colorantes utilizados son compuestos orgánicos con grupos
cromóforos y auxocromos unidos a anillos aromáticos.
•Cromóforos. Son grupos funcionales, responsables de la
absorción. Suelen ser: dobles y triples enlaces carbono-carbono,
moléculas aromáticas, grupo carbonilo, imino (C=N), diazo (N=N),
nitro y enlaces C-Y (donde Y es un átomo con pares libres).
•Auxocromos es un grupo funcional que no absorbe por si
solo, pero que tiene el efecto de desplazar picos de los
cromóforos hacia longitudes de onda larga y aumentar sus
intensidades: metilo, halógenos, hidroxi, alcoxi, amino.

•Mordientes.
•Son sustancias capaces de formar complejos insolubles
con los colorantes y que ayudan al proceso de coloración.
•Ejemplos de mordientes comúnmente usados son el
Lugol, el ácido tánico y algunas sales.
Tipos de Colorantes
•Catiónicos: tienen carga positiva, y se combinan con
estructuras celulares de carga negativa, como ácidos
nucleicos, polisacaridos ácidos. Ejemplos: Azul de metileno,
Cristal violeta, Safranina.
•Aniónicos: tienen carga negativa, y se combinan con
estructuras de carga positiva, como algunas proteínas.
Ejemplos: Eosina, Fucsina acida y Rojo congo.
•Liposolubles: se combinan con las sustancias grasas.
Ejemplos: Sudan negro.

•A pH 7,0 las bacterias tienen carga ligeramente negativa y


por lo tanto el ion positivo coloreado de un colorante básico
(catiónico), es atraído por la célula bacteriana.
Colorantes histológicos más comunes
•Azul brillante de Coomassie. Tiñe a las proteínas de color
azul. Se utiliza en electroforesis.
•Azul de metileno. Se usa para teñir células de bacterias.
•Azul Nilo. Colorante básico, que tiñe los núcleos de color
azul. También puede ser utilizado para teñir células vivas.
•Bromuro de etidio (BE). Se adhiere al ADN y da un color
rojo naranja fluorescente. Se utiliza para identificar células en
proceso de apoptosis.
•Carmín. Es de un intenso color rojo, y como sal de litio tiñe
glucógeno. Las sales de alumbre-carmín se adhieren al
núcleo. Las tinciones con carmín requieren un mordiente; Al o
alumbre.
•Cristal violeta. Con un mordiente adecuado (KI, lugol), tiñe
las paredes celulares de color púrpura.
TIPOS DE TINCIÓN
•Según el estado del microorganismo. (in vivo, e in vitro)
•Según el objeto a teñir: tinción positiva y tinción negativa.

•A.- según el estado de la célula.

•A.1.- Observación in vivo (coloración vital).


•Existen dos técnicas:
•- Observación en fresco.
•Observación vital.
•A.1.1. Examen en fresco.
•- Preparaciones húmedas: Se pone una gota del líquido
que contiene los microorganismos a observar, en el
portaobjetos, luego el cubreobjetos, y se observa.

•- Gota pendiente: se usa un portaobjetos excavado, y sobre


la muestra el cubreobjetos. Se puede observar el
movimiento de los microorganismos en su medio, sin
someterlos a presión entre portaobjetos y cubreobjetos.
•Esta técnica presenta varios problemas:
•1. La gota constituye una lente trémula que desvía los
rayos de luz e interfiere con la iluminación, esto resulta
muy molesto cuando se emplea microscópio de contraste
de fases.
•2. Los portaobjetos excavados actúan como una lente
divergente que puede modificar la realidad de lo que se
está observando.
•A..1.2. Coloración vital.
•Permite poner de relieve detalles estructurales sin matar
al organismo. Se usa el azul de metileno, el rojo neutro, el
rojo congo, etc. (Arraiza et. al).
•Cuando se desea observar células sin afectar su
viabilidad, se puede observar la morfología y movilidad
celular. Las tinciones son normalmente tóxicas para las
células, por ello el colorante se utiliza en soluciones muy
diluidas de 1:5000 a 1:50000.
A.2.- Estudio “in vitro".
•Consiste en matar a la célula lo más rápidamente posible,
para mantener sus propiedades fisiológicas y morfológicas.
• Se crea un frotis (extensión de una muestra sobre un
portaobjetos para separar los microorganismos, y no
aparezcan agrupados), y se fija las células.
En la Fijación, se provoca la muerte celular solidificando el
coloide del protoplasma por coagulación o precipitación.
•La fijación evita que el tejido se degrade y desintegre,
produciendo puentes entre proteínas y diferentes materiales
de los tejidos.
Hay diferentes tipos de fijadores:
•- Físicos: calor (húmedo o seco), frío (congelación rápida).
•- Químicos: según la base fijadora: alcohol metílico,
dicromato de potasio, erlinck, formol 10% tamponado.
•Luego, se lava la muestra para quitar el exceso de fijador.
•Se aplica el colorante, lavándolo después con agua.
b.- Tinciones según el objeto a teñir
•La fijación produce encogimiento de las células, y la tinción
hace que las células aparezcan mayores de lo que son, de
manera que las medidas de las células tratadas no pueden
hacerse con precisión.
Simples: uso de un solo
Positivas: se emplean colorante. Sirven para
colorantes que tiñen al distinguir formas.
microorganismo y no al
medio. Diferenciales: uso de un
colorante inical y luego un
2 tipos de colorante de contraste. Sirven
tinciones para diferenciar distintos tipos de
celulas (Ejemplo: tincion Gram)

Negativas: se emplea colorantes que no tienen


afinidad por los constituyentes celulares (Ejemplo:
nigrosina, tinta china). Tiñen al medio y no a las
bacterias.
b.1. Tinción negativa.
•Se utilizan sustancias que no se unen a la
célula y tiñe el fondo quedando los
microorganismos incoloros.
• Los colorantes ácidos con iones
negativos son repelidos por la superficie
bacteriana cargada negativamente, pero
colorea el fondo de la preparación.
•Es útil para la observación de la
morfología externa de la célula, su tamaño
y las cápsulas. Ejemplos de colorantes
ácidos son la eosina y nigrosina.
b.2. Tincion positiva

•Para aplicar los colorantes ácidos o básicos se usan tres


técnicas de tinción: simple, diferencial y especial.

•a). Tinciones simples


•Un colorante simple es una solución acuosa o alcohólica
de un sólo colorante básico.
•El objetivo primario de una tinción simple es destacar al
microorganismo entero, de forma que la morfología y las
agrupaciones celulares resulten visibles.
• Algunos de los colorantes simples utilizados son el azul
de metileno, la carbol-fucsina, violeta de genciana y
safranina.
•b). Tinción diferencial.

•No tiñe a todas las células por igual. Se utilizan para teñir
aisladamente partes específicas de los microorganismos.
Se suelen utilizar sustancias mordientes para fijar el
colorante.
•La más utilizada es la tinción de Gram.
•Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las
bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y
gramnegativas.
•Tinción de Gram. Fue ideada por Christian Gram en
1883, e indica diferencias fundamentales de la pared
celular de las distintas bacterias.
Tinción Gram
2) Fijar el material
_
Gram + Gram
Una vez que el material esta
seco, pasar el portaobjeto sobre
el mechero.
3) Cubrir el portaobjeto con
Cristal violeta

Se deja el colorante durante


20 segundos.

4) Lavar con agua


Tinción Gram
5) Agregar el mordiente (lugol)
Gram + Gram _
Se deja actuar el mordiente
durante 20 segundos y luego se
lava con agua.
6) Agregar el decolorante
(Acetona o etanol).
La diferencia entre esos dos tipos de células está en su resistencia a la
decoloración.
Las bacterias Gram (-), tienen doble membrana lipídica y una pared
delgada. Las Gram (+) no poseen membrana externa y tienen pared
gruesa.
La mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la
membrana exterior de la célula Gram (-), y su delgada capa de
peptidoglicano es incapaz de retener el complejo cristal violeta-yodo y la
célula se decolora.
Las células grampositivas, tienen pared celular gruesa, se deshidrata y
cierra los poros, provocando que el de complejo cristal violeta-yodo
quede atrapado.
Tinción Gram

Gram + Gram _

7) Agregar el colorante de
contraste (safranina)

8) Lavar con agua


Tinción Gram
Rosa (Gram -) Violeta (Gram +)

•Después de la coloración de contraste las células gram (-)


son rojas mientras que las grampositivas permanecen azules
c). Tinciones especiales
•Se utilizan para teñir partes específicas de los
microorganismos, como endosporas y flagelos, y para poner
en evidencia la presencia de cápsulas (tinción negativa).

Tinción negativa de cápsulas


•Muchos microorganismos poseen una cubierta gelatinosa
llamada cápsula. En microbiología clínica la demostración
de la presencia de cápsula es un medio para determinar la
capacidad de un patógeno para producir enfermedad.
Tinción de endosporas
•Las endosporas bacterianas no pueden ser teñidas por
tinción simple o la de Gram, porque los colorantes no
atraviesan la pared de la endospora.
•Técnica:
1)Preparación del extendido y fijación por calor.
2)Cubrir con verde de malaquita, o fucsina calentando
durante 3 minutos (evitar que la muestra hierva, y añadir
más colorante si éste se evapora para que no se seque).
3)Lavar con agua.
4)Agregar colorante de contraste (safranina).
5)Lavar con agua.
MICROSCOPIO ÓPTICO DE CAMPO
OSCURO
•Un disco bloquea la luz que
llegaría directamente al objetivo.
• Sólo la luz que ha sido refractada
por la muestra alcanza las lentes
del objetivo.
•Como no hay un fondo luminoso
la muestra aparece iluminada
sobre un fondo o campo oscuro.
- El efecto es parecido a las
partículas de polvo iluminadas por
un rayo de sol que se cuela en una
habitación cerrada. (Arraiza et al).
•El microscopio de campo oscuro se utiliza para examinar
algunos microorganismos que, o bien son invisibles en su
forma viva al microscopio óptico normal, o no pueden ser
teñidos por los métodos corrientes, o sufren tal distorsión al
ser teñidos que no pueden identificarse sus características.
MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES
-Los rayos de luz sufren distintas difracciones y recorren
distintos caminos (se desfasan unos con respecto a otros)
antes de alcanzar el ojo del observador.
-Estas diferencias de fase son detectadas por el observador
como diferencias de contraste entre la muestra y el fondo.
-Las partes oscuras de la imagen corresponden a las partes
densas y las partes claras corresponden a partes menos
densas.
•Esta técnica permite observar las estructuras internas de los
microorganismos vivos, pues no es necesario fijar la
preparación, ni teñirla, evitando asi daño a las celulas.
Microscopio de fluorescencia
•Usa luz U.V. (100 y 380 nm.), que
excita sustancias que luego emiten
radiación visible (mayor a 380 nm).
•Estas radiaciones pueden ser
observadas como fluorescencia.
•Algunos materiales como Naranja
de acridina, tienen fluorescencia
propia.
•Para dejar pasar sólo la emisión
secundaria deseada, se deben
colocar filtros apropiados debajo del
condensador y encima del objetivo

Células epiteliales, triple coloración: núcleo


(azul), microtubulos (verdes), actina (rojo).
Microscopio de fluorescencia

•Los componentes de este tipo


de microscopio son:
•-Una fuente de luz.
•-Un filtro que delimita la banda
de excitación, que normalmente
es la ultravioleta.
•-Una muestra fluorescente,
después de la cual, hay un
segundo filtro, que deja pasar
sólo la luz fluorescente.
Microscopio invertido
•Es un microscopio con estructura invertida en comparación al
microscopio convencional. La fuente de luz está ubicada por
encima de la platina
•En el microscopio de luz las muestras vivas, requieren una
hidratación constante, pues el calor de la fuente imposibilita su
supervivencia.
•Permite observar células vivas sin una preparación previa y para
monitorear actividades (crecimiento, comportamiento)

•Desventajas:
•Tienen alto
costo.
•Otra desventaja
es su limitada
magnificación,
pues el objetivo
más potente es
de 60X. placas de Terasaki
Comparación entre tipos de microscopios
Microscopio de Microscopio de Microscopio de
Campo Claro Fluorescencia Contraste de Fases
Alga verde Saccharomyces
(eucariota) Bacteria filamentosa Teñida cerevisiae
con naranja de acridina
OPERACIÓN DEL MICROSCOPIO
OPTICO
•Colocar el objetivo de menor aumento en posición de
empleo, y bajar la platina completamente.
•Colocar la muestra sobre la platina, y sujetar con las
pinzas.
•Realizar el enfoque:
–Acercar al máximo el lente objetivo a la preparación, con
el tornillo micrométrico.
–Mirando a través de los oculares, separar lentamente el
objetivo, con el micrométrico, y cuando se observe la
muestra, girar el micrométrico, hasta enfocar.
– Pasar al siguiente objetivo. La imagen deberá estar ya
casi enfocada, y suele ser suficiente con mover un poco el
micrométrico para lograr el enfoque fino.
Mantenimiento y precuaciones

•Al finalizar un trabajo, dejar puesto el objetivo de menor


aumento
•Cuando no se usa mantenerlo cubierto para evitar que se
ensucien los lentes.
•Nunca tocar los lentes con las manos
•Después de usar el objetivo de inmersión, limpiar el aceite
con pañuelos para óptica, con una mezcla alcohol acetona
( 7:3) o con xilol
EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
• En este microscopio, la luz se sustituye por un haz de
electrones que pasan por un tubo al vacio.
• En lugar de lentes de vidrio, se utiliza lentes
electromagnéticos para enfocar un haz de electrones a través
de un tubo al vacío.
•Su poder de resolución es mucho mayor que el de los
microscopios ópticos, debido a que la longitud de onda de los
electrones es 100 000 veces menor que la de la luz visible.
Por ello se utiliza para examinar objetos inferiores a 0,2 µm,
como los virus o estructuras celulares internas.
•Aumenta hasta un millón de veces, las imágenes que se
producen en blanco y negro y muchas veces tienen colores
falsos.
Microscopio electrónico
•Observacion. Los
electrones chocan con la
muestra y se desvían, y
estas desviaciones son
recogidas por una pantalla.
• Se observa la imagen a
través de una pantalla que
es excitada por los
electrones que llegan a ella,
o se pueden recoger en
una placa fotográfica que
es impresionada
directamente por los
electrones.

•Hay dos tipos de


microscopios electrónicos:
los de transmisión y los de
El Microscopio Electrónico de Transmisión(MET)
El MET permite observar células muertas, después de haber
sido fijadas y teñidas con iones de metales pesados.
Los electrones son dispersados al pasar a través de la
muestra, y luego proyectados hacia una imagen sobre una
pantalla fluorescente.

El (MET) tiene un
limite de resolución
de cerca de 1 nm.
Microscopio electrónico de transmisión
UNIDAD

Imágenes en el MET
1
• Permite estudiar las estructuras internas de los orgánulos
celulares, hasta 1 nm.
•Imagen bidmiensional.
El Microscopio Electrónico de Barrido (MEB),
(SEM),
- El MEB, permite observar células en
tres dimensiones, después de haber
sido fijadas y teñidas con iones de
metales pesados.
- Los electrones son reflectados sobre
la superficie del espécimen, y muestra
su forma real.
•Requiere que la muestra este seca,
luego se cubre con una capa de metal
(oro o platino).
•La SEM es útil en el estudio de
estructuras superficiales de células
intactas y virus.
•El MEB tiene menor resolución que
MET, pero su ventaja es la visión
tridimensional (Bernis, 1978)
MEB. Pueden observarse objetos de 2 nm.
EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (MEB) (SEM)
•En la MEB un cañón de electrones proporciona un haz de
electrones enfocado con precisión, llamado haz primario.

• Estos electrones atraviesan lentes electromagnéticas y


son dirigidos sobre la superficie de la muestra.

•El haz primario de electrones arranca nuevos electrones


de la superficie de la muestra y estos electrones
secundarios son transmitidos hasta un colector de
electrones, amplificados y utilizados para formar una
imagen sobre una pantalla o sobre una placa fotográfica.
Microscopio electrónico de barrido

Voltajes típicos de aceleración de electrones


Microscopia de barrido (SEM) 1 – 30 kV
Microscopía de trasmisión (TEM) 40 – 1200 kV
Hasta donde podemos ver
Desde 100X hasta 70kX

Mag = 120x Mag = 500x Mag = 3.500x

Mag = 6.000x Mag = 25.000x Mag = 70.000x


Masa de pan, 20 keV
Estructura de la madera
Estructura del cemento
Ceramico-fractura
EJERCICIO
Observa detenidamente las siguientes fotos de micrografías y
señala qué tipo de microscopio se utilizó en cada caso.

c. Espermio
b. Capilar sanguíneo cortado
a. Ameba, organismo acercándose a un
transversalmente, por el que
formado por una sola óvulo. El óvulo humano
asoma un glóbulo rojo, célula
célula (unicelular), que es una célula que mide
que mide 7 micrones de
mide cerca de 50 poco más de 100
diámetro
micrometros micrones
d. Núcleo de una
célula animal, de e. Corte transversal de una f. Poros de salida de
alrededor de 5 hoja, espesor 1 mm glándulas gástricas.
micrones de Por una de ellas sale
diámetro un chorro de jugo
gástrico. Diametro de
poro, 5 micras
REFERENCIAS
• Arraiza N., Viguria P.M., Navarro J., Ainciburu
A. Manual de Microscopia. Historia,
descripción y uso del microscopio óptico.
• Bernis Mateu, J.: Atlas de microscopia,
Ediciones Jover, S.A., Barcelona, 1978.
• Locquln, M.; Langeron, M.: Manual de
microscopia, Editorial Labor, S.A., Barcelona,
1985.