You are on page 1of 14

TUGAS REVIEW JURNAL

MIKROBIOLOGI

DJUMARNI FIRMAN
N012 17 1 034

PROGRAM PASCASARJANA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2017
A. Pendahuluan
Actinomycetes merupakan salah satu bakteri yang mirip fungi dan
tergolong dalam bakteri gram positif. Actinomycetes banyak hidup di
tanah, pasir, air dan berasosiasi dengan tanaman tingkat tinggi.
Actinomycetes banyak menghasilkan senyawa bioaktif yang
berkemungkinan besar dapat menghasilkan senyawa-senyawa antibiotik
untuk mengobati gejala infeksi.

B. Metode
1. Isolasi Actinomycetes
Jurnal 1 : Sampel tanah, daun dan akar tanaman, air tawar, air laut,
hewan laut, sedimen laut dan air limbah dikumpulkan dari berbagai tempat
di Arab Saudi. Satu gram sampel tanah disuspensikan dalam 9 ml air
suling steril dan 0,1 ml suspensi ini disebarkan di cawan Starch Nitrate
Agar (SNA); daun dan akar tanaman dan hewan laut dipotong kecil-kecil
dan diletakkan di permukaan media SNA; Sekitar 0,1 ml setiap sampel air
yang diuji disebarkan di permukaan SNA dan semua cawan diinkubasi
pada suhu 28°C selama 7 hari.
Jurnal 2 : Sampel tanah yang dikumpulkan dari berbagai daerah oasis di
Tunisia, disebar di media solid boiled bran barley (ekstrak ragi 0,2% dan
2% agar ditambahkan ke supernatant dari 4% boiled bran barley). PH
diadjust sampai 7. Setelah diinkubasi pada 30-40°C selama beberapa
hari, koloni menunjukkan sporulasi dan aspek filamen diinokulasikan pada
medium padat yang sama.
2. Screening isolat actinomycetes yang memiliki aktivitas
antimikroba
Jurnal 1 :
Metode agar disc : tiap isolat actinomycetes ditanam pada media SNA
pada suhu 28°C selama 4-6 hari. Disk kemudian dipindahkan secara
aseptik ke cawan Mueller-Hinton yang diinokulasi, memiliki 0,1ml 2×106
CFU/ml bakteri patogen yang diuji. Demikian pula, cakram pertumbuhan
actinomycete 6 mm tersebar di piring PDA atau Sabouraud yang berisi
fungi uji. Cawan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam untuk bakteri,
dan pada suhu 28°C selama 4 hari untuk fungi. Aktivitas antimikroba
dievaluasi dengan mengukur diameter zona hambatan (mm).
Metode well difusi : aktivitas antimikroba isolat aktinomicetes terhadap
beberapa patogenik mikroba.
3. Identifikasi
Jurnal 1 : Identifikasi isolate D8 (Identifikasi morfologi , dentifikasi kultur
kemotaksonomi)
4. Pengukuran spektro
Jurnal 2 : Spektrum NMR diukur dengan spektrometer Varian Inova 600.
ESI-MS direkam pada spektrometer massa Kuarter Quattro Triple,
Finnigan TSQ 7000 dengan sumber nano-ESI-API-ion. Spektrum IR
dicatat pada spektrometer FTIR Perkin Elmer 1600. Kromatografi lapis
tipis (TLC) dilakukan pada Polygram SIL G/ UV254. Nilai Rf diukur.
5. Ekstraksi dan purifikasi dari senyawa aktif
Jurnal 2 : Spora 107/ml strain US80 digunakan untuk diinokulasi ke labu
Erlenmeyer 1 L, yang mengandung 200 ml media Bennett ditambah 1%
(b/v) glukosa dan magnesium (2 mmol/l konsentrasi akhir). Setelah
inkubasi pada suhu 30°C selama 24 jam dalam shaking 200 rpm,
prekursor ini digunakan untuk menginokulasi (5% v/v) sejumlah volume
medium kultur 15 l yang memiliki komposisi yang sama dengan preculture
(200 ml dalam lL labu Erlenmeyer). Setelah tiga hari inkubasi untuk
budidaya, kultur broth disaring untuk memisahkan miselium dan
supernatan, yang diperlakukan secara terpisah sebagai berikut: miselium
diberi liofilisasi, diekstraksi dengan aseton (10%) dan larutan
terkonsentrasi pada Rotavapor. Supernatan diekstraksi dua kali dengan
volume etil asetat yang sama dan lapisan organik gabungan diuapkan..
Aktivitas antimikroba diamati hanya pada fase metanol yang diuapkan
sampai kering.
Ekstrak metanol kasar (1,87 g) dipisahkan pada Sephadex LH 20 (MeOH /
50% CHCl3) menjadi tiga fraksi dengan cara melacak reaksi warnanya
dengan asam anisaldehida / sulfat.
6. Determinasi efek perbedaan media pada pertumbuhan isolate
terhadap produksi antimikroba
Jurnal 1 : 50ml media berbeda (Starch nitrat broth, nutrient broth, starch-
peptone medium, yeast extract malt extract broth (ISP 2) dimasukkan
dalam erlenmeyer 250 ml. Setelah sterilisasi, diinokulasi dengan 2 ml
precultures (3×108 CFU/ml) dan diinkubasi dengan shaking (120 rpm dan
30°C selama 5 hari). Filtrat bebas sel diuji untuk aktivitas antimikroba
terhadap beberapa mikroorganisme yang diuji.
6. Determinasi efek pH, temperature, dan periode inkubasi
terhadap produksi antimikroba.
Jurnal 1 : 50ml media SNA dimasukkan dalam labu elenmeyer 250 ml.
Setelah sterilisasi, labu diinokulasi dengan 2 ml precultures (3×108
CFU/ml)) dan diinkubasi dengan shaking (120 rpm) dengan variasi pH (pH
4,5,6,7,8,9), suhu (28,29,30,35,40°C) dan waktu inkubasi (5,6,7,8,9,10
hari). Filtrat diuji untuk aktivitas antimikroba terhadap beberapa
mikroorganisme yang diuji.
7. Total isolasi DNA dan amplifikasi PCR gen 16S rRNA
Jurnal 1 : 34 siklus denaturasi pada suhu 94°C (1 menit), annealing pada
58°C (1 menit) dan extension pada 72°C (1 menit). Produk 1500 bp
diperkuat dengan menggunakan primer forward eubacterial 16F27 (5'-
AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') dan primer terbalik 16R1525 (5'-
AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3'), produk PCR dianalisis dalam gel
agarose 3% yang diwarnai dengan etidium bromida. Gel difoto oleh
software lab image analyzer versi 2.7.0.
Jurnal 2 : Amplifikasi PCR gen 16S rRNA strain US80 dilakukan dengan
menggunakan dua primer 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ dan
5’AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’. Sekitar 300 ng DNA template genom
digunakan dengan 150 pmol masing-masing primer per 50 μl volume
reaksi. Untuk memperbaiki denaturasi DNA, 5% (v/v) DMSO ditambahkan
ke dalam campuran reaksi. Amplifikasi dilakukan pada termocyler otomatis
(Perkin-Elmer) dengan menggunakan 1 U PFU DNA polimerase
(Stratagene) dan sistem penyangga yang direkomendasikan sesuai
dengan profil amplifikasi berikut: 94°C (3 menit) diikuti oleh 45 siklus
denaturasi pada 94°C (30 s), anil pada 60°C (1min) dan ekstensi pada
72°C (3min). Campuran reaksi PCR dianalisis dengan elektroforesis gel
agarose dan fragmen DNA dengan ukuran yang diharapkan dimurnikan
dan diklon ke vektor pCR-blunt yang menghasilkan pLF1.
8. PCR product sequencing dan analisis BLAST
Jurnal 1 : Data urutan DNA dibandingkan dengan semua rangkaian
mikroba di GenBank menggunakan BLAST. Analisis filogenetik molekuler
dari aktinomicetes D8 berdasarkan gen DNA 16S r-strain dibangun
menggunakan 20 strain aktinomicetes berbeda dari GenData Bank.

C. Hasil dan pembahasan


1. Isolasi Actinomycetes
Jurnal 1 : Tabel 1 menunjukkan bahwa 81 isolat aktinomicetes diperoleh
dari sumber yang berbeda dan memiliki aktivitas antimikroba
Jurnal 2 : Strain actinomycetes baru yang diberi nama US80 yang
diisolasi dari tanah oasis Tunisia menghasilkan aktivitas antimikroba
melawan bakteri Gram positif dan Gram negatif dan fungi (Gambar 1).

2. Screening isolat actinomycetes yang memiliki aktivitas


antimikroba
Jurnal 1 : Data menunjukkan bahwa D8 mencapai penghambatan
terbesar terhadap semua organisme yang diuji (Tabel 2). Isolat D8 dipilih
untuk dilanjutkan ke pengujian selanjutnya.

3. Identifikasi isolat
Jurnal 1 :
Karakter morfologi: Morfologi koloni strain D8 konsisten dengan genus
Streptomyces. Ini membentuk miselium substrat bercabang luas dan hifa
udara yang dibedakan menjadi rantai lurus panjang (tipe Rectiflexibiles)
yang membawa lebih dari 50 spora permukaan yang memanjang (Gambar
2). Morfologi spora dan fitur permukaan diamati dengan sanning electron
microscope(Gambar1).

Gambar 2. SEM isolate D8 dengan varian magnification ( A, B, C)


Karakteristik kultur: Karakteristik kultur strain D8 ditunjukkan pada Tabel 3.
Warna miselium substrat bervariasi dari kuning pucat hingga coklat tua.
Pigmen yang mudah tersuspensi diproduksi di semua media uji. Micelia
aerial dari strain sangat banyak, berkembang dengan baik dan bervariasi
pada media uji yang berbeda, berwarna abu-abu pada media agar-agar
pati, putih pada agar sesuai keinginan (ISP-3) dan agar pepaya pati, abu-
abu kemerahan pada glycerol asparagine agar (ISP-5), coklat pucat pada
PDA dan cream pada NA.. Dinding sel hidrolisat isolat D8 mengandung
asam LL-diaminopimelat dan tidak ada karakteristik gula yang ditemukan
yang mengkonfirmasi dinding sel chemotype I, yang dijelaskan oleh
Lechevalier. Analisis lipid dari isolat yang dipilih menunjukkan adanya
fosfatidylinositol (PI) dan asam lemak jenuh. Membandingkan hasil
dengan yang diperoleh dari Manual Bergey of Systematic Bacteriology,
isolat tersebut adalah spesies dari genus Streptomyces dan diidentifikasi
sebagai Streptomyces sp.
Analisis kemotaksonomi
Dinding sel hidrolisat: Analisis kimia sel ditunjukkan pada Tabel 4. Dinding
sel hidrolisat mengandung asam LLdiaminopimelic (LL-DAP) dan tidak
ada ditemukan gula. Phosphatidylethanolamine (PE) dan iso, dan antiso
asam lemak juga terdeteksi dalam hidrolisat sel dari isolat terpilih.

Jurnal 2 : Menurut karakteristik kultur, strain US80 tumbuh dengan baik


dan koloni dapat dideteksi. Warna miscelia vegetatif dan aerial berwarna
kekuningan dan putih kecoklatan. Rantai spora berwarna kuning keabu-
abuan. Perbandingan karakteristik kultur yang diperoleh dengan spesies
actinomycetes yang diketahui dijelaskan dalam Bargey’s Manual of
Systemic

Bacteriology sangat menyarankan bahwa strain US80 termasuk pada


genus Streptomyces. Urutan nukleotida total 1517 bp (aksesi AJ639841)
dari gen 16S rRNA Streptomyces sp. US80 ditentukan di kedua untai.
Penyelarasan urutan ini melalui pencocokan dengan rangkaian gen 16S
rRNA yang dilaporkan di bank gen menunjukkan kemiripan yang tinggi
(97-98%) terhadap gen Streptomyces 16S rRNA. Kesamaan tertinggi
(98%) diperoleh dengan gen 16S rRNA Streptomyces roseoflavus yang
menghasilkan flavomisin antibiotik aminoglikosida.
4. Determinasi efek perbedaan media pada pertumbuhan isolate
D8 terhadap produksi antimikroba
Jurnal 1 : Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa media terbaik untuk
pertumbuhan isolat dan produksi antimikroba yang dipilih adalah starch
nitrate broth. Diameter maksimum zona penghambatan adalah 22, 18.7,
20.6, 20.3, 17, 15.7 dan 11.4 mm untuk Staph. aureus, MRSA, S.
pyogenes, E. coli, S. typhimurium, Shigella sp. dan C. albicans.
Jurnal 2 : Empat karbohidrat (pati, fruktosa, glukosa dan sakarosa) dan
gliserol diuji sebagai sumber karbon tunggal pada 1% (b/v) pada media
cair Bennett. Aktivitas maksimal diperoleh saat glukosa digunakan sebagai
sumber karbon. Untuk lebih mengoptimalkan kondisi kultur, trace mineral
oligoelements, kalium dan garam magnesium diuji menggunakan glukosa
sebagai sumber karbon. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas
antimikroba terhadap mikroorganisme indikator yang digunakan diamati
pada ketiga kondisi tersebut; Namun, kombinasi glukosa dan magnesium
menghasilkan hasil terbaik. Dalam hal ini, kami memperoleh aktivitas
antimikroba terhadap semua mikroorganisme yang diuji termasuk F.
oxysporum sp. albedinis (data tidak ditunjukkan).

5. Determinasi efek pH, temperature, dan periode inkubasi


terhadap produksi antimikroba.
Jurnal 1 : Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa pH optimum untuk
pertumbuhan isolat dan produksi antimikroba yang dipilih adalah pH 8.
Diameter maksimum zona inhibisi pada pH 8 adalah 24.1, 19.8, 20.8,
20.6, 18.6, 17.3 dan 11.7 mm untuk Staph. aureus, MRSA, S. pyogenes,
E. coli, S. typhimurium, Shigella sp. dan C. albicans.
Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa suhu optimum untuk produksi
antimikroba oleh isolat D8 yang dipilih adalah 28°C dan diameter rata-rata
zona hambatan adalah 24.7, 19.9, 21, 21.6, 19, 17.4 dan 12 mm untuk
Staph. aureus, MRSA, S. pyogenes, E. coli, S. typhimurium, Shigella sp.
dan C. albicans.
Antimikroba senyawa biosintesis secara bertahap menurun dengan
meningkatkan masa inkubasi dari 5 sampai 9 hari. Zona penghambatan
yang dicapai oleh isolat D8 yang dipilih terhadap bakteri yang diuji
meningkat sampai mencapai maksimum setelah 5 hari dari masa inkubasi.
Diameter zona penghambatan yang diukur adalah 24, 19.6, 20, 21.6, dan
19, 17.6 dan 12 mm untuk Staph. aureus, MRSA, S. pyogenes, E. coli, S.
typhimurium, Shigella sp. dan C. albicans.
6. PCR
Jurnal 1 : Gen 16S rDNA berhasil diamplifikasi oleh PCR dengan
menggunakan primer spesifiknya. Ukuran produk PCR adalah 1500 bp.
Produk PCR dianalisis dalam gel agarose 3% yang diwarnai dengan
etidium bromida (Gambar 3).

Penyelidikan urutan parsial 16S rRNA (766 bp) menunjukkan isolat D8


sebagai Streptomyces flavogriseus (Accession no. KF235416). Pohon
filogenetik dari strain ini diperoleh dengan menggunakan MEGA versi 4
ditunjukkan pada Gambar 4.
7. Purifikasi dan elusidasi struktur dari senyawa aktif
Jurnal 2 : Fermentasi dilakukan pada skala 151 Streptomyces sp. strain
US80 pada media Bennett ditambah dengan 1% (b/v) glukosa dan
magnesium pada 2 mmol/l (konsentrasi akhir) selama tiga hari. Baik
miselium dan filtrat diekstraksi dengan aseton dan etil asetat. Kromatografi
berulang dilakukan pada gabungan ekstrak yang dikirim ke tiga senyawa,
yang diidentifikasi sebagai irumamycin (1a), X-14952B (1b), dan 17-
hydroxyventuricidin A (1c) oleh 1H, 13C NMR dan spektrum massa dan
perbandingan dengan data yang dipublikasikan.
Senyawa 1a diperoleh sebagai padatan putih yang, pada KLT, secara
bertahap memberi warna hitam setelah disemprot dengan
anisaldehid/asam sulfat, yang khas untuk makrolida. Spektrum 1H NMR 1a
kaya akan sinyal proton alifatik dengan empat multipel olefin tambahan.
Spektrum 13C/APT NMR menampilkan 41 sinyal untuk sembilan metil,
delapan metilen dan tiga belas kelompok metin, dimana sembilan
mengandung oksigen. Dua sinyal di daerah asetil menunjukkan adanya
residu gula. Spektrum massa ESI menunjukkan berat molekul m/z 763,
dan resolusi tinggi menghasilkan formula molekul C41H65NO12.
Senyawa 1b diperoleh sebagai padatan amorf yang menunjukkan
kesamaan dalam spektrum TLC, 1H dan 13C NMR, yang juga
menunjukkan kemiripan struktural dengan irumamycin (1a). Spektrum
NMR proton dari 1b menunjukkan 9 kelompok metil. Spektrum 13C NMR
mengirimkan 42 sinyal. Pergeseran kimia dalam residu gula dan bagian
lakton dari bagian aglikon di 1b hampir sama dengan 1a. Spektrum
tersebut menunjukkan adanya cincin lakton beranggota 20 yang sama
pada 1b seperti pada 1a, dan perubahannya harus terjadi pada rantai
samping. ESI MS menghasilkan berat molekul, yang lebih tinggi dari pada
1a.
Senyawa 1c menunjukkan sifat kromatografi dan spektroskopi yang mirip
dengan 1a dan 1b. Pada spektrum proton NMR, perbedaan utamanya
adalah tidak adanya triplet pada δ0.84 pada 1b, yang digantikan oleh
doublet pada δ1.02 1c. Bobot molekul disimpulkan menjadi 765 Dalton
dari spektrum massa ESI dengan ion pseudo-moleculer pada m/z 788
[M+Na]+, dan rumus molekulnya ditentukan menjadi C41H67NO12 dengan
resolusi tinggi. Spektrum 13C NMR menunjukkan semua 41 sinyal karbon.
Perbandingan data 13C NMR dari 1c dengan yang 1a dan 1b menunjukkan
bahwa semua senyawa memiliki struktur lakton dan residu gula yang
sama, dan bahwa perbedaan tersebut terlokalisasi dalam rantai samping.
Di antara atom karbon dari rantai samping, sinyal pada δ22.6 dari
kelompok metilen pada C-24 (24-CH2CH3) hilang, sehingga gugus metil
harus dilekatkan langsung ke C-24. Struktur 1c akhirnya dikonfirmasi
dengan perbandingan data 13C NMR dengan irumanolide II (1d) yang
merupakan aglycon 1c. Senyawa 1c identik dengan YP 02259L-C yang
telah dijelaskan sebelumnya, meskipun tanpa karakterisasi spektroskopi
penuh.
Aktivitas antimikroba dari tiga senyawa murni (irumamycin, X-14952B dan
17-hydroxy-venturicidin A). Ketiga senyawa murni tersebut menghambat
pertumbuhan dua fungi uji (V. dahliae dan Fusarium sp.) dan C. tropicalis
R2 CIP203. Aktivitas antifungi tertinggi diperoleh dengan irumamycin (1a).
Ketiga senyawa tersebut menunjukkan aktivitas penghambatan hanya
terhadap bakteri Gram positif tapi molekul 1b dan 1c menunjukkan
aktivitas lebih besar dari pada 1a.
DAFTAR PUSTAKA

1. Al-Garni, Saleh Muhammad, et al. “Isolation and identification of


antimicrobial actinomycetes strains from Saudi environment”. Journal of
Food, Agriculture & Environment Vol.12 (2014): 1072-1079 .
2. Fguira, Lilia Fourati-Ben, et al. "Purification and structure
elucidation of antifungal and antibacterial activities of newly isolated
Streptomyces sp. strain US80." Research in Microbiology 156.3 (2005):
341-347.