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DESARROLLO DE UN INÓCULO CON DIFERENTES SUSTRATOS

MEDIANTE FERMENTACION SOLIDA SUMERGIDA

POR:

M en C. Daniel Díaz Plascencia

Correo: ddiazp1@hotmail.com

Facultad de Zootecnia y Ecología


Universidad Autónoma de Chihuahua, Chih., México.

Chihuahua, Chih., México Junio, 2009


CONTENIDO

Página

LISTA DE GRAFICAS………………………………………………………. iv
LISTA DE FIGURAS………………………………………………………… vi
INTRODUCCIÓN……………………………………………………………… 1
OBJETIVO GENERAL………………………………………………………. 3
Objetivos Específicos………………………………………………. 3
REVISION DE LITERATURA………………………………………………. 3

La creación de la Manzarina……………………………………….. 3

La Manzarina en la Alimentación Animal…………………………. 4

Fermentación Solida………………………………………………… 5

Procesos de la Fermentación en Estado Sólido……………….. 9

Fermentación Semi Sólida…………………………………………. 11

Fermentación Sumergida…………………………………………... 12

Fermentación Liquida………………………………………………. 13

Principales Características del Cultivo Microbiano 14

Condiciones de Crecimiento de Saccharomyces Cerevisiae…. 14

Ventajas y desventajas de la fermentación en estado sólido


16
Comparada con el cultivo sumergido en líquido………………...

Optimización de Medios de Cultivo………………………………. 18

Metabolismo Aeróbico……………………………………………... 19

Uso de las levaduras obtenidas de la manzarina en la


20
alimentación animal……………………………………………………

ii
MATERIALES Y METODOS………………………………………………... 22

Tratamientos…………………………………………………………... 23

Mediciones en Muestras Líquidas…………………………………. 25

Análisis Estadístico………………………………………………….. 29

RESULTADOS Y DISCUSION.......................................................... 31

pH………………………………………………………………………. 31

Temperatura…………………………………………………………… 37

Conteo de Levaduras………………………………………………... 42

Nitrógeno Amoniacal………………………………………………… 43

Azucares Solubles…………………………………………………… 52

CONCLUSIONES……………………………………………………………… 59

LITERATURA CITADA………………………………………………………. 60

iii
LISTA DE GRAFICAS

Gráfica Página

1 Comportamiento del pH de los diferentes sustratos con la


levadura A durante la FSS…………………………………………. 33

2 Comportamiento del pH de los diferentes sustratos con la


levadura B durante la FSS…………………………………………. 34

3 Comportamiento del pH de los diferentes sustratos con la


levadura C durante la FSS…………………………………………. 35

4 Comportamiento del pH de los diferentes sustratos con la


levadura D durante la FSS………………………………………….. 36

5 Comportamiento de la temperatura en los diferentes sustratos


con la levadura A durante la FSS………………………………….. 38

6 Comportamiento de la temperatura en los diferentes sustratos


con la levadura B durante la FSS………………………………….. 39

7 Comportamiento de la temperatura en los diferentes sustratos


con la levadura C durante la FSS…………………………………. 40

8 Comportamiento de la temperatura en los diferentes sustratos


con la levadura D durante la FSS………………………………….. 41

9 Producción de levaduras en los diferentes sustratos con la


levadura A durante la FSS…………………………………………. 44

10 Producción de levaduras en los diferentes sustratos con la


levadura B durante la FSS…………………………………………. 45

11 Producción de levaduras en los diferentes sustratos con la


levadura C durante la FSS…………………………………………. 46

12 Producción de levaduras en los diferentes sustratos con la


levadura D durante la FSS………………………………………….. 47

13 Producción de NH3 en los diferentes sustratos con la levadura A


durante la FSS……………………………………………………… 48

iv
14 Producción de NH3 en los diferentes sustratos con la levadura B
durante la FSS……………………………………………………….. 49

15 Producción de NH3 en los diferentes sustratos con la levadura


C durante la FSS……………………………………………………. 50

16 Producción de NH3 en los diferentes sustratos con la levadura


D durante la FSS…………………………………………………… 51

17 Comportamiento de azucares solubles en los diferentes


sustratos con la levadura A durante la FSS…………………….. 54

18 Comportamiento de azucares solubles en los diferentes


sustratos con la levadura B durante la FSS……………………… 55

19 Comportamiento de azucares solubles en los diferentes


sustratos con la levadura C durante la FSS…………………….. 56

20 Comportamiento de azucares solubles en los diferentes


sustratos con la levadura D durante la FSS……………………. 57

v
LISTA DE FIGURAS

Figura Página

1 Cuadricula de hematocímetro (Cámara de Neubauer)…………. 27

vi
INTRODUCCIÓN

La fermentación en estado sólido (FES), la fermentación líquida (FL) y la

Fermentación solida sumergida (FSS) son un proceso que permite el

aprovechamiento de fuentes no convencionales de carbohidratos para la

alimentación animal mediante el uso de microorganismos.

Levadura es un nombre genérico que agrupa a una variedad de

organismos unicelulares, incluyendo especies patógenas para plantas y

animales, y especies no solamente inocuas sino de gran utilidad (González y

Valenzuela 2003), Saccharomyces cerevisiae es una levadura que constituye el

grupo de microorganismos más íntimamente asociado al progreso y bienestar

de la humanidad; su nombre deriva del vocablo Saccharo (azúcar), myces

(hongo) y cerevisiae (cerveza) (Hernández 1999).

El proceso de producción de proteína unicelular es una vía

biotecnológica adecuada para el aprovechamiento de desechos industriales

ricos en carbohidratos. El principal factor limitante en la generación de proteína

unicelular es el alto costo de las fuentes de carbono, por lo que el uso de

subproductos es ideal (Duran, 1989). El emplear manzana de desecho o

pomasa de manzana que es el residuo generado en el proceso de extracción de

jugo de manzana y representa entre 15 y 20% de la fruta procesada (Díaz,

2006). Así como emplear el suero de leche en este proceso permitiría darle

valor agregado, al obtenerse proteína de calidad para la alimentación animal, y

a la vez disminuir su demanda biológica de oxigeno (DBO), (Ghaly y Kamal

2004).

1
2

La manzarina es un producto fermentado obtenido a partir de manzana o

de subproductos de manzana (Malus domestica), este producto fermentado

tiene un valor proteico mayor que el que tienen los productos de los que se

obtiene (bagazo de manzana o manzana de desecho; Becerra, 2006; Díaz,

2006).

El proceso de obtención de Manzarina se desarrollo con base en el

aplicado para la producción de Saccharina (Díaz, 2006), el cual es el producto

de la FES de la caña de azúcar limpia y sin cogollo, en ese proceso, se

presenta un incremento en la calidad nutritiva del sustrato debido al incremento

de la concentración de proteína además de ciertos cambios que se presentan

en los carbohidratos estructurales (Elías et al., 1990). En otros trabajos se ha

mostrado como la FES es utilizada para la mejora de la calidad nutritiva de otro

tipo de subproductos agroindustriales (Peñaloza et al,. 1985; Reíd, 1985).

La manzana (Malus domestica) tiene propiedades benéficas para el

organismo que lo consume como alimento. Esto se ha atribuido principalmente

a su contenido de polifenoles (Alberto et al., 2006). Considerando que la

Manzarina es obtenida por fermentación en estado sólido a partir de

subproductos de la cadena productiva de la explotación del manzano, teniendo

una mejora en la calidad nutritiva resultado del incremento de proteína (Becerra,

2006; Díaz, 2006) generado por el proceso de FES, la Manzarina podría

conservar alguna de las propiedades benéficas de la manzana.

El interés por producir proteína unicelular fue estimulado por agencias

internacionales relacionadas con la salud, alimentación y agricultura ante la


3

evidencia de una escasez de proteína a nivel mundial (Bu'Lock y Kristiansen

1991), es por esto que la búsqueda de fuentes proteicas es vital (Chacon 2004).

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la fermentación solida sumergida (FSS) de cuatro sustratos con

tres levaduras comerciales y una sepa de levadura de manzarina todas del

genero Saccharomyces cerevisiae, mediante su desarrollo en condiciones

aérobicas utilizando la fermentación solida sumergida.

Objetivos Específicos

Monitorear el comportamiento de los sustratos, para el cultivo de S.

cerevisiae en medio líquido. Verificar la funcionalidad de los fermentadores para

el cultivo del microorganismo. Evaluar y monitorear el crecimiento de levadura

S. cerevisiae en distintos sustratos. Evaluar y monitorear el crecimiento de S.

cerevisiae a temperatura ambiente. Evaluar y monitorear el pH, Temperatura y

su comportamiento en la producción de S. cerevisiae. Evaluar la producción de

Azucares solubles, Evaluar la producción de Nitrógeno Amoniacal (NH3).

Evaluar la producción de levaduras y su conteo de UFC.

REVISION DE LITERATURA

La creación de la Manzarina

Becerra, (1998), Díaz, (2006) desarrollaban un proceso biotecnológico

del cual obtuvieron un producto que llamaron Manzarina (Becerra y Díaz, 2006)

el cual usan en la alimentación animal, que se obtiene de la fermentación en

estado sólido de la manzana. En este proceso la energía de los carbohidratos


4

disponibles y la urea como fuente de nitrógeno son utilizadas para el

crecimiento de la microbiota epifita de la manzana.

El crecimiento microbiano es el factor principal en la obtención de la

Manzarina, es un fenómeno complejo por el número de variables que se

involucran y por la interacción de especies que se origina en este ecosistema.

Para la obtención de Manzarina, se requiere un molino de martillos o un

extrusor, superficie de asfalto o cemento para la fermentación y secado y

disponer de urea y sales minerales para su enriquecimiento. En los últimos

años ha cobrado gran importancia el enriquecimiento proteico de residuos

agroindustriales y subproductos ricos en celulosa mediante sistemas de

fermentación en fase sólida con destino a la producción de proteína microbial.

La creación de la Manzarina como alimento alternativo para consumo

animal, está llamada a constituir un elemento importante en el desarrollo de la

producción animal en el Estado de Chihuahua, demostrando la factibilidad de

aprovechar los recursos alimenticios de bajo valor nutritivo, como son los sub-

productos de manzana a través de la fermentación en estado sólido.

El uso de la fermentación en estado sólido de subproductos de manzana

constituye una alternativa para el aprovechamiento de estos, evitando la

contaminación ambiental provocada por la rápida descomposición de los

mismos (Díaz, 2006).

La Manzarina en la Alimentación Animal

La manzarina ha sido utilizada como ingrediente en la elaboración de

bloques multinutricionales (Rodríguez et al., 2006a) los cuales fueron evaluados

en la alimentación de becerros en engorda (Rodríguez et al., 2006c). Se ha


5

obtenido a mediana escala en condiciones rusticas para utilizarla y evaluarla

como ingrediente en dietas para rumiantes. Se encontró que puede sustituir

parte de los ingredientes en dietas de vacas lecheras, con incrementos en la

producción láctea (Gutiérrez, 2007) y beneficios en la salud del animal

(Gallegos, 2007). Han sido evaluadas como ingrediente en la dieta para la

alimentación de borregos en engorda (Hernández, 2008) y como parte del

suplemento en alimentación de bovinos de carne (Rodríguez et al., 2006a y

Rodríguez et al., 2006b). Se encontró que puede disminuir el costo de las

raciones.

Rodríguez et al., (2006c) reportaron que becerros en engorda,

alimentados con bloques multinutricionales, elaborados con un 14.6% de

manzarina como ingrediente puede tener ganancias diarias de peso de 0.570 kg

d-1 ; la dieta se baso en el uso de forraje verde picado, ensilaje y rastrojo de

maíz y como concentrado proteico, mineral y energético, se utilizaron los

bloques multinutricionales. El consumo de bloque fue de 1.52 Kg a -1 d-1, el costo

de la materia prima para la elaboración de los bloques fue menor al utilizar la

manzarina (Rodríguez et al., 2006a), comparado con el costo de la materia

prima que se requiere para elaborar bloques multinutricionales con harinolina

como principal fuente de proteína. Los minerales consumieron cerca de 0.222

kg d-1 de manzarina. La manzarina puede disminuir los costos de alimentación.

Fermentación Solida

La fermentación sólida puede ser definida como un cultivo de

microorganismos adheridos a un soporte sólido poroso y humedecido en el cual

el medio líquido está extendido en una capa muy fina en contacto con una
6

interface aérea. Las bacterias, levaduras y hongos son los microorganismos

que pueden crecer en fermentación sólida, pero la mayoría de las

investigaciones se llevan a cabo con hongos filamentosos. El crecimiento en

forma de micelio y su tolerancia a bajas actividades de agua y condiciones de

alta osmolaridad hacen que los hongos sean la microflora natural más

adecuada para la fermentación sólida.

Pandey et al., (2001) define como fermentación en estado sólido al

crecimiento de microorganismos en un material solido y húmedo, siendo el

material solido la fuente energética, el sustrato también puede estar formado

por un material solido inerte y húmedo, al cual se le adiciona una fuente

energética. A este proceso, por sus iníciales se le conoce como FES.

En un proceso de FES, generalmente no se requiere agregar agua si el

sustrato tiene un contenido alto de humedad (Pandey et al., 2001) y no

necesariamente se tiene que inocular con alguna especie de microorganismo, si

existe la posibilidad de potencializar el crecimiento de algunas de las especies

microbianas de las que se encuentran de manera natural en los sustratos;

algunos de estos tienen una amplia diversidad de microorganismos, en este

caso se tiene un sistema heterogéneo (Valiño et al., 2002).

El modelo de crecimiento miceliar da una ventaja adicional los hongos

filamentosos sobre los microorganismos unicelulares en la colonización de la

matriz sólida y en la utilización de los nutrientes del medio de cultivo. El modelo

básico de crecimiento de los hongos es una combinación del crecimiento apical

con la generación de nuevas hifas por ramificación. Mientras que el crecimiento

apical se lleva a cabo de manera lineal, la ramificación se lleva a cabo de


7

manera exponencial y como resultado se logra una alta velocidad de

crecimiento y una gran capacidad de cubrir eficientemente la superficie de

cultivo.

La estructura de la pared celular unida al crecimiento por las puntas y la

ramificación da a los hongos una estructura sólida y firme que les permite

penetrar en el interior de la matriz sólida. Las enzimas hidrolíticas son

excretadas por las puntas de las hifas sin que se diluyan como en el caso de la

fermentación líquida lo que hace la acción de las enzimas hidrolíticas muy

eficiente y les permite penetrar en la mayoría de los substratos sólidos, lo que

aumenta la disponibilidad de los nutrientes del interior de los substratos

(Raimbault, 1998).

Existe un gran interés en la utilización de S. cerevisiae para transformar

desechos agroindustriales en productos bioquímicos de valor comercial, por

medio de la fermentación sólida (FS), porque se ha encontrado que durante la

FS se manifiestan características fisiológicas diferentes en los microorganismos

en comparación con la Fermentación liquida (FL). Entre los productos

comerciales más importantes, se encuentran algunas enzimas que son

excretadas al medio y cuya producción por FL se presenta en forma muy

disminuida debido a los fenómenos de represión catabólica (Ramesh y

Lonsane, 1991a; Solís-Pereira et al., 1993). A veces, las enzimas producidas

por FS tienen características modificadas, como un aumento en su termo

resistencia, menores tiempos de producción y mayor actividad

(Hesseltine,1972; Moo-Young et al., 1983; Tengerdy, 1985; Grajek y Gervais,


8

1987; Pandey, 1992; Shankaranand et al., 1992; Solís-Pereira et al., 1996;

Acuña-Argüelles; 1995).

Los efectos que se derivan de la utilización de FS sobre los

microorganismos son múltiples como modificaciones en el transporte de

azúcares, la composición de la pared, la membrana celular y en la actividad

enzimática (Grajek y Gervais, 1987; Pandey, 1992). Mientras que las bacterias

y las levaduras requieren de alta actividad de agua (A, > 0.98), los hongos

filamentosos pueden crecer con valores de Aw tan bajos como 0.85, y por esta

razón, son microorganismos muy bien adaptados para la fermentación sólida.

Pandey, (1992) sugiere incluso que un bajo nivel de Aw favorece la germinación

y el crecimiento miceliar de los hongos (Pandey, 1992; Raimbault, (1998).

De acuerdo con Raimbault (1998) el soporte de la fermentación sólida

debe cumplir con varios requerimientos como son: Poseer una matriz porosa

que puede ser biodegradable o inerte, y requiere presentar una gran superficie

de área por volumen dentro del rango de l03 o l06 cm2/cm3 que permita el

crecimiento microbiano en la interface sólido-líquido. Debe absorber agua en

una o varias veces su propio peso con una actividad de agua relativamente

grande en la interface sólido-líquido para poder permitir una alta velocidad de

los procesos bioquímicos.

La mezcla de oxígeno con otros gases y aerosoles deben pasar a través

del cultivo con relativa facilidad, la superficie sólido-líquido debe ser un buen

hábitat para permitir el crecimiento de microorganismos que crecen

rápidamente como bacterias y hongos. La matriz sólida debe resistir la

compresión y un mezclado suave que podría requerir cada tipo de


9

fermentación. Esto requiere partículas pequeñas y granulosas que no tiendan a

unirse unas a otras.

La matriz sólida debe estar libre de contaminantes y de inhibidores del

crecimiento de los microorganismos y debe ser capaz de absorber o contener

substratos para el crecimiento microbiano como carbohidratos, fuentes de

nitrógeno y sales minerales. Estas condiciones son cumplidas por la mayoría de

los soportes naturales utilizados en la fermentación sólida como el bagazo de

caña, el salvado de trigo, etc. Existen también soportes inertes que cumplen

con estos requerimientos y que se han utilizado para la fermentación sólida

como la amberlita y especialmente, el poliuretano.

Procesos de la Fermentación en Estado Solido

Existe gran variedad de sustratos susceptibles de ser utilizados en

procesos de fermentación en estado sólido (FES), como la remolacha forrajera

(Beta vulgaris) también se puede obtener etanol, inoculando con levaduras

Saccharomyces cerevisiae (Gibbons y Westby, 1986). En este trabajo no se

menciona si existe la posibilidad de obtener algún subproducto solido para la

alimentación animal.

Del procesado del grano de café (Coffea arábiga o Coffea canephora),

durante el descascarado para la obtención del grano de café verde se obtiene

un subproducto llamado cascarilla. Este puede ser procesado por FES al

inocularlo con Aspergillus niger (Peñaloza et al., 1985). El beneficio es el

incremento de la calidad nutritiva del producto fermentado debido al aumento en

la concentración de aminoácidos. En la alimentación de pollos en crecimiento

con dietas que incluyen hasta un 10% de cascarilla de café fermentada, se


10

puede obtener una conversión alimenticia similar a la de pollos alimentados con

una ración preparada con ingredientes comúnmente utilizados (Peñaloza et al.,

1985). Los costos de producción se pueden disminuir con este tipo de raciones.

Incluso, las camas de pollinaza con cascarilla de café pueden ser expuestas a

la FES (Calderón et al., 2005). El resultado de este proceso es la mejora en la

calidad nutritiva del producto fermentado debido a incrementos en la

concentración de proteína verdadera (PV). Durante la FES de los subproductos,

parte de la materia seca disponible y de los carbohidratos estructurales son

utilizados como fuentes de energía para el crecimiento de la población de

microorganismos, mismos que originan el incremento en la concentración de

proteína verdadera en el subproducto.

La Sacchaharina es un producto obtenido por FES de la caña de azúcar,

limpia y sin cogollo. Este proceso biotecnológico utilizado en Cuba, aprovecha

la población de microorganismos y el alto contenido de azucares fermentables

presentes de manera natural en la caña de azúcar (Saccharum officinarum). La

ventaja de la Sacchaharina es que tiene un valor proteico mayor a la caña de

azúcar de la cual se obtuvo (Elías et al., 1990). La Sacchaharina puede sustituir

parte del concentrado en la dieta en la alimentación animal.

Valdivie et al., (1990), evaluaron la respuesta productiva de pollos de

engorda al ser alimentados con dietas que incluían 0,5 y 10% de Sacchaharina,

ellos recomiendan incluir como máximo un 10% de Saccharina en ese tipo de

dietas, debido a que este producto fermentado tiene una alta concentración de

fibra. Para obtener Sacchaharina se agrega urea como fuente de NNP para la

síntesis de proteína y sales minerales para potencializar el crecimiento de


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poblaciones de levaduras y bacterias presentes en el sustrato (caña de azúcar).

El proceso es sencillo, de bajo costo y no necesita equipo sofisticado la

(Sacchaharina rustica).

También se puede producir Sacchaharina a nivel industrial en

condiciones controladas (Sacchaharina industrial), lo que requiere de inversión

económica alta en equipo lo que puede hacerlo incosteable. No se requiere la

adición de agua, no se generan residuos y el producto fermentado se retienen

las vitaminas, aminoácidos y enzimas producidos por los microorganismos, los

cuales son de utilidad para el animal que los consume vivos (Vivas y Carbajal,

2004). En Cuba, con un proceso tecnológico similar al que se utiliza para la

obtención de Sacchaharina, se obtiene otro producto al que se le llama bagazo

rico en proteína o Bagarip (Pedraza, 2000). Para producirlo se prepara una

mezcla de cachaza, miel final (melaza) de la industria del azúcar, bagazo de

caña, fuentes de nitrógeno no proteico (NNP) y fosforo. Esta mezcla se inocula

con levaduras para su fermentación. El Bagarip, tiene un contenido de fibra

cruda más bajo (FC, <15% en base ceca) que los valores que se observan en la

mezcla de cachaza, miel y bagazo sin fermentar. Este producto puede incluirse

en dietas para no rumiantes como sustituto parcial de los ingredientes

tradicionalmente usados y como suplemento en la dieta de rumiantes

alimentados con forrajes.

Fermentación Semi Sólida

Es este tipo de fermentación, utilizada básicamente para hongos, el

microorganismo se desarrolla en la superficie húmeda de un material sólido, el

cual generalmente es algún grano de cereal procesado, aunque se han


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realizado intentos para utilizar materiales de desecho. Esto permite al hongo

crecer en condiciones similares a las encontradas en la naturaleza; las esporas,

los propágulos infectivos mediante los cuales el hongo sobrevive e infecta

insectos, son producidas en el aire. Aunque las fermentaciones semi sólidas

son relativamente fáciles de desarrollar en pequeña escala, el escalado de las

mismas a las proporciones necesarias para productos comerciales es bastante

difícil (Tavorsky, 1992). En el caso de los hongos entomopatógenos, los países

en vías de desarrollo han aplicado métodos de fermentación en sustrato sólido,

pero estos presentan muchas restricciones para la producción a nivel comercial.

Por un lado, el escalado se dificulta por problemas asociados con la

esterilización del sustrato, intercambio gaseoso, control de la temperatura,

mantenimiento de cultivos puros y recuperación del producto a partir del

sustrato. Por otra parte, el tiempo de fermentación necesario para la

esporulación en sustratos sólidos (generalmente requiere semanas), la cantidad

de personal y la infraestructura (grandes espacios físicos), son factores que

aumentan los costos de gran manera en este tipo de metodologías (Deshpande,

1999; Jackson, 1997; Jackson et al., 2004).

Fermentación Sumergida

Frente al panorama descrito antes para la fermentación semi sólida, la

fermentación sumergida se perfila como el método más económico para la

producción de agentes biocontroladores. Se trata, como su nombre lo indica,

del crecimiento de microorganismos en sistemas totalmente líquidos (Tavorsky,

1992). Existen gran cantidad de ventajas que hacen de esta metodología más

efectiva, entre las que se destaca la necesidad de menos mano de obra para
13

operar el fermentador y manejo del producto. Se cuenta además con la

posibilidad de controlar de manera más sencilla factores ambientales como la

temperatura, aireación y pH, manteniendo más estable el medio de crecimiento,

cuya homogeneidad favorece las etapas de procesamiento posteriores

(Jackson, 1997; Tavorsky, 1992).

Fermentación Liquida

Se puede definir a la fermentación líquida (FL) o sumergida como un

cultivo de células microbianas dispersas en forma homogénea en un recipiente

agitado que puede no ser aireado por medios mecánicos.

La forma de fermentación liquida más utilizada en los laboratorios de

investigación es el matraz agitado. El desarrollo de esta técnica ha sido

importante porque ha permitido el cultivo de organismos aeróbicos en

condiciones homogéneas con una densidad moderada de la biomasa y ha

simplificado el estudio de la fisiología de los organismos. A su vez, el cultivo de

suspensiones de células en fermentadores agitados ha evolucionado a gran

escala, pues no es raro ver fermentadores con volúmenes superiores a 10 mil

litros, en los cuales se producen todo tipo de compuestos derivados del

metabolismo microbiano. En estos sistemas, la agitación mecánica permite

aumentar la transferencia del gas a la biomasa de tres formas básicas: 1)

Dispersa el gas en burbujas más pequeñas incrementando el área de interface

gas-líquido. 2) Incrementa el tiempo de contacto de líquido con las burbujas de

gas. 3) Disminuye el grueso de la capa estacionaria del líquido al aumentar la

turbulencia del cultivo. Además, la agitación mezcla el cultivo manteniéndolo

homogéneo. Esto es particularmente importante para la dispersión de la


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biomasa y la transferencia de calor (Henzler y Schedel, 1991). Los productos

metabólicos y el calor se dispersan fácilmente, por lo que, no son un factor

limitante para el crecimiento del microorganismo. La barrera principal de

transferencia del O2 en la FL, es su baja solubilidad en el agua y, al hacerse

mayor la capa de agua que debe cruzar, aumenta la dificultad para que llegue a

la célula. Gran parte del gasto energético que debe realizarse en la FL está

relacionado con la necesidad de satisfacer la demanda de oxígeno en el

crecimiento de los microorganismos, esto es muy claro en el caso de

Aspergillus niger, que es un organismo aeróbico estricto y necesita una alta

tasa de transferencia de oxígeno para mantener su crecimiento y producir

muchos de los metabolitos de interés (Righelato, 1975; Solomon, 1975;

Raimbault, 1998).

Principales Características del Cultivo Microbiano

Hubert (1987), Jones y Thomas (1987) mencionan que los cultivos de

levadura presentan varias características importantes: 1) No son patógenos, ni

tóxicos, 2) No se absorben en el tracto digestivo, 3) No dejan residuos en los

tejidos animales, 4) Se utilizan en pequeñas cantidades, 5) Proliferan in vivo e

in vitro, 6) Promueven el crecimiento de bacterias celulolíticas, 7) Son estables

a temperaturas elevadas y 8) No causan mutación.

Condiciones de Crecimiento de Saccharomyces Cerevisiae

Las levaduras requieren para su óptimo crecimiento un ambiente acuoso,

pH con rango de 3.5 a 5.0, posiblemente debido a que la actividad de las

proteínas plasmáticas de las levaduras en los límites de su membrana se da en

estos valores de pH (Rose 1987a); en estas condiciones de pH requerido para


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el crecimiento de la levadura, levadura, la actividad bacteriana a nivel ruminal

tendría consecuencias detrimentales para los microorganismos y para los

rumiantes.

Las levaduras mantienen su actividad metabólica y resisten el estrés

físico asociado con el secado, calentamiento y exposición al pH ácido en

condiciones anaeróbicas (Dawson 1989). No obstante, se ha demostrado que

S. cerevisiae presenta crecimiento limitado bajo esas condiciones (Andreasen y

Stier 1953) y es incapaz de mantener una población productiva dentro del eco-

sistema ruminal (Dawson y Newman 1987; Arambel Y Rung-Syin 1987), no

pueden mantener una población viable en el rumen y son incapaces de

establecerse permanentemente (WiIliams et al. 1990); por tal motivo, no es

común que desarrolle crecimiento a nivel ruminal, en forma adicional a lo

anterior el crecimiento de las levaduras se ve afectado por la presencia de

ácidos grasos insaturados, tales como el colesterol y el ácido nicotínico (Rose

1987b); sin embargo, se ha observado cierto grado de viabilidad ruminal

(Dawson et al. 1990; Hession et al. 1992), que se puede explicar en parte por

los estudios in vitro realizados por Cobos (1996) en condiciones anaeróbicas y

con una concentración de bacterias similar a la esperada en el rumen, donde se

observó que la viabilidad de las diferentes cepas de levadura S. cerevisiae es

mínima después de 12 h; por lo tanto, se estima una alta tasa de degradación

de las levaduras por parte de las bacterias rumínales.

El rango de temperatura óptima para el crecimiento de las levaduras es

de 28 a 30ºC, con sobrevivencia a 37ºC por medio de la formación de

ascosporas (Dengis et al. 1995), aunque a 39ºC que es la temperatura del


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ambiente ruminal, se ve afectado su crecimiento y disminución de la viabilidad

de la levadura a 48 h de incubación (Mendoza 1993).

Ventajas y desventajas de la fermentación en estado sólido comparada

con el cultivo sumergido en líquido

Doelle et al., (1992) consideran como ventajas los siguientes aspectos:

Los medios de cultivo son simples, generalmente subproductos agrícolas que

presentan un alto contenido de los nutrientes necesarios. La baja actividad del

agua es de gran ayuda para evitar las contaminaciones, especialmente de

bacterias y levaduras. La concentración natural del sustrato permite utilizar

reactores más pequeños en comparación con los utilizados en otro tipo de

fermentación. Tienen mayor productividad volumétrica. La aireación forzada es

facilitada por la porosidad del soporte, lo que permite una alta transferencia de

oxígeno al microorganismo. Pueden emplearse, frecuentemente conidios como

inóculo en los procesos de crecimiento de hongos, lo cual disminuye los costos

y las manipulaciones en la preparación del inóculo. Los conidios de los hongos

que se producen son mucho más resistentes y tienen mejor adaptabilidad a las

condiciones en las que se aplican como agente de biocontrol. El proceso de

recobrado es simplificado. Algunos productos son utilizados integralmente,

como alimento animal, productos para el control biológico. Los procesos se

consideran generalmente como tecnologías limpias.

Entre las principales desventajas se encuentran: Su aplicación se limita a

microorganismos que crecen en bajos contenidos de humedad. La extracción

del calor metabólico puede ser un problema, sobre todo cuando se trabaja a

gran escala y no se controla el proceso. La naturaleza sólida del sustrato trae


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problemas al medir los parámetros de la fermentación tales como el pH, la

temperatura, el contenido de humedad y la concentración de sustrato y

productos. Los procesos de transferencia de masa son limitados por la difusión.

Muchos aspectos ingenieriles como el diseño de reactores y el escalado están

muy poco caracterizados. El tiempo de fermentación es mayor debido a que

generalmente se utilizan microorganismos que presentan bajas velocidades

específicas de crecimiento.

Es bueno recalcar que algunas de estas desventajas son relativas, por

ejemplo, el tiempo de fermentación ya que actualmente se están empleando

bacterias en los procesos de FES. Se realizan grandes esfuerzos en la

búsqueda de soluciones parciales a las dificultades antes mencionadas,

algunos como Gervais y Bazelin (1986) experimentaron con un reactor que

permitía la regulación de la humedad relativa del aire y su temperatura en

circulación, ya que según Ballio et al., (1964) y Richard-Molard et al., (1985),

demostraron que durante el desarrollo del hongo, la variación de la actividad del

agua (H2O) en el medio, puede influir en el crecimiento micelial o en la

germinación de las esporas y esto puede ser útil para optimizar la producción

de conidios en fermentadores con sustrato sólido, donde la suplementación de

oxígeno y la cosecha de conidios, resulta más fácil que en fermentaciones

líquidas.

Para el caso específico del control biológico, en la producción de hongos

por fermentación sumergida, en determinados casos, se obtienen blastosporas,

que si bien son estructuras infectivas, resultan poco resistentes a los cambios

de las condiciones climáticas (temperatura, radiación, humedad, etc.), a


18

diferencia de los conidios que se producen en las fermentaciones en fase

sólida. Se caracterizan las primeras por presentar cubiertas delgadas y lisas,

que influyen negativamente en cuanto a su eficiencia y persistencia después de

las aplicaciones dificultando, además, la formación de epizootias.

Optimización de Medios de Cultivo.

Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativa la optimización

de los medios de cultivo (Ertola y et al., 1994). Entre ellas podemos mencionar

las siguientes: La no existencia de información respecto a coeficientes de

rendimiento de macro y micro elementos para el cultivo del microorganismo

determinado. La existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente

de microelementos y factores de crecimiento. El uso de medios de cultivo

conteniendo elementos en exceso respecto de los requerimientos nutricionales

del microorganismo en cuestión, que pueden causar inhibición del crecimiento.

El ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del crecimiento

y formación del producto. El empleo de fuentes nutricionales no convencionales.

Acerca de esto existen en la literatura diferentes ejemplos sobre técnicas que

hacen posible la optimización de los medios de cultivo. La mayoría de estas,

basan la formulación de los mismos en la composición elemental del

microorganismo a estudiar o de otros similares que puedan servir de referencia

para realizar un balance de materia apropiado. (Dreyer et al., 2000).

La optimización de los medios de cultivo con fines industriales, en la

mayoría de los casos ha sido efectuada mediante procedimientos empíricos de

ensayo y error, no solo en la formulación del medio de cultivo, sino también en

las condiciones de operación. De cualquier manera es probable que el medio de


19

cultivo original pueda ser optimizado, modificando el porcentaje de los

componentes del mismo y las materias primas utilizadas, siendo factible en

muchos casos optimizar un medio de tal manera que no sea solamente más

productivo, sino de menor o igual costo que el original, para lo cual se requiere

del uso de varios métodos de optimización (Dreyer et al., 2000).

Un aspecto relevante en la optimización de un medio de cultivo de interés

industrial no es sólo el logro de una formulación racional del mismo, sino

también la posible inclusión de materias primas de bajo costo que hagan

rentable el proceso. Ello ha llevado a la búsqueda de subproductos de bajo

valor comercial que puedan sustituir componentes costosos y que puedan ser

utilizados como fuentes de carbono o nitrógeno (Dreyer et al., 2000).

Metabolismo Aeróbico

En base a sus requerimientos o sensibilidad al oxígeno los

microorganismos pueden ser clasificados como anaerobios, aerobios estrictos y

aerobios facultativos. Para los microorganismos aeróbicos, la presencia del

oxígeno juega un papel muy importante en la regulación de sus actividades

metabólicas.

Los microorganismos aeróbicos necesitan oxigeno para obtener la

energía de los alimentos, y la concentración del oxigeno en el medio de cultivo

juega un papel central en la regulación metabólica por ello, en el cultivo de este

tipo de microorganismos, el aire debe ser distribuido al Interior del liquido de

fermentación para pasar al interior de las células por difusión simple, tras esto

debe cruzar el citoplasma hasta el lumen mitocondrial de este modo, el oxigeno

consumido por los microorganismos debe pasar a través de varias barreras


20

antes de alcanzar la matriz mitocondrial donde se usará como aceptor de

protones al final de la fosforilacion oxidativa. La concentración de 02 que es

ligeramente superior al 21% en el aire llega a ser casi nula en la matriz de la

mitocondria. El proceso de transferencia de oxígeno se debe a su gradiente de

concentración entre las diferentes fases del cultivo. La concentración y la

velocidad de transporte del oxigeno del aire a la biomasa puede modificar de

manera importante el comportamiento del microorganismo en el cultivo al

controlar la producción de ATP y con ello todo la producción energética de los

microorganismos (Pirt, 1975; Righelato. 1975).

Uso de las levaduras obtenidas de la manzarina en la alimentación animal

Becerra (2006), Hang et al. (1981) y Joshi y Sandhu (1996) coinciden en

que durante la FES del BM, el producto obtenido se ve enriquecido

nutricionalmente y esto es resultado del incremento de la cantidad de levaduras

con que se inoculó o de la potencialización del desarrollo poblacional de

aquellas que se encuentran presentes de manera natural en el BM; esto genera

que en el caso de la manzarina, se pueda asumir que además de ser un

alimento rico en PV, sea un alimento con un aporte importante de levaduras,

debido a la alta cantidad de levaduras que contiene, ya sea obtenida del BM

(Becerra, 2006) o de MD (Díaz, 2006).

Una célula de levadura puede llegar a pesar 7.922*10 -11 g (Haddad y

Lindegren, 1953), tomando esto en cuenta, las levaduras pueden representar

una fracción importante de la MS de la manzarina, considerando que se han

obtenido conteos de hasta 4.5*108 ufc ml-1 (Rodríguez et al., 2006b), en base

seca esa cantidad puede ser hasta 10 veces mayor.


21

En la alimentación de rumiantes, las levaduras agregadas en la dieta

influencian el metabolismo microbiano ruminal (Miller-Webster et al., 2002); se

ha reportado que al agregar cultivos de levaduras en dietas con una alta

proporción de concentrado, se puede reducir la producción de lactato e

incrementar un poco el pH en el rumen (Moya et al., 2008); incluso la adición de

cultivos de levaduras en la dieta de vaquillas lecheras puede incrementar la

cantidad total de bacterias viables en el rumen (Lascano y Heinrichs, 2008).

Sin embargo, aún y cuando algunas levaduras son anaerobias

facultativas, debido a su hábitat natural aerobio (requieren oxígeno para el

desarrollo normal de sus poblaciones), 24 h después de suspender su

suplementación en la dieta, la cantidad de levaduras viables en condiciones

ruminales puede ser indetectable (Kung et al., 1997).

Cuando se incluyen en dietas para ganado lechero, las vacas alimentadas

muestran tendencias a tener menor concentración de ácidos grasos no

esterificados en la circulación sanguínea periférica, después del parto

(AlIbrahim et al., 2008); tienden a incrementar el porcentaje de grasa en la

producción de leche (Putnam et al., 1997; Wang et al., 2001), tienden a

incrementar la producción de leche (Bitencourt et al., 2008; Putnam et al., 1997;

Wohlt et al., 1998; Wang et al., 2001), pueden incrementar el consumo de

materia seca (Dann et al., 2000; Wohlt et al., 1998) e incluso pueden disminuir

la pérdida de condición corporal antes del parto (Robinson, 1997).

Se han utilizado en dietas para crías de ganado lechero en un 1% de la

dieta en BS, aparentemente esto reduce la susceptibilidad a las infecciones

(Seymour et al., 1995).


22

En no rumiantes, productos obtenidos de las levaduras, tienen un efecto

benéfico en la ecología microbiana del conducto gastrointestinal; disminuyen la

población de Clostridium perfringens (Hernot et al., 2008); pueden capturar

bacterias patógenas en el conducto gastrointestinal, esto debido a que esas

bacterias se unen a las paredes celulares de levaduras (Ganner et al., 2008),

permitiendo tener un efecto de modulación en la concentración microbiana en el

intestino de cerdos destetados (Weedman et al., 2008).

Los cultivos vivos de levaduras permiten la estabilización de la microflora

normal del ciego cuando se ofrecen en la dieta a cerdas gestantes y lactantes

(Walker et al., 2008), existiendo la posibilidad de incrementar su productividad,

debido a incrementos en la ganancia de peso de las camadas y reducción del

número de días del destete al empadre exitoso (Kim et al., 2008).

MATERIALES Y METODOS

Esta investigación se llevó a cabo en la Facultad de Zootecnia de la

Universidad Autónoma de Chihuahua, en el laboratorio de Nutrición Animal. La

precipitación media anual es de 336 mm. La temperatura media anual es de

18.6 ºC, con un periodo libre de heladas de 223 d (INEGI, 2001). Esta

investigación se llevo acabo de marzo a mayo de 2009.


23

Tratamientos

T1 T2 T3 T4

Ingredientes % Lev. A Lev. A Lev. A Lev. A


Malta Manzana Melaza Suero
Extracto de
Malta 2 20
Manzana Molida 30 300
Melaza de Caña 10 100
Suero de Leche 50 500
Lev. A 0,1 1 1 1 1
Lev. B 0,1
Lev. C 0,1
Lev. D 0,1
Urea 1 1 1 1 1
Minerales 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Sulfato de
amonio 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Agua destilada CBP 977.3 697.3 897.3 497.3
1000 1000 1000 1000

Ingredientes % Lev. B Lev. B Lev. B Lev. B


Malta Manzana Melaza Suero
Extracto de
Malta 2 20
Manzana Molida 30 300
Melaza de Caña 10 100
Suero de Leche 50 500
Lev. A 0,1
Lev. B 0,1 1 1 1 1
Lev. C 0,1
Lev. D 0,1
Urea 1 1 1 1 1
Minerales 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Sulfato de
amonio 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Agua destilada CBP 977.3 697.3 897.3 497.3
1000 1000 1000 1000
24

Ingredientes % Lev. C Lev. C Lev. C Lev. C


Malta Manzana Melaza Suero
Extracto de
Malta 2 20
Manzana Molida 30 300
Melaza de Caña 10 100
Suero de Leche 50 500
Lev. A 0,1
Lev. B 0,1
Lev. C 0,1 1 1 1 1
Lev. D 0,1
Urea 1 1 1 1 1
Minerales 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Sulfato de
amonio 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Agua destilada CBP 977.3 697.3 897.3 497.3
1000 1000 1000 1000

Ingredientes % Lev. D Lev. D Lev. D Lev. D


Malta Manzana Melaza Suero
Extracto de
Malta 2 20
Manzana Molida 30 300
Melaza de Caña 10 100
Suero de Leche 50 500
Lev. A 0,1
Lev. B 0,1
Lev. C 0,1
Lev. D 0,1 1 1 1 1
Urea 1 1 1 1 1
Minerales 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Sulfato de
amonio 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Agua destilada CBP 977.3 697.3 897.3 497.3
1000 1000 1000 1000
25

Se prepararon cuatro sustratos, tratamientos (t) para evaluar la

fermentación en estado sólido sumergido. T1) 20 gr de Extracto de malta (EM)

más 1 g de levadura, T2) 300 ml de Manzana molida (MA) mas 1 g de levadura,

T3) 100 ml de Melaza de caña (ME) más 1 g de levadura, T4) 500 ml de Suero

de leche (SL) más 1 g de levadura. Todos los tratamientos contaron con la

adición de 1% de Urea, 0.2% de sulfato de amonio, 0.5% de premezcla de

vitaminas y minerales traza para favorecer el crecimiento de levaduras y se

aforo a 1,000 ml con agua destilada todos los matraces. Sus combinaciones

fueron evaluadas en 12 Matraces de vidrio de 1,000 ml, cada tratamiento consto

de 3 repeticiones consistentes en matraces de vidrio de 1,000 ml, a cada

matraz se le adapto un oxigenador con la finalidad de inyectar el oxigeno

necesario para la producción de las levaduras ya que es una fermentación

aeróbica, solida sumergida. Durante el periodo de fermentación de las

muestras, fueron tomadas 3 muestras por tratamiento en diferente tiempos (0,

2, 4, 8, 16, 32, 64 y 128 h). Durante los cuales se determinó el pH, temperatura,

carbohidratos, conteos de levaduras y amoniaco.

Mediciones en muestras líquidas

De la hora 0 a la 128 se tomo una muestra de cada repetición de 30 ml, en

frascos de platico y se congeló a -5°C para detener el proceso de fermentación

y posteriormente, se descongelaron a temperatura de refrigeración 4°C para

determinar Amoniaco y conteos de levaduras como se describe a continuación.

pH. Se midió directamente en los matraces a la hora mencionada de cada

muestreo, se determinó el pH midiéndolo con un potenciómetro digital de una

precisión de ±0.1 unidades, se tomo como base la metodología descrita por


26

Rodríguez et al. (2001a). Temperatura, se midió directamente con la ayuda de

un termómetro digital de una precisión de ±0.1. Carbohidratos, se tomo la

lectura con la ayuda de un Refractómetro HI 96801 digital de una precisión de

±0.2. Para este análisis se utilizo 2 gotas de muestras para su lectura y se

utilizo 3 gotas de agua destilada para su calibración. Conteo de levaduras (CL).

Para este análisis se tomó como base, la metodología descrita por Díaz (2006)

y Rodríguez et al. (2001a). Se realizó en todas las muestras en las diferentes

horas de muestreo, las muestras de 30 ml fueron depositadas en frascos de

plástico con tapa de 50 ml; en cada muestra, se agregaron dos agotas de

solución de formalina al 10% para preservarla en refrigeración hasta realizar el

conteo.

El CL se realizó por microscopía; con una pipeta de volumen variable con

un rango de 100 a 1000 µl y puntas desechables se tomó 1 ml de muestra

líquida y se preparó una dilución serial utilizando agua destilada como diluyente;

con una pipeta de volumen variable con un rango de 0.5 a 10 µl y puntas

desechables se tomaron 10 µl de la dilución -3 o -4 de cada muestra, y se

colocaron en un hematocímetro (cámara de Neubauer) para el conteo.

La solución de muestra más agua destilada preparada inicialmente, se

consideró la dilución -1; la cámara de Neubauer se lavó con alcohol etílico

desnaturalizado después de cada CL. Cada célula o grupo aglomerado de

células identificadas como levaduras se consideró como una unidad formadora

de colonias (ufc), estas se contaron en las cuatro esquinas del hematocímetro

(4 cuadrantes de 1 mm2 cada uno; ver Figura 1). Se calculó el promedio de ufc

por cuadrante y se multiplicó por 10,000 para obtener la cantidad de ufc*ml -1


27
28

Figura 1. Cuadrícula de un hematocímetro (cámara de Neubauer). a, b, c

y d, fueron los cuatro cuadrantes utilizados para el conteo de levaduras, su

superficie suma un total de 4 mm2, el espacio entre un cubre objetos y la

superficie de la cámara de Neubauer, utilizando los límites de cada cuadrante

como guía tiene 0.1 mm3 de volumen. Imagen disponible en

http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/contajecelular.htm

Nitrógeno amoniacal (N-NH3). De las muestras líquidas obtenidas del la

h0 a la h128 se tomaron 30 ml de la solución, se colocaron en recipientes de

plástico, se agregaron dos gotas de ácido ortofosfórico y se congelaron (-5°C)

para su conservación hasta el momento de la determinación de N-NH3 al

momento de la determinación, las muestras se descongelaron a temperatura de

refrigeración, (4°C) la concentración de N-NH3 de las muestras líquidas se

determinó por colorimetría según el procedimiento de Taylor (1996), en un

espectrofotómetro Coleman Junior ® II modelo 6|20. Fue necesario diluir las

muestras líquidas con agua destilada, a una concentración de 80 µg de la

muestra.

La ecuación de predicción para calcular la concentración de N-NH3 en las

muestras líquidas, se obtuvo del análisis por triplicado de soluciones estándar

con concentraciones de 0, 5, 10, 15, 20 y 25 µg de N-NH3 *ml-1; se utilizó H2Od

como blanco (estándar con concentración de 0 µg*ml -1).

El procedimiento para medir la absorbancia de las muestras líquidas

diluidas, de las soluciones estándar y de los blancos (0 µg*ml -1), se realizó por

triplicado y consistió en lo siguiente: en tubos de ensayo se agrego 920 µg de

agua destilada y 80 µg de la muestra concentrada para completar 1 ml, se


29

mezclaron en vórtice (Vortex Genie II) posteriormente se tomo 50 µg de la

muestra diluida para cada repetición y se deposito en tubos de ensayo, a lo que

se le agrego 2.5 ml de fenol y se mezclo en un vórtice, posteriormente se

agrego 2 ml de hipoclorito y se mezclo nuevamente, para el estándar o del

blanco, se agrego 50 µg de agua destilada, 2.5 ml de fenol y 2 ml de

hipoclorito, las soluciones obtenidas se mezclaron en un vórtice y se incubaron

por 5 minutos en baño de agua caliente (temperatura de 95~100°C).

Posteriormente, las muestras se dejaron enfriar por 5 minutos a

temperatura ambiente para después tomar la lectura de la absorbancia del

contenido de cada muestra, se midió a una longitud de onda de 630 nm;

previamente el valor de la absorbancia fue ajustado a 0 utilizando los blancos

como referencia. Este procedimiento se describe brevemente por Madrid et al.

(1999), ellos utilizaron 6 ml de solución de H2SO4 concentrado y 1 ml de

muestra líquida para el análisis, en este trabajo se modificó a 3 ml de H 2SO4 y

0.5 ml de muestra debido al tamaño de las celdas del espectrofotómetro. Con

los resultados de la absorbancia de las muestras líquidas diluidas, la ecuación

de predicción obtenida con las soluciones estándar y el porcentaje de dilución

de las muestras líquidas en agua, se calculó la concentración de N-NH3 en

miligramos por gramo de muestra (mg*g -1) en base húmeda (BH).

Análisis Estadístico

El diseño para este experimento se hizo con un arreglo completamente

aleatorio, considerando efectos fijos los niveles sustrato y levadura; el efecto

aleatorio del matraz dentro de cada tratamiento (parcela), el efecto de tiempo, el

efecto de las interacciones de sustrato, levadura y tiempo, para el último el


30

efecto de la interacción triple de factor tiempo, factor sustrato y factor levadura;

los datos se evaluaron con el procedimiento (Proc Mixed) del programa (SAS

2002), para un diseño al azar con arreglo factorial 4x4 en parcelas. Las

variables de respuesta fueron pH; temperatura; azucares solubles; Ufc y

Amoniaco, el modelo propuesto fue:

Yijke = μ + Li + Sj + (SL) ij + Rk (ij) + Ti + (TS) ie + (TL) je + (SLT) ije + εijke

Donde:

Yijke = Variable respuesta

μ = Media general

Si = Efecto del i sustrato

Lj = Efecto del j nivel de levadura

(SL)ij = Efecto de la Interacción de i nivel sustrato j nivel de levadura

= Error de matraz (parcela) k en el tratamiento i nivel de sustrato


Rk(ij)
y j nivel de levadura

Ti = Efecto de e timpo

(TS)ie = Efecto de la Interacción de e tiempo e con i nivel de sustrato

(TL)je = Efecto de la Interacción de e tiempo con j nivel de levadura

= Efecto de la Interacción de e tiempo con i nivel de sustrato y j


(SLT)ije
nivel de levadura

εijke = Error residual de tratamiento con i nivel de sustrato con j nivel

de levadura, en la parcela k y e tiempo


31

RESULTADOS Y DISCUSION

El objetivo de este experimento fue evaluar 4 tipos de sustratos diferentes:

1) Extracto de Malta (EM); 2) Manzana molida (MA); 3) Melaza de caña (ME);

Suero de leche (SL) y 4 tipos de levaduras comerciales, A, B, C y D usando la

fermentación solida sumergida (FSS) en condiciones aeróbicas, para obtener

un punto de referencia y comparar las posibles interacciones de los diferentes

tratamientos, con la presencia de oxigeno en los medios de cultivo, utilizando

una temperatura ambiente de 18 a 27°C en condiciones de laboratorio

pH. Es una condición química que refleja la concentración de productos

acidificantes o alcalinizantes en un medio, este indicador representa una

condición química, cuando se encuentra a un nivel bajo, inhibe la proliferación

de ciertas bacterias, su nivel alto o bajo es dependiente de la presencia de

asidos y otros compuestos como el NH3. El pH de los sustratos fermentados se

observa en las Graficas 1 a la 4.

Esta variable mostro un comportamiento similar para todos los sustratos

con efecto cuadrático (P<0.001) durante el proceso; así también, mostro una

interacción (P<0.001) de tratamiento por el efecto cuadrático de la hora,

indicando que ese incremento fue distinto entre tratamientos.

Según los valores estimados, de la h 0 a la h 128 de FSS, el pH del

sustrato de t1 puede incrementarse de un valor de 3.01±0.95 (h8) hasta un

5.86±0.95 (h128). El pH del sustrato de t2 puede incrementarse desde

3.06±0.95 (h4) hasta 5.59±0.95 (h64). En el sustrato t3 puede incrementarse

desde 5.37±0.95 (h16) hasta 5.81±0.95 (h8) y en el sustrato t4 puede ir desde

4.48±0.95 (h16) hasta 6.60±0.95 (h2). En la FES y en la FSS de algunos


32

sustratos, la disminución de pH está relacionada con el incremento de la

concentración de ácidos orgánicos; la producción de ácidos orgánicos es el

resultado del consumo de carbohidratos de fácil fermentación (Calderón et al.,

2005). El incremento de pH está relacionado directamente con la producción de

NH3 y con una menor producción de ácidos orgánicos (Elías et al., 2001;

Rodríguez et al., 2001b).

El incremento de pH también está relacionado con el incremento del

contenido total de aminoácidos y productos alcalinizantes (Peñaloza et al.,

1985). Rodríguez et al. (2001b), en el proceso de FES de mezclas de bagazo

de caña y boniato, observaron que el pH se incremento después de 72 h de

fermentación.
33

Tiempo (horas)

Grafica 1. Comportamiento del pH de los diferentes sustratos con la levadura A


durante la FSS.

pH Levadura A

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 4,65 3,47 3,15 3,01 3,06 3,21 3,31 3,62
MA 4,04 3,96 3,60 3,48 3,66 3,77 4,71 4,64
ME 5,75 5,66 5,59 5,54 5,37 5,39 5,68 5,71
SL 4,73 6,58 5,13 4,61 4,38 4,26 4,40 4,22
34

Tiempo (horas)

Grafica 2. Comportamiento del pH de los diferentes sustratos con la levadura B


durante la FSS.

pH Levadura B

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 5,32 5,43 5,49 5,55 5,51 5,63 5,71 5,86
MA 4,06 4,10 4,14 4,14 3,99 3,30 4,35 4,36
ME 5,77 5,77 5,76 5,73 5,75 5,69 5,24 5,04
SL 4,73 6,54 5,71 5,72 4,48 4,36 4,40 4,48
35

Tiempo (horas)

Grafica 3. Comportamiento del pH de los diferentes sustratos con la levadura C


durante la FSS.

pH Levadura C

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 5,13 5,12 4,94 4,57 3,63 3,15 3,42 3,85
MA 3,99 4,02 4,07 4,07 3,68 3,66 5,41 5,50
ME 5,68 5,77 5,74 5,72 5,68 5,45 5,41 5,23
SL 4,73 6,60 5,84 4,72 4,46 4,32 4,46 4,37
36

Tiempo (horas)

Grafica 4. Comportamiento del pH de los diferentes sustratos con la levadura D


durante la FSS.

pH Levadura D

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 5,35 5,85 5,37 4,51 3,73 3,72 4,82 5,67
MA 3,96 3,98 4,01 3,97 3,84 3,81 4,42 4,26
ME 5,75 5,81 5,75 5,74 5,68 5,26 5,54 5,56
SL 4,75 6,58 5,77 4,76 4,48 4,34 4,28 4,38
37

Temperatura (T). Los organismos que consumen oxigeno, producen

calor debido a su actividad metabólica, por esta razón esta variable es un

indicador de actividad metabólica y es importante en la FES y en la FSS ya que

indica si existe o no este tipo de actividad biológica. Esta variable tuvo un

comportamiento (P<0.001), el efecto de la interacción del sustrato tratamiento,

por el efecto de levadura durante la FSS (hora) fue significativo (P<0.001).

La temperatura se incremento (P<0.001) de la h0 a la h128 en todos los

tratamientos, posteriormente disminuyo (P<0.001) para mantenerse cerca de la

temperatura de incubación a partir de la h8.

Los valores estimados de las medias en la h0 de la FSS fueron

26.00±0.14 en t1, 25.60±0.14 en t2, 19.23±0.14 en t3 y 23.90±0.14. Las T más

altas se observaron en la h128 para t1, (Grafica 5) para t2 en la h8 (Grafica 6)

para t3 en la h64 y (Grafica 7) y para t4 en la h128 (Grafica 8). El calor

acumulado en sustratos fermentados es el resultado de la actividad metabólica

de los microorganismos; la T también puede ser afectada por la conductividad

del material biológico fermentado (Ibarra et al., 2002).

En el proceso de obtención de la Saccharina que es (similar al de

manzarina), la T interna tiende a mantenerse constante a pesar de los cambios

de T ambiental; aun así, esta puede influenciar ligeramente la T del sustrato

(Ruiz et al., 2002). Según los datos estimados, en todos los tratamientos, la T

se comporto de una manera similar en los diferentes tiempos y con los

diferentes sustratos, indicando una actividad biológica como lo menciona Ibarra

et al., (2002).
38

Tiempo (horas)

Grafica 5. Comportamiento de la temperatura en los diferentes sustratos


con la levadura A durante la FSS.

Temperatura Levadura A

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 26,00 25,46 25,93 26,13 26,66 26,56 27,40 27,00
MA 24,86 24,60 25,26 26,33 25,86 25,60 26,26 25,60
ME 19,23 19,20 19,53 20,06 21,16 20,56 23,06 23,16
SL 23,90 23,26 23,76 24,00 24,60 24,50 24,13 24,96
39

Tiempo (horas)

Grafica 6. Comportamiento de la temperatura en los diferentes sustratos con la


levadura B durante la FSS

Temperatura Levadura B

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 26,00 25,53 25,43 25,80 25,83 26,36 26,56 26,80
MA 24,60 24,33 24,66 25,33 25,66 24,73 25,30 25,10
ME 19,23 18,76 18,86 19,40 19,83 20,43 22,46 22,66
SL 23,80 23,33 23,5 24,10 23,90 23,26 23,93 24,70

.
40

Tiempo (horas)

Grafica 7. Comportamiento de la temperatura en los diferentes sustratos con la


levadura C durante la FSS.

Temperatura Levadura C

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 25,60 25,20 25,16 25,70 25,60 26,06 26,60 26,36
MA 24,56 24,06 24,43 25,23 24,83 24,96 25,43 24,80
ME 19,23 19,03 19,00 19,26 19,76 20,56 22,66 22,80
SL 23,90 23,26 23,33 23,73 24,43 23,93 23,63 24,03
41

Tiempo (horas)

Grafica 8. Comportamiento de la temperatura en los diferentes sustratos con la


levadura D durante la FSS.

Temperatura Levadura D

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 25,50 25,30 25,76 25,96 26,53 26,33 27,13 27,40
MA 24,46 24,13 24,83 25,40 25,93 24,80 25,83 24,80
ME 19,20 18,86 18,86 19,30 19,80 21,60 23,06 22,80
SL 23,50 23,33 23,66 23,63 24,06 23,90 24,00 24,83
42

Conteo de Levaduras (CL). Se ha demostrado que el BM expuesto a

FES es específicamente con levaduras, mejora su calidad nutritiva (Hang et al.,

1981; Joshi y Sandhu, 1996), por esto, la evaluación de esta variable en las

condiciones de FES de los sustratos utilizados en este trabajo es importante.

Se observo un efecto (P<0.001) de interacción de tratamiento con

levaduras y tiempo, esto indica que hubo diferencias en la cantidad de

levaduras y su comportamiento fue fluctuante en los distintos sustratos con las

diferentes levaduras A, B, C y D (Graficas 9 a 12). La concentración más alta de

levaduras se observo en el t2 y t3 siendo así de 8.6*10 8 cel*ml/L en el t1 en la

h2 con la levadura A, para el t2 de 4.4*108 cel*ml/L en la h32 con la levadura

B, para el t3 5.6*108 cel*ml/L en la h128 con la levadura C y para el t4 1.7*109

cel*ml/L en la h128 con la levadura D.

El crecimiento de algunos microorganismos que se encuentran presentes

de manera natural en diferentes tipos de sustratos, se ve potencializado por la

presencia de carbohidratos fermentables, iniciando así con el proceso de FSS

cuando hay condiciones de presencia de oxigeno disuelto en el medio y otros

nutrientes como el NNP. En este caso las levaduras son más favorecidas en el

NNP fue aportado por la urea y el sulfato de amonio (Elías et al., 1990;

Rodríguez et al., 2001b; Becerra, 2006; Díaz, 2006).

El incremento en la calidad nutritiva de algunos sustratos fermentados,

se puede atribuir en gran parte al incremento de la población de levaduras, es

conocido desde hace décadas que su valor proteico es alto y debido a esto,

como concentrado, las levaduras pueden ser comparables a la pasta de soya,

aun y cuando su contenido de metionina es bajo (Klose y Fevold, 1945).


43

En este trabajo, la población de levaduras se incremento en mayor

proporción en los sustratos de melaza y de manzana con las levaduras A y D

basado en esto, el producto fermentado y en combinación con las demás

levaduras puede tener un valor nutritivo potencialmente mayor, según las

condiciones en que se llevo este experimento.

Nitrógeno Amoniacal (NH3). La urea añadida a los sustratos en

procesos de FSS, es transformada a NH3 por efecto de especies microbianas

ureoliticas (Valiño et al., 2002; Calderón et al., 2005), si el sustrato tiene un

aporte energético bajo, los microorganismos no pueden incorporarlo en la

formación de aminoácidos para su crecimiento o lo hacen en una proporción

baja. Cuando se tiene un pH bajo, el NH3 producido es retenido en el sustrato

(Rodríguez et al., 2001b). El NH3 también puede producirse por actividad

desaminativa (Calderón et al., 2005).

Esta variable se incremento cúbicamente (P<0.001), se observo

diferencia (P<0.001) entre tratamientos y levaduras (Graficas 13 a 16). En este

trabajo, de la h0 a la h128 de la FSS, la concentración de NH 3 en los sustratos

se incremento (P<0.001) de 0.10±0.01 a 0.78±0.01mM/ml en el t1 con la

levadura A, para el t2 de 0.02±0.01a 0.89±0.01 mM/ml con la levadura B, para

el t3 de 0.00±0.01a 0.81±0.01 mM/ml con la levadura C y para el t4 de

0.00±0.01 a 0.88±0.01 mM/ml con la levadura D, indicando actividad de los

microorganismos ureoliticos. El NH3 como compuesto puede ser utilizado por

ciertos microorganismos que no hidrolizan la urea agregada, como resultado de

esto, la cantidad de algunos microorganismos presentes en los sustratos

fermentados se puede incrementar (Valiño et al., 2002).


44

Tiempo (horas)

Grafica 9. Producción de levaduras en los diferentes sustratos con la levadura A


durante la FSS.

Ufc Levadura A

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 8,1E+07 8,6E+08 1,4E+08 1,2E+08 2,2E+08 2,5E+08 3,1E+08 3,0E+08
MA 5,2E+07 7,2E+07 1,2E+08 3,2E+08 3,3E+08 3,2E+08 3,5E+08 4,3E+08
ME 7,5E+07 7,1E+07 1,2E+08 2,2E+08 5,2E+08 3,9E+08 8,2E+08 4,4E+08
SL 5,8E+07 5,8E+07 7,8E+07 7,9E+07 9,3E+07 2,5E+07 1,8E+08 2,6E+08
45

Tiempo (horas)

Grafica 10. Producción de levaduras en los diferentes sustratos con la levadura


B durante la FSS.

Ufc Levadura B

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 0,0E+00 0,0E+00 0,0E+00 0,0E+00 8,4E+06 6,8E+06 1,6E+07 5,0E+06
MA 0,0E+00 0,0E+00 0,0E+00 0,0E+00 5,0E+07 4,4E+08 3,0E+08 4,6E+08
ME 0,0E+00 0,0E+00 0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 7,1E+07 7,4E+08 7,1E+08
SL 0,0E+00 0,0E+00 1,0E+07 2,2E+07 2,8E+07 1,3E+07 6,3E+07 4,3E+07
46

Tiempo (horas)

Grafica 11. Producción de levaduras en los diferentes sustratos con la levadura


C durante la FSS.

Ufc Levadura C

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 4,6E+06 8,0E+06 1,1E+07 1,0E+07 2,5E+07 6,9E+07 2,9E+08 5,6E+08
MA 4,8E+06 1,1E+07 8,4E+06 2,0E+07 2,3E+08 3,8E+08 3,4E+08 4,6E+08
ME 2,4E+06 9,0E+06 1,1E+07 8,5E+06 7,0E+07 5,2E+07 4,6E+08 5,1E+08
SL 7,6E+06 2,6E+07 3,5E+07 3,2E+07 1,9E+07 1,2E+07 1,1E+08 1,4E+08
47

Tiempo (horas)

Grafica 12. Producción de levaduras en los diferentes sustratos con la levadura


D durante la FSS.

Ufc Levadura D

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 1,6E+07 2,0E+07 4,9E+07 1,1E+08 3,8E+08 3,7E+08 2,6E+08 1,3E+08
MA 6,4E+06 1,2E+08 4,5E+07 6,8E+07 1,7E+08 3,0E+08 3,8E+08 3,7E+08
ME 1,0E+07 1,4E+07 1,6E+07 1,1E+07 1,3E+08 3,1E+08 1,4E+09 1,7E+09
SL 1,1E+07 4,8E+07 5,6E+07 4,7E+07 3,8E+07 5,6E+07 8,4E+07 4,0E+08
48

Tiempo (horas)

Grafica 13. Producción de NH3 en los diferentes sustratos con la levadura A


durante la FSS.

Nitrógeno Amoniacal Levadura A

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 0,071 0,053 0,016 0,021 0,009 0,010 0,016 0,010
MA 0,051 0,073 0,053 0,006 0,008 0,006 0,010 0,016
ME 0,058 0,081 0,096 0,078 0,030 0,015 0,014 0,034
SL 0,064 0,032 0,072 0,068 0,076 0,065 0,075 0,072
49

Tiempo (horas)

Grafica 14. Producción de NH3 en los diferentes sustratos con la levadura B


durante la FSS.

Nitrógeno Amoniacal Levadura B

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 0,062 0,077 0,070 0,070 0,013 0,049 0,042 0,043
MA 0,069 0,082 0,073 0,078 0,077 0,005 0,001 0,002
ME 0,072 0,089 0,050 0,055 0,052 0,054 0,015 0,025
SL 0,072 0,039 0,072 0,076 0,076 0,077 0,008 0,073
50

Tiempo (horas)

Grafica 15. Producción de NH3 en los diferentes sustratos con la levadura


C durante la FSS

Nitrógeno Amoniacal Levadura C

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 0,078 0,074 0,012 0,076 0,059 0,042 0,023 0,017
MA 0,050 0,056 0,072 0,083 0,011 0,033 0,012 0,000
ME 0,063 0,069 0,047 0,037 0,070 0,018 0,013 0,016
SL 0,075 0,029 0,067 0,080 0,081 0,078 0,074 0,066
51

Tiempo (horas)

Grafica 16. Producción de NH3 en los diferentes sustratos con la levadura


D durante la FSS

Nitrógeno Amoniacal Levadura D

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 0,067 0,078 0,015 0,081 0,084 0,032 0,026 0,053
MA 0,050 0,056 0,072 0,088 0,011 0,033 0,012 0,000
ME 0,072 0,082 0,068 0,047 0,059 0,051 0,018 0,015
SL 0,081 0,043 0,065 0,077 0,068 0,077 0,054 0,081
52

Calderón et al., (2005) sugieren que tanto lactobacilos como levaduras

son capaces de captar NH3 para sintetizar proteína unicelular. Rodríguez et al.,

(2001a) mencionan que no todo el NH3 producido es utilizado, ya que la

producción de NH3 es más rápida que su utilización para la síntesis de

aminoácidos.

Es importante señalar que en los tratamientos los incrementos de pH

coinciden con el incremento del NH3 y con una mayor cantidad de levaduras, al

parecer, la disponibilidad de NH3 en el sustrato, puede llegar a facilitar el

desarrollo de las levaduras. Las levaduras son capaces de captar NH 3

produciendo como resultado proteína unicelular (Calderón et al., 2005), sin

embargo, no todo el NH3 producido es utilizado, debido a que su producción es

más rápida que su asimilación, permitiendo que una parte se pierda en el

ambiente (Rodríguez et al., 2001a).

Azucares Solubles (AS). Los azucares y el oxigeno son para las

levaduras lo que el oxigeno para la vida del hombre, de su vitalidad depende la

conversión de los azucares solubles fermentables en alcohol. La levadura de

cerveza contiene 17 vitaminas, todas las del grupo b, 14 minerales y 46% de

proteínas.

Las células de levaduras en crecimiento rápido ofrecen varias vacuolas,

pero las maduras, normalmente, sólo muestran una. Dentro de su membrana

única, se encuentran partículas densas, de polifosfato, a las que

tradicionalmente se denomina gránulos de velutina. Cuando crecen en

condiciones aeróbicas, y en especial si la concentración de glucosa es escasa

se observan varias mitocondrias en el interior de cada célula. Cada mitocondria


53

está rodeada por una doble membrana. Las mitocondrias albergan a los

citocromos a las enzimas respiratorias y al sistema responsable de la

biosíntesis de adenosin trifosfato (ATP). Son, por tanto, las responsables del

metabolismo oxidativo de los azúcares, que se degradan a dióxido de carbono y

agua; el ATP que sintetizan almacena la energía química derivada de estas

reacciones. En condiciones anaeróbicas, o cuando las concentraciones de

glucosa son altas, las mitocondrias.

Los grados Brix se miden en el cociente total de sacarosa disuelta en un

líquido. Una solución de 25 ° grados brix tiene 25 g de azúcar (sacarosa) por

100 g de líquido o, dicho de otro modo, hay 25 g de sacarosa y 75 g de agua en

los 100 g de la solución.

En este trabajo la finalidad de la variable azucares disueltos, nos brinda

información muy útil ya que al observar el comportamiento de los azucares

disponibles en el medio liquido, entendemos mejor como es el comportamiento

de las levaduras en los diferentes sustratos, y en los diferentes tiempos que se

multiplican las levaduras (Graficas 17 a 20).


54

Tiempo (horas)

Grafica 17. Comportamiento de azucares solubles en los diferentes


sustratos con la levadura A durante la FSS

Azucares Solubles en Levadura A

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 1,80 1,73 1,70 1,46 1,53 1,66 1,46 1,43
MA 2,23 2,00 1,06 0,90 0,80 0,90 0,70 0,66
ME 8,10 8,40 7,80 6,36 6,26 6,03 5,63 5,80
SL 0,00 3,56 3,63 3,60 3,60 3,46 3,20 2,20
55

Tiempo (horas)

Grafica 18. Comportamiento de azucares solubles en los diferentes sustratos


con la levadura B durante la FSS

Azucares Solubles en Levadura B

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 2,26 2,30 2,26 2,26 2,20 1,86 1,30 1,26
MA 2,56 2,60 2,56 2,63 0,80 1,86 0,53 0,53
ME 9,23 9,43 9,46 9,53 9,46 8,86 5,90 5,26
SL 0,00 3,76 3,93 3,83 3,76 3,83 2,83 2,30
56

Tiempo (horas)

Grafica 19. Comportamiento de azucares solubles en los diferentes sustratos


con la levadura C durante la FSS

Azucares Solubles en Levadura C

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 2,23 2,20 2,20 2,20 1,83 1,70 1,60 1,60
MA 2,73 2,73 2,86 2,80 0,83 1,76 0,73 0,60
ME 9,16 9,20 9,16 9,00 8,90 5,70 5,30 5,06
SL 0,00 3,70 3,90 4,00 3,80 3,73 2,96 2,36
57

Tiempo (horas)

Grafica 20. Comportamiento de azucares solubles en los diferentes sustratos


con la levadura D durante la FSS

Azucares Solubles en Levadura D

0 2 4 8 16 32 64 128
EM 2,23 2,20 2,20 2,20 2,20 2,13 2,13 2,13
MA 3,40 3,40 3,46 3,06 1,03 1,90 1,00 0,76
ME 8,76 8,76 8,60 8,53 7,83 5,16 5,00 4,76
SL 0,00 3,60 3,83 3,86 3,60 3,36 2,80 2,26
58

En este trabajo la finalidad de la variable azucares disueltos, nos brinda

información muy útil ya que al observar el comportamiento de los azucares

disponibles en el medio liquido, entendemos mejor como es el comportamiento

de las levaduras en los diferentes sustratos, y en los diferentes tiempos que se

multiplican las levaduras (Graficas 17 a 20). Se observo en las graficas la

disminución en la concentración de azucares solubles conforme avanza el

tiempo y aumentaba la biomasa.

En la medición de azucares solubles, se observa como se presenta la

disminución de los azucares en los sustratos con las diferentes levaduras

mientras avanza la fermentación, este comportamiento es normal debido a que

conforme avanza el tiempo, se incrementa el número de células lo cual provoca

la disminución de los azucares.


59

CONCLUSIONES

Se define la fermentación en estado sólido sumergido (FSS), como un

proceso en el cual se desarrollan microorganismos en materiales líquidos,

utilizando de un 10 a un 30% de materia solida. La producción de alimento

animal por medio de la fermentación en estado sólido sumergido de residuos

agroindustriales, fundamentalmente, de la producción azucarera y manzanera,

han alcanzado notables avances a pesar de las limitaciones que aun se

señalan, tanto por los resultados en el incremento de la masa microbiana como

por la formación de productos. En la actualidad, múltiples investigaciones en

nuestro país están dirigidas a dar un importante aporte a esta tecnología, que

permitirá su integración al desarrollo diversificado de la industria de la caña de

azúcar y de la utilización de manzana o residuos de las jugüeras como lo es el

bagazo de fruta o la pomasa, que permitan producir y dar respuesta a la gran

demanda de proteína para uso animal, de una manera amigable con el medio

ambiente.

El proceso de producción de proteína unicelular por medio de la (FSS) es

una vía biotecnológica adecuada para el aprovechamiento de desechos

industriales ricos en carbohidratos. El principal factor limitante en la generación

de proteína unicelular es el alto costo de las fuentes de carbono, por lo que el

uso de subproductos es ideal.


60

LITERATURA CITADA

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