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La electroforesis en gel se usa de forma rutinaria para la detección y el análisis de tamaño

de proteínas y ácidos nucleicos [1-6]. La separación mediante este método utiliza una
corriente eléctrica para impulsar biomoléculas cargadas a través de una matriz de gel
poroso a una velocidad que es una función de la carga, el tamaño y la forma de las
moléculas. Las proteínas se analizan frecuentemente usando geles orientados
verticalmente hechos de poliacrilamida, mientras que el ADN y el ARN se analizan más
comúnmente usando geles de placas de agarosa horizontales. La agarosa existe como un
copolímero que contiene B-D-galactosa 1,3-ligada y 3,6-anhidro-α-L-galactosa 1,4-unida.
Un pequeño número de sulfato y otros grupos aniónicos también están presentes [3, 4, 7].
La ebullición del carbohidrato en agua y el enfriamiento conduce a la formación de haces
helicoidales de hebras de agarosa unidas por enlaces de hidrógeno. Los paquetes se
asocian entre sí para crear poros que permiten el tamizado molecular de biomoléculas.
Los geles de placas de agarosa horizontal estándar permiten la separación de ADN que
varían en tamaño de 75 a 30,000 pb [3,4,8,9].
Los ADN grandes en la parte superior de este rango se estudian usando geles de agarosa
de bajo porcentaje (0,3-0,5%), mientras que los ADN pequeños generalmente se analizan
usando porcentajes más altos (2-4%) [8-10]. La resolución más alta de ADN
monocatenarios y bicatenarios de menos de 75 nucleótidos de longitud se logra usando
geles de poliacrilamida. Esto se debe a que el fuerte marco de gel covalentemente unido
a la poliacrilamida puede producir poros de gel más pequeños y más estables, lo que
permite un tamizado molecular más fino [2,3,6].
La electroforesis de ADN en geles de placas se realiza principalmente utilizando uno de
los dos tampones estándar, ya sea TAE, 1 compuesto por Tris (2-amino-2- [hidroximetil] -
1,3-propanodiol), ácido acético y EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) o TBE (Tris,
ácido bórico y EDTA). Estas soluciones contienen un ácido débil, ácido acético o bórico,
que puede existir en formas neutras y aniónicas (por ejemplo, COOH y COO) y una base
débil, Tris, que existe en formas neutras o catiónicas (TrisNH2 y Tris-NH3 + ) Estos iones
llevan la corriente eléctrica, almacenan el pH y mantienen un medio de baja
conductividad. EDTA no es absolutamente esencial [4], pero se agrega como preventivo
porque quelata los iones de Mg2 + y, por lo tanto, inactiva las potenciales nucleasas de
ADN que pueden estar presentes.
Para la separación de moléculas de ADN que varían en tamaño desde varios cientos
hasta varios miles de pb, tanto TAE como TBE proporcionan una buena resolución de
fragmentos de ADN, con una separación ligeramente mejorada de fragmentos más
pequeños en TBE y de tamaños mayores en TAE.
A pesar de su rendimiento similar en la mayoría de las aplicaciones, se han observado
algunos efectos específicos del tampón, especialmente en tampones que contienen
borato [11-15].
En los últimos años, también se han desarrollado otros medios conductivos para la
electroforesis de ácidos nucleicos. Los ejemplos incluyen soluciones que contienen L-
histidina, borato de sodio, treonina sódica, borato de litio y mezclas de ácidos y bases
orgánicas compatibles con pKa [16-21].
La electroforesis de ADN generalmente se realiza a voltaje constante. Durante un
experimento, la corriente (medida en mA) aumenta y se produce el calentamiento del
buffer de ejecución. El voltaje se mantiene bajo, 10 V / cm, donde cm se refiere a la
longitud del gel, para minimizar los efectos de calentamiento. Para una plataforma de gel
horizontal típica de tamaño pequeño o mediano (10-15 cm de longitud), los suministros de
energía se establecen entre 100 y 150 V y los geles se ejecutan durante 50-90 min.
Aumentar el voltaje por encima de este rango utilizando tampones TAE o TBE 1X
estándar aumenta la velocidad de movimiento de los ADN, pero conduce a un
calentamiento asimétrico del gel y la solución. Tal calentamiento es indeseable porque
promueve el ensanchamiento, la inclinación y la compresión de las bandas entre sí, así
como un movimiento más rápido de las muestras en el centro que en el exterior del gel (''
sonriente '') y otras anomalías de carril [3 , 4,6,22].
Aunque TAE y TBE se emplean casi universalmente en laboratorios de bioquímica, sus
composiciones nunca se han optimizado rigurosamente y, por lo tanto, todavía se usan
concentraciones esencialmente arbitrarias en la actualidad (89 mM Tris, 89 mM de ácido
bórico y 2 mM EDTA en 1X TBE y 40 mM Tris, 20 mM de ácido acético y 1 mM de EDTA
en 1X TAE) [4, 8, 9].
En el estudio actual, hemos examinado sistemáticamente los impactos de las
concentraciones de ácido, base y EDTA en la corriente eléctrica y en la resolución de
ADN lineales y circulares dentro de geles de placas de agarosa. Además, se investigó el
impacto de la alteración de la estructura del gel, el porcentaje de agarosa y el volumen del
tampón de electroforesis en la corriente eléctrica. Usando condiciones optimizadas de
electroforesis que surgen de estos experimentos, demostramos que se pueden lograr
voltajes mucho más altos con los tampones tradicionales, lo que resulta en tiempos de
ejecución más cortos y una resolución mejorada de pequeñas moléculas de ADN y ARN.

Materiales y métodos

Materiales
La base Tris se adquirió de J. T. Baker y el ácido acético glacial de Mallinckrodt
Chemicals. Se obtuvieron ácido libre de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sal de
EDTA disódica y agarosa Omnipur de EMD Chemicals, Inc. El ácido bórico se adquirió de
Sigma-Aldrich y el bromuro de etidio (EtBr) de Shelton Scientific, Inc. El registro de 2-log
Escalera de ADN, escala de ADN de 1 kb, escala de dsARN y estándares de escalera de
ARNip se compraron de New England Biolabs.

Métodos de electroforesis en gel


Se realizaron experimentos de electroforesis en gel usando geles de agarosa al 1,0% y 6
equipos de gel GT 8 mini-subcelda de 10 cm (Bio-Rad) con un volumen de gel
predeterminado de 40 ml a menos que se especifique lo contrario.
Algunos experimentos utilizaron 11 geles de 14 cm y plataformas Horizon (LabRepco)
junto con volúmenes de gel de 70 ml. La agarosa se disolvió mediante microondas
(durante 25-30 s con un ajuste alto inicialmente, y luego en incrementos de 5-10 s) en el
mismo tampón de electroforesis que se usó para cubrir el gel en el equipo. Después de
verter en una bandeja de plástico con cinta unida a dos extremos, se dejó solidificar los
geles a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos. Permitir menos tiempo que
esto hizo geles propensos a los artefactos de la banda, posiblemente porque la agarosa
cerca de los pozos no se había solidificado por completo. Se emplearon fuentes de
alimentación EPS601 (Amersham Bioscience) y EC-105 (E-CApparatus Corporation) para
todos los experimentos de electroforesis. Se realizó electroforesis hasta que el borde
anterior del colorante azul de seguimiento con bromofenol había migrado a un punto que
estaba un 70% por debajo del gel. Se colocó una línea a los lados de cada bandeja de gel
para garantizar que el colorante de seguimiento viajara la misma distancia en cada gel.
Después de que se completó la electroforesis, los geles se tiñeron durante 15-20 minutos
con EtBr (0,5 ug / ml) y se enjuagaron 3-4 veces con agua desionizada, y las imágenes se
capturaron usando un generador de imágenes Alpha Innotech RED o un instrumento
Kodak Digital Science 440CF Imagestation . Para los experimentos que prueban los
efectos del EtBr sobre las corrientes eléctricas, el producto químico se añadió al gel
después de calentar en el microondas y al tampón de electroforesis que cubre el gel en
concentraciones que varían de 0,5 a 2,0 μg / ml.
Evaluación de los parámetros que afectan la temperatura y el pH durante la electroforesis

Para los experimentos que implican la medición de las temperaturas del tampón de gel, se
colocaron dos termómetros en el tampón de electroforesis, uno en cada extremo del
equipo, y se promediaron los resultados. El pH se determinó usando un medidor de pH
Corning 220 después de eliminar 2 ml de tampón de electroforesis desde arriba del ánodo
y el cátodo antes e inmediatamente después de completar la electroforesis.

Análisis de la migración relativa de ADN de plásmido superenrollado y lineal


Los experimentos que utilizan ADN de plásmido emplearon el vector lanzadera de
levadura p426URA3 [23]. Los plásmidos se purificaron usando un kit miniprep (Qiagen) y
se digirieron con EcoRI (New England Biolabs) para generar ADN linealizados, que se
precipitaron con etanol y se resuspendieron en agua antes de la electroforesis tal como se
describe [9].

Resultados

Los amortiguadores 1X TAE y 1X TBE se usan casi universalmente para la electroforesis


en gel de agarosa, pero su tendencia a acumular corriente eléctrica y calor limita los
voltajes que se pueden aplicar, que son típicamente 100-150 V para geles que son 10- 15
cm de largo. Para ampliar el trabajo previo [4] e identificar los factores que afectan el
calentamiento, inicialmente investigamos los efectos de la alteración de varios parámetros
físicos y químicos en la generación de corriente eléctrica utilizando geles de agarosa de
10 cm.
Un sistema típico de electroforesis en gel en placa horizontal se representa
esquemáticamente en la Fig. 1A. Se fijan la longitud y el ancho de un gel en un equipo
comercialmente disponible, pero el experimentador puede ajustar otros parámetros tales
como el porcentaje de agarosa, el tamaño total del gel y el volumen del tampón de
electroforesis. Las pruebas iniciales evaluaron los efectos de cambiar el volumen de la
solución amortiguadora dentro del equipo, determinado midiendo la altura del buffer por
encima de la superficie superior del gel (Fig. 1B).
Los experimentos emplearon un gel de agarosa al 1% (6 10 cm) preparado en 40 ml de
tampón TBE 1X y se midieron las corrientes eléctricas en un intervalo de 50-300 V. En
este experimento y en los otros mostrados en la Fig. 1, se tomaron medidas en 4 equipos
de gel diferentes y se muestran los promedios resultantes y las desviaciones estándar. El
aumento de la altura del búfer por encima del gel de 2 a 6 mm produjo un aumento
constante de la corriente. Por ejemplo, el ajuste de la altura de 2 a 6 mm aumentó la
corriente a 150 V (15 V / cm) de 61 a 85 mA, un aumento del 40% (Fig. 1B). La expansión
del volumen del gel (que produce cambios en la altura del gel porque la longitud y el
ancho son fijados por la bandeja de moldeo de gel) mientras se mantiene una altura de
tampón constante de 2 mm por encima del gel reveló que los geles más grandes
producen mayores corrientes. A 150 V, la corriente aumentó en un 64% cuando el
volumen de gel se elevó de 30 a 60 ml (Fig. 1C). Las alturas promedio para los geles
analizados en la Fig. 1C se determinaron como 4.1, 6.8, 7.3 y 9.0 mm para los geles de
30, 40, 50 y 60 ml, respectivamente.
Alterar el porcentaje de agarosa en un gel cambia su fuerza y tamaño de poro promedio y
determina el rango de fraccionamiento de tamaño efectivo. Los biólogos moleculares
rutinariamente ajustan este porcentaje dentro del rango de aproximadamente 0,5 a 3,0%,
dependiendo de los tamaños de los ácidos nucleicos que se analizan [8,9,24].
Curiosamente, las corrientes eléctricas no cambiaron cuando las concentraciones de
agarosa variaron entre 0,5 y 3,0% (Fig. 1D). Estos resultados indican que el volumen del
gel y la altura del tampón, pero no la concentración de agarosa y el tamaño medio de
poro, ejercen fuertes efectos sobre la corriente y el potencial de un sistema para producir
calentamiento excesivo durante la electroforesis.
El EDTA quela el magnesio, un cofactor esencial para muchas nucleasas, y por lo tanto
protege al ADN de la degradación, pero su necesidad en electroforesis ha sido
cuestionada [4]. Los principales tampones de electroforesis 1X TAE y 1X TBE contienen 1
y 2 mM de EDTA, respectivamente. Al pH de estos tampones (aproximadamente 8,0), tres
de los cuatro grupos de ácido carboxílico de EDTA existen principalmente en sus formas
de iones carboxilato cargadas negativamente y, por lo tanto, pueden contribuir a la
conductividad de la solución.
El EDTA es poco soluble por debajo del pH neutro y está disponible comercialmente tanto
en formas de ácido libre como de sal de sodio.

La forma disódica es más soluble que el ácido libre y se usa comúnmente en mezclas
concentradas de TAE y TBE que se venden comercialmente o se preparan en laboratorios
de investigación. Los impactos de las diferentes formas de EDTA sobre la corriente
eléctrica se investigaron en la Fig. 2. El tampón TBE estándar 1X (89 mM Tris, 89 mM de
ácido bórico, 2 mM EDTA), preparado usando ácido libre o EDTA disódico, produjo
corrientes más altas que Tampón de TB 1X que no contiene EDTA en cada voltaje entre
50 y 250 V (Fig. 2A). La forma disódica produjo corrientes más altas que el ácido libre,
presumiblemente debido a la conductividad aportada por los iones Na +.
Algunos protocolos que describen la preparación de TBE recomiendan agregar EDTA a
partir de una solución madre de EDTA disódica 50 mM o 0.5 M que previamente se ajustó
a pH 8,0 para permitir que el producto químico se disuelva [8,9,24]. Debido a que el
hidróxido de sodio se usa para establecer el pH, las soluciones preparadas de esta
manera tienen niveles más altos de iones de Na + y una conductividad eléctrica más alta
(figura 2A, enumerada como Na2EDTA, pH 8). Variando la concentración de la forma más
comúnmente utilizada, EDTA disódico (usando el polvo, no una solución madre ajustada a
pH 8,0, para preparar el tampón), reveló que la concentración debe reducirse a
aproximadamente 0,25 mM para reducir las corrientes al mismo nivel como una solución
sin EDTA (Fig. 2B).
1X TBE, que contiene 89 mM de Tris y 89 mM de ácido bórico, es la forma más común de
este tampón utilizado, pero algunos laboratorios preparan y procesan geles utilizando
0,5X TBE [9,25,26]. La disminución de la concentración de los principales electrolitos en el
tampón TB (Tris-NH3 + y B [OH] 4) utilizando 0.5X TB redujo sustancialmente la corriente
eléctrica (figura 2C). La corriente observada a 150 V en 1X TB se redujo en un 36% en
0.5X TB y en un 61% con 0.3X de buffer TB.
Las corrientes producidas usando 1X TAE como tampón de electroforesis también se
vieron influenciadas por la presencia y la forma de EDTA utilizada, pero los efectos no
fueron tan fuertes como los observados con TBE. 1X TAE preparado usando EDTA
disódico y corrientes generadas con ácido EDTA libre que no fueron estadísticamente
separables entre sí (superposición de las desviaciones estándar) (Fig. 2D). Además, las
corrientes en los tampones TAE que contienen EDTA eran solo modestamente más altas
que las observadas en el tampón TA sin EDTA. El impacto más moderado de eliminar
EDTA del tampón Tris-acetato es consistente con el hecho de que la concentración de
EDTA en 1X TAE es solo 1 mM mientras que es 2 mM en 1X TBE. Sin embargo, los
resultados obtenidos con 1X TA y 1X TB (cada uno sin EDTA) también fueron bastante
diferentes, siendo las corrientes con TA aproximadamente el doble de las observadas con
TB (Fig. 2D). 1X TA contiene Tris 40 mM y ácido acético 20 mM. La reducción de las
principales especies cargadas dentro de este tampón (TrisNH3 + y CH3COO) usando
0.5X TA redujo la corriente modestamente, hasta aproximadamente el nivel visto con 1X
TB (figura 2E). Estos experimentos demuestran que las concentraciones tanto de EDTA
como de los principales componentes ácido-base pueden modificarse para reducir la
corriente producida usando tampones TBE y TAE. Es práctica habitual en muchos
laboratorios de biología molecular añadir bromuro de etidio, un fluoróforo que se une al
ADN, al gel y a los medios conductores que cubren el gel, de modo que no es necesario
un paso de tinción del ADN posterior a la electroforesis [9]. Aunque la adición de esta
sustancia química introduce especies cargadas en el sistema, las corrientes eléctricas no
aumentaron cuando se incorporaron en geles procesados en 1X TBE en la concentración
estándar (0.5 lg / ml) o en concentraciones de hasta 2.0 lg / ml (Fig. 2F). ) Los
experimentos anteriores indicaron que 1X TB tiene una conductividad más baja que 1X
TA y que las corrientes son incluso más bajas en los tampones 0.5X y 0.3X TB.
El buffer 1X TBE estándar produce bandas nítidas y una buena resolución en geles que
funcionan a bajos voltajes típicos de 10 V / cm. Sin embargo, tales geles generalmente
requieren tiempos de ejecución de 50-90 minutos para lograr una separación óptima de
los fragmentos de ADN. Realizamos pruebas para determinar si se podía mantener una
buena resolución cuando la electroforesis se realizaba a voltajes más altos, produciendo
tiempos de ejecución más cortos, si se realizaban modificaciones apropiadas para
disminuir la corriente y, por lo tanto, reducir el calentamiento y los posibles artefactos de
bandas de ADN. Se preparó una serie de geles de agarosa al 1% de 10 cm de longitud
utilizando 1X TB, 0.5X TB y 0.3X TB. EDTA se dejó fuera de los buffers porque aumenta
la corriente y, por lo tanto, limita el voltaje que se puede aplicar. La electroforesis también
se realizó usando una baja altura de amortiguación (2 mm) y un bajo volumen de gel (40
ml) para minimizar la corriente. La electroforesis de los fragmentos de ADN lineales en
dos escaleras estándar de ADN usando 1X tampón TBE a 150 V (15 V por cm) reveló una
buena separación de las bandas (Fig. 3A, panel superior izquierdo). Los carriles 2 y 6 del
gel contienen una colección de fragmentos de entre 500 y 10.000 pb de tamaño y los ADN
en los carriles 4 y 8 varían de 100 a 10.000 pb. Los geles se corrieron hasta que el
colorante azul de rastreo de bromofenol migró 7 cm hacia abajo del gel de 10 cm. Las
mismas escaleras se corrieron posteriormente en tampón TB 1X a 150, 200, 250 y 300 V
(figura 3A). La resolución permaneció alta hasta 250 V, pero hubo una notable
compresión de bandas a altos voltajes, por lo que se redujo la distancia que separa las
bandas más alta y más baja del gel. Este fenómeno está indicado por el soporte grande y
la letra '' C '' en el lado derecho de la Fig. 3A. Además de la compactación general que
acercaba a todas las bandas entre sí, también se producía una compresión localizada de
algunas bandas entre sí, vista principalmente a 300 V (mostrada por los pequeños
corchetes y la letra minúscula '' C ''). El uso de 0,5X TB también produjo una buena
separación de bandas a tensiones de hasta 250 V, aunque la resolución se vio
comprometida a 300 V (figura 3B). Los geles preparados y procesados en 0.3X TB
exhibieron baja resolución y compresión de bandas entre sí en todos los voltajes, con una
compresión más fuerte y una intensidad de banda no uniforme aparente a 250 y 300 V
(figura 3C).
Por lo tanto, se logró una buena resolución usando 0.5X TB y 1X TB a tensiones de hasta
250 V (25 V por cm), aunque todas las bandas estaban más cerca entre sí a los voltajes
más altos.
Las corrientes eléctricas producidas durante la electroforesis de los geles mostrados en la
Fig. 3A y B, más los geles de control 1X TBE, se midieron al comienzo y al final de las
ejecuciones realizadas usando varios voltajes diferentes. Las corrientes de inicio y
finalización para geles ejecutados usando 1X TBE que contiene EDTA disódico fueron
mucho más altas que las observadas cuando se usaron 1X TB y 0,5X TB (Fig. 4A).
Además, las corrientes aumentaron en porcentajes más grandes (casi el doble) durante el
transcurso de cada ejecución cuando se utilizó 1X TBE. Cuando los geles se ejecutan a
voltaje constante y la corriente aumenta con el tiempo, la temperatura del tampón de la
cámara también tiende a aumentar. Se prepararon geles de diez centímetros y se
corrieron en 1X TBE, 1X TB y 0,5X TB a 150 y 200 V como antes, deteniendo cada gel
después de que el colorante de seguimiento con azul de bromofenol había migrado 7 cm.
Las temperaturas promedio del yacimiento amortiguador se evaluaron colocando
termómetros en las cámaras al comienzo e inmediatamente después del final de cada
ejecución. A 150 V, la temperatura aumentó solo 1 C durante la prueba en 0.5X TB, pero
subió 10 C en 1X TB y 16 C en 1X TBE (Fig. 4B). Incluso temperaturas más altas se
observaron a 200 V. Estos resultados confirman el postulado de que la reducción de las
concentraciones de EDTA y tampón puede tener fuertes impactos tanto en la
conductividad como en la temperatura producida durante un experimento de
electroforesis. La realización de electroforesis a mayores voltajes utilizando medios de TB
modificados produjo otra ventaja: grandes reducciones en los tiempos de ejecución del
gel. Por ejemplo, los geles 0,5X TB se ejecutan a 100 V (10 V / cm) requirieron 70 minutos
para que el colorante azul de bromofenol viajara 7 cm hacia abajo del gel (Fig. 4C). Por el
contrario, los geles ejecutados a 200 y 250 V se completaron en solo 32 y 20 minutos,
respectivamente, una reducción de tiempo de hasta 3 veces. La agarosa no se usa
comúnmente para la separación de ácidos nucleicos de aproximadamente 75 nucleótidos
de longitud o menos [8,9,24]. Los ácidos nucleicos de este tamaño se separan mejor y
producen bandas más finas en geles de poliacrilamida.
Parte del problema con el uso de agarosa es que el andamiaje débil, unido a hidrógeno
que forma los poros del gel permite una mayor difusión de moléculas pequeñas en todas
las direcciones, dando como resultado bandas anchas de aspecto difuso. Como la
difusión es un proceso dependiente del tiempo, razonamos que el uso de condiciones de
electroforesis y amortiguadores que permiten voltajes más altos y tiempos de ejecución
mucho más cortos debería mejorar la resolución de las moléculas pequeñas. Los geles
preparados con TBE producen una mejor separación de fragmentos más pequeños que
los geles TAE (figura 5A) y también generan menos corriente. Por lo tanto, los medios de
Tris-borato se usaron para probar la hipótesis.
Se prepararon geles de agarosa (4,0%) que tenían 14 cm de longitud en 0,5X TB y se
comparó la resolución de escalas de ADN de bajo peso molecular a 140 V (10 V / cm) y
350 V (25 V / cm, equivalente a 250 V en un gel de 10 cm). Las bandas eran
sorprendentemente menos difusas a mayor voltaje, con bandas delgadas y buena
separación de fragmentos de tan solo 20 bp (figura 5B). Se realizó un experimento similar
usando dos diferentes escaleras de ARN de doble cadena que contenían fragmentos que
variaban en tamaño de 17 a 500 pb. La nitidez de la banda se mejoró enormemente a 350
V, especialmente para la escalera de ARNip que contiene fragmentos de 17, 21 y 25 pb
(figura 5C). Los experimentos descritos anteriormente establecieron que 0.5X TB, sin
EDTA, puede usarse a voltajes más altos con buena resolución de grandes ADN lineales
y con resolución fuertemente mejorada de pequeños fragmentos lineales. Dado que los
biólogos moleculares analizan rutinariamente ADN plasmídicos circulares y sus derivados
circulares y abiertos circulares mellados en geles, también se investigó la migración de
estas moléculas en los tampones modificados. Dos formas de la levadura-E. vector de
lanzadera de coli p426TEF (6352 bp) [23] se analizaron, representando tanto
conformaciones superenrolladas (sin cortar) como lineales (corte enzimático de
restricción).
La electroforesis en un gel al 1% en 1X TBE convencional que contiene EDTA disódico
produjo patrones de migración que se observan típicamente en los tampones TAE y TBE,
con ADN superenrollado (SC) que migra más rápido que el ADN lineal (LIN) (Fig. 6A,
panel izquierdo) [1,2 , 27]. La banda débil en el carril SC que comigra con el estándar de
ADN lineal de 10 kb corresponde al ADN circular abierto mellado (NOC), que migró a una
posición por encima de las formas lineal y SC como se esperaba.
Sorprendentemente, el uso de tampón de TB 1X sin EDTA redujo fuertemente la
movilidad relativa del ADN SC, haciendo que corriera más lento (más alto) que la forma
lineal. Cuando la fuerza iónica se redujo más a 0.5X TB y 0.25X TB, la migración de la
forma SC fue incluso más lenta (Fig. 6A). Un 1X TBE y un 0.5X TBE preparado usando
ácido libre EDTA restauraron el patrón al observado con los tampones preparados usando
EDTA disódico, con SC DNA migrando más rápido que el DNA lineal (Fig. 6B). Las tasas
de migración de plásmidos en tampones Tris-acetato (TAE y TA) también se probaron. A
diferencia de los tampones TBE, la eliminación de EDTA de 1X TAE no modificó las
movilidades relativas de las formas SC y LIN (Fig. 6C). Durante la realización de los
experimentos mostrados en la Fig. 6A y B, observamos que varias bandas inferiores en la
escalera de ADN de 2 log parecían altamente difusas cuando se preparaba TBE con
EDTA de ácido libre. Para explorar esto adicionalmente, se corrieron varios geles de
agarosa al 1% adicionales a 10 V / cm (Fig. 7). Los geles que contienen 1X TB o 1X TBE
convencional (EDTA disódico 2 mM) producen bandas de escalera típicas y delgadas. Sin
embargo, en geles se corrieron con 1X TBE que contenía EDTA ácido libre a la
concentración estándar (2 mM), todas las bandas por debajo de 1 kb eran amplias y
difusas (Fig. 7A, ver flecha doble). De manera similar, los geles 0,5X TB y 0,5X TBE que
contienen EDTA disódico (1 mM o 2 mM) dieron bandas agudas (Fig. 7B, paneles
izquierdos), pero los geles 0,5X TBE que contenían 1 o 2 mM de EDTA ácido libre
exhibieron la difusión que fue mayor a la concentración más alta de EDTA (Fig. 7B,
flechas dobles). Curiosamente, el número de bandas afectadas fue aún más fuerte
cuando se usaron geles TBE de 0.25X (Fig. 7C). Para completar, también se probó la
calidad de la banda en geles de Trisacetate (Fig. 7D). En contraste con los resultados con
TBE, las bandas en geles TAE 1X que contienen 1, 2 o 4 mM de EDTA de ácido libre no
difirieron sustancialmente de las observadas en los geles TAE 1X estándar preparados
con EDTA disódico 1 mM. En un intento por comprender este efecto del ácido libre, se
corrieron geles de 10 cm que contenían 0,5X TBE preparados con EDTA disódico o ácido
libre como antes, excepto que se eliminaron alícuotas de los electrodos positivo y
negativo antes e inmediatamente después de cada corrida para mediciones de pH Los
valores de pH iniciales y finales medidos en el cátodo fueron similares para ambos tipos
de TBE; sin embargo, el pH del depósito que contiene el ánodo se redujo en 0.5-0.6
unidades de pH al final de la prueba cuando se usó el ácido libre. Este resultado implica
una interrupción en la capacidad de amortiguación y, debido a que el ánodo está más
cerca del fondo de cada gel, también es consistente con las imágenes de gel en la Fig. 7
que muestran que los efectos más fuertes se observaron en las bandas en el fondo de
cada gel.

Discusión

Los hallazgos presentados aquí demuestran que las modificaciones específicas de la


configuración física y los amortiguadores principales, especialmente TBE, pueden permitir
que los geles se ejecuten a voltajes más altos, sin corriente o calentamiento excesivos,
conservando una buena resolución de banda. Las pruebas revelaron que el uso de geles
más delgados y volúmenes de tampón de la cámara inferior (minimizando el nivel de
líquido sobre la superficie del gel) producía las corrientes más bajas. Por el contrario, la
alteración de la fuerza del gel y el tamaño medio de poro al variar la concentración de
agarosa de 0,5 a 3% no tuvo ningún efecto. La inclusión de bromuro de etidio en el gel y
el tampón de electroforesis durante un experimento en cantidades que eran hasta cuatro
veces superiores a la concentración estándar tampoco tuvo ningún efecto sobre la
corriente eléctrica. EDTA no es esencial para la electroforesis y se agrega como
preventivo para inhibir las nucleasas de ADN. Los valores de pKa de los cuatro grupos de
ácido carboxílico en EDTA son 1,99, 2,67, 6,16 y 10,26 [28]. Al pH de los tampones TAE y
TBE (8.0), tres de estos grupos existen predominantemente en sus formas de iones
carboxilato cargadas negativamente. Además, uno de los grupos amina dentro de EDTA
puede estar protonado y llevar una carga positiva [28], aunque cada molécula tendrá una
carga neta negativa. Como ya lo notaron Brody y Kern [4], observamos que la presencia
de EDTA en tampones de electroforesis influye en la conductividad. Los medios
preparados usando polvos químicos de sodio EDTA o soluciones madre de EDTA de
sodio que se habían ajustado previamente a pH 8,0 utilizando hidróxido de sodio, tal como
lo recomiendan algunos recursos de biología molecular, generaron corrientes eléctricas
más altas que las soluciones que contienen la forma de ácido libre. Estos resultados son
lógicos, ya que la presencia de iones Na + debería aumentar la conductividad de las
soluciones. Se observaron reducciones más fuertes en la corriente cuando las
concentraciones de Tris y acetato o borato se disminuyeron, por ejemplo, usando
tampones 0,5X en lugar de 1X. Dado que las conductividades de las soluciones de TB
(sin EDTA) eran inferiores a las de las soluciones de TA, este tampón se eligió para
pruebas adicionales.
El análisis de geles que contienen fragmentos de ADN que varían en tamaño de 100 a
10.000 pb reveló que la resolución se mantuvo alta hasta 20-25 V / cm (200-250 V en
geles de 10 cm) utilizando tanto 1X TB como 0,5X TB. Por el contrario, se detectó una
fuerte compresión de todas las bandas cuando se utilizó 0.3X TB, incluso a bajos voltajes,
lo que indica limitaciones a la reducción de la concentración de Tris-borato. El análisis de
los niveles de corriente final y las temperaturas finales alcanzadas en geles a 15-30 V /
cm reveló que los mejores resultados se lograron con 0,5X TB en comparación con 1X TB
o 1X TBE. Es importante destacar que el aumento de los voltajes dio como resultado
tiempos de ejecución más cortos. Los tiempos de ejecución de las muestras sometidas a
electroforesis a 200 y 250 V fueron aproximadamente la mitad y un tercio de los que se
ejecutaron a los 100 V. Aunque el ADN plasmídico superenrollado migra más rápido que
la forma lineal en los medios 1X TBE convencionales, observamos que el uso de 1X TB
sin EDTA hizo que la forma superenrollada migrara más lentamente. Además, la
movilidad del ADN superenrrollado se redujo aún más en 0.5X TB y 0.25X TB que en
soluciones 1X TB. La eliminación de EDTA y la reducción de las concentraciones de TB
disminuyen la fuerza iónica general dentro de los geles. Por lo tanto, los resultados
parecen ser consistentes con trabajos previos que muestran que el cambio de la fuerza
iónica afecta las movilidades de los ADN supercolados, cortados abiertos y lineales
abiertos de diferentes maneras, con el mayor impacto en el ADN superenrollado (forma I)
[1,2]. Aunque los tampones TBE producidos con EDTA ácido libre generaron corrientes
menores que los tampones preparados con la forma disódica, y no alteraron la migración
de ADN superenrollados frente a ADN lineales, el uso de esta forma de EDTA condujo a
una difusión y ampliación inusualmente fuertes de algunas bandas. El mecanismo preciso
que causa este fenómeno no está claro, pero parece estar relacionado con una capacidad
de amortiguación reducida y un cambio de pH en el depósito que contiene el ánodo. Por
lo tanto, aunque la sustitución de EDTA de ácido libre por EDTA disódico en tampones
TBE tiene la ventaja de reducir las corrientes eléctricas, los resultados presentados en la
Fig. 7 indican que tal cambio sería perjudicial para la resolución. Los ácidos nucleicos de
menos de aproximadamente 75 nt de longitud se resuelven poco en geles de agarosa,
incluso cuando se emplean altas concentraciones de agarosa (por ejemplo, 3-4%).

Esta deficiencia es causada principalmente por la rápida difusión de las moléculas


pequeñas en la matriz de agarosa débil, lo que conduce a un fuerte ensanchamiento a
medida que los ADN migran hacia abajo del gel. Pensamos que los voltajes más altos y
los tiempos de ejecución más cortos deberían mejorar la nitidez de la banda y la
separación de las moléculas pequeñas, principalmente porque hay menos tiempo para
que se produzca la difusión. Los geles de agarosa al 4% preparados en 0.5X TB sin
EDTA y ejecutados a 25 V / cm exhibieron bandas delgadas y excelente resolución de
ADN lineales y ARN que eran tan pequeños como 17 pb. Aunque la poliacrilamida se usa
habitualmente para resolver ADN tan pequeños, estos resultados demuestran que los
geles de agarosa que utilizan 0,5X TB a altos voltajes pueden sustituirse por muchas
aplicaciones, incluyendo potencialmente el análisis de cebadores de PCR,
oligonucleótidos de ADN modificados y ARN de interferencia corta (ARNip). ) Este
hallazgo es importante porque la preparación de geles de agarosa es más rápida y más
fácil y los aparatos de gel de agarosa son generalmente más simples que los utilizados
para geles de poliacrilamida. Además, la mayoría de los laboratorios de biología molecular
tienen equipos de gel de agarosa y fuentes de alimentación que pueden alcanzar los
voltajes descritos aquí (200-300 V), y por lo tanto, los experimentos se pueden realizar
utilizando la instrumentación existente.