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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA
Y PARASITOLOGÍA

TESIS

Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Minthostachys
mollis “muña” sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes y
Staphylococcus aureus

Autoras: - SUSANA FIORELLA MANTILLA GERMAN

- EVELYN KARYN YUPANQUI ROJAS

Asesor: Dr. Pedro Estuardo Mercado Martínez

Co-asesor: MsC. Edgar David Zavaleta Verde

TRUJILLO - PERÚ

2018

RESUMEN

El control del crecimiento microbiano es un factor importante en la conservación de
alimentos, para lo cual comúnmente se usan productos químicos; sin embargo estos están
siendo sustituidos por sustancias naturales como los aceites esenciales. La presente
investigación tuvo como objetivo determinar la concentración mínima inhibitoria del
aceite esencial de Minthostachys mollis “muña” sobre el crecimiento de Listeria
monocytogenes y Staphylococcus aureus. Para ello se extrajo el aceite esencial de toda
la planta de muña mediante la técnica de destilación por arrastre de vapor, y se preparó
una solución stock. Se realizó la curva de crecimiento de L. monocytogenes y S. aureus,
determinando que el tiempo de generación fue de 55 y 42 minutos respectivamente; y la
fase logarítmica media 7 y 8 horas respectivamente. Se preparó el inóculo de cada
bacteria, en su fase logarítmica media y con la solución stock se realizó la determinación
de la concentración mínima inhibitoria, utilizando pocillos de microcultivo con
concentraciones finales de 320; 160; 80; 40; 20; 10; 5 y 2.5 µg/mL del aceite esencial.
Los sistemas se incubaron a 37°C por 24 horas, todo se realizó por triplicado. El resultado
de la concentración mínima inhibitoria de Minthostachys mollis “muña” sobre el
crecimiento de L. monocytogenes y S. aureus fue de 40 µg/mL y 80 µg/mL
respectivamente.

Palabras claves: Concentración mínima inhibitoria. Aceite esencial. Minthostachys
mollis “muña”. L. monocytogenes. S. aureus.

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ABSTRACT

The control of microbial growth is an important factor in food preservation, for which
chemicals are commonly used; however, these are being replaced by natural substances
such as essential oils. The objective of the present investigation was to determine the
minimum inhibitory concentration of the essential oil of Minthostachys mollis "muña" on
the growth of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus. To do this, the
essential oil was extracted from the entire muña plant using the steam distillation
technique, and a stock solution was prepared. The growth curve of L. monocytogenes and
S. aureus was determined, determining that the generation time was 55 and 42 minutes
respectively; and the logarithmic phase averages 11 and 8 hours respectively. The
inoculum of each bacterium was prepared, in its average logarithmic phase and with the
stock solution the determination of the minimum inhibitory concentration was made,
using microculture wells with final concentrations of 320; 160; 80; 40; twenty; 10; 5 and
2.5 μg/mL of the essential oil. The systems were incubated at 37°C for 24 hours,
everything was done in triplicate. The result of the minimum inhibitory concentration of
Minthostachys mollis "muña" on the growth of L. monocytogenes and S. aureus was 40
μg/mL and 80 μg/mL respectively.

Key words: Minimum inhibitory concentration. Essential oil. Minthostachys mollis
"muña". L. monocytogenes. S. aureus.

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I. INTRODUCCIÓN

Las bacterias del género Listeria comprenden un grupo de bacterias Gram positivas,
anaerobios facultativos, bacilos no esporulados que están ampliamente distribuidos en el
medio ambiente (Hain y col., 2007). Debido a su naturaleza ubicua, estas bacterias pueden
persistir en las instalaciones de procesamiento de alimentos y, por lo tanto, pueden
contaminar los productos alimenticios (Carpentier y Cerf, 2011).
De las siete especies reconocidas de Listeria (L. monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua,
L. seeligeri, L. welshimeri, L. grayii y L. murrayi),
solo L. monocytogenes y L. ivanovii actualmente se consideran como patógenos e
infecciosos, provocando enfermedades en animales y seres humanos, ya que son
conocidos por ser β-hemolíticos (Brugere-Picoux, 2008; Schuchat y col., 1991).

Listeria monocytogenes se diferencia de la mayoría de los patógenos bacterianos
encontrados en alimentos debido a su capacidad para sobrevivir con condiciones
ambientales duras, creciendo sobre un amplio rango de temperaturas (1 a 45 °C), amplio
rango de pH (4.5 a 9.6), alta concentración de sal (10 a 15 % de NaCl), y actividad de
agua muy baja (0.94). Por lo tanto, puede crecer en diferentes tipos de productos
alimenticios (Farber y Peterkin, 1991).
Desde una perspectiva de salud pública, L. monocytogenes (principalmente los serotipos
1 / 2a, 1 / 2b, 4b) son los responsables de los síndromes severos en los seres humanos,
tales como la meningitis, la septicemia, el aborto y la enteritis febril. Su principal impacto
se da en los individuos inmunocomprometidos, con una alta tasa de mortalidad (20% a
30%) (Swaminathan y Gerner-Smidt, 2007).

L. monocytogenes puede sobrevivir en el entorno gástrico, colonizar el intestino y cruzar
la barrera intestinal, la hemato-encefálica y la materno-fetal. Ha desarrollado mecanismos
avanzados que le permiten invadir y sobrevivir en una amplia variedad de células, incluso
en las que normalmente no son fagocíticas, como células epiteliales y endoteliales y
hepatocitos (Portnoy, 2007; Cossart y Toledo-Arana, 2007). Entre los factores de
virulencia de esta bacteria se encuentran: las proteínas de superficie internalinas (InA,
InB) que favorecen la invasión celular por un mecanismo tipo zipper, en el que la bacteria
se hunde progresivamente en la superficie celular; la listeriolisina O y fosfolipasas que
permiten lisar y escapar de las vacuolas fagocitarias una vez internalizada en la célula; la
proteína polimerizadora de actina, ActA, necesaria para la motilidad en el citoplasma

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5 ... para describir a los cocos responsables de inflamación y supuración. tétradas. Este medio permite realizar la identificación presuntiva de S.. aureus por la pigmentación amarilla. aureus se diferencia de las demás especies por producir coagulasa que se manifiesta por su capacidad para coagular el plasma. epidermidis y el S. 2005). en tanto que en animales se encuentra además de S. es resistente al calor. son anaerobias facultativas.celular e intercelular. Entre las especies que colonizan al humano. intermedius (Kloss y col. en pares.. característica que se utiliza para diferenciar el género Staphylococcus de los géneros Streptococcus y Enterococcus que son catalasa negativos (Kloss y col. y otras se encuentran entre la flora de otros mamíferos y aves.5%). aureus a S. Moreillon y col.5 μm. debido a que fermenta el manitol se genera un cambio de color en el medio que vira de rojo pálido a amarillo (Compernolle y col. cadenas cortas o formando racimos de uvas (Kloss y col. 1998. El género Staphylococcus está formado por cocos Gram positivos. aureus crece bien en medios de cultivos no selectivos. 1992). las de mayor importancia clínica son: S. como el agar sangre.. 2007. a la desecación y puede crecer en medios con grandes cantidades de NaCl (7. 1995). agar chocolate. 1992. Estudios demuestran que el género Staphylococcus contiene 32 especies. Marcos Vivoni y Meurer. de las cuales 16 de ellas se localizan en los humanos. 2005). aunque existen algunas cepas que desarrollan una cápsula de limo. no esporuladas. 1992.. Ogston introdujo el nombre de Staphylococcus. aureus y S. agrupados como células únicas. S. 2001).. algunas forman parte de la microbiota de piel y mucosas. no poseen cápsula. Kloss y Bamerman. con un diámetro entre 0. y transportadores de hexosa fosfato que le permiten utilizar azúcares en el citosol celular durante su replicación intracitoplasmática (Wallecha y col. 2009). Son bacterias no móviles. lugdunensis.5 a 1. La mayoría de los estafilococos producen β- hemólisis o hemólisis total y catalasa. El S. característica de esta bacteria. saprophyticus son comúnmente responsables de infecciones relacionadas con dispositivos e infecciones del tracto urinario. agar cerebro corazón (agar BHI) y medios selectivos como el agar manitol salado o medio de Chapman por su elevado contenido de sal que inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram negativas. aureus (Lowy. Kuroda y col. siendo éstos menos infecciosos que S. S. del griego staphyle que significa racimo de uvas.

Las infecciones causadas por la ingesta de alimentos contaminados con toxinas que se encuentran presentes en el aire. (Creench y col. aureus tiene en su superficie proteínas conocidas por inhibir la fagocitosis y la opsonización por el sistema del complemento en el ser humano.. desde luego. así como el complemento que tiene un papel central en nuestro sistema inmune innato.. aureus. 2005). sobre todo en los hospitales. Durante varias décadas se han reportado un gran número de brotes epidémicos a nivel mundial. opsonización y destrucción de la membrana celular de los patógenos (Foster. la fagocitosis y el reconocimiento de la bacteria.. S. involucrado en la quimiotaxis.S. sino porque es una de las principales bacterias implicadas en enfermedades transmitidas por alimentos (ETA). 6 . Las infecciones causadas por S. aureus pueden resumirse de la siguiente manera: frecuentemente neonatos.. 2007). el agua potable. Actualmente. 2007). la comida o en el equipo donde los alimentos han sido elaborados (Tibavizco y col. Un aspecto importante en salud pública son las infecciones por S. niños y adultos que pueden ser colonizados por esta bacteria y portar el microorganismo generalmente en fosas nasales y. Voyich y col. 2005). a pesar de que emplea un número significativo de factores de evasión. Esta bacteria produce moléculas que pueden inhibir el reclutamiento de neutrófilos. 2005. aureus que han reemergido debido a que la bacteria se ha tornado resistente a diversos antibióticos con los que normalmente se les trata. los neutrófilos participan reclutando leucocitos en el sitio de la infección. estos brotes se dividen como infecciones nosocomiales e infecciones adquiridas en la comunidad. centros de atención. en ocasiones. aureus es importante no solo porque ocasiona infecciones en diversas partes del organismo humano. la aguas residuales y. clínicas y recientemente ha surgido en la comunidad. El reconocimiento del complemento y las inmunoglobulinas por los receptores son bloqueados por la proteína A de la pared celular que se une a la porción Fc de la inmunoglobulina IgG. Durante el desarrollo de las infecciones por S. en la piel y la ropa (Moroney y col. Tales enfermedades son causadas por diversas acciones. siendo esto relativamente común en determinados sectores de la población y en algunas regiones geográficas desfavorecidas por la falta de sistemas de salud. incluyendo la capacidad del patógeno de producir toxinas. la leche.

en materias primas de vital importancia para el avance de la humanidad (Ben-Hsouna y col.. nombre científico de la muña. fenilpropenos. fuga de constituyentes intracelulares tales como metabolitos e iones. 2009). Por lo general pertenecen a una de estas categorías: aceites esenciales. de alimentos (condimentos y saborizantes) y farmacéuticas (saborizantes) (Reichling y col. cumarinas.. debido a sus constituyentes químicos. industrial y medicinal.. antimicrobiana. enzimas asociadas con la síntesis de la pared celular.. Los aceites esenciales lo constituyen una diversa familia de compuestos orgánicos de bajo peso molecular con grandes diferencias en la actividad antimicrobiana. entre otras (Matiz y col. Mucho de los principios activos son sumamente complejos. Los componentes activos de los aceites esenciales pueden dividirse en cuatro grupos según su estructura química: terpenos. taninos. flavonoides y resinas (Thompson. destrucción de la integridad osmótica de la membrana celular (Kuorwel-Kuorwel y col. 1981). carotenoides. El valor medicinal de las plantas curativas. 2011). y fenilpropanoides (Berka- Zougali y col. terpenoides. glúcidos. 2012). antifúngica. Entre las cuales tenemos a Minthostachys mollis. empleando las plantas a nivel alimenticio. Los aceites esenciales y sus principales constituyentes inhiben a los microorganismos por una variedad de mecanismos tales como: destrucción de la membrana citoplasmática. La biodiversidad vegetal ofrece alternativas antibacterianas.. coagulación de contenido celular. 2013). Los aceites esenciales de plantas aromáticas y medicinales contienen principios activos que exhiben bioactividades como: antioxidante. sintetizados o imitados. planta nativa que crece en diversas zonas de la serranía peruana. convirtiéndose de esta manera.El hombre a través del tiempo ha encontrado en los recursos naturales la solución a diferentes problemáticas. desconociéndose aún su naturaleza química. algunas especies con excelentes resultados. síntesis DNA/RNA. alcaloides. otros han sido purificados. sapogeninas. la cual es usada para el tratamiento de dolencias de vías 7 . terpenos. fenoles. inhibición de la síntesis de proteínas. 2012). Los aceites esenciales son las fracciones liquidas volátiles generalmente destilables por arrastre con vapor de agua. se debe a la presencia de una sustancia química (principio activo) que produce un efecto fisiológico. que contienen las sustancias responsables del aroma de las plantas y que son importantes en la industria cosmética (perfumes y aromatizantes). quinonas.

modificado por Melchor en 1964. Además contiene carbohidratos. alcaloides. éteres y terpenos en mayor porcentaje. trazas de vitamina B1. de aspecto bien tupido en hojas.respiratorias y digestivas.. Se encuentran reunidas en seudo verticilos axilares. formados por cuatro pequeñas cimas. Roersch. brevemente pedunculadas. Rojas y col. calcio.20% para la parte desterpenada (compuestos oxigenados) y 8 . El tallo es ramificado desde la base. 2014). donde existe en abundancia (Salaverry. La muña. Las flores son pequeñas y blancas. fósforo. en las cuales se deposita la mayor cantidad de aceite esencial. glicósidos.n. dos en cada axila y situadas en la parte superior de las ramas (Salaverry.m. 2005).5 m de altura.9 a 1. 2003). El clima más apropiado es aquel con abundante lluvias y elevada luminosidad (Salaverry.s. 1970): REINO: Vegetal DIVISIÓN: Angiospermae CLASE: Dicotyledoneae SUB CLASE: Simpetaleae ORDEN: Tubiflorales FAMILIA: Lamiaceae GÉNERO: Minthostachys ESPECIE: Minthostachys mollis (Kunt/Griseb) NOMBRE COMUN: “MUÑA” La composición de la muña es: aceite esencial.. recibe la siguiente clasificación (Dabbah y col. fierro. taninos. La muña habita en los diferentes pisos ecológicos de nuestra serranía. mentol y mentona (Alaba y Jiménez. mucílagos. Las flores se encuentran en la parte superior de las ramas reunidas en verticilos. esteroles. crece entre 2500 y 3500 m. Minthostachys mollis es una planta de 0. esencias. 2005. que también presenta pelos. tiene forma prismático cuadrilátero y propenso a la lignificación. irregulares o zigomorfas. 1999. saponinas. Gibaja (1960) realizó la desterpenación del aceite esencial de Minthontanchy mollis (muña) determinando el 10. según el sistema de Engler & Prantil. 2005). frondosa en la parte superior. las mismas que son opuestas y aserradas presentando pelos en los peciolos y en la cara inferior de las hojas.

coli.13 mm. Concluyó que el aceite esencial de muña presenta actividad antibacteriana en Streptococcus mutans. mirabillis y antiviral contra el virus Herpes Simplex tipo 1 y el virus de la Pseudorrabia.25922 y K. De los resultados obtenidos se concluye que se ha evidenciado la efectividad antibacteriana de una infusión a base de té verde y muña sobre la flora salival mixta. En las pruebas de susceptibilidad concluyó que la bacteria más sensible al aceite esencial de muña era Fusobacterium nucleatum seguido de Actinobacillus actinomycetemcomitans. aeruginosa (Primo y col. determinaron la efectividad antibacteriana salival mixta de las infusiones a base de té verde. P. 2001). pneumoniae ATCC 10031. 2005). 11 mm respectivamente. obtuvieron el aceite esencial de muña mediante la técnica arrastre de vapor de agua y fue sometida a cromatografía de gases y se determinó sus principales componentes pulegona y transmenton. La propiedad antimicrobiana se debería a las sustancias terpenoides presentes en el aceite esencial del Minthostachys mollis (Díaz. 16. sin embargo. sonnei MC. Actinobacillus actinomycetemcomitans y Actinomyces sp. 14. se observó una efectividad antibacteriana menor con respecto a la infusión a base de té verde y la Clorhexidina (Paredes. 18. cereus.80 % para la fracción terpénica. Lactobacillus sp.. la infusión a base de té verde resultó ser similar en cuanto a su efectividad antibacteriana con respecto a la Clorhexidina.42 mm. Streptococcus mutans. y té verde y muña.. Fusobacterium nucleatum. Escherichia coli ATCC.89. Además de la acción fungistático / funguicida para Fusarium moniliforme y Aspergillus Níger. 9 .38 mm. cereus MC. observaron buena actividad contra Staphylococcus aureus. S. carvacrol. y col (2009). y Actinomyces sp. y col. y que existían diferencias significativas entre las medias de las muestras. Así mismo. Inga y Guerra (2000) demostraron mediante un estudio las propiedades bactericidas / bacteriostáticas del aceite esencial de Minthostachys mollis frente a Staphylococus aureus ATCC 25923. frente a Amoxicilina como control positivo y agua destilada como control negativo. Salmonella typhi. Primo y col. pulegona y mentona. (2001) estudiaron a Minthostachys verticillata “peperina”. Paredes N.50 mm. B. 2009). (2005). Lactobacillus sp. Díaz K. Cano (2007) determinó la presencia de carvacril acetato. no encontró efectividad en la infusión a base de muña. B. con una media de halos de inhibición 20. aunque con escasa actividad contra P. E.

aureus. además de confirmar resistencias inusuales. 10 . Sabiendo que los alimentos son vehículos de transmisión de microorganismos patógenos. causando daños en la producción del alimento y en la salud del consumidor. Además se han encontrado estudios ya realizados con Minthostachys mollis “muña”. que inhibe a otros géneros bacterianos. Conociendo también que en la desinfección de alimentos se utilizan agentes químicos comunes que por sus características pueden alterar directa o indirectamente el alimento. monocytogenes y S. mollis que inhibe el crecimiento de L. 2001). da respuestas definitivas cuando el resultado obtenido por otros métodos es indeterminado (Andrews. ya que son manipulados y trabajados en condiciones inadecuadas de higiene. La CMI se ha establecido como "gold Standard" frente a otros métodos que evalúan susceptibilidad antimicrobiana.La cuantificación de la actividad in vitro de los antimicrobianos se evalúa habitualmente mediante algunas de las variantes de los métodos de dilución. Es por ello que se busca una alternativa diferente como el empleo de plantas medicinales para el control de calidad e inocuidad en la fabricación de alimentos. La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) se define como la mínima concentración de antimicrobiano (en μg/mL) que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo después de 24 horas de incubación a 37°C. los cuales al ser consumidos genera una serie de consecuencias que son perjudiciales para la salud del ser humano. es por ello que se espera saber cuál es la concentración mínima del aceite esencial de M. OBJETIVO GENERAL • Determinar la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Minthostachys mollis “muña” sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus. Este trabajo forma parte del programa sobre acción bacteriana de plantas medicinales que está ejecutando el laboratorio de Fisiología y Genética Bacteriana en el Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.

 Conocer la concentración mínima de Minthostachys mollis “muña” que inhibe el crecimiento de S. aureus ATCC® 12600™. mediante la técnica de dilución en caldo en pocillos de microcultivo. monocytogenes ATCC® 19115™. aureus subsp. aureus subsp. 11 .OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Determinar la fase logarítmica media y el tiempo de generación de L. monocytogenes ATCC® 19115™ y S. aureus ATCC® 12600™.  Conocer la concentración mínima de Minthostachys mollis “muña” que inhibe el crecimiento de L. mediante la técnica de dilución en caldo en pocillos de microcultivo.

provincia de Trujillo.1.. mollis “muña” por el método de destilación por arrastre de vapor (Berka-Zougali y col. Identificación Taxonómica de Minthostachys mollis “muña” La planta obtenida en el Mercado “La Hermelinda”. MATERIALES Y MÉTODOS 1.1. se tomó una alícuota de 1 mL de esta solución y se diluyó en 9 mL de Caldo de Enriquecimiento BHI (Anexo 04). MATERIAL BIOLÓGICO  Cepa de Listeria monocytogenes ATCC® 19115™. fue identificada en el Herbario Antenor Orrego (HAO) de la Universidad Privada Antenor Orrego (Anexo 01 y 02). distrito de Trujillo. 2.  Cepa de Staphylococcus aureus subsp. Preparación de solución Stock del aceite esencial El aceite esencial de M.1 Procesamiento de Minthostachys mollis “muña” La planta Minthostachys mollis “muña”. Obtención del aceite esencial de Minthostachys mollis “muña” El aceite esencial se obtuvo a partir de toda la planta de M. II. 2012).2.  Minthostachys mollis “muña” 2. 2. 12 . se obtuvo en el Mercado “La Hermelinda”. 2.3.1. para ello se usó 2 Kg de la planta (Anexo 03). PROCEDIMIENTO 2. mollis “muña” se disolvió inicialmente en una mezcla solubilizante (Tween 80) a una concentración de 40 mg/mL.1. Después. aureus ATCC® 12600™. departamento de La Libertad.

con la finalidad de obtener colonias aisladas. 2. pasado el tiempo de incubación se extrajo una alícuota del medio y se sembró en agar BHI por la técnica de siembra en estrías por agotamiento. Reactivación de la cepa Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 12600™ Staphylococcus aureus subsp.3. Con un hisopo estéril embebido con el microorganismo liofilizado se reactivó en caldo BHI y se incubó a 37°C durante 24 horas.2.1. luego fue incubado a 37°C durante 24 horas.3.2. monocytogenes equivalente al tubo N° 0. aureus 2.5 del Nefelómetro de MacFarland (1. monocytogenes y S. Reactivación de las cepas Listeria monocytogenes ATCC® 19115™ y Staphylococcus aureus subsp.1. Se sembró en el medio Agar manitol salado utilizando la técnica de siembra en estrías por agotamiento y se incubó a 37°C durante 24 horas.2. Curva de crecimiento de Listeria monocytogenes Se sembró 1 mL de suspensión de L.5x108 UFC/mL) en 99 mL de caldo de enriquecimiento BHI a 37 °C durante 12 horas en agitación constante y se determinó la concentración de la población microbiana cada 2 horas por el método de recuento en placa.2. Reactivación de la cepa Listeria monocytogenes ATCC® 19115™ L. aureus ATCC® 12600™ en presentación KWIK STIK contenía un microorganismo liofilizado. aureus ATCC® 12600™ 2. con una ampolla de fluido de rehidratación en la parte superior y una torunda para su adecuada inoculación (Anexo 9).2. monocytogenes ATCC® 19115™ en presentación KWIK STIK contenía un microorganismo liofilizado. Obtención de la curva de crecimiento de L. con una ampolla de fluido de rehidratación en la parte superior y una torunda para su adecuada inoculación (Anexo 5). Con estos recuentos se 13 . 2.

2. aureus en una placa conteniendo Agar nutritivo y se incubo a 37 °C por 8 horas obteniendo un cultivo en fase logarítmica media.3.2. aureus Se sembró S.2. monocytogenes Se sembró L.1. la fase logarítmica media y por consiguiente el tiempo de generación. Determinación de la concentración mínima inhibitoria Se realizó por la técnica de dilución en caldo en pocillos de microcultivo (Negroni. 2.. monocytogenes en una placa conteniendo Agar BHI y se incubó a 37 °C por 7 horas obteniendo un cultivo en fase logarítmica media. Se preparó una suspensión bacteriana de 1 mL equivalente al tubo N° 0.5x108 UFC/mL). Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus Se sembró 1 mL de suspensión de S. Brooks y col.4.5x108 UFC/mL) en 99 mL de caldo nutritivo a 37 °C durante 12 horas en agitación constante y se determinó la concentración de la población microbiana cada 2 horas por el método de recuento en placa. Preparación de inóculo de L.4.5 del Nefelómetro de MacFarland (1. Con estos recuentos se obtuvo la curva de crecimiento.5 del Nefelómetro MacFarland (1.4.5. 2. Preparación de inóculos 2.5x108 UFC/mL). 1996) de 2 mL de volumen. Se preparó una suspensión bacteriana de 1 mL equivalente al tubo N° 0. 2. aureus equivalente al tubo N° 0. Se adicionó 800 µL de Caldo de Enriquecimiento BHI en 8 pocillos y para el primer pocillo se 14 . obtuvo la curva de crecimiento. 1991. la fase logarítmica media y por consiguiente el tiempo de generación.5 del Nefelómetro de MacFarland (1. Preparación de inóculo de S.

3. y en donde no hubo crecimiento visible correspondió a la CMI. 160. 200. Determinación de la CMI Al realizar la lectura. Luego se completó el mililitro con 200 µL de inóculo (3x105 células) para tener las concentraciones finales de: 320. adicionó 800 µL de solución Stock del aceite esencial de M.5. 80. 50. 40. 6. adecuados a diferentes concentraciones del aceite esencial. se observó el crecimiento o inhibición del microorganismo en todos los pocillos. 20. 2016). mollis. PROCESAMIENTO DE DATOS 3.1.125 µg/mL. 25.25. Los resultados se validaron realizando tres repeticiones. Se adicionó en un noveno pocillo 800 µL de Tween 80 que sirvió de control del medio (Cueva-Yesquen. 12. 10. 5. 100. 2. 15 . Del primer pocillo se tomó 800 µL y se realizó diluciones hasta el octavo pocillo para obtener las concentraciones 400. 3.5 µg/mL. Se incubó los 9 sistemas a 37 °C por 24 horas y se verificó el crecimiento con la aparición de turbidez (Anexo 14 y 15).

III. En la Tabla 02 se muestra que la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Minthostachys mollis sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes fue de 40 µg/mL y sobre el crecimiento de Staphylococcus aureus fue de 80 µg/mL. 16 . aureus ATCC® 12600™ fue de 55 y 42 minutos respectivamente. con esto se determinó la fase logarítmica media de Listeria monocytogenes ATCC® 19115™ que fue de 7 horas. con el cual se determinó la concentración mínima inhibitoria sobre el crecimiento de L. la tasa de crecimiento (u=m) que fue de 0.aureus subsp. se obtuvo el aceite esencial. los cuales se utilizaron para la CMI en el sistema de pocillos. En la Figura 01 se observan dos líneas: la azul es la curva de crecimiento y la roja es la curva corregida.752 (presente en la ecuación de la recta). aureus ATCC® 12600™. la tasa de crecimiento (u=m) que fue de 0. aureus ATCC® 12600™ que fue de 8 horas. monocytogenes ATCC® 19115™ y S.9792 (presente en la ecuación de la recta). En la Figura 02 se observan dos líneas: la azul es la curva de crecimiento y la amarilla es la curva corregida. RESULTADOS A partir de la planta muña. con esto se determinó la fase logarítmica media de Staphylococcus aureus subsp. En la Tabla 01 se muestra el tiempo de generación para Listeria monocytogenes ATCC® 19115™ y Staphylococcus aureus subsp. así como también se determinó la fase logarítmica media y el tiempo de generación.

752x +15771 1.00E+10 1.00E+09 Fase logarítmica UFC/ mL Fase logarïtmica 1.00E+11 1. 1.00E+08 corregida 1. 17 . Fase logarítmica de la curva de crecimiento de Listeria monocytogenes ATCC® 19115™.00E+07 y = 0.00E+06 0 2 4 6 8 10 12 Horas Figura 01.

00E+13 1. Fase logarítmica de la curva de crecimiento de Staphylococcus aureus subsp.457 1.9792x + 18.00E+11 Fase logarítmica UFC/ mL Fase logarítmica 1.00E+09 y = 0.00E+12 1. 1. aureus ATCC® 12600™. 18 .00E+10 corregida 1.00E+08 0 2 4 6 8 10 12 Horas Figura 02.

aureus ATCC® 12600™. monocytogenes ATCC® 19115™ 40 µg/mL S. L. aureus subsp. monocytogenes S. aureus ATCC® 12600™ 80 µg/mL 19 .Tabla 01. monocytogenes y S. Concentración mínima inhibitoria (CMI) del aceite esencial de Minthostachys mollis sobre el crecimiento de L. aureus. aureus subsp. aureus subsp. aureus ATCC® 19115™ ATCC® 12600™ 55 minutos 42 minutos Tabla 02. Tiempo de generación de L. monocytogenes ATCC® 19115™ y S. Bacterias CMI L.

con ausencia o reducida cantidad de productos químicos ha ido incrementando notoriamente. Además la técnica de dilución en agar o difusión en disco puede reducir la eficiencia del aceite esencial por la precipitación de este en los pocillos o en los discos (Sánchez y Kouznetsov. DISCUSIÓN El efecto antimicrobiano de los aceites esenciales se determina evaluando mediante la concentración mínima inhibitoria (CMI). 2008). Los componentes activos de los aceites esenciales pueden dividirse en cuatro grupos según su estructura química: terpenos. por lo que la sustitución de los productos antimicrobianos químicos por sustancias naturales.. fenilpropenos. 2012). por ejemplo: ciertos componentes del AE pueden actuar como desacopladores. 2010). los cuales interfieren en la translocación de protones sobre la membrana y subsecuentemente interrumpir por la fosforilación del ADP (Cano y col. que no alteran las características sensoriales ni nutricionales de los alimentos ha sido revisada por diversos autores desde hace varios años (Velázquez. como los aceites esenciales. Los aceites esenciales son compuestos extraídos de varios tipos de plantas y usados para preservar alimentos y bebidas. La técnica de dilución en caldo utiliza un medio líquido que contiene concentraciones crecientes geométricamente (típicamente una serie de diluciones dobles) del agente antimicrobiano. Las técnicas más comúnmente utilizadas son: la dilución en agar y dilución en caldo. La demanda del consumidor por alimentos naturales. que se define como la concentración en la que se evita el crecimiento visible de bacterias bajo las condiciones de crecimiento definidas. tienen un efecto inhibitorio sobre el desarrollo de microorganismos (Azaña.. 2010). y fenilpropanoides (Berka-Zougali y col. lo que hace indispensable la búsqueda de compuestos alternativos y nuevas tecnologías no contaminantes.. que es inoculado con un numero definido de células bacterianas (Wiegand y col. 2008). El control del crecimiento microbiano es uno de los factores más importantes a considerar en la conservación de alimentos. IV. Estudios in vitro han mostrado que los aceites esenciales inhiben el crecimiento bacteriano pero varían en su eficacia debido a que los componentes químicos que actúan 20 . 2010). los cuales afectan la actividad de las enzimas catalizadoras a nivel de membrana. terpenoides. Los terpenoides pueden servir como un ejemplo de agentes liposolubles.

piperitenone (1. 2011).7%). compuestos tales como el timol. dichos aceites por su acción lipofílica tienen la capacidad de pasar las membranas celulares. piperitona (1. 2007). Los aceites esenciales que tienen mayor capacidad inhibitoria presentan como mayores componentes del mismo. estado Trujillo.5%). 2002.. isopulegona (1. 2010). 2009). el aceite esencial de Minthostachys mollis (muña). Entre los compuestos fitoquímicos responsables de la actividad antibacteriana destacan los derivados fenólicos timol y carvacrol (Domingo y López-Brea. a nivel citoplasmático puede actuar sobre lípidos y proteínas coagulando dichas moléculas (Bakkali y col. la ajedrea de verano (Satureja hortensis) o tomillo (Thymus serpyllum) (Baca. minomeno(0... La actividad antimicrobiana de los diferentes aceites esenciales es muy difícil de comparar teniendo en cuenta la variación de la composición del aceite esencial (compuestos orgánicos de bajo peso molecular) entre especies de plantas. alcohólica (mentol y mentona). la alicina y el eugenol (Winward y col. En recientes estudios se ha demostrado la actividad antibacteriana de diversos aceites esenciales. permeabilizando la membrana celular. Delaquis y col. 2012). los cuales pueden contener más de 150 componentes (Brack y Heinz.. conduciendo a la pérdida de iones. El análisis del aceite esencial de M. éteres y terpenos en mayor porcentaje (Azaña. el aldehído cinámico. 2008. 2004).2%) y mentona (36%) los componentes principales además de linalol (0. carvacrol. 2014). mollis recogidos de Mollis Tuñame Paramo. pulegona y mentona (Cano. los cuales 21 . estación del año.2008). Venezuela mediante la técnica de cromatografía de gases mostrando la presencia de trece compuestos.5%).. 2010).1%). cetónica.. métodos de extracción y parte de la planta que es usada (Kuorwell-Kuorwell y col. romper polisacáridos. Con respecto a la composición química del aceite esencial de Minthostachys mollis (muña) existen pocos trabajos de investigación por lo que se tiene poca información. el linalol. 2002). el carvacrol. al igual que otros aceites esenciales. Además se determinó la presencia de carvacril acetato. siendo pulegona (55. al colapso de la bomba de protones y a la disminución del ATP lo cual conduce a la muerte celular. diferencias en el origen geográfico. entre otros (Mora y col. presenta una estructura aldehídica. ácidos grasos y lípidos. ésteres.5%).como agentes antimicrobianos varían en tipo y concentración (Hyldgaard y col. Benkeblia. y en una menor proporción se encuentra el carvacrol así como en varias hierbas conocidos como el orégano (Origanum vulgare).

probablemente se debe a que la pared celular de las bacterias Gram-positivas estudiadas está compuesta básicamente por peptidoglicano que representa hasta el 90% de la pared. membrana externa y lipopolisacáridos.. inducen alteraciones en la permeabilidad de la membrana.. 2008). igualmente podría actuar como intercambiador de protones. 2010). 2014). La actividad antibacteriana del timol y otros monoterpenos está relacionada a daños estructurales y funcionales que provocan en la fracción lipídica de la membrana plasmática. En esta investigación se expuso a L . Cabe resaltar que los aceites esenciales mostraron un mayor efecto inhibitorio frente a cepas Gram-negativas. donde las bacterias Gram-negativas son relativamente más sensibles (Guerra y col. estos interactúan con proteínas de membranas y dianas intracelulares. aureus a las mismas condiciones y concentraciones del aceite esencial de Minthostachys Mollis (Muña). 2012). este último con un contenido de lípido A que pudiera favorecer la entrada. mientras que la pared celular de las Gram-negativas está constituida solo por el 10% del peptidoglicano. reduciendo el gradiente de pH a lo largo de la membrana (Xu y col.pueden penetrar la membrana del citoplasma. además posee tres polímeros que se encuentran fuera de su envoltura: lipoproteína. causando una desestabilización de esta. ácidos teicoicos que también suelen estar presentes en pequeñas cantidades y polisacáridos. Este comportamiento particular frente a un grupo de cepas. por disolución de los aceites esenciales debido a su carácter hidrofóbico y provocar la muerte celular por desestabilización de la membrana externa y la membrana plasmática. despolarización y liberación de material intracelular de las bacterias (Hyldgaard y col. Este lípido A no está presente en las bacterias Gram-positivas y esta sería una causa probable del efecto del aceite en los diferentes grupos bacterianos. del mismo modo refieren que el mentol tiene un efecto “antiplasmid” (secuencia extracromosómica de ADN que no puede ser compartida entre los patógenos) lo que hace interrumpir la eficiencia de la célula (Fisher y Phillips. y con algo menos de actividad se presentan los derivados alcohólicos y cetónicos (Domingo y López-Brea..monocytogenes y S. por lo cual se 22 . Investigaciones recientes reportan que el carvacrol aumenta la fluidez de la membrana y causa fuga de protones e iones de potasio lo que resulta en un colapso del potencial de membrana y la inhibición de la síntesis de ATP. 2008).

Es por ello que se concluye que la concentración mínima inhibitoria de L. Solórzano Santos y Miranda- Novales. 2011). 23 . 2008. aureus es 80 µg/ml.asume que la actividad antimicrobiana de éste depende principalmente de tres características: su carácter hidrófilo o hidrófobo. monocytogenes es 40 µg/ml y S. sus componentes químicos y el tipo de microorganismo que debe atacar (Fisher y Phillips.

 La concentración mínima inhibitoria del aceite esencial para L. monocytogenes fue de 40 µg/mL. aureus fue de 80 µg/mL.  El tiempo de generación de Staphylococcus aureus fue de 42 minutos y su fase logarítmica media fue de 8 horas. CONCLUSIÓN  El tiempo de generación de Listeria monocytogenes fue de 55 minutos y su fase logarítmica media fue de 7 horas. mientras que para S. 24 . V.

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ANEXOS 32 .

Ficha de identificación taxonómica de Minthostachys mollis “muña” 33 .ANEXO 01.

Constancia de identificación de la especie de la planta de Minthostachys mollis “muña” 34 .ANEXO 02.

ANEXO 03. Equipo de destilación por el método de arrastre de vapor 35 .

Soluciones de trabajo para realizar la concentración mínima inhibitoria. 36 .ANEXO 04.

Presentación KWIK-STIK de Listeria monocytogenes ATCC® 19115™ 37 .ANEXO 05.

Certificado de Identificación de Listeria monocytogenes ATCC® 19115™ 38 .ANEXO 06.

Placa de Petri conteniendo colonias típicas de Listeria monocytogenes ATCC® 19115™ en Agar BHI 39 .ANEXO 07.

Observación microscópica de Listeria monocytogenes ATCC® 19115™.ANEXO 08. Coloración Gram 40 . Aumento 1000 X.

ANEXO 09. aureus ATCC® 12600™ 41 . Presentación KWIK-STIK de Staphylococcus aureus subsp.

ANEXO 10. Certificado de Identificación de Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 12600™ 42 .

Placa de Petri conteniendo colonias típicas de Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 12600™ en Agar Manitol Salado 43 .ANEXO 11.

Observación microscópica de Staphylococcus aureus subsp.ANEXO 12. Coloración Gram 44 . aureus ATCC® 12600™. Aumento 1000 X.

monocytogenes y Staphylococcus aureus 45 . Biorreactor utilizado para determinar la curva de crecimiento de L.ANEXO 13.

para evaluar CMI frente a Listeria monocytogenes ATCC® 19115™. 46 .ANEXO 14. Sistema de pocillos a diferentes concentraciones del aceite esencial de Minthostachys mollis “muña”. 320 µg/mL 160 µg/mL 80 µg/mL 40 µg/mL 20 µg/mL 10 µg/mL 5 µg/mL 2. monocytogenes ATCC® 19115™ es 40 µg/mL.5 µg/mL La concentración mínima inhibitoria de L.

5 µg/mL La concentración mínima inhibitoria de Staphylococcus aureus subsp. Sistema de pocillos a diferentes concentraciones del aceite esencial de Minthostachys mollis “muña”. 320 µg/mL 160 µg/mL 80 µg/mL 40 µg/mL 20 µg/mL 10 µg/mL 5 µg/mL 2. aureus ATCC® 12600™. 47 .ANEXO 15. aureus ATCC® 12600™ es 80 µg/mL. para evaluar CMI frente a Staphylococcus aureus subsp.

5 N.I N.I N.I N.I N.I I I I 20 N.I N.I N. Inhibición bacteriana según la concentración del aceite esencial de Minthostachys mollis (µg/mL).I N.I N. aureus L.I N.I N.I LEYENDA I = Inhibe el crecimiento N.I N. Concentración Bacterias del aceite esencial S.I N.I N. ANEXO 16 Tabla 03.I N.I N.I 10 N.I 5 N. monocytogenes de Minthostachys mollis (µg/mL) 1° repetición 2° repetición 3°repetición 1° repetición 2° repetición 3°repeticion 320 I I I I I I 160 I I I I I I 80 I I I I I I 40 N.I N.I N.I N.I N.I N.I N.I 2.I = No inhibe el crecimiento 48 .I N.