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TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E

DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG

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1. Identificação do material bibliográfico: [ X ] Dissertação [ ] Tese

2. Identificação da Tese ou Dissertação


Autor (a): Flávio Silva de Carvalho
E-mail: flavioas8@hotmail.co
m.
Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ X ]Sim [ ] Não

Vínculo empregatício do autor nenhum


Agência de fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Sigla:
Nível Superior CAPES
País: Brasil UF: GO CNPJ: 00.889.834/0001-8
Título: Avaliação farmacológica e toxicológica de novos candidatos a protótipos de fármacos antitumorais

Palavras-chave: tumor ascítico de Ehrlish; antitumoral; leucemia; apoptose; nutlin; toxicidade aguda.
Título em outra língua: Pharmacological and toxicological evaluation of new drug candidates for
prototypes antitumor

Palavras-chave em outra língua: ascites tumor Ehrlish; antitumor; leukemia; apoptosis; nutlin;
acute toxicity.

Área de concentração: Fármacos e Medicamentos


Data defesa: (dd/mm/aaaa) 02/03/2011
Programa de Pós-Graduação: Ciências Farmacêuticas
Orientador (a): Marize Campos Valadares Bozinis
E-mail: marizecv@farmacia.ufg.br
Co-orientador (a):* Ricardo Menegatti
E-mail: rm_rj@yahoo.com
*Necessita do CPF quando não constar no SisPG

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Flávio Silva de Carvalho Data: 14 / 02 / 2013


Assinatura do (a) autor (a)

1
Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo
suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o
período de embargo.
1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

FLÁVIO SILVA DE CARVALHO

AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA E
TOXICOLÓGICA DE NOVOS CANDIDATOS
A PROTÓTIPOS DE FÁRMACOS
ANTITUMORAIS

Goiânia
2011

2
FLÁVIO SILVA DE CARVALHO

AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA E TOXICOLÓGICA


DE NOVOS CANDIDATOS A PROTÓTIPOS DE
FÁRMACOS ANTITUMORAIS

Dissertação apresentada ao Programa de


Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
da Universidade Federal de Goiás, como
parte dos requisitos para obtenção do título
de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Área de concentração: Fármacos e
Medicamentos

Orientadora: Profª Drª Marize Campos Valadares Bozinis


Co-orientador: Prof. Dr. Ricardo Menegatti

Goiânia
2011

3
4
5
iii

Dedico este trabalho a todos que se


debruçam nas bancadas dos laboratórios
buscando formas de preservar a vida em
todas suas formas, e em atos de extrema
humildade, curvam-se ao conhecimento
descoberto, agradecendo ao Supremo
Criador por mais um fragmento de sua
infinita bondade.

6
iv

AGRADECIMENTOS
Sou grato a todos os que de uma ou de outra forma contribuíram para fazer feliz e
produtivo este período de minha vida, seja pelo apoio financeiro, moral e espiritual e em
especial:
À Profª Drª Marize Campos Valadares Bozinis, por ter primado pela minha
formação como profissional, com orientação pontual e indispensáveis contribuições e críticas,
sempre feitas com alegria e serenidade.
Ao Prof. Dr. Ricardo Menegatti, pela extrema docência, por ter mostrado o melhor
caminho nos momentos de dificuldade, sempre pensando no meu futuro e no futuro de todos
os seus pupilos, e, principalmente, por ter colaborado na minha formação humana e pessoal
como pesquisador.
Aos colegas, professores e servidores, por terem contribuído para o meu
crescimento, permitindo-me observar a mim mesmo nas inúmeras oportunidades em que
ofereceram generosamente sua experiência, dando-me ainda a oportunidade de formação e
fortalecimento de vínculos de amizade.
Aos meus familiares, meus amigos e minha amada por terem, ao longo deste
período, compreendido minhas ausências, colaborando desta forma para a manutenção de
minhas energias e serenidade.
À oportunidade de vida que tenho nesta etapa de minha existência e ao fato de ter
tido uma grande oportunidade de crescimento como ser humano.
Ao conhecimento adquirido com o estudo, que ora deixo consignado, como singela
homenagem ao Supremo Criador, anelando ter contribuído de alguma forma para a
preservação da vida humana.
.

7
v

“Interessar-se por novos motivos ajuda a viver em permanente juventude.”


Carlos Bernardo González Pecotche

8
vi

RESUMO
No âmbito de uma linha de pesquisa que visa a avaliação farmacológica e toxicológica
de novos candidatos a protótipos de fármacos antitumorais, foi realizado neste trabalho a
avaliação farmacológica e toxicológica dos compostos LQFM030, LQFM031 e LQFL032,
desenhados a partir dos protótipos nutlins. Adicionalmente, também avaliou-se os compostos
LQFM004, LQFM005, LQFM028 e LQFM029, inicialmente idealizados como candidatos a
protótipos de fármacos antipsicóticos, desenhados a partir do LASSBio579. Inicialmente
realizou-se uma triagem citotóxica com todos os candidatos, utilizando o teste de
citotoxicidade de Exclusão do Azul de Tripano, em células K-562. Diante disto, observou-se
que os melhores valores de IC50 foram obtidos com os candidatos LQFM030 e LQFM029
(0,55 e 0,56 mM, respectivamente) e a partir de então teve-se como ponto de partida essas
duas moléculas para um estudo mais detalhado e aprofundado da citotoxicidade, onde
observou-se que a molécula LQFM030 apresentou o melhor perfil citotóxico no teste de
Exclusão do Azul de Tripano e para o teste de Redução do MTT, no intervalos de tempo de
24, 48 e 72h, quando comparado com a molécula LQFM029, utilizando a linhagem celular K-
562. Frente a isso, o candidato LQFM030 foi alvo dos demais estudos realizados visando
estudo de sobrevida, ensaios de segurança (Captura do Corante Vermelho Neutro, Toxicidade
Aguda Oral), ciclo celular, mecanismo de morte celular por apoptose e atividade antioxidante.
Os dados mostraram que a molécula LQFM030 aumentou a expectativa de vida dos animais,
e um valor de IC50 compatível com o valor dos Nutlins encontrado na literatura; diante da
avaliação da toxicidade aguda, segundo a OECD 423, a molécula teve classificação 5 ou não-
classificada de acordo com a classificação GSH; no ciclo celular observou-se um aumento da
fase G2/M (73%) e da fase sub-G1 (73,6%), e uma diminuição da fase S (40,9%); para a
avaliação do mecanismo de morte celular foi caracterizado um aumento da expressão da
proteína Bax (8 vezes em relação ao grupo não-tratado), e uma diminuição de Bcl-2 (84%),
assim como um aumento do potencial de membrana e uma diminuição de ROS (espécie
reativa de oxigênio), onde não observou-se uma variação na expressão das proteínas TNF e
NFκβ; porém um aumento da modulação da proteína citocromo-c de 85%; a atividade
antioxidante não apresentou um efeito significativo, e perante a voltametria ciclica o
candidato mostrou apenas a presença do pico de oxidação, não sendo caracterizado como um
bom sistema de oxirredução. Para o ensaio de segurança, em célula basal 3T3, o candidato
apresentou uma citotoxicidade com o valor de IC50 de 0,14 mM aproximadamente. Assim, o
candidato a protótipo a fármaco antitumoral LQFM030 apresentou como um bom candidato a
protótipo antitumoral com dados importantes para tal finalidade, e a necessidade de estudos
ainda mais aprofundados para uma melhor conceituação.

Palavras-chave: tumor ascítico de Ehrlich; antitumoral; leucemia; apoptose; nutlin; toxicidade


aguda.

9
vii

ABSTRACT
As part of a line of research aimed at the pharmacological and toxicological evaluation
of new candidates for antitumor drug prototypes, this work was conducted to evaluate
pharmacological and toxicological compounds LQFM030, and LQFM031 LQFL032, drawn
from nutlins prototypes. Additionally, we also evaluated whether the compounds LQFM004,
LQFM005, and LQFM028 LQFM029 initially envisioned as candidates for prototypes of
antipsychotic drugs, drawn from LASSBio579. Initially there was a cytotoxic screening all
candidates, using the cytotoxicity test of exclusion of Trypan Blue in K-562 cells. Given this,
it was observed that the best IC50 values were obtained with the candidates and LQFM030
LQFM029 (0.55 and 0.56 mM, respectively) and from then on had as starting point for these
two molecules to a more detailed and thorough cytotoxicity, where it was observed that the
molecule had the best LQFM030 cytotoxic profile in the test of exclusion of Trypan blue and
the MTT reduction test, at intervals of 24, 48 and 72, compared with LQFM029 the molecule,
using the cell line K-562. Given this, the candidate LQFM030 was the target of other studies
conducted to study the survival, safety tests (Capture the Neutral Red dye, Acute Toxicity
Oral), cell cycle, cell death mechanism of apoptosis and antioxidant activity. The data showed
that the molecule LQFM030 increased life expectancy of the animals, and an IC50 value
commensurate with the value of Nutlins found in literature, on the evaluation of acute
toxicity, according to OECD 423, the molecule was rated 5 or non- classified according to the
classification GSH, the cell cycle was observed an increase in G2 / M phase (73%) and sub-
G1 phase (73.6%), and a decrease in S phase (40.9%) ; to assess the mechanism of cell death
was characterized increased expression of Bax (8 times compared to untreated group), and a
decrease of Bcl-2 (84%) as well as an increase in membrane potential and a decrease of ROS
(reactive oxygen species), where there was not a change in protein expression of TNF and
NFκβ; antioxidant activity did not show a significant effect, and before the candidate cyclic
voltammetry showed only the presence of peak oxidation, not being characterized as a good
redox system. When tested for safety in basal cell 3T3, the candidate presented a cytotoxicity
with IC50 value of approximately 0.14 mM Thus, the candidate prototype antitumor drug
LQFM030 presented as a good candidate for antitumor prototype with important data for such
purpose, and the need for further detailed studies to better conceptualization.

Keywords: ehrlich ascites tumor, anti-tumor, leukemia, apoptosis, nutlin; acute toxicity.

10
Sumário
DEDICATÓRIA ……………………………………………………………………………..iii
AGRADECIMENTOS………………………………………………………………………..iv
EPÍGRAFE................................................................................................................................v
RESUMO……………………………………………………………………………………..vi
ABSTRACT………………………………………………………………………………….vii
LISTA DE FIGURAS……………………………………………………………………….viii
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 2
1.1 MERCADO FARMACÊUTICO GLOBAL....................................................................................... 2
1.1.1 NOVOS “PAPILINES”ANTITUMORAIS ......................................................... 2
1.1.2 IMPACTO SÓCIO-ECONÔMICO DO CÂNCER .............................................. 4
1.2 Câncer...................................................................................................................................... 5
1.2.1 Genética do Câncer ............................................................................................... 5
1.3 Leucemia ................................................................................................................................. 8
1.4 MECANISMOS DE MORTE CELULAR ...................................................................................... 10
1.4.1 Apoptose ............................................................................................................. 10
1.4.2 Necrose ............................................................................................................... 12
1.5 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ................................................................................................... 13
1.5.1 Estresse Oxidativo .............................................................................................. 13
1.6 Fatores de Transcrição .......................................................................................................... 15
1.6.1 NFK-B ................................................................................................................ 15
1.6.2 Família Bcl ......................................................................................................... 16
1.7 p53/MDM2 ............................................................................................................................ 18
1.8 Sobre os Nutlins .................................................................................................................... 19
2 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 21
2 OBJETIVOS ..................................................................................................................... 22
2.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................................... 22
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................................ 22
3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 23
3 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 26
3.1 COMPOSTOS ESTUDADOS ..................................................................................................... 26
3.2 ENSAIOS PARA AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE......................................................................... 26
3.2.1 Ensaios de Citotoxicidade .................................................................................. 26
3.2.1.1 Ensaio de viabilidade celular pelo método de Exclusão do Azul de Tripano ............ 26
3.2.1.1.1 Conceito .............................................................................................................. 26
3.2.1.1.2 Descrição do Protocolo Experimental ................................................................. 27

11
3.2.1.2 Ensaio de viabilidade celular pelo método de Redução do MTT .............................. 27
3.2.1.2.1 Conceito .............................................................................................................. 27
3.2.1.2.2 Descrição do Protocolo Experimental ................................................................. 28
3.2.1.3 Ensaio de Sobrevida de Animais Portadores de TAE................................................. 29
3.2.1.3.1 Animais ................................................................................................................ 29
3.2.1.3.1.1.1 Descrição dos animais ........................................................................... 29
3.2.1.3.1.1.2 Alojamento e manejo dos animais ........................................................ 30
3.3 TUMOR ASCÍTICO DE EHRLICH (TAE)..................................................................................... 30
3.3.1 Manutenção das células do Tumor Ascítico de Ehrlich (TAE) .......................... 30
3.3.2 Obtenção das células do Tumor Ascítico de Ehrlich (TAE) .............................. 30
3.4 CURVA DE SOBREVIDA .......................................................................................................... 31
3.4.1 Conceito .............................................................................................................. 31
3.4.2 Descrição do protocolo experimental ................................................................. 31
3.5 CICLO CELULAR ...................................................................................................................... 32
3.6 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL INDUTOR DE APOPTOSE E DOS MECANISMOS DE INDUÇÃO DE
APOPTOSE ......................................................................................................................................... 33
3.6.1
Ros (1)...................................................................................................................... 33
3.6.2
Rodamina (2) ........................................................................................................... 33
3.6.3 Bax, BCL-2 e Citocromo-c................................................................................. 34
3.6.4 TNF e NFKB ...................................................................................................... 34
3.7 ENSAIOS DE SEGURANÇA ...................................................................................................... 35
3.7.1 Captura do Corante Vermelho Neutro ................................................................ 35
3.7.1.1 Conceito .................................................................................................................... 35
3.7.1.2 Descrição do protocolo experimental ....................................................................... 35
3.7.2 Teste de Toxicidade aguda dose única – teste de classe (OECD 423) ............... 36
3.7.2.1 Descrição do protocolo experimental ....................................................................... 36
3.7.3 Observação dos sinais de toxicidade (Screening Hipocrático) ........................... 37
3.7.4 Estudo histopatológico ....................................................................................... 38
3.7.5 Avaliação dos índices dos órgãos ....................................................................... 39
3.7.6 Avaliação da atividade antioxidante ................................................................... 39
3.7.6.1 Conceito .................................................................................................................... 39
3.7.6.2 Descrição do protocolo experimental ....................................................................... 39
3.7.6.3 Determinação da Concentração Efetiva 50 % ........................................................... 40
3.7.7 Avaliação da atividade antioxidante pelo sistema β-caroteno/Ácido Linoléico. 40
3.7.7.1 Conceito .................................................................................................................... 40

12
3.7.7.2 Descrição do protocolo experimental ....................................................................... 41
3.8 PREPARO DAS SOLUÇÕES DO PROTOCOLO EXPERIMENTAL ................................................ 42
3.8.1 Tratamento da Água Destilada ........................................................................... 42
3.8.2 Solução de β-caroteno (20 mg/mL)ácido linoléico ............................................ 42
3.8.3 Solução do controle de Trolox (0,2 mg/mL) ...................................................... 42
3.8.4 Solução de β-caroteno/ácido linoléico................................................................ 42
3.9 ELETROQUÍMICA ................................................................................................................... 43
3.10 Estatística .............................................................................................................................. 43
4 RESULTADOS .................................................................................................................... 44
4 RESULTADOS ................................................................................................................ 45
4.1 AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE.......................................................................................... 45
4.1.1 Ensaio de viabilidade celular por Azul de Tripano ............................................ 45
4.1.2 Citotoxicidade dos candidatos a protótipos LQFM029 e LQFM030 ................. 49
4.1.3 Avaliação da Sobrevida dos Animais Portadores de Tumor Ascítico de Ehrlich
52
4.2 CICLO CELULAR ...................................................................................................................... 55
4.3 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL INDUTOR DE APOPTOSE E DOS MECANISMOS DE INDUÇÃO DE
APOPTOSE ......................................................................................................................................... 57
4.3.1 ROS .................................................................................................................... 57
4.3.2 Rodamina ............................................................................................................ 59
4.3.3 Citocromo-C ....................................................................................................... 61
4.3.4 Bax e Bcl-2 ......................................................................................................... 63
4.3.5 TNF e NFK-B ..................................................................................................... 66
4.4 ENSAIOS DE SEGURANÇA ...................................................................................................... 69
4.4.1 Captura do Corante Vermelho Neutro ................................................................ 69
4.4.2 Toxicidade Aguda em dose única....................................................................... 70
4.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE .......................................................................... 75
4.5.1 Avaliação da capacidade de reação com 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) .. 75
4.5.2 Avaliação da atividade antioxidante pelo sistema β-caroteno/Ácido Linoléico. 75
4.5.3 Eletroquímica...................................................................................................... 79
5 DISCUSSÃO .................................................................................................................... 81
6 CONCLUSÃO .................................................................................................................. 87
7 PERSPECTIVAS ............................................................................................................. 90
8 REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 92

13
viii

Lista de figura
Figura 1: estrutura molecular da Atrovastatina ......................................................................... 2
Figura 2: relação de candidatos a protótipos antitumorais, que se encontram na fase clínica,
dentre os vários tipos de câncer. ................................................................................................. 3
Figura 3: estimativa do câncer para o ano de 2010/2011, para a população brasileira. ............ 4
Figura 4: quadro exemplificando os tipos de genes ligados 1ª formação tumor. ...................... 6
Figura 5: formação do cromossomo Philadelphia, característico das leucemias mielóides
crônicas. ...................................................................................................................................... 9
Figura 6: Caractetisciticas morfmologicas de apoptose e necrose (Grificich et al., 2007). .... 11
Figura 7: Indução da apoptose pela via de receptores da morte e por disfunção mitocondrial.
(Parolin et al.; 2001, Adaptado de Kaplowitiz, 2000). ............................................................. 12
Figura 8: Relação entre o aumento de EROs e ERNs com o desencadeamento de processos
inflamatórios, envelhecimento e apoptose................................................................................ 14
Figura 9: Aumento de fatores angiogênicos ocasionados pelo aumento de espécies reativas de
oxigênio. ................................................................................................................................... 15
Figura 10: esquema diagramático dos estímulos que ativam as ações do NF-kB (flecha
contínua) e fenômenos nos quais a ativação do NF-kB está envolvida (flecha pontilhada).
(Glezer et al., 2000). ................................................................................................................. 16
Figura 11: Controle da permeabilidade mitocondrial realizada pelas proteínas da família Bcl-
2. ............................................................................................................................................... 17
Figura 12: Fórmula estrutural dos análogos de Nutlin (POPOWICZ, DOMLING, HOLAK,
2012) ......................................................................................................................................... 20
Figura 13: Região de ligação da proteína MDM2 à proteína p53. .......................................... 20
Figura 14: Fluxograma das avaliações toxicológicas e farmacológicas realizadas neste
projeto. ...................................................................................................................................... 24
Figura 15. ................................................................................................................................. 25
Figura 16: Estrutura química do Azul de Tripan. ................................................................... 26
Figura 17: Formação do composto Formazan a partir do MTT, pela ação da enzima succinil
desidrogenase. .......................................................................................................................... 28
Figura 18: Estrutura química do corante Vermelho Neutro. ................................................... 35
Figura 19: Fluxograma representando a metodologia seguida para o ensaio de toxicidade
aguda em dose única, a partir da dose de 300 mg/kg. .............................................................. 37
14
Figura 20: Viabilidade celular da linhagem tumoral K-562 após 24h de incubação em
diferentes concentrações (1,568 – 0,012 mM) de exposição das compostos LQFM030, 031 e
LQFM 032. A figura 20A representa o perfil citotóxico, pelo teste de exclusão do Azul de
Tripan o, das compostos LQFM030, 031 e LQFM 032 frente às células K-562, onde cada
ponto representa a média e o ± desvio padrão de uma concentração realizada em triplicata e
cada experimento realizado em duplicata. Já a figura 20B representa os valores de inibição
celular de 50% da linhagem leucêmica K-562 (IC50 24h). ....................................................... 46
Figura 21: Viabilidade celular da linhagem tumoral K-562 após 24h de incubação em
diferentes concentrações (1,568 – 0,012 mM) de exposição das compostos LQFM004, 005,
028 e LQFM029. A figura 21A representa o perfil citotóxico, pelo teste de Exclusão do Azul
de Tripano, das compostos LQFM004, 005, 028 e LQFM029 frente às células K-562, onde
cada ponto representa a média e o ± desvio padrão de uma concentração realizada em
triplicata e cada experimento realizado em duplicata. Já a figura 21B representa os valores de
inibição celular de 50% da linhagem leucêmica K-562 (IC50 24h). ......................................... 48
Figura 22: Viabilidade de células da linhagem tumoral K-562 após 24, 48 e 72h de incubação
em diferentes concentrações (1,568 – 0,012 mM) das compostos LQFM029 (22A) e
LQFM030 (22B). A atividade citotóxica foi avaliada pelo teste de Exclusão do Azul de
Tripano, onde cada ponto representa a média e o ± desvio padrão de uma concentração
realizada em sexplicata e cada experimento realizado em duplicata. A figura 22C apresenta a
inibição celular de 50% da linhagem tumoral K-562 (IC50 24h), avaliada pelo Teste de
Exclusão do Azul de Tripano, após 24, 48 e 72h de incubação em estufa a 37 ºC e 5% CO2,
com as compostos LQFM029 e LQFM030. ............................................................................ 50
Figura 23: Viabilidade de células da linhagem tumoral K-562 após 24, 48 e 72h de incubação
em diferentes concentrações (1,568 – 0,012 mM) das compostos LQFM029 (23A) e
LQFM030 (23B). A atividade citotóxica foi avaliada pelo ensaio de redução do MTT, onde
cada ponto representa a cada ponto representa a média e o ± desvio padrão de uma
concentração realizada em sexplicata e cada experimento realizado em duplicata. A figura
23C apresenta a inibição celular de 50% da linhagem leucêmica K-562 (IC50 24h), avaliada
pelo ensaio de redução do MTT, após 24, 48 e 72h de incubação em estufa a 37 ºC e 5% CO 2,
com as compostos LQFM029 e LQFM030. ............................................................................ 51
Figura 24: Efeito do composto LQFM030 na sobrevida dos animais portadores de Tumor
Ascítico de Ehrlich (TAE). Os grupos tratados com o composto LQFM030 nas doses de 75
150 e 300 mg/Kg, por gavagem, durante 10 dias de tratamento, receberam a primeira

15
administração 24h após a inoculação com o tumor TAE na concentração de 2 x 106 células/ml.
Em cada grupo (controle e tratado) havia 10 animais, onde foram observados diariamente até
a morte do último animal (Curva Kaplan-Meier, Log-rank). P<0,05 em relação ao grupo TAE.
.................................................................................................................................................. 53
Figura 25: O elemento 25A apresenta a média e ± desvio padrão do peso corporal (g) do
grupo controle e dos grupos tratados com o composto 030 nas concentrações de 75, 150 e 300
mg/Kg. Para a análise estatística fez-se o teste Anova e o pós-teste utilizado foi o Tukey.
P<0,01 em relação ao grupo controle. O elemento 25B demonstra o peso corporal dos animais
tratados e não tratados portadores do Tumor Ascítico de Ehrlich (TAE), do teste de sobrevida.
A imagem B.1 representa a dose de 75 mg/Kg; B.2 a dose de 150 mg/Kg e a B.3 a dose de
300 mg/Kg. ............................................................................................................................... 54
Figura 26: o elemento 26A apresenta a ação do composto LQFM030 (0,55 mM) na
progressão do ciclo celular, representado pelo percentual de células na fase sub-G1, G1, S e
G2 quando comparado ao controle, em um intervalo de tempo de tratamento de 24h, frente às
células K-562. Já a figura 26B apresenta um histograma demonstrando a análise do ciclo
celular em células K-562 após 24H de incubação com 0,55 mM do composto LQFM030.
Utilizou-se o citômetro de fluxo para a determinação das fases do ciclo celular e o programa
FACSCanto II (BDBiosciences, CA, USA .............................................................................. 56
Figura 27: Histograma representando a análise de ROS em células K-562 após 3 e 6h (figura
27A), 12 e 24 h (figura 27B) de incubação em 0,55 mM do composto LQFM030. A figura
27C dessa figura apresenta o percentual de expressão do nível de ROS do tratado (LQFM 030
- 0,55 mM) quando comparado ao controle. Cada coluna do gráfico representa uma média e o
± desvio padrão de um intervalo de tempo analisado (3, 6, 12 e 24h), realizados em dois
experimentos independentes. Utilizou-se o citometro de fluxo para a análise da expressão do
ROS e o programa FACSCanto II (BDBiosciences, CA, USA). ............................................. 58
Figura 28: Histograma representando a análise de Rodamina em células K-562 após 3 e 6 h
(figura 28A), 12 e 24h (figura 28B) de incubação em estufa a 37 ºC e 5% CO2, com 0,55 mM
do composto 030. A figura 28C apresenta o percentual de expressão do nível de Rodamina do
tratado com o composto LQFM 030 (0,55 mM) quando comparado ao não-tratado. Cada
ponto representa a média e o ± desvio padrão de um intervalo de tempo analisado (3, 6, 12 e
24h), realizados em dois experimentosindependentes. Utilizou-se o citômetro de fluxo para a
análise da expressão de Rodamina e o programa FACSCanto II (BDBiosciences, CA, USA).
.................................................................................................................................................. 60

16
Figura 29: A figura 29A apresenta o percentual de expressão do nível de Citocromo-C do
tratado (LQFM 030 - 0,55 mM) quando comparado ao controle. A figura 29B presenta um
histograma representando a ação do composto LQFM030 (0,55 mM) sobre as células K-562
após 24 h de incubação em estufa a 37 ºC e 5% CO2, visando a observação do comportamento
do Citocromo-C. Para a análise estatística fez-se o teste T e considerou-se estatisticamente
significativo quando P<0,05 em elação ao grupo controle. Utilizou-se o citometro de fluxo
para a análise da expressão de Citocromo-C, e o programa FACSCanto II (BDBiosciences,
CA, USA................................................................................................................................... 62
Figura 30: A figura 30A apresenta o percentual de expressão do nível de Bax do tratado, com
o composto LQFM 030 (0,55 mM), quando comparado ao controle. A figura 30B apresenta
um histograma representando a análise do Bax em células K-562 após 24H de incubação com
0,55 mM do composto 030. Para a análise estatística fez-se o teste T e considerou-se
estatisticamente significativo quando P<0,05 em relação ao grupo controle. Utilizou-se o
citômetro de fluxo para a análise da expressão de Bax e o programa FACSCanto II
(BDBiosciences, CA, USA). .................................................................................................... 64
Figura 31: a figura 31A apresenta o percentual de expressão do nível de Bcl-2 do tratado,
com o composto LQFM030 (0,55 mM), quando comparado ao controle. A figura 31B
apresenta um histograma representando a análise do Bax em células K-562, após 24H de
incubação com 0,55 mM do composto LQFM030. Para a análise estatística fez-se o teste T e
considerou-se estatisticamente significativo quando P<0,05, em relação ao grupo controle.
Utilizou-se o citômetro de fluxo para a análise da expressão de Bcl-2 e o programa
FACSCanto II (BDBiosciences, CA, USA). ............................................................................ 65
Figura 32: a figura 32A apresenta o percentual de expressão de TNF das células tratadas
(LQFM030 - 0,55 mM) e não tratadas. A figura 32B apresenta um histograma representando a
modulação do TNF em células K-562 após 24 h de incubação com 0,55 mM do composto
LQFM030. Para a análise estatística fez-se o teste T e considerou-se estatisticamente
significativo quando P<0,05 em relação às células não-tratadas. Utilizou-se o citômetro de
fluxo para a análise da expressão de TNF e o programa FACSCanto II (BDBiosciences, CA,
USA). ........................................................................................................................................ 67
Figura 33: a figura 33A apresenta o percentual de expressão de NFκβ, das células tratadas
(LQFM030 - 0,55 mM) e não tratadas. A figura 33B apresenta um histograma representando a
modulação do NFκβ, em células K-562 após 24 h de incubação com 0,55 mM do composto
LQFM030. Para a análise estatística fez-se o teste T e considerou-se estatisticamente

17
significativo quando P<0,05 em relação às células não-tratadas. Utilizou-se o citômetro de
fluxo para a análise da expressão de NFκβ,e o programa FACSCanto II (BDBiosciences, CA,
USA). ........................................................................................................................................ 68
Figura 34: Viabilidade de células da linhagem celular 3T3 após 48h de incubação em estufa
com diferentes concentrações do composto 030 (1,568 – 0,012 mM). A atividade citotóxica
basal foi avaliada pelo teste de Vermelho Neutro, onde cada ponto representa a média e o ±
desvio padrão de uma concentração realizada em triplicata e o experimento foi realizado em
duplicata. .................................................................................................................................. 69
Figura 35: a figura 35A representa a média e ± desvio padrão do peso corporal (g) do grupo
controle e dos grupos tratados com o composto LQFM030 nas concentrações de 300 e 2000
mg/Kg. Já a figura 35B desta figura apresenta um gráfico com a média e ± desvio padrão do
peso do fígado (g) do grupo controle e dos grupos tratados com o composto 030 nas
concentrações de 300 e 2000 mg/Kg. A figura 35C apresenta a média e ± desvio padrão do
peso do baço (g) do grupo controle e dos grupos tratados com o composto 030 nas
concentrações de 300 e 2000 mg/Kg. Para a análise estatística de todos os gráficos fez-se o
teste Anova e o pós-teste utilizando sendo o teste Tukey. P<0,05 em relação ao grupo
controle. .................................................................................................................................... 71
Figura 36: análise histopatológica do estômago do grupo controle e dos grupos tratados com
as doses de 300 e 2000 mg/kg. A primeira coluna (36A) apresenta o desarranjo das fossetas
gástricas dos grupos tratados quando comparado com o grupo controle (100x). A segunda
coluna (36B) apresenta os sinais de hiperplasia desse órgão – grupo controle 40x e grupos
tratados 20x. Cortes histológicos corados com hematoxilina-eosina. ...................................... 72
Figura 37: análise histopatológica do fígado (37A) e rim (37B) do grupo controle e dos
grupos tratados com as doses de 300 e 2000 mg/kg do composto LQFM030. Fígado e rim
40X. Cortes histológicos corados com hematoxilina-eosina. ................................................... 73
Figura 38: Análise histopatológica do baço (38A), pulmão (38B) e coração (38C) do grupo
controle e dos grupos tratados com as doses de 300 e 2000 mg/kg do composto LQFM030.
Baço, pulmão e coração 40X. Cortes histológicos corados com hematoxilina-eosina. ........... 74
Figura 39: Avaliação da atividade sequestrante do radical DPPH• (0,3mM/ml) pelo controle
(ácido ascórbico – figura 39A), nas concentrações de 0,975 – 500,0 µg/ml e pelo composto
LQFM030 (figura 39B), nas mesmas concentrações. .............................................................. 75
Figura 40: Avaliação da atividade antioxidante pelo sistema β-caroteno/Ácido Linoléico do
controle Trolox (figura 40A) nas concentrações 12,5 – 200 µg/ml e do candidato LQFM030

18
(figura 40B), nas concentrações de 12,5 – 200 µg/ml. A figura 28C representa o sistema β-
caroteno/Ácido Linoléico. ........................................................................................................ 77
Figura 41: Cinética do controle Trolox e do candidato LQFM030 – figuras 41A e 41B,
respectivamente – observados de 20 em 20 minutos em um intervalo de tempo de 100
minutos. .................................................................................................................................... 78
Figura 42: Análise voltamétrica do composto LQFM030 e do eletrólito suporte (solução de
KCl -0,1 molL-1, pH 7,0, temperatura ambiente). Em uma faixa de varredura selecionada de -
0,25 à 1,2 V, em uma velocidade de varredura de 100 mVs-1. ................................................ 79

19
1 INTRODUÇÃO

1
1 INTRODUÇÃO

1.1 MERCADO FARMACÊUTICO GLOBAL

O mercado farmacêutico movimentou 808 bilhões de dólares em todo mundo no ano


de 2009 (GLOBAL PHARMACEUTICAL MARKET, 2009). A América do Norte foi
responsável por 40,1% deste montante (Global Pharmaceutical Sales, 2009) e apresentou uma
taxa de crescimento entre 3 a 5% neste ano. Porém, mesmo a América Latina sendo
responsável por apenas 5.9% deste rendimento ela apresentou a maior taxa de crescimento
anual 10-12% dentre os últimos anos (GLOBAL PHARMACEUTICAL SALES, 2009).
Ainda em 2009 os fármacos antitumorais foram responsáveis pela movimentação de
52.3 bilhões de dólares. Como exemplos têm-se a atrovastatina – figura 1 - (Global
PHARMACEUTICAL MARKET, 2009) responsável pelo faturamento de cerca de 10% do
total, a bevacizumabe e a rituximabe onde juntos movimentaram 23,5 bilhões de dólares. o
que os colocam na 1ª posição entre todas as outras classes de fármacos (TOP 15 GLOBAL
THERAPEUTIC, 2009).

HO
CO2Na
OH

F
N

H
N
O
(Atrovastatina)

Fonte:Wikipedia

Figura 1: estrutura molecular da Atrovastatina

1.1.1 NOVOS “PAPILINES”ANTITUMORAIS

Em relação aos candidatos a protótipos de fármacos antitumorais, no ano de 2009 a


“Pharmaceutical Research and Manufacturers of America” (PHRMA) publicou uma lista
com 800 candidatos a protótipos de fármacos – figura 2 - que se encontra em fase clínica ou
2
em curso para aprovação pelo “Food Drug and Administration” - FDA (Report Medicines,
2009). Dentre os vários tipos de câncer, os mais pesquisados são os tumores sólidos e
leucemias, 203 e 129 respectivamente (REPORT MEDICINES, 2009).

Fonte: Report Medicines, 2009

Figura 2: relação de candidatos a protótipos antitumorais, que se encontram na fase clínica, dentre os vários tipos de câncer.

Ainda foi publicada, pela PHRMA, uma lista de 34 novos fármacos onde figuram o
everolimus (Companhia Novartis) empregado no tratamento de carcinoma renal avançado;
ofatumumabe (Companhia Genmab), empregado no tratamento da leucemia linfocítica
crônica refratária aos tratamentos disponíveis; pralatrexato (Companhia Allos), para o
tratamento de linfoma de células-T periféricas resistentes ao tratamento; romidepsina
(Companhia Gloucester), no tratamento de linfoma de células-T cutâneas; pazopanibe
(Companhia GlaxoSmithKline), empregado no tratamento de carcinoma de células renais
avançado; vacina para o papilomavírus humano (Companhia GlaxoSmithKline), auxilia no
tratamento de câncer cervical (New Drug in Approvals, 2010). Esses seis novos fármacos
correspondem apenas 17.64% do total dos novos fármacos ingressantes no mercado em 2009,
o que ratifica a demanda por novos protótipos antitumorais que sejam mais efetivos, seguros e
que apresentem menos efeitos colaterais. (HARDMAN, 2009).

3
1.1.2 IMPACTO SÓCIO-ECONÔMICO DO CÂNCER

Em 2008, mais de 1.4 milhões de novos casos de câncer foram diagnosticados. Cerca
de 77% de todos os casos de câncer são diagnosticados em indivíduos acima de 55 anos de
idade. Diversos são os fatores que propiciam o desenvolvimento de câncer tais como os
genéticos, os ambientais e hábitos e costumes de um indivíduo. Os genéticos podem ser de
origem hereditária ou somática. Os fatores ambientais podem ser causados por agentes
químicos (nitrito, nitrato, aflatoxina B, álcool), físicos (radiação UV) e agentes infecciosos
(Helicobacter pylori, papiloma vírus humano; hepatites B e C, HBV/HCV) (HARDMAN,
2009).
Já o estilo de vida (tabagismo, exposição excessiva à luz solar, dieta gordurosa,
estresse, sedentarismo) também apresenta grande influência no de desenvolvimento do
câncer. Levando em consideração este último fator, pode-se dizer que a mudança de hábitos
pode contribuir profilaticamente (OLIVEIRA, 2002)
Atualmente, o câncer é responsável por uma em cada quatro mortes, sendo
considerada a segunda causa de morte mundial, ficando atrás apenas dos óbitos decorrentes de
problemas cardiovasculares. Em 2009, nos Estados Unidos, aproximadamente, 565.650
pessoas morreram de câncer, o que corresponde a 1.500 pessoas por dia (Report Medicines in
Development, 2009). Segundo relatório da Agência Internacional para Pesquisa em Câncer
(IARC)/OMS, o impacto do câncer mais que dobrou no últimos 30 anos, sendo a causa de 7
milhões de mortes por ano (12,5% de mortes no mundo) e estima-se que 16 milhões de novos
casos de câncer sejam registrados até o final de 2020. No Brasil, as estimativas para o ano de
2011 apontam uma estimativa de quase 490 mil novos casos de câncer (figura 3).

Figura 3: estimativa do câncer para o ano de 2010/2011, para a população brasileira.

4
1.2 Câncer

A palavra câncer ou neoplasia é empregada para descrever um complexo e


heterogêneo grupo de estados patológicos no qual todas elas apresentam um ponto em
comum, que é a perda da capacidade de controlar o processo de replicação celular devido
alterações genéticas (TURKINGTON, 2005).
Aline et al. descorre em sua dissertação que o desenvolvimento neoplásico é um
processo que apresenta vários estágios, onde ocorre, durante esses estágios, um acúmulo de
mutações somáticas na célula, podendo resultar em um fenótipo maligno. Os estágios de
desenvolvimento do câncer estão representados em três fases: iniciação, promoção e
progressão (TURATTI, 2006).
O primeiro estágio (iniciação) se caracteriza por uma mutação irreversível de um
fragmento do material genético, onde a celular pode se transforma em maligna (câncer) se
receber estímulos promotores de malignidade. O segundo estágio (promoção) é um processo
longo caracterizado pela presença de estímulos (agentes promotores – carcinógenos químicos,
hormônios endógenos, luz ultravioleta, etc) onde a célula alterada genéticamente não perde a
capacidade de replicação, impedindo dessa maneira a morte dessa célula. Já a terceira fase se
caracteriza pela invazividade das células neoplásicas para os tecidos adjacentes, próximos;
(SHAW, 2007).

1.2.1 Genética do Câncer

Os genes que estão diretamente ligados à formação do tumor são, principalmente,


aqueles ligados ao controle do ciclo celular, reparo do DNA danificado e apoptose
(ZIEGLER, 1998). Existem, basicamente, três tipos de genes que estão envolvidos na
formação de células tiumorais: os oncogenes, genes supressores tumorais e genes envolvidos
na estabilidade dos genes -figura 4- (VOGELSTEIN, 2004).

5
Figura 4: quadro exemplificando os tipos de genes ligados 1ª formação tumor.
6
Os oncogenes são proto-oncogenes mutados, sendo que os proto-oncogenes são genes
normais que são responsáveis pelo controle do ciclo celular e diferenciação da célula.
Geralmente, os proto-oncogenes codificam enzimas. Quando ocorrem mutações,
transformando esses genes em sua forma oncogênica, há um aumento de atividade (ganho de
função) tanto pelo aumento da afinidade pelo substrato quanto pela perda de sua regulação.
Por isso, essas mutações são denominadas como mutações ativadoras (BUNS, 2008).
Os principais tipos de mutações que podem ocorrer nos proto-oncogenes são:
translocação cromossômica (mudança de um segmento de cromossomo para a outra parte de
um cromossomo homólogo ou ao interior de um cromossomo não homólogo), deleção (perda
de um ou alguns nucleotídios ou perda de uma porção do cromossomo), amplificação,
mutação pontual ou através de uma inserção de um material genético viral. (LOPES, 2002).
Alguns oncogenes produzem oncoproteínas, como a bcl-2, IE84 (Citomegalovírus),
SV40-T (vírus SV40), E6 (HPV), EBNA-5 (EBV) e HBx (vírus da hepatite B), que se ligam
fortemente a seus receptores e inibem as proteínas codificadas por genes supressores do
crescimento celular ou indutores da apoptose, como a p53 e a Rb (JUNQUEIRA, 2005;
FERRARI, 2002).
Os oncogenes da família Bcl-2 apresentam mais de 15 membros já identificados tais
como as proteínas anti-apoptoticas: Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl e A1, e outras pró-apoptóticas
como a Bax, a Bad e Bid (PAROLIN, REASON, 2001). Atualmente sabe-se de três funções
para essa família: dimerização, atividade formadora de poro ou canal de íons e ligação a
outras proteínas. A Bcl-2 bloqueia a penetração nuclear de perfurina e granzima, substâncias
liberadas pelos linfóticos T, mantendo a integridade da membrana mitocondrial. Impedindo,
dessa forma, a liberação de citocromo-c e a consequente ativação das caspases e da apoptose
(PAROLIN, REASON, 2001).
As proteínas codificadas pelos genes supressores tumorais atuam como reguladores
negativos, ou seja, funcionam como freios da proliferação celular. Dessa forma, a atividade
desses genes, após a mutação, fica reduzida ou nula levando à perda da homeostase do tecido.
Os genes supressores tumorais estão envolvidos no controle da estabilidade dos
compartimentos teciduais que incluem a manutenção da integridade genética, progressão do
ciclo celular, diferenciação, interações celulares e apoptose (BUNS, 2008). As inativações dos
genes supressores tumorais podem ser resultantes de mutações “missense” em resíduos
essenciais para a atividade, mutações que geram uma proteína truncada, inserções e deleções
de vários tamanhos ou ainda por silenciamento epigenético (VOGELSTEIN, 2004).

7
Cerca de 30 genes supressores tumorais já foram reconhecidos e codificam proteínas
reguladoras dos pontos de checagem no ciclo celular (CAMPBELL, 2000). Como exemplos
de genes supressores tumorais, podemos citar os genes p53, o Rb – retinoblastoma e APC
(CAMPBELL, 2000; VOGELSTEIN, 2004).
Os genes envolvidos na estabilidade (caretakers genes) do genoma quando sofrem
mutações também contribuem para o desenvolvimento de células tumorais. Os genes
envolvidos nos processos de reparo do DNA (mismatch repair genes - MMR; nucleotide-
excision repair genes – NER; base-excision repair genes - BER) e os genes envolvidos na
recombinação mitótica e segregação dos cromossomos (BRCA1, BLM e ATM) são exemplos
de “caretakers genes”. Esses genes são responsáveis por manter as alterações genéticas em um
nível mínimo. Assim, qualquer mutação que impeça a atividade das proteínas codificadas por
esses genes promove um aumento das mutações e, consequentemente, leva a tumorigênese
(VOGELSTEIN, 2004; MENDELSOHN, 2008).

1.3 Leucemia

O termo leucemia vem do termo grego leukemia e significa “sangue branco”. É um


câncer das células do sangue e da medula óssea caracterizado pelo acúmulo incontrolável de
células do sangue. Embora a leucemia possa atacar qualquer um dos diferentes componentes
que compõem o sangue (incluindo plasma, glóbulos brancos, glóbulos vermelhos e
plaquetas), a maioria dos tipos de leucemia afeta as células brancas do sangue. (Turkington,
2005; Altman, 2007).
A leucemia é uma desordem clonal que surge de células progenitoras hematopoiéticas
em desenvolvimento na via linfóide ou mielóide ou a partir de células troncos primitivas com
potencial para formar várias linhagens (QUINTÁS-CARDAMA, 2008).
Baseando-se na rapidez com que a doença se desenvolve e se agrava e pelo tipo de
célula do sangue que é afetado, as leucemias podem ser agrupadas em quatro categorias:
leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, leucemia linfocítica aguda e leucemia
linfocítica crônica (ALTMAN, 2007).
A leucemia mielóide crônica (LMC) ocorre principalmente em adultos, embora um
número pequeno de crianças pode também desenvolver a doença. A LMC resulta de uma
transformação neoplásica de uma célula-tronco hematopoética. Clinicamente, a LMC segue
uma progressão previsível, na qual uma fase crônica inicial, caracterizada por uma produção

8
excessiva de granulócitos imaturos, é seguida por uma aceleração da doença e eventual
transformação em uma fase terminal de leucemia aguda com o acúmulo de células blásticas
primitivas (crise blástica). A evolução para a crise blástica muitas vezes envolve a aquisição
de outras anomalias cromossômicas (WANG, 2005).
A característica genética marcante que dirige essa patogênese é a translocação
cromossômica t(9;22)(q34;q11). Citogeneticamente resulta no cromossomo Philadelphia e
molecularmente dá origem ao gene híbrido BCR-ABL. Esse gene codifica uma proteína
quinase, BCR-ABL, que está constitutivamente ativa na leucemia mielóide crônica – figura 5-
(NOWELL, 1960; QUINTÁS-CARDAMA, 2008).

Figura 5: formação do cromossomo Philadelphia, característico das leucemias mielóides crônicas.

O gene ABL é o homólogo humano do oncogene v-ABL presente no vírus da


Leucemia Murina de Abelson. É expresso de forma ubíqua e funções diversas foram
atribuídas a essa tirosina quinase como a regulação do ciclo celular, resposta celular ao
estresse genotóxico e transmissão de informações sobre o ambiente de sinalização celular
através de integrinas. Aparentemente, a proteína ABL desempenha um complexo papel
através da integração de vários sinais intra e extracelulares e influencia no ciclo celular e na
apoptose. De forma semelhante à ABL, a proteína Bcr é expressa ubiquamente e a sua porção
N-terminal possui atividade de serino-treonina quinase, contudo a sua função ainda não está
bem definida (DEININGER, 2000).
O Imatinib, inibidor tirosina quinase, é considerado a primeira escolha de
medicamento para a leucemia mielóide crônica devido a sua eficácia, baixa toxicidade e
capacidade de manter duráveis as respostas hematológicas e citogenéticas. Mas apesar dos
excelentes resultados, vários pacientes desenvolvem resistência ao Imatinib, em torno de 20-
25% dos pacientes. Diversos são os mecanismos de resistência e incluem mutações no

9
domínio quinase do BCR-ABL1, diminuição de entrada de imatinib em células, a aquisição
de alterações genéticas secundárias e ativação de vias de sinalização alternativa. Pacientes
com resistência podem ainda ser tratados com as compostos desatinib ou nilotinib (segunda
geração de inibidores de tirosina quinase) (SANTOS, 2009; GORA-TYBOR, 2008;
RADICH, 2010). Apesar dos medicamentos existentes ainda há necessidade do
desenvolvimento de novos fármacos como fontes alternativas para os atuais medicamentos.

1.4 MECANISMOS DE MORTE CELULAR

Atualmente, sabe-se que existem cinco tipos de morte celular, classificadas de acordo
com as características bioquímicas e morfológicas intrínsecas a cada categoria, assim
denominadas: autofagia, necrose, apoptose, mitose catastrófica e senescência (GRIVICICH,
2007).

1.4.1 Apoptose

Parolin conceitua o termo apoptose como: “forma fisiológica de morte celular que
ocorre segundo programa genético que desencadeia processo de autodigestão controlada, em
consonância com a remoção de células lesadas, senescentes ou imprestáveis, sem alteração do
microambiente celular” (PAROLIN, REASON, 2001).
Esse tipo de morte celular vem sendo estudado desde a década de 70, sendo
considerado um processo ativo e que ocorre tanto em situações fisiológicas quando em
situações patológicas (MAFALDA, CAMARGO, SCHOR, 1999).
O processo de apoptose, também conhecida como morte celular programada, apresenta
as seguintes características morfológicas: encolhimento do citoplasma, condensação da
cromatina no núcleo, a exposição de fosfatidilserina, dobramento da membrana plasmática
(blebs) e desintegração da célula em pequenos fragmentos (corpos apoptóticos), sendo
fagocitados por macrofagos (LIU, CHENG, CAO, 2011), assim demonstrado na figura 6.

10
Figura 6: Caractetisciticas morfmologicas de apoptose e necrose (GRIVICICH, 2007).

A ativação dessa via pode ocorrer através de estímulos externos (por via de receptores
– ligante Fas, Fator de Necrose Tumoral - FNT) ou internos (tais como lesão do DNA,
estresse intracelular que altera o ciclo celular ou que pertuba as vias metabólicas).
O processo de morte celular por apoptose apresenta duas vias para a sua ativação: via
intrínsica e via extrínsica. A via extrínsica é caracterizada pela ligação de um “ligante de
morte” a um receptor, que desencadeia a apoptose, denominado “receptor de morte”. Essa
ligação leva a formação de um complexo denominado DISC (death-inducing signalling
complex), ativando uma cadeia iniciadora de caspases.
Essa via, portanto, necessita da ativação de receptores. Esses receptores fazem parte de
uma grande família denominada Fatores de Necrose Tumoral (TNF- tumor necrosis factor)
que inclui os seguintes membros: TNF, Ligante Fas/APO1/CD95, TRAIL - TNF-related
apoptosis-inducing ligant (TISCHNER et al., 2010).
Ambas as vias culminam na ativação de caspases (proteases) levando a morte celular
por apoptose, assim descrita na figura 7. (PAROLIN, REASON, 2001).

11
Figura 7: Indução da apoptose pela via de receptores da morte e por disfunção mitocondrial. (PAROLIN,
REASON, 2001)

A via intrínsica se dá através de inúmeros estímulos tais como: lesão do material


genético, estresse ocosionado no retículo endoplasmático, diminuição de citoquinas, ativação
de receptores de antígenos, levando a abertura de poros da membrana mitocondrial
(TISCHNER et al., 2010).
O aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial (MOMP – mitochondrial
outer membrane permeabilization) a translocação para o citosol de uma proteína pro-
apoptótica denominada de citocromo-c, que se liga a uma molécula adaptadora (Apaf-1/Faa-
1), onde esse complexo ativará a proteína caspase 9 (PAROLIN, REASON, 2001).

1.4.2 Necrose

Este processo de morte celular é sempre de cunho patológico que resulta na perda
estrutura e funcional, onde a sua principal característica é o extravasamento das organelas

12
intracelulares, devido a um rompimento da membrana celular, levando a um desencadeamento
de um processo inflamatório local (MAFALDA, CAMARGO, SCHOR, 1999)
A opção da celular por optar pelo processo apoptótico ou pelo processo necrótico é a
existência de ATP (adenosina tri-fosfato), pois a apoptose é um mecanismo ativo e,
conseguentemente, necessita de energia para desencadeá-la; diferentemente da necrose que é
um processo passive (PAROLIN, REASON, 2001).

1.5 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Antioxidantes são substâncias que retardam a velocidade de oxidação através de um


ou mais mecanismos, como inibição de radicais livres, complexação com metais, captura do
radical peroxila, captura de radical hidroxil, captura de radicais orgânicos e quantificação de
produtos gerados durante a peroxidação lipídica (ANTUNES, 2004).

1.5.1 Estresse Oxidativo

Todas as células do organismo humano vivem sobre condições aeróbicas, sendo por
consequencia, expostas a uma grande quantidade de agentes oxidantes endógenos (produzidos
durante a cadeia respiratória, reações imunológicas, enzimas como a xantina oxidase e óxido
nítrico sintase) ou exógenos (radiação ionizante e não-ionizante; poluentes; gases tóxicos,
como o ozônio; drogas e toxinas) (BHOOSHAN PANDEY, SYED RIZVI, 2011)
O estresse oxidativo, segundo Park et al. (2011), é causado por Espécies Reativas de
Oxigênio (ERO), e que tem como principal consequência a rápida despolarização da
membrana mitocondrial interna, levando, dessa maneira, a um subsequente comprometimento
do processo de fosforilação oxidativa da célula acometida. As mitocôndrias danificadas pelo
estresse oxidativo produz ainda mais EROs, tais como o ânion superóxido (O2 -), peróxido de
hidrogênio (H2O2), levando dessa maneira a um comprometimento da viabilidade celular
(PARK, LEE, CHOI, 2011).
Sabe-se atualmente que além espécies oxidativas existem, também, espécies
nitrosativas que causam danos na parede mitocondrial, como por exemplo o óxido nítrico
(NO2-), cujo aumento, dessas espécies reativas de nitrogênio, é mediado por fatores de
transcrição, tais como interleucia 1 (IL1), TNF-alfa, AP-1 (ZISKOVEN et al., 2010).

13
O aumento dessas espécies reativas pode levar a processos inflamatórios, assim
como a processos apoptóticos devido a lesões passiveis de ocorrer ao material genético da
célula, assim descrito na figura 8.

Figura 8: Relação entre o aumento de EROs e ERNs com o desencadeamento de processos inflamatórios,
envelhecimento e apoptose.

Reconhece-se atualmente que agente citotoxicos (radiação ionizante, fármacos) , são


utilizados para o tratamento do câncer, não somente por causar injurias diretamente sobre as
células cancerosas, mas, também, por causar um estresse oxidativo levando a lesões no DNA
ou no citoesqueleto celular. Além disso, a aumento de ROS está diretamente interligada com a
regulação de uma proteína pró-apoptótica denominada p53 (BENHAR, ENGELBERG,
LEVITZKI, 2002).
Em um trabalho apresentado por Nicholas et al., mostra que o aumento de espécies
reativas de oxigênio leva a produção de fatores angiogênicos, como a IL-8 (interleucina-8) e o
VEGF (vascular endothelial growth factor, também conhecida como fator de crescimento
endotelial vascular). Assinalou, também, que tanto o estresse oxidativo quanto a hipoxia
podem ocasionar lesões celulares e aumentar os níveis de HIF-1 (hypoxia inducible factor-1),
sendo este responsável pelo aumento do fator VEGF. A figura 9 demonstra visualmente como
ocorre esse fenômeno (BROWN, BICKNELL, 2001).

14
Figura 9: Aumento de fatores angiogênicos ocasionados pelo aumento de espécies reativas de oxigênio.

1.6 Fatores de Transcrição


1.6.1 NFK-B

O fator de transcrição NFK-B, descoberto em 1986, é um fator nuclear (NF) que “uma
vez ativado por agentes como lipopolissacarídeos, possui a capacidade de ligar-se a uma
sequência de 10 pares de bases na região promotora do gene que codifica a cadeia leve K das
moléculas de anticorpo das células B (KB)” (GLEZER et al., 2000).
O NFK-B é um heterodímero que possui duas subunidades: p65 ou RelA e p50. Além
dessas subunidades também foram descritas outras subunidades de cadeia como a c-Rel, RelB
e p52. Podendo essas combinações ativar outros tipos de genes ou, ainda, bloquear a própria
transcrição do fator NFK-B (p50-RelA). As subunidades p50 e p52, são sintetizadas na forma
inativa denominadas p105 e p100, respectivamente (GLEZER et al., 2000).
A família NFK-B é formada, portanto, de vários fatores de trasncrição: RelA (p65),
RelB, c-Rel, NFK-B1 (p105-p50) e NFK-B (p100-p52). Este fator de transcrição é mantido na
forma inativa no citoplasma, através da ação de proteínas inibitórias denominadas IKB. A
família IKB é constituída por: IKBalfa, beta ou E. Esta proteína (NFK-B) está ligada a
respostas de estresse ocasionadas à célula, através de fatores como o fator de necrose tumoral-
alfa, componentes de bactérias (LPS), infecçao viral, glutamato (neurotransmissor), citocinas
(tnf e interleucina-1), entre outros (MELVIN, MUDIE, ROCHA, 2011) – Figura 10.

15
Figura 10: esquema diagramático dos estímulos que ativam as ações do NF-kB (flecha contínua) e fenômenos
nos quais a ativação do NF-kB está envolvida (flecha pontilhada). (Glezer et al., 2000).

1.6.2 Família Bcl

A família Bcl2 apresenta tanto proteínas pro-apoptóticas quanto proteínas anti-


apoptóticas que estão diretamente ligadas ao processo de morte celular por apoptose de uma
célula.
Essa família de proteínas apresenta dois grupos, membros pró-apoptóticos e anti-
apoptóticos. Os membros da família Bcl-2 anti-apoptótico (Bcl-2, Bcl-xl, Bcl-w, Mcl-1,
A1/Bfl-1), tem como característica a presença de mais de quatro domínios homólogos e se
localizam, principalmente, na membrana do reticulo endoplasmático ou da membrana externa
da mitocôndria. Os membros da família Bcl-2 pró-apoptótico são encontrados principalmente
no citoplasma celular e se dividem em dois subgrupos: as que apresentam três domínios
homólogos (Bax, Bak e Bok), denominado Bax/Bak-like proteins; e as que contêm apenas um
domínio homólogo (Bad, Bim, Bid, Bmf e Puma), denominado BH3-only proteins
(TISCHNER et al., 2010; HACHEM, GARTENHAUS, 2005).
O controle da permeabilidade da membrana mitocondrial é realizado, principalmente,
por essas proteínas, onde as proteínas com características pro-apoptoticas se ligam a
membrana mitocondrial externa se homogomerizando permitindo a saída de outras fatores

16
desencadeadores de apoptose SMAC e citocromo-c, apresentado na figura 11 (PLACZEK et
al., 2010).

Figura 11: Controle da permeabilidade mitocondrial realizada pelas proteínas da família Bcl-2.

Sabe-se que algumas proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2 e Bcl-x) são capazes de


bloquear a entrada no núcleo de perfurina e granzime - substâncias liberadas pelos linfócitos
T citotóxicos que promovem a ativação de caspases (PAROLIN, REASON, 2001).
Karberg et al., publicou em seu trabalho realizado com citocinas que há uma maior
expressão de proteína pro-apoptótica Bax em camundongos quando comparada com a
proteína Bak (KARLBERG et al., 2010)

17
1.7 p53/MDM2

O gene supressor tumoral p53 inicialmente foi classificado como oncogene. A proteína
p53(53kDa), codificada por esse gene, foi detectada pela primeira vez como um complexo
com o antígeno SV40 T em células transformadas SV40. A proteína p53 está implicada em
uma grande variedade de processos celulares tais como a parada do ciclo celular, senescência,
apoptose, reparo do DNA, autofagia e metabolismo. Liga especificamente ao DNA e regula a
transcrição de genes alvo como a p21, que bloqueia o ciclo celular e Bax, Puma e Noxa, que
conduz a morte celular por apoptose. Assim, a via p53, em resposta a um estresse oncogênico,
bloqueia o desenvolvimento tumoral desencadeando a apoptose ou senescência celular
(RUDDON, 2007; WIMAN, 2010).
A proteína p53 representa um alvo ideal para o desenho de compostos antitumorais,
isto porque o gene p53 sofre mutações em mais da metade dos tumores humanos. Os tumores
restantes, embora carreguem a p53 selvagem (não-mutada), possuem defeitos na via
apoptótica mediada pela p53. Na mesma linha, estudos revelaram que tratamentos por radio e
quimioterapia ativam a p53 e induzem a apoptose de células tumorais (WANG, 2003.).
Os níveis protéicos e de atividade de p53 são finamente regulados por MDM2 em
células normais. MDM2 (murine double minute 2) é uma proteína expressa ubiquamente e
desempenha um papel importante no desenvolvimento do tecido, enquanto p53 fornece um
mecanismo de vigilância antitumoral poderosa. A desregulação do equilíbrio MDM2/p53 leva
à transformação maligna das células. Por exemplo, a superexpressão de MDM2 fornece
células com uma vantagem de crescimento, promove a tumorigênese e está correlacionado
com um prognóstico clínico pior e má resposta à terapia do câncer (SHANGARY, 2009).
A inibição da interação p53-MDM2 com os compostos sintéticos deve promover tanto o
acumulo quanto ativação da proteína p53 com uma conseqüente morte, por apoptose, das
células tumorais. Inibidores da interação p53-MDM2 apresentam-se bem atrativos para o
desenvolvimento de novos compostos antitumorais (CHÈNE, 2004). Esta abordagem tem
gerado um número considerável de potenciais agentes terapêuticos (nutlins, benzodiazepinos,
reativação da p53 e indução das células tumorais por apoptose [reactivation of p53 and
induction of tumour cell apoptosis – RITA], oxindol e quinolinol) que atuam interferindo na
interação p53-MDM2. Entretanto, a eficácia destes tratamentos em humanos ainda deve ser
determinada (DESILET, 2010). Entre os potenciais compostos antitumorais citados, os nutlins

18
têm recebido bastante atenção dos pesquisadores por sua potente e específica atividade
inibitória da interação p53-MDM2.

1.8 Sobre os Nutlins

Em 2004, Vassilev e companheiros de trabalho, descreveram uma nova classe de


antagonistas que inibiam a interação entre as proteínas MDM2 e p53. Estes análogos, que
apresentam em comum o grupo cis-imidazolina tetrasubstituído, foram denominados Nutlins
(O. COSTA, 2005).
Os Nutlins são sintetizados como uma mistura racêmica, onde cada enantiômero pode
ser separado através de coluna quiral. Como exemplo, podemos citar o Nutlin-3,
arbitrariamente denominado enantiômero-a, uma afinidade de ligação 150 vezes maior
quando comparado seu enantiômero-b (VASSILEV et al., 2004).
Como já citado acima, os Nutlins (1, 2 e 3) são análogos cis-imidazoline que possuem a
capacidade de deslocar a proteína p53 recombinante do seu complexo MDM2 com valores de
IC50 que variam na faixa de 100 a 300 nM (VASSILEV et al., 2004; SHANGARYET,
2009).
Através de estudos de modelamento computacional foi possível o desenvolvimento do
nutlins. Teoricamente, os nutlins devem se ligar ao domínio hidrofóbico do MDM2
deslocando a proteína p53. Análises cristalográficas da estrutura tridimensional possibilitaram
a verificação do modo como os nutlins se ligam com a MDM2. Eles mimetizam a região de
ligação helicoidal da p53, interagindo com a fenda hidrofóbica do MDM2. Neste mesmo
estudo foi verificado que os compostos nutlins são capazes de bloquear a ligação do MDM2
com a p53 conduzindo, assim, à apoptose e inibição do crescimento de xenotransplantes
tumorais humanos em camundongos nude (VASSILEV et al., 2004; SHANGARYET., 2009).

19
Atualmente têm-se três análogos de Nutlins que estão representados na figura abaixo
(Figura 12).

Figura 12: Fórmula estrutural dos análogos de Nutlin (POPOWICZ, DOMLING, HOLAK, 2012)

Através da ligação dos Nutlins à proteína MDM2, a P53 ficará livre para o exercício
de suas atividades, de reparo celular e supressão tumoral. As regiões de ligação entre essas
duas proteínas estão representadas na figura abaixo (Figura 13), e ela se dá através de 3
resíduos de aminoácidos presentes na proteína P53, que são: fenilalanina (F19), triptofano
(T23), e leucina (L26) – (KUSSIE et al., 1996).

Figura 13: Região de ligação da proteína MDM2 à proteína p53.

O inibidor, Nutlin, mimetiza as regiões de interação da P53 à MDM2 através de 3


porções de sua estrutura: o bromo-fenil se liga mimetizando o resíduo de triptofano, o
segundo bromo-fenil se liga mimetizando o resíduo de leucina, e, por final, a cadeia lateral de
etil-éter se liga diretamente à MDM2 mimetizando o resíduo de fenila da P53 (VASSILEV et
al., 2004).
20
2 OBJETIVOS

21
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL

No âmbito de uma linha de pesquisa que visa a avaliação farmacológica e toxicológica de


novos candidatos a protótipos de fármacos antitumorais, descreveremos neste trabalho o a
avaliação farmacológica e toxicológica dos compostos LQFM030, LQFM031 e LQFM032,
desenhados a partir dos protótipos nutlin-1, nutlin-2 e nutlin-3.
Adicionalmente, também avaliamos os compostos LQFM004, LQFM005, LQFM028 e
LQFM029, inicialmente idealizados como candidatos a protótipos de fármacos antipsicóticos,
desenhados a partir do LASSBio579, dentro do contexto INCT-INOFAR

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Efetuar ensaios farmacológicos e toxicológicos dos compostos alvos frente às


seguintes proposições:

• Avaliar a citotoxicidade de todos os compostos de estudo frente à linhagem celulare


K-562, como forma de triagem para os testes a posteriori.
• Investigar o potencial indutor de apoptose dos candidatos com resultados mais
promissores citotóxicos protótipos sobre células K-562.
• Pesquisar o mecanismo de indução de apoptose celular dos protótipos com melhor
atividade citotóxica sobre as células K-562.
• Avaliar a sobrevida dos animais portadores de Tumor Ascítico de Erhlich, após
tratamento com o candidato a protótipo que apresentou a melhor atividade citotóxica
frente à linhagem tumoral K-562.
• Verificar a toxicidade oral aguda em dose única dos compostos que obtiveram uma
melhor atividade citotóxica.
• Realizar triagem de atividade antioxidante dos compostos que apresentaram um
melhor perfil citotóxico.

22
3 MATERIAL E MÉTODOS

23
Para um melhor entendimento por parte do leitor, a figura 14, representada a baixo,
apresenta os passos realizados e a sequência metodológica feita das avaliações toxicológicas e
farmacológicas dos compostos estudados.

10
Triagem citotóxica dos compostos LQFM004; 005; 028; 029;
030; 031 e 032, pelo método de Exclusão do Azul de Tripano
(24h)

20
Avaliação citotóxica dos compostos LQFM030 e LQFM029,
pelos métodos de Exclusão do Azul de Tripano e Redução do
MTT (24, 48 e 72h).

30 40
Avaliação da sobrevida dos Avaliação do Ciclo Celular e do
Animais portadores de TAE, após Mecanismo de Indução por
tratamento Apoptose, sobre as células K-
562, após tratamento

50 60
Avaliação da Toxicidade Aguda Avaliação a sobrevida dos
em Dose Única. Animais portadores de TAE

70 80
Avaliação da segurança pelo Ensaio Avaliação da Atividade
de Captura do Corante Vermelho Antioxidante, pelo método de
Neutro. DPPH e pelo sistema β-
caronteno/Ácido Linoléico

Figura 14: Fluxograma das avaliações toxicológicas e farmacológicas realizadas neste projeto.

24
Já a Figura 15 abaixo mostra, de maneira mais refinada e minuciosa, todos os testes
realizados para a avaliação toxicológica e farmacológica dos candidatos a protótipos avaliados
neste trabalho.

Viabilidade pelo Ensaio de Exclusão do Azul


Avaliação de Tripano
Da
Citotoxicidade Viabilidade pelo Ensaio de Redução do MTT
Avaliação da Sobrevida dos Animais
portadores de TAE
Ciclo Celular

Ros/Rodamina
Citometria
De Citocromo-c
Fluxo
Bax/Bcl-2

TNF/ NFκβ

Captura do Corante Vermelho Neutro


Ensaios
De Toxicidade Aguda em Dose Única
Segurança
Estudo Histopatológico

Avaliação da capacidade de reação com 2,2-


difenil-1-picril-hidrazil (DPPH)
Avaliação da Avaliação pelo sistema β-caroteno/Ácido
Atividade Linoléico
Antioxidante
Eletroquímica

25
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 COMPOSTOS ESTUDADOS

Visando os objetivos iniciais de planejamento e avaliação farmacológica de novos


candidatos a protótipos de fármacos antitumorais LQFM030, LQFM031 e LQFM032,
desenhados a partir dos protótipos nutlin-1, nutlin-2 e nutlin-3 e a avaliação dos compostos
LQFM004, LQFM005, LQFM028 e LQFM029, inicialmente idealizados como candidatos a
protótipos de fármacos antipsicóticos, desenhados a partir do LASSBio579, esses compostos
estudados foram cedidos pelo Laboratório de Química Farmacêutica Medicinal (LQFM) da
Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás (UFG); coordenado pelo Prof. Dr.
Ricardo Menegatti.

3.2 ENSAIOS PARA AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE


3.2.1 Ensaios de Citotoxicidade

3.2.1.1 Ensaio de viabilidade celular pelo método de Exclusão do Azul de


Tripano
3.2.1.1.1 Conceito
. O princípio do método de Exclusão do Azul de Tripano consiste em se avaliar a
viabilidade celular através da integridade da membrana, onde as células viáveis permanecem
translúcidas por excluírem esse corante supravital, e as células não viáveis, que apresentam
membrana danificada, absorvem esse corante adquirindo a coloração azul. A figura 16
representa a estrutura química do corante Azul de Tripano (Wikipedia -
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Trypan_blue.png).

Figura 16: Estrutura química do Azul de Tripan.

26
3.2.1.1.2 Descrição do Protocolo Experimental

Em uma placa de Elisa de 96 poços (TPP, Trasadingen, Suiça) foi-se adicionado 90 µl


por poço de suspensão celular na concentração de 1 x 106 células viáveis/ mL, contadas em
câmera de Neubauer, da linhagem tumoral K-562, e incubadas a 37 ºC em estufa úmida,
contendo CO2 a 5%, por 24, 48 e 72 horas, com os compostos a serem estudados, nas
concentrações de 1,56 a 0,012 mM/mL. Após os respectivos tempos de incubação, alicotas de
20 µl da suspenção celular de cada poço foi retirada e colocada em 180 µl de solução Azul de
Tripano (0,2%), para a contagem das células viáveis e não-viáveis em câmera de Neubauer,
assim como para a observação de qualquer alteração morfológica. A média da absorção das
células não-tratadas (controle) foi considerada como 100% de viabilidade celular.
O percentual de inibição celular, na presença dos compostos em estudo, foi calculado
da seguinte forma:
Equação 1:

Média do número de células viáveis dos poços tratados com cada concentração x 100
Média do número de células viáveis do controle com o meio

Para cada tempo de incubação (24, 48 e 72 horas) foi realizado dois experimentos
independentes (duplicata), e cada concentração do composto analisada foi feita em triplicata.
Os resultados de viabilidade obtidos foram plotados (GraphPad Prism 5.0), submetidos a uma
análise estatística (GraphPad InStat).

3.2.1.2 Ensaio de viabilidade celular pelo método de Redução do MTT

3.2.1.2.1 Conceito

Outro ensaio citotóxico utilizado para se avaliar a atividade dos candidatos a


protótipos foi o teste colorimétrico do MTT (3-4,5 Dimetiltiazol -2-il)2,5-Difenil Brometo de
Tetrazolium).

27
O MTT é um sal amarelo solúvel, metabolizado pela enzima succinato desidrogenase
presente na mitocôndria, transformando-se em um produto azul insolúvel (formazan), sendo
que a quantidade de formazan produzido a partir de uma concentração fixa de MTT é
proporcional ao número de células viáveis (Figura 17). A intensidade de coloração, que é
determinada espectroscopicamente, é utilizada para medir a integridade da mitocôndria e,
consequentemente, a viabilidade celular.

Figura 17: Formação do composto Formazan a partir do MTT, pela ação da enzima succinil desidrogenase.

3.2.1.2.2 Descrição do Protocolo Experimental

Em uma placa de Elisa de 96 poços (TPP, Trasadingen, Suiça) foi-se adicionado 90 µl


por poço de suspensão celular na concentração de 1 x 106 células viáveis/ mL da linhagem
leucêmica K-562, à 10% de soro fetal bovino, em meio RPMI, e incubadas com 10 µl de
diferentes concentrações (1,56 - 0,012 mM/mL) de cada composto. Após o tempo de
incubação de 24 h, 48 h e 72 horas em estufa úmida a 37º C, com 5% de CO2, cada poço
recebeu 10 µl de MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), a 5 mg/mL, e a placa foi
novamente incubada por mais quatro horas. Em seguida, centrifugou-se a placa de Elisa a 800
rpm por 10 minutos, fazendo com o cristais de formazan se precipitassem e o sobrenadante
fosse retirado cuidadosamente. Adicionou-se, então, 100 µl de dimetisulfóxido (DMSO)
(VETEC,RJ, BRASIL) para a solubilização dos cristais formazan. A placa de Elisa foi
cuidadosamente homogeneizada e a intensidade de coloração foi quantificada
espectroscopicamente por meio de um leitor de Elisa (STAT FAX 2100, Awareness
Technology, Dusseldorf, Germany) em um comprimento de onda de 545 nm. A média da

28
absorção das células não tratadas (controle) foi considerada como 100% de viabilidade
celular.

A porcentagem de viabilidade celular foi determinada a partir da seguinte fórmula:


Equação 2:

% Viabilidade celular = [(MDOCélulas tratadas – MDOBranco)] x100


[(MDOControle – MDOBranco)]

Onde: MDOCélulas tratadas = Média da Densidade Óptica de cada concentração da


do composto teste
MDOBranco = Média da Densidade Óptica do Branco
MDOControle = Média da Densidade Óptica do Controle

Cada tempo de incubação (24, 48 e 72 horas), em placa de Elisa, foi realizado em


duplicata, e para cada concentração do composto testado foi feita em triplicata. Os resultados
de viabilidade obtidos foram plotados e submetidos a uma análise estatística (Graphpad Prism
5.0).

3.2.1.3 Ensaio de Sobrevida de Animais Portadores de TAE


3.2.1.3.1 Animais

3.2.1.3.1.1.1 Descrição dos animais

Para o ensaio de Sobrevida de Animais Portadores de Tumor Ascítico de Erhlich


(TAE) foram utilizados camundongos Swiss albinos (Mus musculus), fêmeas e saudáveis,
com aproximadamente 30 g de peso corpóreo, doados pelo biotério de criação da Indústria
Química de Goiás (IQUEGO). Todos os animais foram utilizados em conformidade com as
normas e procedimentos éticos relativos ao uso de animais de laboratório do Hospital das
Clínicas da Universidade Federal de Goiás (HC), protocolo 137/2009.

29
3.2.1.3.1.1.2 Alojamento e manejo dos animais

Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno, com ração balanceada para


roedores (Purina - marca) e água fornecidas ad alibitum, sendo que a iluminação da sala foi
mantida em um ciclo claro/escuro de 12 h, a fase clara iniciada às 7:00 horas. Durante todo o
experimento os animais permaneceram em sala com umidade e temperatura controladas
(umidade relativa de 65 a 70% e temperatura de 23 ± 2 ºC). Os camundongos foram mantidos
nessas condições por um período de adaptação de no mínimo 7 dias antes do inicio de cada
ensaio (aclimatação). A maravalha e as caixas utilizadas durante todo o período experimental
foram autoclavadas para um maior controle microbiológico dos mesmos. Os animais foram
mantidos no Biotério da Faculdade de Farmácia da UFG.

3.3 TUMOR ASCÍTICO DE EHRLICH (TAE)

O Tumor Ascítico de Ehrlich foi descrito pela primeira vez em 1905 pelos pesquisadores
Ehrlich e Apollant, como um adenocarcinoma de mama (Mota, 2010). Pode se desenvolver na
forma de tumor sólido ou ascítico, dependendo do local de inserção no animal. Cresce
rapidamente, apresentando dessa maneira um comportamento agressivo e indiferentemente
das linhagens de murinas (Mota, 2010; Matsuzaki, 2004; Nogueira 2008).

3.3.1 Manutenção das células do Tumor Ascítico de Ehrlich (TAE)

As células do TAE foram mantidas nas dependências do Laboratório de Farmacologia


e Toxicologia Celular da Faculdade de Farmácia da UFG. Estas células tumorais crescem de
forma ascítica na cavidade peritoneal dos camundongos e sua manutenção é feita por
passagens consecutivas entre animais, pela via intraperitoneal (IP).

3.3.2 Obtenção das células do Tumor Ascítico de Ehrlich (TAE)

Após a eutanásia, onde os camundongos foram anestesiados subcutaneamente com 10


mg/Kg de xilazina (Syntec, Cotia-SP, Brasil) e 100 mg/Kg de cetamina (Agener, Embu-
Guaçu-SP, Brasil), e constatada a ausência de reflexo de pata realizou-se o deslocamento

30
cervical e procedeu-se à coleta do fluido ascítico em uma seringa estéril. Coletou-se 1 mL do
líquido ascítico, sendo diluído em 10 mL de meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) e
centrifugado a 1500 rpm por 10 minutos, sendo então ressuspendido em 1 mL de RPMI. Após
essa etapa de centrifugação e ressuspenssão em 1 mL de RPMI , 20 ul desta suspensão foi
diluída em 180 µl de azul de Tripano (Vetec, RJ, Brasil) a 0,2% para contagem das células
viáveis, em câmara de Neubauer (Boeco, Hamburg, Germany) sob microscopia óptica. Para a
realização da curva de sobrevida realizou-se a diluição dessa solução com PBS (phosphate
buffer saline) estéril, a fim de se obter 2 x 106 células viáveis/mL.

3.4 CURVA DE SOBREVIDA

3.4.1 Conceito

A curva de sobrevida avalia o aumento da expectativa e/ou da qualidade de vida de um


grupo de animais tratados com uma substância teste e que estão inoculados com o TAE, frente
a um grupo de animais que não receberam nenhum tratamento e que também estão inoculados
com o TAE. Dessa maneira pode-se, também, avaliar a toxicidade dessa substância teste em
relação ao tumor inoculado.

3.4.2 Descrição do protocolo experimental

Os animais passaram por um período de aclimatação de sete dias antes do início do


experimento para a averiguação do comportamento, hábitos alimentares e fisiológicos e das
condições sanitárias.
Os animais eram adultos jovens (fêmeas nulíparas e não grávidas), com 8 a 10
semanas de idade e com média de peso de 30 g cada grupo, onde o peso de cada camundongo
não excedeu a 20% da média do grupo. Utilizou-se 4 grupos contendo 10 animais em cada.
Esses grupos foram subdivididos da seguinte forma:

 Grupo 1 - animais portadores de TAE e sem tratamento.

31
 Grupo 2 - animais portadores de TAE e tratados com o composto LQFM030 na dose
de 300 mg/kg/dia
 Grupo 3 - animais portadores de TAE e tratados com o composto LQFM 030 na dose
de 150 mg/kg/dia
 Grupo 4 - animais portadores de TAE e tratados com o composto LQFM 030 na dose
de 75 mg/kg/dia

Todos os animais foram tratados, pela via intraperitonial, com um volume de 0,2 mL de
suspensão celular de TAE em uma concentração de 2 x 106 células viáveis/mL, sendo que o
dia de inoculação do TAE é considerado como dia 0. O tratamento iniciou-se 24 horas após a
inoculação do tumor e os animais pertencentes a cada grupo receberam por via oral 0,2 mL
das suas respectivas doses durante 10 dias consecutivos. A avaliação da atividade antitumoral
in vivo foi determinada pelo aumento do tempo de sobrevida dos animais tratados quando
comparados com os animais portadores de TAE não-tratados.

3.5 CICLO CELULAR

A metodologia deste ensaio apresenta três etapas, onde a primeiramente foi feita uma
suspensão celular em uma concentração de 1 x 106 céls/mL e incubada em garrafa de 10 mL
(Greiner Bio-one Brasil) com o composto em uma concentração igual ao IC50 (550 nM)
encontrado no teste MTT por um período de 24 horas. Foi feito também o controle celular
para comparação dos resultados.
Na segunda etapa, após o período de incubação, as células foram centrifugadas a 1500
rpm por 10 minutos (Mettich Zentrifugen rotina 38R) e posteriormente lavadas por duas
vezes com 2 mL de PBS (phosphate buffered saline) normal gelado. Novamente as células
foram centrifugadas e o botão celular foi ressuspendido com 1 mL de solução fixadora (álcool
etílico a 70%) por gotejamento. Foi feita então a homogeneização do tubo por 1 minuto e em
seguida a incubação a -20° C overnight.
A terceira etapa consiste no tratamento com o marcador iodeto de propídeo (IP) (Sigma-
Aldrich, St. Louis, Mo), onde os tubos após serem retirados do freezer foram centrifugados a
1500 rpm por 10 minutos. Nos tubos não marcados o botão celular foi ressuspendido com 1
mL de PBS e para os tubos marcados, colocou-se 1 mL de solução fixadora [RNase a 200
µg/mL, IP a 50 µg/mL, PBS]. Os tubos foram então incubados a 20° C por 2 horas sob abrigo
da luz. Em seguida foi feita a leitura no citômetro de fluxo BD FACSCanto II system (Becton
32
Dickinson, San José, CA), através do software Diva. Foram selecionados 10000 eventos em
gate, fluxo intermediário e comprimento de onda 488nm.

3.6 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL INDUTOR DE APOPTOSE E DOS


MECANISMOS DE INDUÇÃO DE APOPTOSE

3.6.1
Ros (1)

Para realização desse ensaio, 1 x 106 células/mL foram incubadas com 0,55 mM da
substância teste por um período de 3, 6, 12 e 24 horas. Após esse período, as células foram
centrifugadas a 1500 rpm por 10 minutos. Descartado o sobrenadante, as células foram
ressuspendidas com PBS a 37° C, sendo novamente centrifugadas e com os tubos de
citometria identificados, foi colocado 1 mL da solução de diacetato diclorofluoresceína
(DCFH-DA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), diluído em PBS em uma concentração
igual a 10µM nos tubos marcados. Esses tubos foram então incubados por 1 hora a 37°C, sob
abrigo da luz. Novamente as células foram centrifugadas e lavadas com 1 mL de PBS a 37°C.
Após centrifugação, o botão celular foi ressuspendido com 400 µl de PBS a 37°C. Foi feita
então a leitura no citômetro de fluxo, com 10000 eventos selecionados em gate, com fluxo
médio a um comprimento de onda igual a 488 nm.

3.6.2
Rodamina (2)

Para o ensaio 1 x 106 células/mL foram testadas com 0,55mM da substância teste por
um período de 3, 6, 12 e 24 horas. Após esse período, as células foram centrifugadas e lavadas
com 1 mL de PBS a 37°C. Novamente centrifugadas, o botão celular foi ressuspendido com 1
mL de rodamina -123 (Rh-123) a 1µg/mL sendo, então, incubadas por 1 hora sob abrigo da
luz a 37°C. As células foram lavadas mais uma vez com 1 mL de PBS a 37°C, centrifugadas e
o botão celular, ressuspendido com 400µl de PBS a 37°C. Foi feita leitura no citômetro
usando uma gate de 10000 eventos, com fluxo médio e comprimento de onda de 488nm.

33
3.6.3 Bax, BCL-2 e Citocromo-c

Nesse ensaio 1 x 106céluas/mL foram incubadas com 0,55 mM da substância teste por
24 horas. As células foram centrifugadas e então lavadas duas vezes com PBS-BSA gelado.
250µl de solução de fixação e permeabilização foi colocada em todos os tubos de citometria e
incubado por mais 20 minutos a 20°C. Posteriormente as células foram lavadas com 2 mL de
PBS-T20 (PBS + 0,5% tween 20) e após descarte do sobrenadante, foi adicionado 50µl de
PBS-T20 em todos os tubos e 5µl do anticorpo Bax para investigação da expressão de Bax;
citocromo-c : para investigação da expressão do citocromo-c ou Bcl-2: para investigação da
expressão do Bcl-2] foi colocado nos tubos marcados. Os tubos foram incubados por 20
minutos sob abrigo da luz, em temperatura ambiente. Novamente as células foram lavadas por
duas vezes com PBS-T20 e o botão celular ressuspendido com 400µl de PBS-BSA. Foi feita
então leitura no citômetro usando gate de 10000 eventos, fluxo médio e comprimento de onda
488 nm para Bax, 488 nm para citocromo-c e 633 nm para Bcl-2.

3.6.4 TNF e NFKB

Nesse ensaio 1 x 106 células/mL foram incubadas por 24 horas com 0,55 mM da
substância teste. As células foram centrifugadas a 1500 rpm por 10 minutos e lavadas por
duas vezes com 2 mL de PBS-BSA gelado, em seguida foi adicionado 5 µl do anticorpo TNF-
R1nos tubos marcados e incubados por 20 minutos sob abrigo da luz, à temperatura ambiente.
Novamente as céluas foram lavadas com 2 mL de PBS-BSA gelado e centrifugadas. O botão
celular foi então, ressuspendido com 250µl de solução de permeabilização e fixação, ficando
incubadas por 20 minutos sob abrigo da luz à 20°C. Após esse período as células foram
centrifugadas e lavadas por duas vezes com 2 mL de PBS-T20. 50µl de PBS-T20 foi colocado
em todos os tubos e nos marcados foi adicionado ainda mais 5µl do anticorpo NFKapaβ,
sendo então, incubadas por mais 20 minutos sob abrigo da luz. Novamente as células foram
lavadaspor duas vezes com 2 mL de PBS-T20 e o botão celular ressuspendido com 400 µl de
PBS-BSA. Foi feita leitura em citômetro de fluxo, com gate de 10000 eventos, fluxo médio e
comprimento de onda de 488 nm.

34
3.7 ENSAIOS DE SEGURANÇA
3.7.1 Captura do Corante Vermelho Neutro

3.7.1.1 Conceito
O vermelho Neutro (3-amino-7-dimethylamino-2-methylphenazine hydrocloride) é um
corante vital que em pH fisiológico (pH 7,0) que passa facilmente através da membrana
plasmática e se concentra no interior dos lisossomos, portanto o objetivo desse teste é o de
avaliar a integridade lisossomal. (Borefreund e Puerner, 1984).

Figura 18: Estrutura química do corante Vermelho Neutro.

3.7.1.2 Descrição do protocolo experimental

O ensaio do Vermelho Neutro é dividido em três etapas que são: plaqueamento,


tratamento das células com o composto e exposição ao vermelho neutro.
Na primeira etapa (plaqueamento) adicionou-se, em uma placa de Elisa de 96 poços
(TPP, Trasadingen, Suiça) 100 µl por poço de suspensão celular (DMEN - Meio de cultura
denominado Dulbecco's Modified Eagle Medium - soro fetal bovino 10 %) em uma
concentração de 3,0 x 104 células viáveis/ mL da linhagem celular 3T3, e incubou-se por 24
horas em estufa úmida a 37º C, com 5% de CO2.
Após esse tempo de incubação, verte-se a placa de Elisa em um papel toalha estéril
para a retirada total volume presente em cada poço. Depois dessa etapa adiciona-se 50 µl de
DMEN e 50 µl das diferentes concentrações de cado composto (segunda etapa- tratamento
das células com o composto), de 1,56 a 0,22 mM. Novamente, incuba-se por 48 horas em
estufa úmida a 37º C, com 5% de CO2, e após esse período retira-se a solução dos poços
vertendo-se a placa de Elisa em papel toalha estéril e adicionando logo em seguida 250 µl da
solução Vermelho Neutro a 0,5% (terceira etapa – exposição ao vermelho neutro). Aguarda-se
um período de 3 horas e retira-se, novamente, o conteúdo presente nos poços da placa de

35
Elisa. Após essas etapas, lavam-se os poços com 250 µl de PBS estéril e verte-se a placa de
Elisa em papel toalha estéril para a adição da seguinte solução reveladora: (ácido acético –
1%; etanol – 50%; água deionizada – 49%).
A placa de Elisa foi cuidadosamente homogeneizada e a intensidade de coloração foi
quantificada espectroscopicamente por meio de um leitor de Elisa (STAT FAX 2100,
Awareness Technology, Dusseldorf, Germany) em um comprimento de onda de 545 nm. A
média da absorção das células não-tratadas (controle) foi considerada como 100% de
viabilidade celular. O cálculo da viabilidade celular foi a mesma utilizada para o ensaio de
redução do MTT.
Para cada candidato a protótipo foi realizado em duplicata, e para cada concentração do
composto testada foi feita em triplicata. Os resultados obtidos foram submetidos a uma
análise estatística e apresentados em gráficos.

3.7.2 Teste de Toxicidade aguda dose única – teste de classe (OECD


423)

3.7.2.1 Descrição do protocolo experimental


Os animais passaram por um período de aclimatação de sete dias antes do início do
experimento para a averiguação do comportamento, hábitos alimentares e fisiológicos e das
condições sanitárias.Os animais eram adultos jovens (fêmeas nulíparas e não grávidas), com
8 a 10 semanas de idade e com média de peso de 30 g cada grupo, onde o peso de cada
camundongo não excedeu a 20% da média do grupo. Os animais foram privados da
alimentação por duas horas antes do início do experimento e por mais duas horas após a
administração, por via oral, das substâncias teste. A água foi oferecida ad libitum até o
termino dos experimentos.
O teste de toxicidade oral aguda foi realizado segundo o protocolo experimental
Guideline 423 (OECD 423) – representado pela figura 19 - e seguindo a proposta da
Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório/Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA) e por Frajblat (2006), que elucidam as normas de cuidados
com os animais de laboratório, biossegurança e bem estar dos mesmos. A figura 7 mostra que
ao se iniciar o tratamento dos animais com a dose de 300 mg/kg, este grupo deverá conter 3
animais; no caso da morte de nenhum ou de apenas um animal o experimento com a dose de
300 mg/kg deve ser repetida e se confirmada a resposta anterior o composto é classificado na
sua respectiva categoria segundo a GHS; agora se ocorrer a morte de 2 ou 3 animais após a
36
administração da dose de 300 mg/kg deve-se mudar diminuir a dose do composto
administrado, indo para a dose de 50 mg/kg. O veículo utilizado para a administração foi o
óleo de girassol comercial.

Figura 19: Fluxograma representando a metodologia seguida para o ensaio de toxicidade aguda em dose única, a
partir da dose de 300 mg/kg.

3.7.3 Observação dos sinais de toxicidade (Screening Hipocrático)

Para a realização das observações sistemática das alterações comportamentais nos


animais utilizados para a avaliação dos candidatos a protótipos foi-se utilizado o “screening”
hipocrático, onde observou-se os seguintes critérios comportamentais: atividade geral,
motilidade, frequência cardíaca , piloereção, exoftalmia, lamber patas, hipnose, coçar focinho,
morder cauda, convulsão clônica/tônica, tremores finos/grosseiros, sialorréia, ereção da cauda
(straub), tremor da cauda, sedação, catatonia, analgesia, anestesia, perda do reflexo corneano,
37
diâmetro pupilar, lacrimação, ataxia, para a orelha observou-se a palidez, cianose, hiperemia e
para a urina obsevou-se se estava aumentada, diminuída e a coloração, além de outros efeitos
como aumento da defecação, diarréia, contorção, reação a fuga, agressividade e granidos
(frênito vocal), aperto da cauda, força para agarrar, hipotermia e morte.
As observações foram realizadas em diferentes períodos durante o dia, após a
administração das compostos, que foi de 5 min, 10 min, 20 min, 30 min e 60 min; 2 h, 4 h, 6
h, 12 h e 24 h e a partir de então, diariamente, até o décimo dia.
A intensidade das alterações comportamentais foram semi-quantificadas de zero a
quatro, correspondendo respectivamente a ausente, raro, pouco, moderado e intenso de acordo
como modelo proposto por Malone e Robichaud 1962. É importante observar que certas
atividades são consideradas basais nos animais, portanto para essas atividades foi considerado
um valor correspondente de atividade.
No décimo quarto dia todos os animais foram anestesiados e seguindo o protocolo da
Cornell University/Cornell Center for Animal Resources and Education (Flecknell, 1996;
Kohn, et al.; 1997) e submetidos à eutanásia por deslocamento cervical.
Logo após a eutanásia foi-se realizada a necropsia de cada animal e fez-se a avaliação
geral dos órgão, sendo retirado o coração, fígado, pulmão, baço e rins para análise
macroscópica e observando-se qualquer alteração visual dos mesmo realizou-se o estudo
histopatológico.

3.7.4 Estudo histopatológico

Após a eutanásia dos animais os órgãos (coração, fígado, pulmão, baço, rins e
estômago) foram extirpado e colocados em formaldeído 10% tamponado, para análise
macroscópica e observando-se qualquer alteração visual dos mesmo realizou-se o estudo
histopatológico (OECD 423).
Os órgãos extirpados foram seccionados para processamento histopatológico
automático (Histotécnico AMA – DM20): desidratação crescente com séries de álcool (70-
100%), diafanização crescente em xilol – processo este chamado de diafanização,
impregnação e inclusão em parafina. Após estes procedimentos cada bloco de inclusão foi
seccionado, em micrótomo convencional (Leica), em uma espessura de 3,0 µm e
subsequentemente submetidos ao processo de coloração tradicional hematoxilina-eosina e
examinados em microscópio óptico (Zens – Scope A) para a obtenção das imagens
38
histopatológicas. Este ensaio foi realizado em colaboração da Profa. Dra. Aline Carvalho
Batista da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Goiás.

3.7.5 Avaliação dos índices dos órgãos

Como já citado acima, logo após a eutanásia foi-se realizada a necropsia de cada
animal e fez-se, além do estudo histopatológico, a avaliação do índice de dois órgãos: fígado e
baço. O índice de órgãos foi calculado seguindo a seguinte fórmula:

Equação 3:
Índice = Peso do órgão (g)
Peso do animal (g)

3.7.6 Avaliação da atividade antioxidante

3.7.6.1 Conceito
O método DPPH baseia-se na redução e descoloração do radical 2,2-difenil-1-picril-
hidrazil (DPPH•) através da doação de um átomo de hidrogênio pelo polifenol à composto do
radical. Para essa análise utiliza-se uma solução alcoólica do radical DPPH•, que absorve no
comprimento de onda próximo de 517 nm, e à medida que seu elétron deixa de ser
desemparelhado a absorção decresce devido à mudança de coloração, passando a ser
amarelada, frente à composto antioxidante testada.

3.7.6.2 Descrição do protocolo experimental

O método fotocolorimétrico foi realizado em duplicata, com o radical livre estável


DPPH na concentração inicial de 0,3 mM, em etanol. A amostra foi diluída em duplicata ,
com concentrações variando 1,56 à 0,02 mM em etanol. Para a realização do teste, 1 mL da
solução de DPPH• 0,3 mM foi adicionada a 2,5 mL de cada concentração das amostras
testadas.
Para os brancos, adicionou-se 1 mL de etanol, ao invés do DPPH• , em cada
concentração da amostra. O controle é preparado com 1 mL de DPPH• e 2,5 mL de etanol. As
reações transcorreram à temperatura ambiente (em torno de 25 ºC) por 30 minutos, ao abrigo
da luz. Depois de transcorrido esse intervalo de tempo, foram feitas as leituras, em
espectrofotômetro de UV, no comprimento de onda de 517 nm. Como padrão desse ensaio foi
39
utilizado como antioxidante de referência o ácido ascórbico, nas mesmas concentrações do
compostos LQFM030.

3.7.6.3 Determinação da Concentração Efetiva 50 %

A concentração efetiva 50% (CE50) é um parâmetro numérico que fornece a


concentração mínima necessária para o antioxidante reduzir em 50% o radical DPPH da
reação, sendo utilizada para expressar a atividade antioxidante. Foi-se utilizado o programa
“Excell 2007” para se determinar o CE50 , através da relação entre os valores de AA%
(porcentagem de atividade antioxidante) e as concentrações de cada amostra, em que o CE50
foi obtido por regressão linear dos pontos plotados graficamente.
Para a determinação do AA%, onde cada amostra foi lida em triplicata, foi utilizada a
seguinte fórmula:
Equação 4:
AA% = 100 – {[(ABSA - ABSB) x 100] / ABSC}
Onde: AA% = Atividade antioxidante percentual;
ABSA = Absorbância da amostra (Extrato + DPPH);
ABSB = Absorbância do branco da amostra (Extrato + Etanol);
ABSC = Absorbância do controle (DPPH + Etanol).

A atividade antioxidante foi expressa como porcentual de inibição da oxidação,


calculada em relação a 100% da oxidação do controle (sem antioxidante). Os resultados foram
expressos em CE50 +/- DP e foram organizados e apresentados da forma de gráfico e tabelas.

3.7.7 Avaliação da atividade antioxidante pelo sistema β-caroteno/Ácido


Linoléico

3.7.7.1 Conceito

Este ensaio espectrofotométrico avalia a atividade de inibição de radicais livres


gerados durante a peroxidação do ácido linoléico. O método está fundamentado na oxidação,
ou seja, na descoloração do β-caroteno induzida pelos produtos radicalares do ácido linoléico.
O sistema modelo ao ser submetido às condições de oxidação gera radicais livres, a partir da
oxidação do ácido linoléico que irá abstrair o hidrogênio do composto insaturada do β-
caroteno, como resultado desse ataque o sistema perde a sua coloração alaranjada
40
característica, sendo possível avaliar a atividade antioxidante pela mudança de coloração do
sistema.

3.7.7.2 Descrição do protocolo experimental

A amostra foi diluída em duplicata, com concentrações variando 200 a 12,5 µg/mL.
De cada solução-teste retirou-se um volume de 0,4 mL de cada amostra com a sua respectiva
concentração e adicionou-se 5 mL da solução do sistema modelo (β-caroteno/ácido linoléico)
em tubo de ensaio. Fez-se o mesmo com uma solução controle de Trolox, onde obteve-se as
mesmas concentrações da solução-teste. Todos os tubos de ensaio foram protegidos com
papel alumínio. Homogeneizou-se, em um agitador, todas as amostra ( composto teste e
Trolox) e colocou-se a posteriori esses tubos de ensaio em banho Maria a 40 ºC. Após 2
minutos e depois em intervalos de 15 minutos até completar o tempo de 120 minutos,
realizaram-se as leituras dessas amostras em espectrofotômetro de UV, no comprimento de
onda de 470 nm, sendo que o aparelho de leitura foi calibrado com água destilada.

Os resultados foram expressos em percentual de inibição de oxidação, seguindo a


seguinte fórmula:
Equação 5:
Redução da absorbância = ABSinicial – ABSfinal
Onde ABSinicial= abserção inicial da amostra
ABSfinal = absorção final da amostra

A percentagem de oxidação que se dá através do decréscimo da absorção da amostra e


do sistema, foi expressa da seguinte forma:

Equação 6:
% Oxidação = [(Redução Abs) amostra x 100]
(Redução Abs) sistema

41
Para se obter a % de proteção da amostra, utilizou-se a seguinte equação:
Equação 7:
% Proteção = 100 – (% Oxidação)

Verifica-se a ação antioxidante da amostra, comparando-a com a atividade antioxidante do


controle (Trolox).

3.8 PREPARO DAS SOLUÇÕES DO PROTOCOLO EXPERIMENTAL


3.8.1 Tratamento da Água Destilada

Preparou-se 500 mL de água destilada oxigenada. A oxigenação da água destilada foi


realizada acoplando-se bomba de vácuo ao Erlenmeyer contendo a água, em seguida
protegeu-se a boca do frasco com papel alumínio. A oxigenação da água foi realizada
durante um intervalo de tempo de 40 minutos.

3.8.2 Solução de β-caroteno (20 mg/mL)ácido linoléico

Em 1 mL de clorofórmio adicionou-se 20 mg do composto de β-caroteno.

3.8.3 Solução do controle de Trolox (0,2 mg/mL)

Em um tubo Falcon contendo 10 mL de álcool etílico adicionou-se 2 mg de Trolox,


homogeneizar e protegê-lo com papel alumínio. Esta solução é extemporânea, deve ser
preparada imediatamente antes do uso.

3.8.4 Solução de β-caroteno/ácido linoléico

Em um Erlenmeyer, adicionou-se 40 µl de ácido linoléico, 530 µl de Tween 40, 50 µl


da solução β-caroteno, e para solubilizar adicionou-se 1 mL de clorofórmio e após a
homogeneização retirar o clorofórmio evaporando-o. Em seguida, adiciona-se um volume
correspondente de água tratada com oxigênio até chegar em uma absorção entre 0,6 nm e
0,7 nm, em um comprimento de onda de 470 nm.

42
3.9 ELETROQUÍMICA

Todas as análises de voltametria cíclica foram realizadas no Laboratório de Análise


Farmacêutica e Ambiental, da Faculdade de Farmácia (UFG) em um
potenciostato/galvanostato μAutolab III, integrado ao software GPES 4.9 e a uma célula
eletroquímica de três eletrodos. Foram utilizados um eletrodo de carbono vítreo (eletrodo de
trabalho), um eletrodo de calomelano saturado (eletrodo de referência) e um eletrodo de
platina (eletrodo auxiliar). Como eletrólito suporte, foi utilizada solução de KCl (0,1 molL-1,
pH 7,0, temperatura ambiente). A faixa de varredura selecionada foi de -0,25 à 1,2 V, em uma
velocidade de varredura de 100 mVs-1.
Os voltamogramas do branco (10 mL de eletrólito suporte) e da amostra (10 mL
eletrólito suporte contendo ainda 100 µl da solução estoque) foram registrados e tratados no
software Origin 8.0. Este ensaio foi realizado em colaboração do Prof. Dr. Éric de Sousa Gil
da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás.

3.10 Estatística

Os dados foram expressos como médias ± erro padrão das médias. As diferenças entre
dois grupos foram detectadas pelo teste t de Student e entre três ou mais grupos pela análise
de variância (ANOVA), seguida do teste de Tϋkey. As diferenças foram consideradas
significativas quando P < 0,05 (Sokal e Rohlf, 1981).

43
4 RESULTADOS

44
4 RESULTADOS
4.1 AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE
4.1.1 Ensaio de viabilidade celular por Azul de Tripano

A atividade citotóxica dos compostos LQFM030, LQFM031 e LQFM032 (1,56 -


0,012 mM), os quais desenhados a partir dos protótipos nutlin-1, nutlin-2 e nutlin-3, foi
avaliada por meio do teste de viabilidade celular de Exclusão do Azul de Tripano, em as
células leucêmicas K-562, em 24h de exposição como forma de triagem para seleção das
compostos mais ativas e os estudos de mecanismos subsequentes. Os dados são apresentados
na Figura 20. Conforme apresentado, todos os compostos investigados demonstraram
atividade citotóxica sobre a linhagem leucêmica K-562. O composto LQFM 030 demonstrou
a maior atividade citotóxica com uma concentração inibitória de 0,55mM. O protótipo LQFM
031 apresentou citotoxicidade de 1,17mM. Já o composto LQFM 032 apresentou baixa
citotoxicidade, não sendo possível determinar o IC50.

45
20A 20B

Viabilidade celular (%) 100

Compostos IC50 24H (mM)


75 LQFM 030
LQFM 030 0,55
LQFM 031 LQFM 031 1,17
LQFM 032 *
50
LQFM 032
*Não apresentou valor de IC50 frente às condições realizadas.

25

0
0.01 0.1 1 10
Concentração mM

Figura 20: Viabilidade celular da linhagem tumoral K-562 após 24h de incubação em diferentes concentrações (1,568 – 0,012 mM) de exposição dos compostos LQFM030,
031 e LQFM 032. A figura 20A representa o perfil citotóxico, pelo teste de exclusão do Azul de Tripan o, das compostos LQFM030, 031 e LQFM 032 frente às células K-
562, onde cada ponto representa a média e o ± desvio padrão de uma concentração realizada em triplicata e cada experimento realizado em duplicata. Já a figura 20B
representa os valores de inibição celular de 50% da linhagem leucêmica K-562 (IC50 24h).

46
Para a avaliação citotóxica dos compostos LQFM004, LQFM005, LQFM028 e
LQFM029, inicialmente idealizados como candidatos a protótipos de fármacos antipsicóticos,
realizou-se uma triagem dos referentes compostos frente à linhagem leucêmica K-562, após
exposição de 24h, nas concentrações de 1,56 - 0,02 mM. Os dados dessa triagem foram
apresentados na figura 21. A investigação do potencial citotóxico dos compostos LQFM004,
005, 028 e 029 sobre as células K-562, pelo método de azul de tripano, em 24h de exposição,
que está apresentada na figura 21, demonstra que o composto que apresentou o menor valor
de IC50 foi a LQFM029 (0,567). Os demais compostos, LQFM004 e 005 apresentaram valores
de IC50 de 0,724 e 1,29, respectivamente. Para o composto LQFM028 não foi possível
determinar o IC 50.

47
21A 21B

100
Viabilidade celular (%)

75 LQFM 004 Compostos IC50 24H (mM)


LQFM 004 0,724
LQFM 005 LQFM 005 1,29
50 LQFM 028 *
LQFM 028 LQFM 029 0,567
*Não apresentou valor de IC50 frente às
LQFM 029 condições realizadas
25

0
0.01 0.1 1 10
Concentração mM

Figura 21: Viabilidade celular da linhagem tumoral K-562 após 24h de incubação em diferentes concentrações (1,568 – 0,012 mM) de exposição dos compostos LQFM004,
005, 028 e LQFM029. A figura 21A representa o perfil citotóxico, pelo teste de Exclusão do Azul de Tripano, das compostos LQFM004, 005, 028 e LQFM029 frente às
células K-562, onde cada ponto representa a média e o ± desvio padrão de uma concentração realizada em triplicata e cada experimento realizado em duplicata. Já a figura
21B representa os valores de inibição celular de 50% da linhagem leucêmica K-562 (IC50 24h).

48
Diante destes dados de triagem citotóxica, os compostos LQFM029 e LQFM030
foram escolhidas para os estudos a posteriori, visando um estudo de mecanismos de morte
celular e segurança.

4.1.2 Citotoxicidade dos candidatos a protótipos LQFM029 e LQFM030

Para melhor caracterizar a capacidade citototóxica das compostos LQFM029 e


LQFM030 foram realizados dois tipos de ensaios: teste de Exclusão do Azul de Tripano, para
confirmação dos dados, e o ensaio de redução do MTT, frente a linhagem leucêmica K-562
nos intervalos de tempo de tratamento de 24, 48 e 72h. A figura 22 representa os resultados do
teste de exclusão do Azul de Tripano e a figura 23 os resultados do ensaio de redução do
MTT, desses respectivos compostos.
Para o teste de Exclusão do Azul de Tripano, os valores de IC50 encontrados para o
composto LQFM030 foram 0,55; 0,112; 0,049 mM para os intervalos de tempo de 24, 48 e
72h, respectivamente. Já para o composto LQFM029, os valores de IC50 foram 0,567; 0,229
e 0,0575 mM nos intervalos de tempo de 24, 48 e 72h, respectivamente.
No teste de Redução do MTT os valores de IC50 encontrados para o composto
LQFM029 foi de 0,567; 0,229 e 0,057 mM para os intervalos de tempo de 24, 48 e 72h,
respectivamente. Para o composto LQFM030 os valores de IC50 encontrados foi de 0,55;
0,112 e 0,049 para os mesmo intervalos de tempo descritos para o composto anterior.
Perante os dados apresentados pela figura 22, pode-se observar que o candidato a
protótipo 030 apresentou um melhor perfil citotóxico, no teste de exclusão do Azul de
Tripano, para as células K-562, nos intervalos de tempo 24, 48 e 72h, quando comparado com
o composto LQFM 029. O mesmo ocorreu quando se avaliou a citotoxicidade no teste de
MTT, frente à linhagem leucêmica K-562, representada pela figura 23.
Tendo em vista que o composto LQFM030 demonstrou um melhor perfil citotóxico,
esto composto foi eleita para estudos de curva de sobrevida, mecanismos de morte celular,
avaliação de atividade antitumoral in vivo e avaliação da atividade antioxidante. Além disso,
estes dados também justificaram o estudo inicial de avaliação de segurança desto composto.
Para os estudos de mecanismos de morte celular in vitro utilizamos o valor do IC50 do teste
de Exclusão do Azul de Tripano, no intervalo de tempo de 24h, que foi de 0,55mM.

49
22A 22B
150 150
24H 24H
125 48H 125 48H
Viabilidade Celular %

Viabilidade Celular %
100 72H 100 72H

75 75

50 50

25 25

0 0
0.01 0.1 1 10 0.01 0.1 1 10
Concentração mM Concentração mM

22C

composto IC50 24h (mM) IC50 48h (mM) IC50 72h (mM)
LQFM
029 0,567 0,229 0,0575
LQFM
030 0,55 0,112 0,049

Figura 22: Viabilidade de células da linhagem tumoral K-562 após 24, 48 e 72h de incubação em diferentes concentrações (1,568 – 0,012 mM) dos compostos LQFM029
(22A) e LQFM030 (22B). A atividade citotóxica foi avaliada pelo teste de Exclusão do Azul de Tripano, onde cada ponto representa a média e o ± desvio padrão de uma
concentração realizada em sexplicata e cada experimento realizado em duplicata. A figura 22C apresenta a inibição celular de 50% da linhagem tumoral K-562 (IC50 24h),
avaliada pelo Teste de Exclusão do Azul de Tripano, após 24, 48 e 72h de incubação em estufa a 37 ºC e 5% CO2, com as compostos LQFM029 e LQFM030.

50
23A 23B

150 150
24H 24H
125 48H 125 48H
Viabilidade Celular %

Viabilidade Celular %
100 72H 100 72H

75 75

50 50

25 25

0 0
0.01 0.1 1 10 0.01 0.1 1 10
Concentração mM Concentração mM

23C
8C
composto IC50 24h (mM) IC50 48h (mM) IC50 72h (mM)
LQFM 029 * 0,708 0,117
LQFM 030 0,0977 0,0741 0,0234

*Não apresentou valor de IC50 frente às condições realizadas

Figura 23: Viabilidade de células da linhagem tumoral K-562 após 24, 48 e 72h de incubação em diferentes concentrações (1,568 – 0,012 mM) dos compostos LQFM029
(23A) e LQFM030 (23B). A atividade citotóxica foi avaliada pelo ensaio de redução do MTT, onde cada ponto representa a cada ponto representa a média e o ± desvio
padrão de uma concentração realizada em sexplicata e cada experimento realizado em duplicata. A figura 23C apresenta a inibição celular de 50% da linhagem leucêmica K-
562 (IC50 24h), avaliada pelo ensaio de redução do MTT, após 24, 48 e 72h de incubação em estufa a 37 ºC e 5% CO 2, com as compostos LQFM029 e LQFM030.

51
4.1.3 Avaliação da Sobrevida dos Animais Portadores de Tumor Ascítico
de Ehrlich

Tendo em vista o importante efeito citotóxico observado do composto 030,


investigamos a sobrevida dos animais portadores de Tumor Ascítico de Ehrlich (TAE) e
tratados com 300, 150 ou 75 mg/kg do candidato LQFM030, por gavagem, durante 10 dias de
tratamento, apresentado na figura 24.
Nesta avaliação pôde-se observar que no grupo não-tratado os animais, após a
inoculação do TAE (1o dia do teste), iniciaram o processo de morte a partir do décimo quinto
dia (15o) e a última morte deste grupo ocorreu no 20o dia de observação. O grupo tratamento
com 150mg/kg do composto produziu um aumento de sobrevida de 25%. Já o tratamento com
75 e 300mg prolongou a sobrevida dos animais em 15%. Importante ressaltar que os animais
pertencentes ao grupo não-tratado morreram em um curto período de tempo, sendo que nos
180 e 190 dias ocorreram 6 mortes, do grupo com 10 animais, ao todo. Pode-se observar
também neste experimento que os grupos tratados com o candidato LQFM030 começaram a
morrer quando o grupo não-tratado estava sendo encerrado. É interessante destacar que os
animais tratados com 300 mg/kg apresentaram maior morbidade, o que pode estar associado a
efeito tóxico.
Os dados da sobrevida estão de acordo com a avaliação do peso corporal dos animais,
apresentados na figura 25A e 25B. O grupo não-tratado apresentou media de peso corpóreo de
42,0g enquanto que o tratamento com 75, 150 e 300 mg/kg, apresentou média de peso
corpóreo inferior ao grupo não-tratado e foi de 41,5; 38,0; 32,0 g, respectivamente. As figuras
6 ilustram que houve uma redução do volume corporal dos animais tratados, quando
comparados com o grupo controle. Esse dado visual, figura 25B, corrobora com os dados
apresentados na figura 24.

52
Controle
100 300mg/kg

Sobrevida (%)
150mg/kg
75
75mg/kg

50 P=0,0092

25

0
0 5 10 15 20 25 30
Dias

Figura 24: Efeito do composto LQFM030 na sobrevida dos animais portadores de Tumor Ascítico de Ehrlich (TAE). Os grupos tratados com o composto LQFM030 nas
doses de 75 150 e 300 mg/Kg, por gavagem, durante 10 dias de tratamento, receberam a primeira administração 24h após a inoculação com o tumor TAE na concentração de
2 x 106 células/ml. Em cada grupo (controle e tratado) havia 10 animais, onde foram observados diariamente até a morte do último animal (Curva Kaplan-Meier, Log-rank).
P<0,05 em relação ao grupo TAE.

53
25A 25B

50
** B.1 LQFM 030
40 *** p<0,001
Média do Peso (g)

*** **p<0,01
30

20

10

0
le

kg
kg

Kg
tro

g/
g/

g/
0m

m
on

0m

75
C

30

15

Dose (mg/Kg)

Figura 25: O elemento 25A apresenta a média e ± desvio padrão do peso corporal (g) do grupo controle e dos grupos tratados com o composto 030 nas concentrações de 75,
150 e 300 mg/Kg. Para a análise estatística fez-se o teste Anova e o pós-teste utilizado foi o Tukey. P<0,01 em relação ao grupo controle. O elemento 25B demonstra o peso
corporal dos animais tratados e não tratados portadores do Tumor Ascítico de Ehrlich (TAE), do teste de sobrevida. A imagem B.1 representa a dose de 75 mg/Kg; B.2 a dose
de 150 mg/Kg e a B.3 a dose de 300 mg/Kg.

54
4.2 CICLO CELULAR

Os efeitos do composto LQFM030 (0,55 mM) sobre o ciclo celular das células K-562,
após 24h de incubação, estão apresentados na figura 26. A análise do ciclo celular sobre a
linhagem leucêmica K-562, tratadas e não-tratadas com o candidato LQFM 030 demonstrou
uma diferença marcante nas proporções dos números de células nas diferentes fases do ciclo
celular. O tratamento com o composto LQFM030 reduziu em aproximadamente 7 vezes o
número de células em G0/G1, isto é, houve uma redução de 86% desta fase do ciclo, quando
comparado com o grupo não-tratado. Além disto, reduziu em 40,9% o número de células na
fase S e, por outro lado, aumentou em 73% o número de células na fase G2/M. Observou-se
também o aumento em 73,6% de células na fase sub-G1, após o tratamento com o composto
LQFM030, em um intervalo de tempo de 24h. Uma vez que na avaliação do ciclo observou-se
um indicativo de apoptose com o aumento de fase sub-G1. Frente a estes dados apresentados
investigaram-se alguns mecanismos de morte celular pelo mecanismo de apoptose.

55
60
*** Não Tratado
26A
Tratado

número de células
40
***p<0,001

20
*** ***

1
1

M
S
G
G

2/
0/
b-

G
G
Su
Controle Tratado
26B
Número de Células

Conteúdo de DNA

Figura 26: o elemento 26A apresenta a ação do composto LQFM030 (0,55 mM) na progressão do ciclo celular, representado pelo percentual de células na fase sub-G1, G1, S
e G2 quando comparado ao controle, em um intervalo de tempo de tratamento de 24h, frente às células K-562. Já a figura 26B apresenta um histograma demonstrando a
análise do ciclo celular em células K-562 após 24H de incubação com 0,55 mM do composto LQFM030. Utilizou-se o citômetro de fluxo para a determinação das fases do
ciclo celular e o programa FACSCanto II (BDBiosciences, CA, USA.

56
4.3 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL INDUTOR DE APOPTOSE E DOS
MECANISMOS DE INDUÇÃO DE APOPTOSE
4.3.1 ROS

A avaliação dos efeitos do composto LQFM030 sobre a produção de ROS revelou,


diferentemente do esperado, uma marcada redução de ROS, quando comparado ao grupo
controle. Esta redução foi observada 3, 6, 12 e 24 h após o tratamento. As maiores reduções
de produção de ROS foram observadas nos tempos de 6 e 12 h após, em relação ao controle.
Observamos ainda uma tendência de restabelecimento dos níveis de ROS após 24h (figura
27).

57
27A

Controle 3h 6h
Intensidade de Fluorescência

FIT-C

27B

Controle 12h
Intensidade de Fluorescência

24h

FIT-C

27C

Controle
3h
Intensidade de Fluorescência

*** 6h
12h
***
24h
*** *** P<0.001

***

Figura 27: Histograma representando a análise de ROS em células K-562 após 3 e 6h (figura 27A), 12 e 24 h
(figura 27B) de incubação em 0,55 mM do composto LQFM030. A figura 27C dessa figura apresenta o
percentual de expressão do nível de ROS do tratado (LQFM 030 – 0,55 mM) quando comparado ao controle.
Cada coluna do gráfico representa uma média e o ± desvio padrão de um intervalo de tempo analisado (3, 6, 12 e
24h), realizados em dois experimentos independentes. Utilizou-se o citometro de fluxo para a análise da
expressão do ROS e o programa FACSCanto II (BDBiosciences, CA, USA).
58
4.3.2 Rodamina

Como apresentado na figura 28, o tratamento das células K-562 com o composto 030
produziu um aumento do potencial de membrana mitocondrial de forma-tempo dependente.
Observamos que nos tempos de 12 e 24h após o tratamento houve um aumento de 15 e 27%,
respectivamente.

59
Intensidade de Fluorescência 28A

Controle 3h 6h

FIT-C
28B
Intensidade de Fluorescência

Controle 12h 24h

FIT-C

28C

Rodamina
200
LQFM 030
Intensidade de Fluorescência

150

100

50

0
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
Tempo

Figura 28: Histograma representando a análise de Rodamina em células K-562 após 3 e 6 h (figura 28A), 12 e
24h (figura 28B) de incubação em estufa a 37 ºC e 5% CO2, com 0,55 mM do composto 030. A figura 28C
apresenta o percentual de expressão do nível de Rodamina do tratado com o composto LQFM 030 (0,55 mM)
quando comparado ao não-tratado. Cada ponto representa a média e o ± desvio padrão de um intervalo de tempo
analisado (3, 6, 12 e 24h), realizados em dois experimentosindependentes. Utilizou-se o citômetro de fluxo para
a análise da expressão de Rodamina e o programa FACSCanto II (BDBiosciences, CA, USA).

60
4.3.3 Citocromo-C

Os efeitos do composto LQFM 030 (0,55mM), após 24 h de tratamento sobre o


citocromo-c estão apresentados na Figura 29. Em consonância com os dados acerca dos
efeitos do composto LQFM030 sobre o potencial de membrana mitocondrial, o composto 030
induziu a um aumento de liberação da proteína Citocromo-C, quando comparado ao grupo
não-tratado. O aumento observado da proteína Citocromo-C foi de aproximadamente 8 vezes
em relação às células não-tratadas, correspondendo a um percentual de aproximadamente
85%.

61
29A

* Controle
Citocromo - C

% Celular
p<0,05

29B
Não-tratado Tratado
Intensidade de Fluorescência

PE-A

Figura 29: A figura 29A apresenta o percentual de expressão do nível de Citocromo-C do tratado (LQFM 030 - 0,55 mM) quando comparado ao controle. A figura 29B
presenta um histograma representando a ação do composto LQFM030 (0,55 mM) sobre as células K-562 após 24 h de incubação em estufa a 37 ºC e 5% CO 2, visando a
observação do comportamento do Citocromo-C. Para a análise estatística fez-se o teste T e considerou-se estatisticamente significativo quando P<0,05 em elação ao grupo
controle. Utilizou-se o citometro de fluxo para a análise da expressão de Citocromo-C, e o programa FACSCanto II (BDBiosciences, CA, USA

62
4.3.4 Bax e Bcl-2

Estudos ainda preliminares, representativos de um experimento, sobre os efeitos do


composto LQFM030 (0,55 mM) na expressão das proteínas Bax e Bcl-2 em células
leucêmicas K-562, estão apresentados nas figuras 30 e 30, respectivamente. Os resultados
demonstraram que o tratamento com o LQFM030 produziu uma modulação destas proteínas,
ou seja, observou-se um aumento de quase 8 vezes de Bax, e em paralelo a uma redução de
84% de Bcl-2.

63
30A

50 **
Controle
40 Bax

% Celular
30
** p<0,05
20

10

30B
Intensidade de Fluorescência Não-tratado Tratado

PE-A

Figura 30: A figura 30A apresenta o percentual de expressão do nível de Bax do tratado, com o composto LQFM 030 (0,55 mM), quando comparado ao controle. A figura
30B apresenta um histograma representando a análise do Bax em células K-562 após 24H de incubação com 0,55 mM do composto 030. Para a análise estatística fez-se o
teste T e considerou-se estatisticamente significativo quando P<0,05 em relação ao grupo controle. Utilizou-se o citômetro de fluxo para a análise da expressão de Bax e o
programa FACSCanto II (BDBiosciences, CA, USA).

64
31A BCL-2
8
Controle
BCL-2
6

% Celular
p<0,05
4

2 **

31B

Não-tratado Tratado
Intensidade de Fluorescência

PerCP-A

Figura 31: a figura 31A apresenta o percentual de expressão do nível de Bcl-2 do tratado, com o composto LQFM030 (0,55 mM), quando comparado ao controle. A figura
31B apresenta um histograma representando a análise do Bax em células K-562, após 24H de incubação com 0,55 mM do composto LQFM030. Para a análise estatística fez-
se o teste T e considerou-se estatisticamente significativo quando P<0,05, em relação ao grupo controle. Utilizou-se o citômetro de fluxo para a análise da expressão de Bcl-2
e o programa FACSCanto II (BDBiosciences, CA, USA).

65
4.3.5 TNF e NFK-B

Para uma melhor elucidação do possível mecanismo de ação do composto LQFM030


foi avaliado a modulação desto composto sobre as proteínas TNF e NFκβ. Conforme
demonstrado na figura A e B, não observamos diferenças estatísticas dos níveis de TNF
(figura 32) e NFκβ (figura 33) após o tratamento com o candidato LQFM030 (0,55 mM), em
um intervalo de tempo de 24h, quando comparado com as células não-tratadas.

66
32A

4
Controle
TNF
3

% Celular
2

F
e
ol

TN
32B

tr
on
C
Não-tratado Tratado
Intensidade de Fluorescência

FITC-A

Figura 32: a figura 32A apresenta o percentual de expressão de TNF das células tratadas (LQFM030 - 0,55 mM) e não tratadas. A figura 32B apresenta um histograma
representando a modulação do TNF em células K-562 após 24 h de incubação com 0,55 mM do composto LQFM030. Para a análise estatística fez-se o teste T e considerou-
se estatisticamente significativo quando P<0,05 em relação às células não-tratadas. Utilizou-se o citômetro de fluxo para a análise da expressão de TNF e o programa
FACSCanto II (BDBiosciences, CA, USA).

67
33A
4
Controle
NFKB
3

% Celular
2

B
ol

FK
tr

N
on
C
33B

Não-tratado Tratado
Intensidade de Fluorescência

PE-A

Figura 33: a figura 33A apresenta o percentual de expressão de NFκβ, das células tratadas (LQFM030 - 0,55 mM) e não tratadas. A figura 33B apresenta um histograma
representando a modulação do NFκβ, em células K-562 após 24 h de incubação com 0,55 mM do composto LQFM030. Para a análise estatística fez-se o teste T e
considerou-se estatisticamente significativo quando P<0,05 em relação às células não-tratadas. Utilizou-se o citômetro de fluxo para a análise da expressão de NFκβ,e o
programa FACSCanto II (BDBiosciences, CA, USA).

68
4.4 ENSAIOS DE SEGURANÇA
4.4.1 Captura do Corante Vermelho Neutro

Para o estudo de segurança do candidato LQFM030 avaliou-se a citoxicidade basal,


pelo ensaio de Captura do Corante Vermelho Neutro (figura 34), em linhagem basal 3T3 após
48h de incubação em estufa a 37 ºC e 5% CO2, com diferentes concentrações do composto
LQFM030 (1,568 – 0,012 mM). Observou-se que o candidato a protótipo apresentou uma
toxicidade basal com valor de IC50 de 0,136 mM.

150
LQFM 030
125
Viabilidade Celular %

100

75

50

25

0
0.01 0.1 1 10
Concentração mM

Figura 34: Viabilidade de células da linhagem celular 3T3 após 48h de incubação em estufa com diferentes
concentrações do composto 030 (1,568 – 0,012 mM). A atividade citotóxica basal foi avaliada pelo teste de
Vermelho Neutro, onde cada ponto representa a média e o ± desvio padrão de uma concentração realizada em
triplicata e o experimento foi realizado em duplicata.

69
4.4.2 Toxicidade Aguda em dose única

No estudo da toxicidade aguda em dose única, realizado de acordo com o guia da


OECD 423, que visa o estudo de segurança do candidato LQFM030, verificou-se que após a
administração, por gavagem, na dose de 300 mg/kg, não houve sinais de toxicidade visíveis e
as observações comportamentais sistemáticas ficaram na escala 0 do screening hipocrático. Já
para a dose de 2000 mg/kg foi observado alterações no comportamento sistemático do animal,
onde foi possível a detecção da piloereção na escala de 2 e catatonia na escala de 3. Não
ocorreu morte, ou letalidade, dos animais durante o período experimental, tendo assim a sua
classificação na categoria 5 do GSH (Global System Harmonized) ou não-classificada. Não
foi observado mudanças no peso corpóreo dos animais em experimento (figura 35A). O peso
do figado e do baço também foram determinados, e segundo os resultados obtidos não houve
nenhuma diferença estatística, em relação ao peso dos órgãos, quando comparados com o
controle (figura 35B e 35C).
Na análise macroscópica, sugerida pelo guia OECD 423 e realizada a partir de
necropsia, não foi observado nenhuma alteração estrutural e visual do fígado, baço, coração,
pulmão, rins e estômago. Também foi realizado o estudo histopatológico dos órgãos
analisados macroscopicamente, sendo que os cortes histológicos do fígado, coração, pulmão,
baço e rins não apresentaram alteração da histologia, tanto para a dose de 300 mg/kg quanto
para a dose de 2000 mg/kg (figura 36, 37 e 38). O fígado dos animais de todos os grupos
experimentais apresentou uma arquitetura lobular normal e hepatócitos normais isoformes. A
histopatologia dos rins dos animais de todos os grupos experimentais mostrou glomérulos
preservados numericamente, sem particularidades histológicas.
Em contrapartida, o estômago apresentou alterações histológicas onde foi possível
detectar um desarranjo das fossetas gástricas e hiperplasia deste órgão. Esta alteração
histológica foi observada em ambas as doses administradas por gavagem (figura 36).

70
35A 35B

50
Controle 20
Controle
40 300 mg/kg
Peso Corporal (g)

300 mg/Kg
2000 mg/Kg 15
2000 mg/Kg
30

Peso (mg)
10
20

10 5

0 0
le

Kg
kg
tro

g/
35C
g/
on

m
m
C

00
0
30

20

20
Controle
300 mg/Kg
15
2000 mg/Kg
Peso (mg)

10

Figura 35: a figura 35A representa a média e ± desvio padrão do peso corporal (g) do grupo controle e dos grupos tratados com o composto LQFM030 nas concentrações de
300 e 2000 mg/Kg. Já a figura 35B desta figura apresenta um gráfico com a média e ± desvio padrão do peso do fígado (g) do grupo controle e dos grupos tratados com o
composto 030 nas concentrações de 300 e 2000 mg/Kg. A figura 35C apresenta a média e ± desvio padrão do peso do baço (g) do grupo controle e dos grupos tratados com o
composto 030 nas concentrações de 300 e 2000 mg/Kg. Para a análise estatística de todos os gráficos fez-se o teste Anova e o pós-teste utilizando sendo o teste Tukey. P<0,05
em relação ao grupo controle.

71
36A 36B

Controle

300 mg/kg

2000 mg/kg

Figura 36: análise histopatológica do estômago do grupo controle e dos grupos tratados com as doses de 300 e
2000 mg/kg. A primeira coluna (36A) apresenta o desarranjo das fossetas gástricas dos grupos tratados quando
comparado com o grupo controle (100x). A segunda coluna (36B) apresenta os sinais de hiperplasia desse órgão
– grupo controle 40x e grupos tratados 20x. Cortes histológicos corados com hematoxilina-eosina.

72
Fígado (37A) Rim (37B)

Figura 37: análise histopatológica do fígado (37A) e rim (37B) do grupo controle e dos grupos tratados com as doses de 300 e 2000 mg/kg do composto LQFM030. Fígado e
rim 40X. Cortes histológicos corados com hematoxilina-eosina.

73
Baço (38A) Pulmão (38B)

Coração (38C)

Figura 38: Análise histopatológica do baço (38A), pulmão (38B) e coração (38C) do grupo controle e dos grupos tratados com as doses de 300 e 2000 mg/kg do composto
LQFM030. Baço, pulmão e coração 40X. Cortes histológicos corados com hematoxilina-eosina.

74
4.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
4.5.1 Avaliação da capacidade de reação com 2,2-difenil-1-picril-hidrazil
(DPPH)

A avaliação da atividade sequestrante do radical DPPH• (0,3mM/ml) pelo ácido


ascórbico (controle), nas concentrações de 0,975 – 500,0 µg/ml, apresentou uma
concentração efetiva 50% de 5,87 µg/ml. Por outro lado, o composto LQFM030 não
apresentou, nas concentrações de 0,975 – 500,0 µg/ml, atividade sequestrante do radical
DPPH• eficiente; apresentando uma concentração efetiva 50% de 6,08 x 1020 µg/ml. Com esse
valor apresentado de EC50 o composto LQFM030 não apresentou uma atividade antioxidante
frente ao radical DPPH•.

27A 27B
120
110 12
100
90 10
80
70 8
AA%

AA%

60
6
50
40
y = 15,551ln(x) + 22,467 4 y = 1,021ln(x) + 1,1388
30
20 R² = 0,7623 R² = 0,7479
2
10
0 0
0 200 400 600 0 200 400 600
concentração µg/mL
Concentração em mg/mL

Figura 39: Avaliação da atividade sequestrante do radical DPPH• (0,3mM/ml) pelo controle (ácido ascórbico –
figura 24A), nas concentrações de 0,975 – 500,0 µg/ml e pelo composto LQFM030 (figura 24B), nas mesmas
concentrações.

4.5.2 Avaliação da atividade antioxidante pelo sistema β-caroteno/Ácido


Linoléico

A avaliação da atividade antioxidante pelo sistema β-caroteno/Ácido Linoléico com o


candidato LQFM030, nas concentrações de 12,5 – 200 µg/ml mostrou uma atividade
antioxidante baixa, quando comparado com o controle Trolox, uma vez que apresentou um

75
valor de concentração efetiva 50% (EC50) de 38,42 µg/ml e o controle 1,9 x 10-2. A avaliação
da atividade antioxidante foi realizada em um intervalo de tempo de 2h e representada na
figura 40. O perfil do sistema β-caroteno/Ácido Linoléico reduziu a absorbância de 0,642 para
0,266 em um intervalo de tempo de 2h, apresentando ao final uma redução em sua
absorbância de 0,376. Já o controle Trolox apresentou uma redução em sua absorbância de
0,018, apresentando uma percentagem de proteção de 85,24%. Em contrapartida, o composto
LQFM030 teve uma redução em sua absorbância de 0,351, apresentando uma percentagem de
proteção de 57,97 %.
Na cinética do controle Trolox e do candidato LQFM030, representada na figura 19,
os dados foram coletados de 20 em 20 minutos durante um intervalo de tempo de 100
minutos. Pode-se observar que o controle Trolox obteve uma curva cinética similar em todas
as concentrações, diferentemente do candidato LQFM030 que em suas últimas concentrações,
25 e 12.5 µg/ml não protegeu o composto β-caroteno da ação dos radicais livres gerados a
partir do ácido linoléico. Já as concentrações de 50, 100 e 200µg/ml do composto LQFM030
apresentaram um perfil cinético similar com o controle Trolox.

76
40A - Trolox

100
y = 4,4781ln(x) + 67,721
95
90

AA%
85
80
75
Tro…
70
0 50 100 150 200 250
Concentração µg/mL

40B – LQFM030
120
y = 30,274ln(x) - 60,452
100
80
AA%

60
40
20
LQFM030
0
0 50 100 150 200 250
Concentração µg/mL

40C – Sistema β-caroteno/Ácido Linoléico

0,7
0,6
0,5
0,4
AA%

0,3 Sistema
0,2
0,1
0
0 50 100 150
Tempo (min)

Figura 40: Avaliação da atividade antioxidante pelo sistema β-caroteno/Ácido Linoléico do controle Trolox
(figura 40A) nas concentrações 12,5 – 200 µg/ml e do candidato LQFM030 (figura 40B), nas concentrações de
12,5 – 200 µg/ml. A figura 40C representa o sistema β-caroteno/Ácido Linoléico.

77
41A – Trolox

0,65 200
µg/mL
100
0,55
Absorbância (%)

µg/mL
50
0,45 µg/mL

0,35

0,25

0,15
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (min)

41B – LQFM030

0,65 200
µg/mL
100
0,55 µg/mL
Absorbância (%)

50 µg/mL
0,45
25 µg/mL

0,35

0,25

0,15
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (min)

Figura 41: Cinética do controle Trolox e do candidato LQFM030 – figuras 41A e 41B, respectivamente –
observados de 20 em 20 minutos em um intervalo de tempo de 100 minutos.

78
4.5.3 Eletroquímica

A análise de voltametria cíclicado composto LQFM030 mostrou apenas um pico de


oxidação, não sendo caracterizado o sistema de oxirredução, uma vez que não apresentou o
pico de redução, quando comparado com o voltamograma controle (branco) que é formado
por uma solução de KCl (0,1 molL-1, pH 7,0, temperatura ambiente), em uma faixa de
varredura selecionada de -0,25 à 1,2 V, em uma velocidade de varredura de 100 mVs-1.

Figura 42: Análise voltamétrica do composto LQFM030 e do eletrólito suporte (solução de KCl -0,1 molL-1,
pH 7,0, temperatura ambiente). Em uma faixa de varredura selecionada de -0,25 à 1,2 V, em uma velocidade de
varredura de 100 mVs-1.

79
5 DISCUSSÃO

80
5 DISCUSSÃO

O câncer é uma enfermidade geralmente associada com a progressão do ciclo celular


de maneira aberrante e a uma indução defeituosa de mecanismos de morte ligados ao processo
apoptótico, devido à ativação de proto-oncogenes e/ou inativação de genes supressores
tumorais (WANG, 2010). O avanço do conhecimento da evolução molecular do câncer com
detecção de novos elementos durante o progresso da doênça, em geral, fazem destes novos
elementos alvos de atuação de diversos candidatos a protótipos de fármacos antitumorais
(WANG, 2010).
Neste trabalho, investigamos a atividade citotóxica e indutora de apoptose de dois
grupos de candidatos a protótipos a fármacos antileucêmicos. O primeiro grupo de compostos
(LQFM030, LQFM031 e LQFM032), foi planejado a partir dos protótipos Nutlin-1 e Nutlin-
2, já o segundo grupo (LQFM004, LQFM005, LQFM028 e LQFM029), foi inicialmente
idealizado como antipsicóticos. Ambos os grupos de compostos apresentaram atividade
citotóxica contra a linhagem leucêmica K-562, sendo que os melhores resultados foram
obtidos com o composto LQFM030. Estes resultados podem ser parcialmente explicados pela
presença de grupamentos cloro presentes no candidato LQFM030 e ausente nos demais
compostos. O tratamento das células leucêmicas K-562 por 72h, pelo método de MTT, com
esse respectivo composto (LQFM030 - derivado do nutlin-1) apresentou a menor
concentração inibitória 50% (0,023 mM), sendo portanto, considerada o composto mais
promissora como agente citotóxico contra leucemias.
Os compostos nutlins (nutlin 1-3) foram as primeiras classes de pequenos compostos,
identificadas por meio de uma triagem de uma série diversificada de compostos com
capacidade de impedir a complexação do MDM-2 com a proteína pró-apoptótica p53,
conhecida como “guardião do genoma”. A complexação do MDM-2 com a p53 interrompe o
processo de apoptose as células tumorais perdendo, dessa maneira, a capacidade de morte
com alto poder proliferativo (VASSILEV et al., 2004).
Estes compostos apresentam potencial citotóxico in vitro contra diversos tipos
celulares, os exemplos incluem linhagens de câncer cólon, mama, osteossarcoma (VASSILEV
et al., 2004), e leucemias (GU, 2008). Nestes estudos os valores de IC50 para os nutlins
variaram de 1 a 20 µM (HU, 2006; VASSILEV et al., 2004; GU, 2008).

81
Outros estudos com nutlins frete linhagens tumorais apresentam valores de IC50 na
faixa de 10 a 30 µM (VASSILEV et al., 2004; TABE et al., 2009; KUROSU et al., 2010). Já
o nosso candidato a protótipo (LQFM030) apresentou valores de IC50 igual a 23,4 µM. É
importante ressaltar que a avaliação da atividade citotóxica do nosso estudo com o candidato
LQFM030 foi realizado contra a linhagem K-562, a qual apresenta perfil de resistência a
fármacos. Além disto, nos vários estudos de citotoxicidade relatados na literatura o tempo de
incubação com o nutlin foi de ate 8 dias, ao passo que em nosso estudo o tempo máximo foi
de 3 dias (72h).
Em paralelo ao efeito citotóxico in vitro, Vassilev et al., (2004) relataram que os
nutlins apresenta uma marcada atividade antitumoral in vivo. Estes autores demonstraram, que
o nutlin-3 pode impedir o crescimento de osteosarcoma (linhagem SJSA-1) transplantado em
camundongos Nude. Neste estudo, os animais foram tratados com 200 mg/kg de nutlin-3, pela
via oral (gavagem), duas vezes ao dia por 20 dias. O tratamento foi bem tolerado pelos
animais e produziu marcada inibição do crescimento tumoral, em relação ao grupo que
recebeu somente o veiculo da preparação. Além disto, os animais não apresentaram redução
de peso significativo, a necropsia dos órgãos dos animais não mostrou anormalidades
histopatológicas ao final do tratamento. Os autores sugerem ainda que o nutlin-3 pode, por
meio da ativação de p53, atuar em mais de um sitio de ação, incluindo o microambiente
tumoral. Neste sentido, os resultados da avaliação da sobrevida dos animais portadores TAE e
tratados com 300, 150 ou 75 mg/kg do candidato a protótipo LQFM030, durante 10 dias de
tratamento, uma vez ao dia, produziu um aumento de sobrevida de 25% para o grupo de
animais tratados com 150mg/kg, enquanto que o grupo de animais tratados com 75 e 300mg a
sobrevida foi de 15%. É interessante destacar que os animais tratados com 300 mg/kg
apresentaram maior morbidade, o que pode estar associado a efeito tóxico.
Uma das principais consequências diretas de ativação da p53 em células proliferativas
é a parada da células na fase G0/G1 e/ou G2/M do ciclo celular. Neste sentido, as compostos
nutlins têm como característica a ativação de p53 e consequentemente impedem a progressão
do ciclo celular, resultando em uma diminuição da fase S com o acumulo de células
predominantemente na fase G2/M (TABE et al., 2009; MÜLLER et al., 2007; ROH et al.,
2011).
Ainda sobre os nutlins, estudos demonstraram que as células retidas na fase G2/M não
apresentavam alto índice mitótico o que significa que a fração de células da fase G2/M
consistia de células na fase G2. A este respeito, no nosso estudo, os efeitos do composto

82
LQFM030 sobre as fases do ciclo celular mostrou uma diferença marcante nas proporções dos
números de células nas diferentes fases do ciclo celular. Além disto, reduziu em 40,9% o
número de células em fase S e, por outro lado, aumentou em 73% o número de células em
fase G2/M. A literatura trás também que há um aumento do número de células na fase sub-G1
do ciclo celular, quando tratado com o composto nutlin (KUROSU et al., 2010)
No nosso estudo verificamos um aumento em 73,6% de células em fase sub-G1
(indicativo de apoptose), em correspondências aos dados observados em estudos anteriores.
A investigação da atividade citotóxica em células de metabolismo basal, utilizando a
linhagem celular 3T3 (fibroblasto) realizada por Vassilev et al. (2004), demonstrou que os
nutlins possuem atividade citotóxica em células normais com valor IC50% de 130 mM. Neste
quesito para a avaliação da segurança do candidato LQFM030, os nossos resultados mostrou
um valor de IC50 de 0,136 mM, para a mesma linhagem celular (3T3). Este dado sugere que o
candidato LQFM030 é aproximadamente 100 vezes mais citotóxico para esta linhagem de
células basais, podendo apresentar uma margem de segurança menor quando comparado aos
Nutlins.
Em relação a segurança de utilização do candidato LQFM030, mais especificamente
em relação à toxicidade aguda, nos estudos realizados não observou-se letalidade tanto para a
dose de 300mg/kg, quanto para a dose de 2000 mg/kg. A análise do peso relativo do baço e do
fígado, juntamente com o peso corporal médio de cada grupo experimental não demosntrou
alterações em quando comparado com o controle. Por outro lado, no estudo histopatológico
realizado observou-se que houve alteração na organização das fossetas gastricas e uma
hiperplasia do estômago, porém, os demais orgãos extirpados (fígado, rins, coração, pulmão e
baço) não apresentaram nenhuma alteração histopatológica.
Experimentos em ex vivo, com leucemia mielóide aguda (KOJIMA et al., 2006),
leucemia linfocítica crônica-B (KOJIMA et al., 2006; COLL-MULET et al., 2006),
apresentaram que a inibição da proteína MDM2 é inibida pelo composto Nutlin-3,
desencadeando dessa maneira o mecanismo de morte celular por apoptose.
Em um trabalho desenvolvido por Mulher et al. (2007), utilizando diferentes linhagens
celulares (sarcomas – SW872; U2OS; FU-DDLS-1; MHM; OSA; T449; T778), mostrou que
após o tratamento das células com o composto nutlin 3 (10µM) , em um intervalo de tempo
de 4h, ocorreu uma modificavam da expressão gênica das mesmas, aumentando a expressão
da proteína Bax e diminuindo a expressão da proteína Bcl-2. Esta alteração de expressão se
manteve nos demais tempos de estudo (24 e 48h).

83
Em um outro experimento realizado por Yoko Tabe et al. (2009) utilizando linhagens
de leucemia mielóide crônica (Z-138; Granta 519; MINO) observou, através da técnica
molecular Western Plot, que houve um aumento gradativo da expressão da proteína Bax, nos
intervalos de 1, 8 e 24h, ao serem tratados com o compostos Nutlin 3 (10µM). Assim como
também observaram uma diminuição da expressão da proteína Bcl-2, nos mesmos intervalos
de tempo e na mesma concentração para a avaliação do comportamento da proteína Bax. Esta
alteração de expressão se manteve nos demais tempos de estudo (24 e 48h). Esse
comportamente celular foi também confirmado por outros pesquisadores (KUROSU et al.,
2010).
Para o composto LQFM030 pôde-se observar que, além do aumento da expressão de
proteína Bax, houve um aumento do potencial de membrana mitocondrial e uma diminuição
da proteína anti-apoptótica Bcl-2, quando as células foram tratadas com o composto
LQFM030 em um intervalo de tempo de 24h. Além disso, pôde-se observar que os
mecanismos na morte celular induzidas pelo composto LQFM030 e da classe dos Nutlins
envolvem o processo de apoptose pela via mitocondrial.
Nas diferentes avaliações de atividade antioxidante não detectou uma atividade
satisfatória para o candidato a fármaco em estudo.
Na avaliação a atividade sequestrante do radical DPPH• o controle (ácido ascórbico),
apresentou uma concentração efetiva 50% de 5,87 µg/ml, e a molécula LQFM030 não
apresentou uma atividade sequestrante do radical DPPH• eficiente; apresentando uma
concentração efetiva 50% de 6,08 x 1020 µg/ml.
No ensaio da atividade antioxidante pelo sistema β-caroteno/Ácido Linoléico com o
candidato LQFM030, mostrou uma atividade anti-oxidante baixa, quando comparado com o
controle trolox, uma vez que apresentou um valor de concentração efetiva 50% (EC50) de
38,42 µg/ml e o controle 1,9 x 10-2.
Na cinética do controle trolox e do candidato LQFM030, pôde-se observar que o
controle trolox obteve uma curva cinética similar em todas as concentrações, diferentemente
do candidato LQFM030 que em suas últimas concentrações, 25 e 12.5 µg/ml não protegeu a
molécula β-caroteno, da ação dos radicais livres gerados a partir do ácido linoléico. Já as
concentrações de 200, 100 e 50 µg/ml apresentou um perfil cinético similar com o controle
Trolox.
Na análise de voltametria cíclica da molécula LQFM030 mostrou apenas um pico de
oxidação, não sendo caracterizado o sistema de oxirredução, uma vez que não apresentou o

84
pico de redução, quando comparado com o voltamograma controle (branco). Apesar do
candidato LQFM030 não ser caracterizado como um sistema de oxi-redução, por não
apresentar o pico de redução, isso não implica na ausência de uma capacidade anti-oxidante,
mas sugere que possivelmente o composto não apresentará uma boa atividade anti-oxidante,
assim como foi observado para o composto.
A presença de um único pico de oxidação, pode ser uma indicação para o resultado
encontrado de ROS, na elucidação do mecanismo de ação do LQFM030. O que ocorre,
normalmente nas células em processo de apoptose é um aumento de ROS que tem como
conseguencia a danificação do material genético da célula e subsequentemente a expressão do
gene p53 -fator pró-apoptótico (PAROLIN, REASON, 2001). Com a tendência de oxidação
da molécula LQFM030, ou seja, de doar elétrons, ela pode estar interagindo com o ROS
(radicais livres – par de elétrons desemparelhados) diminuindo-os.
Diante dos dados apresentados, podemos concluir que o composto em questão possui
um excelente perfil de atividade antitumoral com promissores resultados como candidato a
protótipo de fármaco antileucêmico. Outra consideração que pode ser feita é que este
composto, o LQFM030, é uma simplificação estrutural do nutlin-1, com menor molecular, o
que pode favorecer ainda mais o perfil de farmacocinética destes compostos, ou seja,
favorecer ainda mais a permeabilidade celular. Além disto, o processo de síntese requer
menos etapas em comparação à síntese dos nutlins.

85
6 CONCLUSÃO

86
6 CONCLUSÃO

No âmbito de uma linha de pesquisa que visa a avaliação farmacológica e toxicológica


de novos candidatos a protótipos de fármacos antitumorais, conclui-se neste trabalho que dos
compostos desenhados a partir dos protótipos Nutlins (LQFM030, LQFM031 e LQFL032), o
que apresentou o melhor perfil citotóxico, frente à linhagem leucêmica K-562, foi o candidato
LQFM030.
Já para a avaliação dos compostos LQFM004, LQFM005, LQFM028 e LQFM029,
inicialmente idealizados como candidatos a protótipos de fármacos antipsicóticos, desenhados
a partir do LASSBio579, o candidato que apresentou melhor perfil citotóxico, frente à
linhagem K-562, foi o LQFM029.
Diante desse fato, realizou-se uma análise mais aprofundada da citotoxicidade desses
dois candidatos a protótipos (LQFM030 e LQFM029), onde se concluiu que o composto que
apresentou um melhor perfil citotóxico foi o LQFM030.
Em seguida foram realizados os ensaios farmacológicos e toxicológicos desse
composto alvo. Para a investigação do potencial indutor de apoptose concluiu-se que o
tratamento da linhagem celular K-562 com o composto LQFM030 alterou a progressão do
ciclo celular, diminuindo a fase S (40,9%) e aumentando as fases sub-G1 em 73,6%
(indicativo de morte celular) e G2/M em 70%.
Para a pesquisa do mecanismo de indução de apoptose celular concluiu-se que o
tratamento da linhagem celular K-562 com o composto LQFM030 modulou a expressão
gênica, aumentando a expressão da proteína Bax em 8 vezes quando comparado ao grupo
não-tratado e do Citocromo-c (85%) e diminuindo a expressão da proteína Bcl-2 (84%).
Além disso, houve um aumento do potencial de membrana (Rodamina) e uma diminuição de
ROS, entretanto, não houve modulação da expressão das proteínas TNF e NFκβ.
Na avaliação da sobrevida dos animais portadores de TAE, após tratamento com o
candidato a protótipo concluiu-se que houve um aumento significativo da expectativa de vida
do animal em todas as doses administradas, porém, observou-se que houve efeito tóxico ao
ser administrada, por um período de 10 dias, a dose de 300 mg/kg.
Já para a verificação da toxicidade oral aguda em dose única o composto LQFM030
foi classificado na categoria 5 ou não-tóxico, pela GSH. Não foi observado alteração do peso
corporal dos animais tratados, e tão pouco para o índice corporal do fígado e do baço;

87
entretanto, para o estudo histopatológico observou-se alterações na organização das fossetas
gástricas e uma hiperplasia.
Para o ensaio de segurança concluiu-se que o composto LQFM030 apresentou um
efeito citotóxico aumentado para as células basais (3T3) de 100 vezes , quando comparado
com o Nutlin, que é uma simplificação estrutural desse composto.
Na realização da triagem da atividade antioxidante do composto LQFM030, concluiu-
se que ele não apresenta um efeito antioxidante expressivo, ao serem analisados todos os
ensaios realizados para essa averiguação.

88
7 PERSPECTIVAS

89
7 PERSPECTIVAS

São várias as perspectivas para os próximos anos. Uma delas é de aprofundar os


estudos em relação ao candidato a protótipo antitumoral LQFM030 através dos seguintes
pontos:
 Avaliação da modulação gênica da expressão da proteína p53 e do fator anti-
apoptótico MDM2;
 Por meio do estudo farmacocinético desse composto; por meio do estudo
sinérgico com outros antitumorais;
 E ainda pelo estudo in vivo da genotoxicidade e/ou genoproteção desse
candidato.
Sabe-se que para isso será necessário muito empenho e esforço, porém com os
resultados obtidos até o momento, estímulos não faltarão para alcançar os próximos passos a
serem dados para o cumprimento desses objetivos.

90
8 REFERÊNCIAS

91
8 REFERÊNCIAS
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