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I.

INTRODUCCIÓN

La Salmonella spp es un bacilo Gram-negativo anaerobio facultativo perteneciente a la familia


Enterobacteriaceae. Aunque los miembros de este género son capaces de moverse por medio
de flagelos peritricos, existen variantes no móviles como S. entérica serovar Pullorum y S.
entérica serovar Gallinarum, así como cepas no móviles debido a la presencia de flagelos
disfuncionales. Las especies de Salmonella son quimiorganotrofos, con habilidad para
metabolizar nutrientes por las vías fermentativa y respiratoria. Las bacterias crecen
óptimamente a 37°C y puede catabolizar la D-glucosa. Estos microorganismos son oxidasa
negativos y catalasa negativos, crecen en citrato como única fuente de carbono, generalmente
producen ácido sulfhídrico, descarboxilan la lisina y ornitina, y no hidrolizan la urea. La mayoría
de estas características se utilizan para la identificación bioquímica de cepas aisladas de
Salmonella.

La Salmonella presenta dos rutas metabólicas, la oxidativa y la fermentativa. Son oxidasa


negativos porque fermentan la glucosa generando ácido y gas, descarboxilan la lisina y la
ornitina, no hidrolizan la urea. La mayor parte de integrantes de este género no pueden
fermentar la lactosa ni la sacarosa. Para la detección de la salmonela los mejores agares para la
detección son el agar XLD y al agar sulfito de bismuto, sin embargo hay otros más. En el agar
XLD, la lisina va ser aquella que aumentará la diferenciación de los microorganismos
pertenecientes al género Salmonella, ya que sin la lisina estos microorganismos rápidamente
fermentan la xilosa produciendo la acidificación del medio y no se podrá diferenciar de otras
especies no patógenas. Sin embargo en el agar SB, el verde brillante del medio proporcionará el
carácter selectivo, ya que inhibe el desarrollo de las bacterias gran positivas.

Es por ello que el objetivo para este trabajo es determinar la presencia o ausencia de Salmonella
en una muestra de alimento.
II. MATERIALES Y MÉTODOS:

Materiales

- Muestra de Alimento.
- Homogenizador de una o dos velocidades, con control por reóstato, podría utilizarse
también una licuadora.
- Vasos o recipientes de vidrio o de metal, adecuados para el homogenizador, de 1 litro
de capacidad, resistentes a las temperaturas de esterilización en autoclave.
- Balanza de una capacidad no inferior a 2 500 g y de una sensibilidad de 0,1 g.
- Instrumentos para preparar las muestras: pinzas, tijeras, mangos de bisturí, espátulas;
todo ello previamente esterilizado en autoclave o por aire caliente.
- Incubadora a 35-37° C

Método: Detección de Salmonella.-

- Pipetas estériles de 5 y 1 mL.


- Placas petri estériles
- Caldo Lactosado o Agua de Peptona Tamponada
- Caldo Selenito Cistina
- Caldo Tetrationato verde brillante
- Agar Verde Brillante, Agar Sulfato de Bismuto o Agar XLD (xilosa, lisina, desoxicolato)
- Agar LIA (Lisina Hierro inclinado).
- Agar TSI (Triple Azúcar Hierro).
- Asa de siembra con alambre de nicrom.

Procedimiento

a) Enriquecimiento No Selectivo.-

1. Se taró el vaso del homogenizador estéril y luego se vació; se pesó 25g representativos de
la muestra a analizar.
2. Se añadió 225 g del diluyente (Caldo Lactosado) y luego se incubó el medio a 35-37° C
durante 18-24 horas.

b) Enriquecimiento Selectivo.-

1. Se transfirió 1 mL del cultivo de pre-enriquecimiento en 10 mL de Caldo Selenito cistina,


después se incubó a 43° C por 24 horas.
2. Volvimos a transferir 1 mL del cultivo de pre-enriquecimiento en 10 mL de Caldo
Tetrationato verde brillante y luego lo incubamos a 43° C durante 24 horas.

a) Siembra en Medios de Agar selectivos para Salmonella.-


1. Se transfirió una asada a alguno de los medios de aislamiento selectivo: Agar Verde
brillante, Agar Sulfito de bismuto o Agar XLD
2. Luego se incubó las placas a 35-37° C durante 24 horas.
3. Se revisó las placas y se buscó colonias típicas:
- Agar Verde brillante: colonias pequeñas incoloras, rosa o fucsia o translúcidas a opacas,
rodeadas de un halo rosa o rojo del medio.
- Agar Sulfito de bismuto: colonias marrones o grises a negras, con o sin brillo metálico,
rodeadas de un halo marrón a negro del medio.
- Agar XLD: colonias de color rojo purpúreo alrededor de las colonias con centro negro. El
medio evidencia un viraje de color del rojo al amarillo por la degradación de azúcares.
4. Se transfirió las colonias sospechosas por puntura y estría en superficie inclinada a medios
de diferenciación bioquímica: agar lisina hierro y agar triple azúcar hierro, en tubos
inclinados. Después se incubó los tubos a 35-37° C durante 24 horas.
5. Se realizó la lectura. Los cultivos sospechosos de Salmonella en:
- Agar Lisina hierro presentan una reacción alcalina (color púrpura) en todo el medio, con o
sin producción de H2S (ennegrecimiento del medio).
- Agar Triple azúcar hierro; acidez en el fondo por fermentación de la glucosa (amarillo) y
alcalinidad en la superficie porque no fermenta lactosa ni sacarosa (rojo).

III. RESULTADOS

Luego de los procesos de pre enriquecimiento (caldo Lactosado 225ml) y enriquecimiento


(tetraionato verde brillante y selenito cistina por separado) y del periodo de incubación se
dispuso a sembrar en Agar XDL, Agar Sulfito de Bismuto y Agar Verde Brillante dividiendo
cada Agar en 2 para ahorrar material usándose en cada uno el inóculo extraído de cada caldo
de enriquecimiento (TVB y SC) para determinada temperatura.

37°C 43°C
37°C

TVB TVB SC

TVB SC
SC
Agar VB

43°C
TVB

SC

SC

TVB
TVB
37°C 43°C
SC
Agar SB
Agar XDL

El agar utilizado porque presentaba las mejores colonias presuntivas de salmonella fue el Agar
SB tanto de 37 y 43°C. Se extrajo un inóculo de las colonias que presentaban un color entre verde
y negro, con precipitación oscura y se sembró en baterías de bioquímica para la determinación
de presencia de salmonella.
Las baterías bioquímicas dieron un resultado negativo ante Salmonella, siendo fácil de
observar porque no se presentó la reacción característica de precipitación negra (sulfato
ferroso) en TSI, LIA, SIM.

UREA VP RM SIM LIA TSI CS

43°C
INOCULADO OBTENIDO DEL AGAR SB
RESULTADOS DE LA SIEMBRA DEL

37°C
Basándonos en los criterios microbiológicos publicados por el MINSA podemos catalogar al
alimento usando la siguiente tabla:

La tártara presenta ausencia/25g lo que quiere decir que el producto es aceptable y es adecuado
para el consumo.

IV. DISCUSION
1. Fundamento de los medios para detección de Salmonella sp.
Agar XLD (Xilosa-lisina-desoxicolato)
Este agar contiene tres carbohidratos (xilosa, lactosa y sacarosa) para la producción
de ácidos, rojo de fenol como indicador de pH, tiosulfato como fuente de azufre,
citrato férrico de amonio para detectar la producción de H2S y lisina para evidenciar
la actividad de la lisina descarboxilasa. La lisina se incluye para aumentar la
diferenciación de los microorganismos pertenecientes al género Salmonella, ya que
sin la lisina estos microorganismos rápidamente fermentan la xilosa produciendo la
acidificación del medio y no se pueden diferenciar de otras especies no patógenas.
El desoxicolato de sodio es utilizado como un inhibidor de los microorganismos
Gram positivos.

Colonias Típicas: Las colonias sospechosas de Shigella sobre el agar XLD son
transparentes y parecen rojas por el color del medio. Este género bacteriano al no
fermentar la xilosa, la lactosa, ni la sacarosa, no da lugar a que el rojo fenol vire a
amarillo. Como estos microorganismos tampoco tienen la capacidad de alcalinizar
el medio por la descarboxilación de la lisina, no se produce color rojo púrpura
alrededor de las colonias. Las colonias típicas de la Salmonella son de color rojo
con el centro negro debido a la producción de H2S.

Agar SB (Sulfito de Bismuto)


Se trata de un medio selectivo/ diferencial que se utiliza con el fin de aislar colonias
presuntivas del género Salmonella. El verde brillante del medio es una de las
sustancias que le proporciona el carácter selectivo, ya que inhibe el desarrollo de
las bacterias gran positivas. El sulfito de bismuto tiene dos efectos, el selectivo y el
diferencial. El metal pesado bismuto selecciona a Salmonella frente a los coliformes
y a los gram positivos. Por su parte, el sulfito permite la diferenciación de
microorganismos que pueden producir la enzima desulfhidrasa. La producción de
esta enzima por Salmonella lleva a la formación a partir del sulfito, de sulfuro de
hidrógeno (H2S), éste reacciona con el sulfato ferroso (FeSO4), que produce un
precipitado negro de sulfuro de hierro (FeS).

Colonias Típicas: Las colonias sospechosas de Salmonella sobre el agar SB tienen


una coloración que puede ir de verde a negra con o sin un halo oscuro,
presentando a menudo brillo metálico.

Agar Verde Brillante


Es un medio selectivo para el aislamiento de Salmonella spp., excepto S. typhi, S
paratyphi y Shigella. Los gram positivos así como Salmonella typhi y Shigella
resultan muy reprimidas por la concentración elevada de verde brillante. Contiene
además lactosa y sacarosa, el rojo fenol es el indicador de pH, que vira al amarillo
cuando hay producción de ácido a partir de la fermentación de azúcares. Este
indicador presenta color rojo intenso en ambiente alcalino, el cloruro de sodio
mantiene el balance osmótico, y el verde brillante actúa como agente selectivo.

Colonias Típicas: Las colonias típicas del género Salmonella son pequeñas,
incoloras, blancas, rosadas o fucsias, transparentes u opacas, sobre el medio
coloreado de rosado a rojo.

2. La salmonella es un microorganismo patógeno, es por ellos que se puede apreciar


en la tabla que no existen valores marginalmente aceptables, ya que el número de
microorganismos necesarios para que se desarrolle la enfermedad es muy bajo
(104-105) es por ello que no se puede arriesgar al consumidor.

3. Una ausencia de salmonella en la muestra quiere decir que ha habido una adecuada
elaboración de la tártara, con ingredientes limpios y en buen estado. Ya que esta
no sufre acción de agentes físicos o químicos como para la eliminación de este
microorganismo.

4. Si en caso contrario, se daría porque, la tártara es una salsa elaborada


principalmente de mayonesa, y una de los ingredientes que se usa para preparar la
mayonesa es el huevo. La salmonella al ser una bacteria que crece en el tracto
intestinal de los humanos y animales, como es este caso de la ganilla al momento
de poner sus huevos quedan resto de heces, la salmonella se queda impregnada en
la cascara, y si no habido una adecuada limpieza (lavado) o incluso la cascara es
encuentra deteriorada o con fisuras, los microorganismos podrían acceder al
interior del huevo.

5. Otro de los motivos por el cual habrían presencia de salmonella en la tártara, es por
el intervalo de tiempo relativamente alto después de su elaboración, ya que al ser
un organismo mesófilo, su rango del crecimiento óptimo se encuentra entre 20- 40
°C, la cual es igual al de la temperatura ambiente, por ende mientras más tiempo
se encuentre la muestra en la intemperie, sin refrigeración; habrá más posibilidad
de que el microorganismo se desarrolle.
V. CONCLUSIONES

 Se llegó a la conclusión de que Salmonella es una enterobacteria gram- la cual es


causante de infecciones como la salmonelosis y la fiebre tifoidea, por lo cual si se
detecta su presencia en alimentos estos deben ser descartados.

 La muestra de salsa tartará comprada en una carretilla cerca al mercado modelo de


San Miguel no encontró presencia de Salmonella lo que indicaría que la salsa era
apta para el consumo humano. Sin embargo, se llegó a esta conclusión después de
realizar todo el procedimiento incluyendo la bioquímica porque si se tenían
sospechas de que se podría encontrar a este patógeno en la muestra analizada.

 En el caso de las otras muestras sucedió lo mismo no se encontró presencia de


salmonella indicado que todas eran aptas para el consumo.

VI. RECOMENDACIONES

 Colocar la muestra en un caldo de pre enriquecimiento debido a que por los


procesos la Salmonella se daña por lo cual se coloca en este caldo, en el caso de
esta práctica fue el cado Lactosado.
 Dejar que se concluyan los tiempos de incubación a la temperatura sugerida.
 Realizar un buen rotulado con el fin de evitar confusiones
 Al momento de realizar la bioquímica tomar las cepas que sean más probables de
salmonella.

VII. BIBLIOGRAFIA

1. Brock T. Biología de los microorganismos. 10ma ed. Reino Unido: Pearson Pretince
hall; 2004.
2. Tortora G. Introducción a la microbiología. 9ª ed. México: Editorial médica
panamericana; 2007.
3. Microbiología Blog [en línea] [fecha de acceso; 16 de Junio del 2017], disponible en:
http://microbitosblog.com/2010/06/14/salmonella/
4. Facult. farmacia [en línea] [fecha de acceso; 16 de Junio del 2017], disponible
en:http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/sulf
itobismuto
5. Facult. farmacia [en línea] [fecha de acceso; 16 de Junio del 2017], disponible en:
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Ag
ar_XLD.pdf
6. Laboratorios Britania [en línea] [fecha de acceso; 16 de Junio del 2017], disponible
en: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/verdebriagar.htm