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REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA, VOLUMEN 38, No.

2 DE 2009

Orgánica y Bioquímica
PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE a-AMILASA
DE PENICILLIUM COMMUNE PRODUCIDA MEDIANTE
FERMENTACIÓN EN FASE SÓLIDA

PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF a-AMYLASE FROM
PENICILLIUM COMMUNE PRODUCED BY SOLID STATE
FERMENTATION

PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA a-AMILASA DE PENICILLIUM
COMMUNE PRODUZIDA MEDIANTE FERMENTAÇÃO EM FASE SÓLIDA

Esperanza Espinel1,2, Elizabeth López1,3

Recibido: 17/12/08 – Aceptado: 21/08/09

xima actividad de hidrólisis de almidón
soluble con pH 6,0, y estabilidad en un in-
Este estudio reporta la purificación y ca- tervalo de pH de 5,0-7,0. La estabilidad
racterización parcial de una a-amilasa térmica de la enzima se presentó en el in-
producida por Penicillium commune me- tervalo de temperatura 0-50 °C y su tem-
diante fermentación en fase sólida, em- peratura óptima fue 70 °C. Los iones
pleando yuca blanca colombiana (Ma- Ca2+, Ba2+ y Ag+ aumentaron significati-
nihot esculenta Crantz) como soporte. La vamente la actividad de la enzima, siendo
enzima fue purificada por precipitación
el ión Ca2+ el que tuvo el más alto poder
fraccionada con sulfato de amonio, cro-
activador. Cu2+ no alteró significativa-
matografía de intercambio aniónico
mente la actividad de la enzima, mientras
(DEAE-Sephadex A-50), cromatografía
de filtración por gel (Sephadex G-75) y que Li+ y Fe3+ la disminuyeron ligera-
cromatografía de intercambio catiónico mente (13%), y Co2+ y Hg2+ la disminu-
(CM-Sephadex C-50) obteniendo una ac- yeron 25% y 40% respectivamente. Los
tividad específica final de 314,82 U/mg, valores de Km y Vmáx fueron calculados
un grado de purificación del orden de 62 y usando la linealización de Lineweaver-
un rendimiento de 9%. La purificación Burk, con el resultado Km = 0,48 mg/mL
hasta la homogeneidad fue confirmada y Vmáx = 5,85 mmol glucosa/min. Entre
por SDS-PAGE. El peso molecular esti- los principales productos de hidrólisis del
mado fue 35 kDa. La enzima mostró má- almidón de yuca se encuentran la maltosa

1 Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. Bogotá, Colombia.
2 Dirección actual Colegio Marruecos y Molinos IED, SED. Bogotá, Colombia. neespinelb@unal.edu.co
3 melopezr@unal.edu.co

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2 DE 2009 y la glucosa. The molecular weight was esti. e estabilidade num intervalo de ture was 70 °C. fermentación en fase só. sendo o ião Ca2+.0. A enzima mostrou máxima acti- bility was in the range of temperature vidade de hidrólises de amido solúvel a from 0 to 50 °C. co- lombian white tapioca. este resultado proporciona ver-Burk. Among hydrolysis products of evidencia de que la enzima es capaz de tapioca starch are maltose and glucose. with ion Ca2+ as the highest acti. e Co2+ e Hg2+ a 192 . The enzyme shows mento de 9%.0-7. Km = 0. Ba2+ and Ag+ pH de 5. This study reports the purification and partial characterization of an a-amylase Este estudo reporta a purificação e carac- from Penicillium commune produced by terização parcial de uma a-amilasa pro- solid state fermentation using colombian duzida por Penicillium commune median- white tapioca (Manihot esculenta Crantz) te fermentação em fase sólida usando as support. and is stable in a PAGE.0 to 7.0. O peso molecular estimado foi de range of pH from 5. solid state fermentation. um grau PAGE.85 µmol glucose/min were calcula. Íons Ca2+.0. commune. anion esculenta Crantz) como suporte. ram ligeiramente (13%). Ions Ca2+.48 mg/mL and Vmax significativamente a actividade da enzi- = 5.0. and its optimal tempera. ma. comportamiento característico yme ability to hydrolyze the starch a-1. romper los enlaces glicosídicos a-1. A purification factor of 62 with a tração por gel (Sephadex G-75) e croma- 9% yield and final specific activity of tografia de intercambio catiónico (CM- 314. a-amylase. enquanto que Li+ e Fe3+ a diminuí- ted using the linearization of Linewea. 35 kDa.82 U/mg were recorded. cromatografia de fil- C-50). A purificação até à homo- maximal activity in the soluble starch geneidade foi confirmada por SDS- hydrolysis at pH 6. a-amilasa. A enzima foi estável num significantly increase the activity of the intervalo de temperatura de 0-50 °C. Thermal sta. No. Penici- llium commune. VOLUMEN 38. Penicillium lida. ma foi purificada por precipitação frac- hadex A-50). cionada com sulfato de amónio.4 de una a-amilasa. grafia de intercambio aniónico (DEAE- change chromatography (CM-Sephadex Sephadex A-50). sua temperatura óptima de reacção foi de vator. Ba2+ e Ag+ aumenta- the activity of the enzyme. Cu2+ não alterou respectively. gel filtration chromato. A enzi- exchange chromatography (DEAE-Sep. o que teve o Co2+ and Hg2+ decrease it 25% and 40% mais alto poder indutor. The enzyme was purified by mandioca branca colombiana (Manihot ammonium sulphate precipitation. e enzyme. whereas Li+ ram significativamente a actividade da and Fe3+ decrease it slightly (13%) and enzima. de purificação na ordem de 62 e um rendi- mated to be 35 kDa. yuca blanca colombiana. pH 6. Purification Sephadex C-50) obtendo una actividade to homogeneity was confirmed by SDS específica final de 314. Cu2+ does not alter significantly 70°C. glucosidic linkages. a characteristic behavior of an a-amylase. cromato- graphy (Sephadex G-75) and cation ex.82 U/mg.4 del this result provides evidence of the enz- almidón.REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA.

fue donada do al mayor control de factores ambienta. Son de gran nética de una a-amilasa obtenida a partir importancia en la industria alimenticia. enzima. principais produtos de hidrólises do ami- do de mandioca encontram-se a maltosa e Cada una de las aplicaciones industria- glucosa. Penici. obtendo Km = 0. lo que genera usando a linearização de Linewea. y la búsqueda de enzimas que pre- a-amilasa.48 mg/mL e de enzimas y la mínima degradación por Vmáx = 5.. y aun. llium commune. Colombia.4 de polisacáridos como el almi. Una cepa de Penicillium sp. mandioca branca colombiana. medio Saboraud agar-maltosa 4%. blecer su potencial en aplicaciones bio- dón y el glicógeno. sa. El al- y los procesos de purificación son menos midón de yuca empleado fue adquirido en costosos (3. Bogotá.4 do amido. les de las a-amilasas requiere propieda- dencia de que a enzima é capaz de romper des únicas respecto a especificidad. partamento de farmacia de la Universidad la fermentación en fase sólida (FFS) Nacional de Colombia. sin embargo. Entre os acción de proteasas (5). 2 DE 2009 Orgánica y Bioquímica diminuíram 25% e 40% respectivamente. esta- os enlaces glucosídicos a-1. rés en investigación. para producir malto. mayores rendimientos en la producción ver-Burk. Recientemente se ha reportado la pro- ducción de a-amilasa por hongos del gé- nero Penicillium (7. La FFS son semejantes en textura al hábitat yuca (Manihot esculenta Crantz) fue com- 193 . REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. fermentação em fase só- lida. nismos. animales y microorga. No. en estos trabajos no se lleva a cabo la purifi- Las a-amilasas son enzimas que catalizan cación y posterior caracterización de la al azar la hidrólisis de enlaces glicosídi. temperatura y dependencia del comportamento característico de uma pH (6). 4). natural de hongos filamentosos como Pe- Os valores de Km e Vmáx foram calculados nicillium commune. senten propiedades diferentes a las cono- cidas se mantiene como un tema de inte- a-amilasa. Tradicional- mente la producción de a-amilasas se ha llevado a cabo mediante procesos de fer- mentación líquida sumergida (FLS) debi. por el laboratorio de microbiología del de- les como temperatura y pH. papelera y farmacológica. El microorganis- constituye una alternativa interesante mo se mantuvo a temperatura ambiente en puesto que los metabolitos se concentran.85 mmol glucosa/min. de una cepa nativa de Penicillium commu- textil. que las fuentes productoras de a-amilasas empleando yuca blanca colombiana (Ma- incluyen plantas. este resultado proporciona evi. son las enzimas microbianas las que encuentran mayor demanda en apli- caciones industriales (2). sin embargo. tecnológicas. VOLUMEN 38. oligosacáridos de diferentes tamaños En esta publicación se describe la pro- y cadenas más o menos ramificadas lla. ne mediante fermentación en fase sólida. 8). bilidad. nihot esculenta crantz) como soporte. Los medios empleados en Ciacomeq Ltda. purificación y caracterización ci- madas dextrinas límite (1). ducción. etapas fundamentales para esta- cos a-1.

Para la FLS se separó croorganismo como perteneciente a la es. 2 DE 2009 prada en un supermercado en Bogotá y fue teo de esporas con un hemacitómetro. (NH4)2SO4. Los medios de fermentación se prepara- torio de micología y fitopatología ron tomando como referencia el medio (LAMFU) de la Universidad de los Czapcek-Dox (9). rallada manualmente luego de retirar la Una suspensión de 1x107 esporas/mL se cáscara empleando un rallador de plástico utilizó para inocular los medios de fer- doméstico convencional. La les diluída 1:10. y se suplementaron Andes de Bogotá. KCl. commune. mL de suspensión de esporas de P. 0. 0. y se realizó el con. con los ceba.0 g de yuca rallada. en una extracción de ADN total a través del condiciones estáticas.15. método de extracción por fenol-cloro. 1. región amplificada fue secuenciada por suspendidos en 100 mL de solución de sa- la compañía Macrogen (Seúl.1 M pH 7. se amplifi. Se formularon dos medios. A yuca o yuca rallada.8S-ITS2 decidos con 10 mL de solución de sales. fue con CaCl2.0 g de al- dores universales ITS4 e ITS5 (11). La solución de sales con- identificación molecular se realizó com. almidón de dextrosa y extracto de levadura) (9). se inocularon con 1 se hicieron utilizando el algoritmo Blastn.REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. Para las FFS el medio se preparó con 10 g formo (10). se filtró micelio sobrenadante. tenía (g/100 mL de agua destilada): parando la secuencia obtenida contra to. El medio para la FLS contenía 3. los análisis bioinformáticos y 15 psi por 15 min. con agitación constante nicamente durante 30 min en un agitador durante 10 min. FeSO4. No. La identificación se realizó mediante téc- nicas de biología molecular en el labora.0. de la subunidad ribosomal.nih.ncbi. mentación. K2HPO4. de almidón ó 10 g de yuca rallada. com- Los alineamientos con mayor puntaje y má. mune y se incubaron a 22 °C.50. según la fuente de carbono. ción de la enzima. gos reportadas en la base de datos del CaCl2. hume- có por PCR la región ITS1. 0. Los medios se esterilizaron a 121 °C nlm. crecido en medio líquido SDY (sucrosa. FFS y FLS.01. 0.5. VOLUMEN 38.00. el sobrenadante constituyó el extracto crudo. Se hizo se- xima identidad obtenidos (E value = 0. se filtró sobre gasa estéril de placa MLW modelo Thys 2 a 80 osci- en condiciones asépticas para retirar el laciones completas por minuto. gov). el hongo mediante centrifugación por 30 pecie P.00. se agitó mecá- en agua estéril. MgSO4. la solución sobre algodón y se centrifugó 194 . commune fue suspendido fer fosfato 0. 3. NCBI (National Center for Biotech- nology Information: http://www. guimiento cada 24 horas de la produc- identidad 100%) permiten identificar el mi. En el caso de la FFS se adicionaron 50 mL de buf- El micelio de P. Posteriormente. min a 8 000 rpm.50. La midón de yuca ó 3. das las secuencias nucleotídicas de hon. y se realizaron dos ti- partir de la biomasa generada se realizó pos de fermentaciones. El Penicillium sp. Corea). en una centrífuga MLW modelo T52.

se retira la mez- cla del baño y se adicionan 500 mL del Se emplearon bandejas de aluminio reactivo de Nelson. se completa el volu- (22. empleando albúmina séri- ciones completas por minuto. se adicionan 500 mL del reactivo de Somogyi y se lleva la mez- cla a un baño María a temperatura de ebu- llición. Para La actividad específica se define como las obtener el extracto crudo se añadieron unidades de actividad por miligramo de 150 mL de buffer fosfato 0. La fracción con la proteína de interés pre- men de 2085 mL. y 800 en el cual se obtuvo la mayor producción mL de CaCl2 5mM. No. za la determinación colorimétrica a 500 pesor aproximadamente de la mezcla de nm (espectrofotómetro Genesys 5). solución sobre algodón para retirar los sólidos gruesos. y se filtró la ca bovina como proteína patrón. Se tomaron 10 mL de cada extracto crudo y se diali- zaron contra agua destilada para realizar Para medir la actividad a-amilasa se utili- medidas de concentración de proteína y zó el método de Nelson-Somogyi (12).1 M pH 7. contra agua destilada y se liofilizó. el precipitado se descartó y tación fraccionada con sulfato de amonio. pH 6. Las bandejas con el medio Una unidad de actividad enzimática se se esterilizaron a 121 ºC y 15 psi durante define como la cantidad de enzima que li- 15 min y se inocularon con 3 mL de la bera 1 mg de glucosa por minuto bajo las suspensión de esporas. se obtuvo un sobrenadante con un volu.0. proteína.50 cm X 16. VOLUMEN 38. 37 °C. 195 . Precipitación con sulfato de amonio tos.50 cm).50 cm X 2. 2 DE 2009 Orgánica y Bioquímica por 30 min a 8 000 rpm. La incubación se condiciones del ensayo. realizó a 22 ºC durante siete días. en men a 10 mL con agua destilada y se reali- cada una se puso una capa de 1 cm de es. en una centrifuga MLW El extracto crudo fue sometido a precipi- modelo T52. Bradford (13). 100 g de yuca rallada y 100 mL de solu- ción de sales. La actividad enzimática. El filtrado total se centrifugó a 8 000 rpm por 30 min. De este sobrenadante se cipitó entre 50 y 80% de saturación. por ser el medio muestra que contiene la enzima. reacción a 37 °C. el sobrenadante constituyó el extracto crudo. mezcla de reacción contiene 1 mL de so- lución de almidón soluble al 1% (p/v). El trabajo se continuó empleando la 200 mL de una dilución apropiada de la FFS con yuca rallada. Luego de 20 min de de enzima. REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. Este tomaron 100 mL para realizar ensayos precipitado se disolvió en el mínimo volu- preliminares de precipitación fraccionada men de agua destilada. Al residuo se le realizó una segunda extracción bajo las mismas condiciones y se juntaron los dos extrac. se agitó mecánicamente durante una hora La concentración de proteínas fue de- a temperatura ambiente en un agitador de terminada por el método colorimétrico de placa MLW modelo Thys 2 a 80 oscila. Pasados 10 min. se dializó 24 h con sulfato de amonio.0.

REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA.0 cm) equilibrada con el mismo buff. 196 . Las fracciones que Determinación del peso molecular contenían la proteína de interés. desnaturalizantes que se dializó contra agua destilada y se liofilizó. pH 7.0 cm). No. gradiente discontinuo de fuerza iónica (NaCl 0. cada fracción (4. inhibidor de la tripsina de soya (29 kDa) y La velocidad de flujo fue de 27 mL/h.0 y fue sometido a residual fue determinada bajo las condi- cromatografía de intercambio catiónico ciones normales del ensayo. fos- cm).5 x 30. (4. La elusión de (49 kDa). dares: fosforilasa B (104 kDa). la enzima fue incubada a 37 °C por 1 h en diferentes buffers en un ran- El pool G-75-pico II se disolvió en buffer go de pH entre 2. con geles de poliacrilamida al 12%. albúmina grafía de filtración por gel sobre Sepha. de suero bovino (83 kDa).1 a 0. Se corrieron electroforesis SDS-PAGE (14). se mezclaron en un pool (pool 30. CM-pico I) que se dializó contra agua er.0 a 37 °C. A cada fracción (5 ml) se le midió la absorbancia a 280 nm y la actividad enzimática. Se usaron sobre CM Sephadex C-50 (2. 2 DE 2009 Cromatografía de intercambio aniónico ca (NaCl 0. por electroforesis en condiciones claron en un pool (pool DEAE-pico II).0.0 buffers glicina-HCl.5 x rés. ovoalbúmina dex G-75 (2. A cada fracción El liofilizado de la etapa anterior se di. pH 6. do realizando medidas de actividad en un rango de pH entre 2. y se aplicó a una ciones que contenían la proteína de inte- columna de DEAE Sephadex A-50 (2. anhidrasa carbónica (37 kDa). El pool DEAE-pico II se disolvió en con las siguientes proteínas como están- NaCl al 1% y fue sometido a cromato. Las fracciones que mostraron Efecto del pH sobre la actividad mayor actividad enzimática.1 a 0. La velocidad de flu- jo fue de 30 mL/h. se mez.0 y 12. La elusión se realizó por medio de fato y glicina-NaOH. Las frac- fosfato 50 mM.5 X 30. todos con concen- un gradiente discontinuo de fuerza ióni.5 M).0 y 12. los cuales se tiñeron con azul de Coomas- Cromatografía de filtración por gel sie.5 mL) se le midió la ab- sorbancia a 280 nm y la actividad enzi- mática. acetato-acético. tración 100 mM. La velocidad de flujo fue de 27 mL/h. Los marcadores de peso molecular empleados fueron de la marca Bio-Rad. La elusión se realizó por medio de un destilada y se liofilizó. A lisozima (20 kDa).5 M).0 y la actividad fosfato 0.5 mL) se le midió la absorbancia a 280 solvió en el mínimo volumen de buffer nm y la actividad enzimática. Cromatografía de intercambio Para establecer el efecto del pH sobre la catiónico estabilidad.05 M. se mezcla- y la estabilidad de la enzima ron en un pool (pool G-75-pico II) que se dializó contra agua destilada y se con- El pH óptimo de la enzima fue determina- centró por liofilización. las proteínas se realizó con NaCl al 1%. VOLUMEN 38.

30 y 60 min de incubación fue- rentes de almidón soluble (0. Las mediciones de actividad se mediante comparación con patrones de realizaron bajo las condiciones normales glucosa y maltosa en una cromatografía del ensayo. La concentración final de sal en la mezcla de reacción para todos los casos En los medios con yuca rallada hay un fue 1. 800 mL de buffer fosfato mo/acético/agua (70:60:10. en las que la activi- 37 °C. y 1 mL de solución de revelado se hizo con H2SO4/metanol almidón.6H2O. REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. se incubó partir de 48 horas. La mezcla de reacción conte. en los diferentes medios de cultivo se pre- FeCl3.0. VOLUMEN 38. La enzima. mg/mL). Los productos de hidrólisis realizó a partir de la linealización de Li.15 U/mL para la FLS. luego se determinó la actividad re. La actividad en mM.5H2O. CaCl2. No. la fase móvil fue clorofor- de CaCl2 5 mM. previamente dia.2-1.21 U/mL para la sidual bajo las condiciones normales del FFS y 6. Para medir los efectos de EDTA y SDS. ras luego de adicionar el revelador y ca- lentar a 120 °C por 3 min. v/v). AgNO3. fueron observados como manchas oscu- neweaver-Burk.2H2O. (15). determinada en un rango de temperatura luego se realizó la medición de actividad entre 0 y 92 °C en buffer fosfato 100 mM.0. pH 6. v/v/v) y el 100 mM. LiCl. La concentración la estabilidad fue establecido incubando final en la mezcla de reacción para ambos por 1 h la enzima en buffer fosfato 100 compuestos fue 10 mM. CoCl2. la acti- 197 . con un máximo a las con la solución de la sal durante 30 min a 168 horas (siete días). La estimación de Km y Vmáx se (5:95.0 mM. enzimática residual bajo las condiciones pH 6. En cuanto ensayo. BaCl2 y senta en la Figura 1. La actividad sin adición de los io. fue determinada bajo las condiciones nor- males del ensayo. la enzima fue incubada con el com- La temperatura óptima de la enzima fue ponente respectivo por 30 min a 37 ºC. EDTA y SDS sobre la actividad enzimática Se utilizaron las siguientes sales: La cinética de producción de a-amilasa CuSO4.0 en un rango de temperatura ausencia de EDTA y SDS fue considera- entre 40 y 92 °C. HgCl2. El efecto de la temperatura sobre normales del ensayo. La actividad residual da como de 100%. Capacidad para hidrolizar el almidón de yuca y productos de hidrólisis Efecto de la concentración de sustrato Los productos finales de hidrólisis luego Se utilizaron siete concentraciones dife. Efecto de algunos iones metálicos. 2 DE 2009 Orgánica y Bioquímica Efecto de la temperatura sobre la nes metálicos fue definida como de actividad y la estabilidad de la enzima 100%. dad enzimática fue de 8. 100 mL Merck). incremento de la actividad a-amilasa a lizada contra agua destilada.4 ron evaluados según Hmidet et al. pH 6. de capa delgada (silica gel 60 F254 nía 100 mL de enzima purificada. a los medios con almidón de yuca. 20. de 10.

commune. La purificación de a-amilasa de P. Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones. te para la producción de a-amilasa por P. VOLUMEN 38. este fato de amonio. un mune se resume en la Tabla 1. producción de la misma cantidad de quida sumergida que presenta un valor a-amilasa tomaría más tiempo. El extracto hongo filamentoso. cuyo usuales de este microorganismo. perfil de elusión (Figura 2) mostró un úni- 198 . 50-80%. se. no obstante. la tividad enzimática en la fermentación lí. da. máximo de 7. com- El crecimiento de P. de yuca en fermentación en fase sólida. esta fracción fue aplicada a una mejante a las condiciones de los hábitats columna de DEAE Sephadex A-50. la yuca rallada constituye un mejor sopor- zar los valores observados con yuca ralla. 2 DE 2009 Actividad a-amilasa durante cultivos en FFS (-) y FLS (—) usando almidón de yuca (O) y yuca ralla- da (p) como sustrato.REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. No. la mayor actividad medio ofrecía una mayor área superficial a-amilasa se encontró en la fracción y presentaba una textura más rugosa.76 U/mL a los 10 días de observación. crudo fue precipitado por adición de sul- dio sólido empleando yuca rallada. vidad enzimática comienza a aumentar a Los resultados obtenidos sugieren que partir de las 120 horas (5 días) sin alcan. a partir de las 168 horas commune y que en caso de usar almidón (7 días) se aprecia un incremento en la ac. se favoreció en el me.

14 15. VOLUMEN 38. pH 7. II.97 314. el cual fue dializado contra agua desti- tra agua destilada y liofilizado.0.75 12 CM Sephadex C-50 0. las fracciones del pico ac- con actividad fueron reunidas en el pool tivo fueron reunidas en el pool G-75 pico DEAE-pico II.85 9 co pico con actividad a-amilasa luego de con NaCl al 1%.66 535.75. No. y fue apli- Perfil de elusión sobre DEAE-Sephadex A-50.82 61.0 NaCl 0.00 100 Precipitado sulfato 10 220. Extracto crudo 1985 873. el cual fue dializado con. 2 DE 2009 Orgánica y Bioquímica Resumen de la purificación de a-amilasa de Penicillium commune. Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones.61 146.2 M. Las fracciones del pico dad a-amilasa. REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. (O) Absorbancia 280 nm. El perfil cromatográfico la adición de buffer fosfato 50 mM.53. lada y liofilizado.40 4446.65 2660. la elusión se realizó buffer fosfato 50 mM. (p) actividad enzimática. con este paso se alcan- do un grado de purificación de 10.28 402.05 76 de amonio fracción 50 – 80% DEAE-Sephadex 5 49.40 5.09 1.53 59 A-50 Sephadex G-75 2 3.51 3.59 10. pH (Figura 3) mostró un único pico de activi- 6. Este pool fue aplicado a una columna El pool G-75 pico II se disolvió en de Sephadex G-75.08 3414. alcanzan. 199 .55 53.7 1.34 28. zó un grado de purificación de 28.

(p) actividad enzimática.0 NaCl 0. la 5).0 (7) y el de la a-amilasa de Peni- La comparación de la movilidad electro.85. cilium griseofulvum de 5. 200 . indicando la purificación hasta la ho. ran- luego de la adición de buffer fosfato 50 go en el que se encuentra la a-amilasa de mM. commune. alcanzan- do un grado de purificación final de 61.0. pH 7. Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones. cado a una columna de CM Sephadex 10 y 210 kDa (2). la mayo- C-50. máxima actividad se obtuvo con pH 6. pH 7.0 (2).0 y 12.1 M. 2 DE 2009 Perfil de elusión sobre Sephadex G-75.0.pico I.5 (8). (O) Absorbancia 280nm. el pH óptimo de la a-amilasa de Penicillium chrysogenum fue de 5. VOLUMEN 38. rango ligeramente ácido a neutro. la mayoría de las a-amila- lar en una electroforesis SDS-PAGE (Fi.REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. No. sin embargo. El perfil de elusión (Figura 4) mos. ría de las a-amilasas microbianas tienen tró un único pico con actividad a-amilasa su peso molecular entre 30 – 70 kDa. 2. Este pool mostró una sola banda Cuando la actividad de la enzima fue en- en la electroforesis SDS-PAGE (Figura sayada con diferentes valores de pH. sas microbianas tienen su pH óptimo en el gura 6) permite establecer un peso mole. liofilizado y disuelto en buffer fosfato 50 mM. En otros estudios. con actividad fueron reunidas en el pool CM. El rango de peso en el que se encuentra el pH óptimo de la molecular para las a-amilasas oscila entre a-amilasa de Penicillium commune. Aunque el forética de la a-amilasa de P. rango cular de 35 kDa. commune pH óptimo para las a-amilasas varía entre con la de los marcadores de peso molecu. el cual fue dializado contra agua destilada. mogeneidad de la enzima. Las fracciones P.

2 DE 2009 Orgánica y Bioquímica Perfil de elusión sobre CM Sephadex C-50. REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. 201 . (O) Absorbancia 280nm. Electroforesis SDS-PAGE de las fracciones de purificación de a-amilasa de Penicillium commune 1) Extracto crudo 2) Sulfato de amonio fracción 50-80% 3) DEAE-pico II 4) G-75 pico II 5) CM-pico I. No. VOLUMEN 38. Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones. (p) actividad enzimática.

Vale la pena destacar que la en- serva que la enzima fue estable en el ran. es 70 (Figura 8) para así poder analizar la inac- °C. indicando que el rango llus sp.0. 0-50 °C. por tanto. la actividad decreció rápidamente por Uchino. la tivación térmica de la enzima. serva en la gráfica. didas de actividad por el método de Nel- son-Somogyi. 202 . corresponde construyó una gráfica de Arrhenius a la temperatura óptima de reacción. nación de la temperatura óptima se xima actividad y. El cambio actividad disminuye rápidamente porque de pendiente cerca a los 50 °C que se ob- la enzima se va desnaturalizando. Luego de la incubación de la enzima de estabilidad térmica de la enzima es por 1 h en buffer de diferente pH. (18). se ob. Cuando se sobrepasa este valor. Con los datos obtenidos en la determi- La temperatura a la cual se alcanza la má. No. 2) a-amilasa purificada de Penicillium commune.0. Rangos de estabilidad en vada de este hallazgo.0-7. Un caso de 6. VOLUMEN 38. cuando la enzima fue incubada durante a esta temperatura induce un cambio con- una hora en buffer fosfato 100 mM. 1) Marcadores de peso molecular. es la necesidad de el pH similares han sido reportados para revisar cuál es el tiempo requerido para la las a-amilasas de Aspergillus awamori inactivación total de la enzima en las me- (16) y Thricoderma viride (17). 2 DE 2009 Determinación del peso molecular de a-amilasa de Penicillium commune por electroforesis SDS-PAGE.8% Una consecuencia de orden práctico deri- con un pH 7. de su actividad con un pH 5.0 en un rango de temperatura entre 40 y comportamiento similar fue reportado 92 ºC. zima conserva 35% de su actividad des- go de pH 5.REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. para una a-amilasa de Baci- a partir de 50 °C. La enzima retuvo 95% pués de ser calentada una hora a 92 ºC.0 y 98. sugiere que la incuba- Como se puede observar en la Figura ción por periodos prolongados de tiempo 7. pH formacional de la enzima.

Cada punto experimental corresponde al promedio de dos determinaciones. No. VOLUMEN 38. 2 DE 2009 Orgánica y Bioquímica Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de a-amilasa de Penicillium commune. REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. Se observan dos líneas rectas con cambio de pendiente cerca de los 50 °C. Cada punto ex- perimental corresponde al promedio de dos determinaciones. Gráfica de Arrhenius. 203 .

La a-amilasa de Penicillium commune ta remoción de los iones Ca2+ no basta presenta una cinética típica de Michae.85 mmol glucosa/min.88 mg/mL). Las efecto activador del calcio puede estar re- Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad de a-amilasa de Penicillium commune. respectivamen. Vmáx=5. Lo an- Aspergillus fumigatus (0. 19. Ca2+. pero no CaI o CaII. fusca (0. Aureobasidium pu. Km=0. Gupta. se pueda evaluar el efecto de los iones escogidos. CaIII) que la a-amilasa de Bacillus hal- llulans (5.48mg/ml. es posible remover mg/mL) (18. del EDTA y del SDS. es CaIII sin observar cambios estructurales muy similar a la del hongo filamentoso significativos.REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. De acuerdo con 5. se hace lis-Menten y posee una alta afinidad por necesario tratar la enzima con EDTA o el almidón soluble respecto a otras a-ami. con dializar contra agua destilada. según Nielsen. 204 . lasas microbianas como Thermofibida (22). VOLUMEN 38.42 mg/mL) terior justifica que luego de la diálisis (21). El commune se muestra en la Figura 10. Además. (2). por lo tanto. La cantidad de iones Ca2+ pue- usando la linelización de Lineweaver. 2 DE 2009 a-amilasas son proteínas pequeñas que contienen por lo menos un ión Ca2+ por Los valores de Km y Vmáx determinados molécula. del Ag+ aumentan significativamente la acti- EDTA y del SDS sobre la actividad enzi. Ba2+ y El efecto de algunos iones metálicos. No.75 mg/mL) y Bacillus sp. para lograr una comple- te. 20). contra agua destilada no se genere pérdi- da total de la actividad enzimática y. de variar de uno a diez dependiendo del Burk (Figura 9) fueron 0. vidad de la enzima. et al.48 mg/mL y origen de la enzima. siendo el ión Ca2+ el mática de la a-amilasa de Penicillium que tiene el más alto poder activador. EGTA.85 mmol glucosa/min. et al. de los tres iones calcio (CaI. sin embargo. Como se puede notar. (1.64 mapalus contiene. CaII.

His122. tal como lo indican Li. EDTA y SDS. mación de pequeñas cantidades de malto- cados en el mecanismo catalítico de las sa y dextrinas. No. sin que se presente completa zación de las cargas negativas en la de los desnaturalización con la concentración dominios estructurales A y B de la enzima ensayada. la de EDTA y SDS 10 mM. mientras que Li+ y Fe3+ la disminuyen ligeramente y Co2+ y Hg2+ la disminuyen considerablemente.4 del almidón de cio. EDTA o SDS. Entre los princi- sulfihidrilo o imidazol son importantes en pales productos de hidrólisis se encuen- la función de la enzima. la enzima. enlaces glicosídicos a-1. 2 DE 2009 Orgánica y Bioquímica Efecto de algunos iones metálicos. VOLUMEN 38. En cuanto al SDS. Cu2+ no altera significativamente la actividad de la enzima. La activi- dad fue determinada luego de la incubación de la enzima por 30 min a 37 °C con diferentes sales. Este resultado proporciona ción inhibitoria sobre la actividad de la evidencia de que la enzima presenta el enzima. REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. cuya cantidad fue aumen- a-amilasas. Esta afirmación tran maltosa y glucosa. ya que es capaz de romper los a-amilasa de P. 205 . El agente quelante EDTA y tando a medida que aumentaba el tiempo el surfactante SDS también mostraron ac. así como la for- meración para Taka amilasa) están impli. lacionado con interacciones adicionales su efecto sobre la estructura terciaria de favorables que contribuyen a la neutrali. de reacción. La concentración final de los iones metálicos fue 1 mM. nu. a-amilasa de Penicillium commune se que residuos aminoacídicos con grupos muestra en la Figura 11. Al control no se le adicionaron sales. El análisis cromatográfico de los produc- La inhibición por iones mercurio su. et al. La producción de concuerda con el hecho de que varios re. del EDTA y del SDS sobre la actividad enzimática. trazas de glucosa fue determinada desde siduos de histidina (His210. lo cual es de interés por su potencial este ión. (22). los 10 min de reacción. commune contiene cal. se corrobora en la producción de biocombustibles. La inhibición que ocasiona el comportamiento característico de una EDTA apoya la sugerencia de que la a-amilasa. (20). tos de hidrólisis del almidón de yuca por giere. y que su actividad es dependiente de yuca.

Dado que Ca2+ tiene el más alto poder ma en cultivos en FFS y FLS estático. 8). como sustrato. 2 DE 2009 Cromatografía de capa delgada de los productos de hidrólisis de almidón de yuca por a-amilasa de Penicillium commune. sugiriendo que la incubación por perio- ten el crecimiento de Penicillium commu. producción de maltosa y glucosa en la 206 . crantz) empleados como soporte.REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA. Tanto el almidón de yuca como la yuca La gráfica de Arrhenius presenta un blanca colombiana (Manihot esculenta cambio de pendiente cerca a los 50 °C. VOLUMEN 38. No. produce una a-amilasa. activador y el EDTA causa una fuerte in- permite establecer que la fermentación en hibición. La comparación de las cinéticas de producción de la enzi.0 a 37 °C. y los mejores resultados en cuanto a activi. Las muestras fueron removidas con intervalos determinados de tiempo. almidón han sido reportados para las Con temperaturas superiores probable- a-amilasas de Penicillium griseofulvum y mente la enzima adquiere un estado con- Penicillium chrysogenum (7.0 y fue estable en un rango de pH entre es activa sobre almidón de yuca usado 5. ión. ratura induce un cambio conformacional vestigación. formacional que le permite conservar 35% de su actividad después de ser calen- tada a 92 ºC durante una hora. La enzima presenta un pH óptimo de La a-amilasa de Penicillium commune 6. el microorganismo sólo de la enzima. En las condiciones usadas en esta in. lo cual se evidencia en la peratura óptima de 70 °C y presenta má. Resultados similares en la hidrólisis de xima estabilidad en el rango 0-50 °C. que su actividad es dependiente de este dad a-amilasa. dos prolongados de tiempo a esta tempe- ne.0 y 7. además tiene una tem. permi. se confirma que la a-amilasa de fase sólida con yuca blanca rallada arroja Penicillium commune contiene calcio.

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