Tuberkulosis adalah penyakit menular kronis yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

Karena penggunaan luas obat anti-tuberkulosis dan perkembangan mutasi, kemunculannya

dan penyebaran tuberkulosis multidrug-resistant diakui sebagai salah satu ancaman paling berbahaya
kontrol tuberkulosis global. Beberapa mutasi tunggal telah diidentifikasi terkait secara signifikan
dengan resistansi obat. Namun, penelitian sebelumnya tidak memperhitungkan interaksi gen-gen,
dan munculnya resistansi obat menular dihubungkan dengan mutasi genetik ganda. Di
studi ini kami menggunakan perangkat lunak bioinformatika GBOOST (Universitas Hong Kong, Clear Water
Bay,
Kowloon, Hong Kong, Cina) untuk menghitung interaksi Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
pasang dan identifikasikan pasangan gen yang terkait dengan resistansi obat. Sebagian besar yang tidak identik
mutasi pada gen target obat yang termasuk dalam pasangan gen yang disaring dikonfirmasi
oleh laporan sebelumnya, yang meminjamkan kredit yang kuat untuk efektivitas metode kami. Terutama,
sebagian besar pasangan gen yang diidentifikasi mengandung target obat juga terdiri dari keluarga Pro-Pro-Glu
(PPE)
protein, menunjukkan bahwa protein keluarga PPE memainkan peran penting dalam resistansi obat Mtb.
Oleh karena itu, penelitian ini memberikan wawasan yang lebih mendalam ke dalam mekanisme yang
mendasari anti-tuberkulosis
resistansi obat, dan metode ini berguna untuk mengeksplorasi mekanisme resistensi obat untuk
mikroorganisme lainnya.
Sumber Data dan Panggilan SNP

Result and discussion

Semua interaksi pasangan Nucleotide Polymorphism (SNP) yang diperoleh oleh GBOOST
dan pasangan gen yang disaring sesuai dari dua set data diprediksi (Tabel S1 dan S2).
Karena mutasi gen target paling signifikan dalam resistansi obat Mtb [18], kami terutama
berfokus pada pasangan gen yang mengandung setidaknya satu gen target. Informasi target obat berasal
database DrugBank dan tercantum dalam Tabel S3. Di dataset 1, katG-PPE54, pasangan gen rpoB-PPE54
terkait dengan resistensi INH dan resistensi RMP diidentifikasi, masing-masing (Tabel 3). Di kumpulan data 2,
embA-PPE68, pasangan gen embB-PPE54 yang terkait dengan resistensi EMB terdeteksi, dan katG-PPE54,
KatG-transcriptional regulator, katG-ccsA, katG-fdxB dan pasangan gen katG-oxidoreductase yang terkait
dengan
Resistensi ETH ditemukan

Material and methods

Sumber Data dan Panggilan SNP

Dalam penelitian ini, dua set data dianalisis. Set data pertama berisi 127 sampel Mtb,
yang termasuk 34 EMB-, 65 INH-, 53 RMP- dan 45 STR-resistant strains. Sebanyak 38 pan-rentan
strain Mtb terlibat dalam dataset ini. Semua data sekuensing dari set pertama telah diunduh
dari TDR TB Strain Bank (nomor aksesi ENA: PRJEB11653) [15]. Semua data dari set pertama adalah
dibagi menjadi empat kelompok sesuai dengan strain resisten yang berbeda untuk analisis data berikut, seperti
dilakukan oleh penelitian sebelumnya [15]. Kumpulan data kedua berisi 161 sampel Mtb, dan semua urutan
data diunduh dari NCBI Sequence Read Archive (SRA) (SRA065095), yang termasuk
22 CPM-, 69 EMB-, 36 ETH-, 117 INH-, 21 KAN-, 54 OFX-, 117 RMP- dan 83 STR-resistant strains [16].
Dan total dari 44 strain pan-rentan Mtb terlibat dalam set ini. Demikian pula, semua data dari
set kedua dibagi menjadi delapan kelompok sesuai dengan jenis strain resisten untuk yang berikut
analisis data, seperti yang dilakukan oleh penelitian sebelumnya [16]

Semua data pengurutan yang diunduh diperlakukan dengan perangkat lunak Trimmomatic v0.32 [31]
untuk menghapus atau memotong bacaan berkualitas rendah (parameter: MEMIMPIN: 3; TRAILING: 3;
MINLEN: 36;
SLIDINGWINDOW: 4:20). Bacaan berkualitas tinggi kemudian dipetakan ke genom referensi Mtb H37Rv
(Akses GenBank: AL123456.3) menggunakan Bowtie2 v2.2.6 [32] dengan parameter default. Pengurutan
pemfilteran dan pemanggilan SNP dilakukan oleh SAMtools v1.2 [33] dan VarScan v2.4 [34] (parameter:
min-coverage = 10; min-freq-for-hom = 0,95; min-avg-qual = 20), dan SNP dengan frekuensi alel minor
(MAF) <0,01 [35] dianggap sebagai kesalahan sequencing dan dibuang. Akhirnya, kami menggunakan PLINK
v1.07 perangkat lunak [36] untuk memfilter filogenetik terkait SNP yang cenderung mempengaruhi pasangan
gen
identifikasi (parameter: indep-pairwise = 10, 5, 0,5) [37]. Prosedur ini dapat mengecualikan pasangan gen
itu hanya bisa dihasilkan dari genotipe strain.

3.2. SNP Pair dan Gene Pair Calculations

Gen-gen interaksi telah lama diakui secara fundamental penting dalam
memahami penyebab genetik dari sifat penyakit yang kompleks. GBOOST adalah identifikasi paket perangkat
lunak
interaksi gen-gen dalam studi kasus-kontrol genome-lebar [38]. Dalam penelitian ini, kami menggunakan
GBOOST
perangkat lunak (parameter: wm = GPU; st = 12.838; tt = 12.838) untuk mendeteksi interaksi SNP-SNP pada
risiko
resistansi obat. GBOOST mengadopsi metode uji chi-square untuk menguji efek interaksi antara
dua SNP dan fenotipe. Kami menetapkan ambang ke p <0,005 (2> 12,838).
Dengan mempertimbangkan bahwa mutasi pada gen target adalah faktor kunci untuk resistansi obat, SNP
pasangan yang diperoleh oleh GBOOST ditugaskan ke gen yang sesuai. Selanjutnya pasangan gen
yang mengandung setidaknya satu gen target disaring untuk analisis lebih lanjut. Kami juga menggunakan
permutasi
tes untuk mengurangi risiko palsu-positif (menghitung 10.000 kali total). Hasil chi-square
tes dapat lebih dikoreksi menggunakan tes permutasi (FDR <0,005). Alur kerja keseluruhan dari metode kami
disajikan sebagai Gambar 3.
Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1417 6 dari 8
interaksi gen-gen dalam studi kasus-kontrol genome-lebar [38]. Dalam penelitian ini, kami menggunakan
GBOOST
perangkat lunak (parameter: wm = GPU; st = 12.838; tt = 12.838) untuk mendeteksi interaksi SNP-SNP pada
risiko
resistansi obat. GBOOST mengadopsi metode uji chi-square untuk menguji efek interaksi antara
dua SNP dan fenotipe. Kami menetapkan ambang ke p <20,005 (> 12,838).
Dengan mempertimbangkan bahwa mutasi pada gen target adalah faktor kunci untuk resistansi obat, SNP
pasangan yang diperoleh oleh GBOOST ditugaskan ke gen yang sesuai. Selanjutnya pasangan gen
yang mengandung setidaknya satu gen target disaring untuk analisis lebih lanjut. Kami juga menggunakan
permutasi
tes untuk mengurangi risiko palsu-positif (menghitung 10.000 kali total). Hasil chisquare
tes dapat lebih dikoreksi menggunakan tes permutasi (FDR <0,005). Alur kerja keseluruhan
metode kami adalah presente

Conclusions

Munculnya dan penyebaran tuberkulosis resisten telah menjadi ancaman yang paling signifikan
kontrol TB global. Pola resistensi obat dapat sangat bervariasi dari obat tunggal hingga multi-obat
resistensi, dan munculnya resistansi obat menular dikaitkan dengan beberapa mutasi genetik. Untuk
mengungkap mekanisme resistensi obat dan untuk mengembangkan strategi kontrol yang lebih baik, kami
pasangan gen yang diidentifikasi terkait dengan resistensi obat Mtb.
Semua asosiasi pasangan SNP disaring dan ditugaskan ke gen yang sesuai.
Selanjutnya, untuk mengungkapkan mekanisme resistensi potensial dari strain Mtb, gen yang diperoleh
pasangan disaring oleh target obat dan mutasi non-sinonim. Yang diperoleh tidak identik
mutasi pada gen target obat dibandingkan dengan percobaan yang dilaporkan, dan hasilnya
memvalidasi keefektifan metode kami. Banyak pasangan gen terkait resistensi obat yang mengandung
gen target diidentifikasi: satu untuk INH, satu untuk RMP, empat untuk EMB dan lima untuk ETH. Pasangan
gen lebih lanjut
analisis mengungkapkan bahwa pasangan gen katG-PPE54 dan rpoB-PPE54 terdeteksi terkait dengan INH dan
Resistensi RMP, masing-masing. Pasangan gen embA-PPE68 dan embB-PPE54 memainkan peran yang
mungkin dalam Mtb
resistensi terhadap EMB. Mutasi gabungan pasangan gen katG-PPE54 akan membawa resistensi Mtb ke ETH
Singkatnya, penelitian ini menunjukkan potensi metode bioinformatika dalam memprediksi obat
gen-gen terkait resistansi dan mengklarifikasi mekanisme resistensi obat anti-tuberkulosis.
Selain itu, pendekatan ini juga berguna untuk mengeksplorasi mekanisme resistensi obat
mikroorganisme lainnya.