PRÁCTICA NO.

7
PURIFICACIÓN DE COMPUESTOS ORGÁNICOS POR CROMATOGRAFÍA

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología
LABORATORIO DE QUÍMICA
ORGÁNICA APLICADA

PRÁCTICA NO. 7

–Purificación de compuestos orgánicos por

cromatografía–

Equipo: No. 1 Grupo: 2LM3

Fecha: miércoles 21 de marzo de 2018

Integrantes:

 Mariell Sandoval Molotla

 Daniela Sánchez Álvarez
 Antonio Aguilar Morales
 Dulce Marlen Tecotl Sanchez

Profesores:

 Gabriela Robles Mora

 Guadalupe Mariana Francisco Torres

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ÍNDICE

Objetivo …Pág.03

Introducción …Pág.03

Diagrama de bloques …Pág.05

Desarrollo experimental …Pág.08

Materiales y reactivos …Pág.08

Características físico-químicas y
toxicológicas de los reactivos. …Pág.08

Resultados …Pág.09

Análisis de resultados …Pág.11

Conclusiones …Pág.14

Fuentes consultadas …Pág.16

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OBJETIVOS

1. Conoceremos y comprenderemos los fundamentos de la

cromatografía.
2. Elegiremos el diluyente adecuado mediante cromatografía en placa
fina para separar mezcla de compuestos orgánicos mediante
cromatografía en paca fina.
3. Separaremos una mezcla de carotenos por cromatografía en columna.

INTRODUCCIÓN

La técnica de Cromatografía se basa en el principio general de distribución de

un compuesto entre 2 fases (fija y móvil.
La fase fija o estacionaria es la que tiene movimiento, en cambio la fase móvil
es la que está fija (no se mueve). En otras palabras, es el removimiento de los
componentes de una mezcla.

En cromatografía, los solutos se separan en base a la distinta velocidad de

desplazamiento cuando son arrastrados por una fase móvil a través de un
lecho cromatográfico que contiene a una fase estacionaria (sólida o líquida).
La muestra se disuelve en la fase móvil y se hace pasar a través de la fase
estacionaria (inmiscible con la móvil) que se mantiene fija en una columna o
sobre una superficie plana. Las dos fases se eligen de tal modo que los
componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre las dos
fases. Aquellos que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se
mueven lentamente con el flujo de fase móvil, mientras que los que se retiene
débilmente avanzan con más rapidez.

Cromatografía de líquidos (fase móvil líquida).

Fase estacionaria sólida: se trata de sólidos finamente divididos (con gran
superficie específica)
Cromatografía de adsorción: la fase estacionaria sólida retiene a los solutos
por un doble efecto de adsorción física y química. Las interacciones
implicadas son del tipo de fuerzas de van der Waals.
Cromatografía de cambio iónico: el sólido retiene a los solutos gracias a
atracciones electrostáticas. La fase estacionaria sólida lleva en la superficie
cargas electrostáticas fijas, que retienen contra iones móviles que pueden
intercambiarse por iones de la fase móvil.
Cromatografía de exclusión: la fase estacionaria es un material poroso, que
retiene a las moléculas en función de su tamaño. en ocasiones se denomina
también cromatografía de filtración sobre geles o de permeabilidad en
geles (GPC).

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Clasificación atendiendo al modo se lleva a cabo la separación (cómo se

ponen en contacto las fases):
Cromatografía en columna: la fase estacionaria se introduce en un tobo
estrecho a través del cual se hace pasar la fase móvil. Esta se desplaza por
capilaridad, gravedad o presión. Pueden emplearse fases móviles líquidas,
gaseosa o fluidos supercríticos.
Cromatografía plana: la fase estacionaria se coloca en un soporte plano. En
cromatografía plana el flujo de fase móvil se consigue por capilaridad o por
capilaridad y gravedad. Sólo pueden emplearse líquidos como fases móviles.
Existen:
 Cromatografía en papel: la fase estacionaria está constituida por el
agua retenida en la celulosa. también existen papeles cambiadores
de iones.
 Cromatografía en capa fina: la fase estacionaria es un sólido
adsorbente finamente dividido o un líquido inmovilizado sobre un sólido
colocado sobre una placa plana.

En este tema nos centraremos en la cromatografía en columna y

consideraremos únicamente cromatografía de líquidos y de gases.

Consideraciones generales sobre la Cromatografía en Columna.

Consideremos la separación de dos sustancias A y B en una columna por

cromatografía de elución. La elución implica el transporte de una especie a
través de una columna por adición sucesiva de fase móvil (eluyente).
Sucesivas adiciones de fase móvil hacen descender las moléculas de analito
por la columna en una serie de transferencias entre la fase móvil y la fase
estacionaria. Si al final de la columna se coloca un dispositivo que responda a
los cambios de composición de la fase móvil, es decir, a la presencia de los
distintos solutos (detector) se puede registrar un cromatograma, gráfico que
representa la respuesta del detector en función del tiempo de elución (o
volumen de eluyente añadido).
El factor de relación de frente (RF) se calcula de la siguiente manera:

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑒 𝑥
𝑅𝐹 =
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑆𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒

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DIAGRAMA DE BLOQUES

Diagrama de bloques Experimento I

Pesar 100g de espinaca.

Práctica No. 7 Colocarllos en un mortero con
20 ml de cloruro de metileno y
"Preparación de extracto de macerar
carotenos"

Filtrar el macerado y de ser Guardar y etiquetar el filtrado

necesario evaporar disolvente

Nota: El extracto de carotenos se realizó por las maestras

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Diagrama de bloques Experimento II

Experimento 2:
Procedimiento para elegir Marcar ligeramente con lápiz una
un eluyente por linea base de 0.3-0.5 al borde de
cromatografía en placa la placa
fina

Con el tubo cpilar

Preparar un tubo capilar de forma
aplicar la muestra de
que uno de sus extremos quede en
espinaca sobre la linea
punta
de la placa

Dejar subir o correr el

Dejar secar el disovelvente de la
disolvente hasta que llegar
muestra aplicada e introducir la
0.5 cm antes del borde
placa en camara
superior de la placa y dejar
cromatográfica
secar

Marcaremos el contrno de las

manchas y hacer un dibujo de Determinar el Rf de cada
la placa para presentarla en mancha.
resultados

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Diagrama de bloques Experimento III

Experimento 3:
Colocar en la parte inferior de la
Procedimiento para la
columna cromatografica, una capa
separación de un
de algodón, de tal manera que
amezcla de carotenos
permita sálida del disolvente pero
por cromatografia en
no de sílica
columna

Empacar la columna,
Pesar 3 gramos de sílica gel y adicionado una cantidad de
preparar una suspensión con suspensión de sílica y abrir llave
8ml de disolvente elegido de la columna para dejar fluir
disolvente

Cerrar la llave y adicionar otra

cantidad de suspensión y
repetir pasos hasta usar toda
la suspensión. Empacada la
columna colocar capa de
algodón para proteger sílica
Con una pipeta adicionar
lentamente de tal manera que
no se resbale por las paredes 0.3
ml de extracto de espinaca

Abrir la la llave de la columna

Adicionar poco a poco
para introducir el xtracto de fase
disolvente para intoducir,
estacionaria y cerrarla para
más el extracto.Abrir y
evitar que el menisco rebase el
cerrar la llave
nivel de sílica

Ya que haya penetrado toda

la mezcla a la silica depositar Observar las diferentes
20 ml de disolvente y empezar fracciones del extracto por
a eluir, recogiendo porciones cromatografia en capa fina
en tubos de ensayo

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DESARROLLO EXPERIMENTAL

Material
Soporte Universal Columna cromatografía o
Algodón bureta
Tubos capilares 3 vasos de precipitados
Propipeta o Jeringa Cuadros pequeños de
Pinza de 3 dedos Aluminio

Reactivos
Hexano Metanol
Acetato de etilo Extracto de espinacas
Cloroformo Silica gel
Cloruro de metileno

Propiedades físico-químicas de los reactivos

REACTIVOS PROPIEDADES FISICO- TOXICOLOGÍA

QUÍMICAS
HEXANO Aspecto: Líquido *Fácilmente inflamable
transparente e incoloro. *Nocivo
Olor característico *Inflamable 3
Punto de ebullición: 60- *Salud 1
70°C *0 Reactivo
Punto de fusión: -95°C
Insoluble en agua
Punto de Inflamación: -
22°C
CLOROFORMO Aspecto: Líquido incoloro *Incompatible con
con olor dulce metanol.
Punto de fusión: -63°C *Poco Inflamable
Punto de ebullición: 61°C *Formación de Monóxido
Soluble en agua: 8 g/l a de C.
20°C *Veneno
Peso Específico:1.48 g/cm3 *Salud 2

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CLORURO DE Líquido transparente e *Nocivo

METILENO incoloro. *Vapor Tóxico
Olor característico. *Inflamable
Punto de ebullición: *Salud 2
39,75°C
Punto de fusión: -95°C
Solubilidad: 20 g/l en agua
a 20°C
Densidad: (20/4)
METANOL Líquido claro, incoloro de *Reacción vigorosa con
olor picante característico. agentes oxidantes.
Punto de ebullición: 64.5°C *Altamente inflamable.
Punto de fusión: -97.8°C *Gases Tóxicos, óxidos de
Soluble en agua Carbono.
Viscosidad: 0.56/20°C

ACETATO DE ETILO Líquido incoloro de olor *Nocivo

característico. *Altamente Inflamable.
Punto de ebullición: 77°C
Punto de fusión: -84°C
Soluble en agua.
Punto de Inflamación: 7°C

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_____RESULTADOS
 PROCEDIMIENTO PARA ELEGIR UN ELUYENTE POR CROMATOGRAFÍA EN PLACA
FINA

En este caso el eluyente que nos correspondía era el hexano, el cual no presento
gran cantidad de extracciones.

Imagen No.1 Imagen No.2

Reacción de placa
cromatográfica con Hexano.
Extracción de los componentes
de espinaca con Hexano, se
observa una pequeña mancha a
pocos centímetros del punto
de partida.

De acuerdo con lo que se observó y midió en la placa fina se obtuvieron los

siguientes datos para realizar el cálculo de Rf con hexano.

𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 3.2 𝑐𝑚

Rf=𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎= 1.5 𝑐𝑚 = 0.4687

EQUIPO Rf
1 0.4687 (Hexano)
2 Rf1=0.23
Rf2=0.6 (Acetato de Etilo)
Rf3=0.93
Rf1=0.31
Rf2=0.71 (Metilo)
Rf3=0.87
3 Rf1=0.625
Rf2=0.66

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Rf3=0.85 (Acetato de Etilo)

Rf4=1
Rf1=0.09 (Cloroformo)
Rf2=0.58

Conforme con las diversas pruebas elaboradas por cada uno de los equipos con
los diferentes disolventes se concluyó que el mejor era el Acetato de Etilo, debido
a que empleando ese disolvente se presentaron más fases o marcas del extracto
de la espinaca, es decir se presentaron más extracciones de los elementos que
conformaban esa mezcla. Po lo tanto todos empleamos dicho eluyente para la
cromatografía en columna.

 PROCEDIMIENTO PARA LA SEPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE CAROTENOS POR

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

Para la cromatografía en columna se utilizó una

Imagen No.3
Observación de la
descomposición de la muestra
de carotenos a través de la
fase estacionaria y la fase
móvil.
columna de vidrio vertical que se llenó con un
soporte sólido adsorbente (fase estacionaria: sílica
gel). La muestra que se quiere separar se deposita
en la parte superior de este soporte. El resto de la
columna se llena con el eluyente (disolvente que
constituye la fase móvil: Ácido de etilo) que, por
efecto de la gravedad, hace mover la muestra de
carotenos a través de la columna. Se establece un
equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase
estacionaria y el disolvente eluyente que fluye por
la columna. Debido a que cada uno de los
componentes de la muestra estableció
interacciones diferentes con la fase estacionaria y
la móvil, serán transportados a diferentes
velocidades y se conseguirá su separación.
La polaridad del Acetato de etilo afecta las
velocidades relativas con las que los diferentes
componentes de la mezcla se mueven en la
columna.

Por lo tanto, el disolvente polar desplazará las moléculas, incluyendo las más
polares, rápidamente a través de la columna. Y por otro lado, el proceso de
adsorción se debe a interacciones intermoleculares de tipo dipolo‐dipolo o
enlaces de hidrógeno entre la muestra de carotenos y el Acetato de etilo.

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1 2 3 4

Imagen No.4

Observación de los diferentes componentes obtenidos

por la cromatografía en columna.

1: Primer componente obtenido.

2: Segundo componente obtenido

3: Tercer componente obtenido.

4: Cuarto componente obtenido

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Durante la realización de la práctica fue importante realizar antes que nada la

determinación del disolvente a emplear como el eluyente, porque al hacer antes
la prueba con placa fina, determinaríamos cual era el más eficaz para extraer los
componentes del extracto de espinaca. Es por ello que cada equipo ejecuto con
diferentes disolventes para después comparar el Rf de cada equipo y determinar
cuál de los disolventes emplearíamos en la cromatografía en capa fina y el cual
debía mostrarnos la mayor cantidad de extracción como en la cromatografía en
capa fina. En este caso el mejor disolvente resulto ser el ácido de etilo, debido a
que al momento de reportar el Rf de cada equipo fue el que más extracciones o
más Rf presento, lo cual se refleja en el número de manchas que se presentaron
en la capa fina, es decir, extrajo el mayor número de componentes de la mezcla.

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En general cuando obtuvimos el Rf de cada sustancia los valores son adecuado y

dentro de parámetros normales, es decir, el valor de cada uno no sobrepasa la
unidad y es así como debe ser, todos los valores se encuentran debajo del cero y,
nuevamente como se mencionó anteriormente el disolvente que extrajo mayor
componente es aquel que presento mayor Rf, es decir este valor es importante
determinarlo para poder saber cuál es el mejor disolvente para emplear como
eluyente.

Por otra parte es importante mencionar que hay diferentes situaciones que se
deben controlar durante la realización de cromatografía en columna; por
ejemplo que el gel silica no debe secarse porque al adicionar el eluyente puede
fracturarse y no permitir la buena separación, más bien ya no sirve como medio
para separar los componentes, el algodón que nos permite filtrar el disolvente
para recuperarlo no debe ser muy grande pero debe ser el suficiente para
obtener el disolvente, el buen empaquetamiento de la silica es relevante porque
este sirve como medio de separación y esto se liga a que existen distintos tipos de
empacamientos columna. Entre ellos están los polímeros macromoleculares
semirrígidos, los entrecruzados, las sílices rígidas ó las de “poro controlado”. Los
materiales semirrígidos se hinchan ligeramente se debe tener cierto cuidado en su
uso ya que se limitan a una presión de 300psi.

Las cuentas de poliestireno parcialmente sulfonado que tienen un tamaño usual

de 5µm, son buenas para usarse con sistemas acuosos mientras los no sulfonados
son compatibles con sistemas no acosos. Otro tipo de empacamiento hidrofílico
poroso es preparado mediante una polimerización por suspensión de metacrilato
de 2-hidroxietilo con dimetacrilato de etileno.

Estos empacamientos resisten presiones de hasta 3000psi y pueden ser usados con
sistemas acuosos y una amplia gama de disolventes orgánicos polares; aunque
son factores importantes el empaquetamiento es el más relevante así como
nunca dejar sin disolvente al momento de ya estar ejecutando la cromatografía
en columna.

Precisamente la identificación de las sustancias está ligada a la separación de sus

componentes, en primera instancia sabemos que la cromatografía en capa fina
nos permitió identificar el disolvente a emplear en la columna, sabemos que el
mejor fue aquel que presento mayor Rf o extracciones; por otro lado lo
empleamos en la columna y nuevamente se presentaron distintas fases las cuales

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representaban cada componente extraídos y lo importante era realizar

nuevamente la cromatografía en capa fina a cada una de extracciones debido
a que esto nos permite saber que tan puro esta ese extracto y así mismo
identificar que componente o sustancia es, puesto que es bien sabido que cada
sustancia tiene un Rf que lo caracteriza y de esa forma puede ser identificado.

Es relevante mencionar que al finalizar la separación por columna ya no

realizamos la cromatografía en capa fina de cada componente extraído debido
al tiempo con el que se contaba pero sabemos que resultaba importante como
medio de identificación de las sustancias.

CONCLUSIONES

La cromatografía se podría se podría considerar como una buena técnica de

purificación y separación de compuestos ya que la ventaja de que se desarrolla
más rápidamente, proporciona mejores separaciones y se puede elegir entre
diferentes adsorbente. Ya que también se utiliza a menudo para monitorizar las
reacciones químicas y también para el análisis cualitativo de los productos de una
reacción, puesto que permite conocer de manera rápida y sencilla cuántos
componentes hay en una mezcla.

En la ingeniería en Alimentos, la cromatografía se aplica para Determinación de

pesticidas en vegetales mediante cromatografía de gases espectrometría de
masa/masa (GC-MS/MS), ya que muchas veces al regar y aplicar un pesticida a
las plantas para que los animales no las contaminen, muchas veces el uso de
químico es mucho y esto puede traer enfermedades a la sociedad cuando uno
consume las frutas o los vegetales.

DIFERENCIAS ENTRE CROMATOGRAFÍA DE PLACA Y LA DE COLUMNA

PLACA FINA COLUMNA

Para la cromatografía en capa fina
(TLC), la fase estacionaria es una capa
de partículas de unos milímetros de
espesor, fijadas sobre un soporte sólido
generalmente de aluminio, plástico o
vidrio. Después de aplicar el
analito cerca de la parte inferior de la
placa seca, el disolvente empieza a
Todas las cromatografías denominadas
en columna se caracterizan por tener
una fase estacionaria que se
encuentra dentro de una columna de
vidrio de 5 a 30 mm de diámetro por la
que se hace pasar una fase móvil
Líquida o gaseosa que estará en
permanente movimiento. Según la

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producir la separación. afinidad de las moléculas por la fase

móvil o la estacionaria, éstas se
separaran.

Las ventajas y desventajas de la cromatografía respecto a otras técnicas de

separación es por ejemplo La ventaja principal de la TLC es que se analizan
simultáneamente la muestra y el patrón, mientras que en la cromatografía en
columna las muestras se analizan individualmente. Además, las muestras que son
difíciles de separar, se pueden resolver utilizando dos disolventes diferentes por
desarrollo de la placa en direcciones perpendiculares. Una desventaja es que los
procesos de cromatografía son algo largos y se debe tener cuidado ya que si un
paso no sale bien hay que repetirlo hasta que se logre.

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FUENTES CONSULTADAS

 Morrison, R. y Boyd, R. (1990). Química orgánica México. Adisson- Wesley

Iberoamericana.

 Abbott y Andrews R.S. Introducción a la cromatografía 3ª ed. Alhambra

S.A. Madrid, 1970

 Brewster, R.Q. Vander Werf C.A. y Mc Ewen W.E. Curso práctico de

química orgánica 2ª ed. Ed. Alhambra S.A., Madrid. 1979

 Louis F. Fieser. (Octubre 2014). “EXPERIMNTOS DE QUIMICA

ORGANICA". Editorial Reverté. Recuperado el 24 de febrero de 2018.

 Morrison, R. y Boyd, R. (1999). ”Química orgánica”, México: Addison Wesley

Iberoamericana. (Recuperado el día 24 de febrero de 2018 a las 20:34 hrs).

 Hill, J. y Kolb, D. (1999). “Química para el nuevo milenio“,México: Pearson

Educación. (Recuperado el día 24 de febrero del 2018 a las 20:56 hrs).

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