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Rev. Fac. Agron. (LUZ).

2006, 23: 213-222

Una metodología para la propagación


in vitro de Aloe vera L.

N. Albany1, J. Vilchez2, S. León de Sierralta1, M. Molina1 y P. Chacín1.

1
Dpto. Química, Facultad de Agronomía. Universidad del Zulia. Apar-
tado 15205. Maracaibo ZU. 4005ZU, Venezuela.
2
Dpto. Botánica, Facultad de Agronomía. Universidad del Zulia. Apar-
tado 15205. Maracaibo ZU. 4005, Venezuela.

Resumen
La zábila (Aloe vera L.) es uno de los cultivos de importancia económica de
la familia Liliaceae. La propagación por hijuelos no satisface el mercado nacio-
nal; siendo factible la producción masiva de plantas de zábila mediante la pro-
pagación in vitro. Se realizó un ensayo para evaluar el efecto de diferentes
concentraciones de NaClO (1, 2 y 3%) en la desinfección superficial durante la
fase de establecimiento (FE). En la fase de multiplicación (FM), se evaluó el
estado físico del medio de cultivo (líquido y semi-sólido) en interacción con el
seccionamiento del explante (corte transversal y transversal-longitudinal par-
cial); además se evaluó el tamaño de las vitroplantas (pequeñas: <5 cm, media-
nas: 5-10 cm y grandes: >10 cm) para la fase de aclimatización (FA). Se utilizó
un diseño completamente aleatorizado para evaluar las variables porcentaje
de contaminación (%C) y porcentaje de mortalidad (%M) de los explantes en la
FE, coeficiente de multiplicación (CM), altura del explante (AE) en la FM y
porcentaje de sobrevivencia (%S) en la FA. Se detectaron diferencias significa-
tivas (P<0,05) entre las concentraciones de NaClO donde el menor %C (9,09%)
se obtuvo con 3%. En la FM, sólo el estado físico del medio de cultivo arrojó
diferencias estadísticas (P<0,01) para AE, siendo 3,85 cm en líquido y 2,83 cm
en semi-sólido. En la FA no se encontraron diferencias significativas para el
%S. Todas las vitroplantas se adaptaron a condiciones ex vitro a pesar de su
tamaño inicial.
Palabras clave: Aloe vera L., zábila, establecimiento, multiplicación,
aclimatización.

Recibido el 5-11-2004 z Aceptado el 20-6-2005


Autor para correspondencia email: nilca_albany@cantv.net; jorge_vilchez@cantv.net

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Albany et al.

Introducción
La zábila (Aloe vera L.) es un nes debido a la carencia de técnicas
miembro de la familia de las liliáceas, de propagación comercial eficientes.
originaria del norte de África e intro- La alta esterilidad masculina
ducida en las Antillas y América tro- que presenta la zábila dificulta la pro-
pical donde crece en forma natural y pagación sexual de esta especie. Por
se cultiva comercialmente (4). Es una tanto su propagación es principalmen-
planta de crecimiento herbáceo peren- te vegetativa a través de hijuelos. Este
ne, que posee tallos cortos, con un sis- método presenta bajos índices de mul-
tema radical superficial (10,16). tiplicación y riesgos de diseminación
La zábila es una especie de gran de enfermedades fungosas y
importancia en la medicina natural e bacterianas (14).
industrial; de sus hojas se extrae una El cultivo de tejidos constituye
sustancia denominada aloína, cuyos una de las alternativas tecnológicas
principios activos son componentes de más utilizadas para conseguir la pro-
numerosas preparaciones medicinales pagación clonal rápida de cultivos que
empleadas para el tratamiento de presentan bajos índices de multipli-
dolores de cabeza y estomacales, así cación, puesto que se puede lograr la
como para el combate de infecciones producción masiva de plantas sanas
cutáneas, entre otras enfermedades. de alta calidad, libre de cualquier pa-
Además, la utilización de sus raíces y tógeno que pueda afectar el desarro-
hojas es de gran importancia en la llo y aprovechamiento del cultivo (6).
elaboración de cosméticos, pinturas y Roy y Sakar (15) sugieren que el cul-
barnices (10, 14, 15). tivo in vitro puede ser utilizado como
En Venezuela, la expansión del una técnica de propagación rápida de
área cultivada destinada a satisfacer zábila. Este trabajo tiene como obje-
la demanda creciente de aloína y el tivo desarrollar una metodología para
aumento del consumo de productos la micropropagación de zábila (Aloe
medicinales ha encontrado limitacio- vera L.).

Materiales y métodos
El material vegetal usado fueron mía de LUZ durante el período com-
hijuelos de plantas de zábila jóvenes prendido entre noviembre 2003-junio
cultivados en macetas en el 2004 y comprendió tres fases: estable-
umbráculo del Laboratorio de Fisio- cimiento, multiplicación y
logía vegetal (10º41’12’’LN y aclimatización.
71º38’05’’LO) de la Facultad de Agro- Fase de establecimiento
nomía, Universidad del Zulia (LUZ), Para el establecimiento se selec-
Venezuela. La micropropagación, se cionaron hijuelos sanos de tamaño
realizó en el Laboratorio de Cultivos comprendido entre 20 y 30 cm medi-
de Tejidos de la Facultad de Agrono- dos desde la base del tallo hasta el

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extremo distal de la hoja más larga. Los explantes fueron colocados


A cada hijuelo se le eliminaron los en una cámara de incubación a una
restos de sustrato y raíces, y se lava- temperatura de 27°C±2°C bajo luz
ron con agua corriente y jabón líqui- blanca fluorescente continua de 150
do comercial. Posteriormente se eli- mmol.m-2.s-1. Transcurridos 15 días de
minó totalmente la hoja externa de cultivo se evaluaron los porcentajes de
cada hijuelo y se realizó un corte mortalidad (%M) y contaminación
transversal del follaje, quedando re- (%C), considerando los hongos, leva-
ducida la altura del explante a 3 cm duras y bacterias como agentes con-
aproximadamente. Finalmente se re- taminantes. En esta investigación se
pitió el lavado con agua jabonosa y estableció como vitroplanta estableci-
luego se realizó un enjuague con abun- da, aquel explante que transcurrido
dante agua corriente. 15 días de cultivo estaba libre de con-
Bajo un diseño experimental taminantes visibles y había desarro-
completamente aleatorizado con tres llado al menos una hoja.
tratamientos y diez repeticiones, se Fase de multiplicación
estudió la desinfección del material A partir de vitroplantas de 21
vegetal con hipoclorito de sodio días, se estudió el efecto del
(NaClO) al 1, 2 y 3% a partir de cloro seccionamiento del explante (corte
comercial (5,25% NaClO), durante 10 transversal y transversal-
minutos en agitación constante. En longitudinal parcial) en interacción
seguida en condiciones asépticas den- con el estado físico del medio de culti-
tro de la cámara de flujo laminar se vo (semi-sólido y líquido en agitación)
realizaron tres enjuagues consecuti- sobre el coeficiente de multiplicación
vos con agua bidestilada estéril. (CM) y la altura del explante (AE).
Para el establecimiento in vitro se El corte transversal se realizó a
tomaron los explantes según los trata- una altura promedio de 1 cm desde la
mientos indicados, y se les redujo el ta- base hacia la zona distal de las hojas
maño a 1 cm de altura y 0,5 cm de diá- (figura 1a), de igual manera se reali-
metro aproximadamente. Estos zó el corte transversal-longitudinal
explantes fueron colocados en tubos de parcial al cual se adicionó un corte
ensayo (100x125 mm) conteniendo 10 longitudinal desde la zona apical ha-
mL de medio de cultivo constituido por: cia la zona basal abarcando las tres
50% de las sales del medio de cultivo cuartas partes de la altura del
Murashige y Skoog (MS) (11), 1 mg.L-1 explante (figura 1b). El medio de cul-
de tiamina-HCl, 100 mg.L-1 mioinositol, tivo fue similar al descrito en la fase
25 mg.L 1 de cisteina, 100 mg.L-1 ácido de establecimiento para el medio
ascórbico, 1 mg.L -1 de 6- semi-sólido (figura 1c) y para el me-
benzylaminopurina (BAP), 30 g.L-1 de dio líquido se excluyó el agar como
sacarosa y 10 g.L-1 de agar (FISHER®); componente del medio de cultivo (fi-
ajustando el pH a 5,8. Los medios de gura 1d). Se evaluó un total de cuatro
cultivo fueron esterilizados en autocla- tratamientos sobre las variables CM
ve a 121°C y 1,1 kg.cm2 durante 20 min. y AE con un diseño experimental com-

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pletamente aleatorizado y diez repe- El tamaño se midió desde el extremo


ticiones. basal de la vitroplanta hasta el ápice
Se colocaron cuatro explantes de la hoja más larga. Estos tres tra-
por envase de 250 mL de capacidad tamientos se analizaron a través de
(frascos para el medio semi-sólido y un diseño experimental completamen-
Erlenmeyer para el medio líquido) los te aleatorizado con 30 repeticiones por
cuales contenían 20 mL del medio de tratamiento.
cultivo. Los explantes bajo el efecto Las vitroplantas fueron
del medio líquido se colocaron en un transplantadas a bandejas de anime
agitador orbital a 50 rpm y los culti- (poliuretano) con 150 orificios de 70
vados en medio semi-sólido fueron cc de capacidad cada uno. El sustrato
colocados en una cámara de estuvo constituido por una mezcla de
incubación. En ambos casos las con- 40% de arena, 40% de abono de río y
diciones de cultivo fueron las mismas 20% de viruta de coco. Las
de la fase de establecimiento. Trans- vitroplantas se aclimataron en el
curridos 21 días de cultivo se evaluó umbráculo de la cátedra de Fisiología,
el coeficiente de multiplicación defi- Facultad de Agronomía-LUZ, bajo
nido como el número de explantes fi- condiciones de luz natural, tempera-
nales en relación al explante inicial y tura promedio de 35ºC y frecuencia de
la altura del explante determinada riego de tres veces por semana duran-
desde la base del explante hasta la te las dos primeras semanas y después
zona distal de la hoja en cm. una vez por semana el resto del pe-
Fase de aclimatización riodo. Transcurridos 60 días después
Las vitroplantas provenientes del transplante se evaluó el porcen-
de la fase de multiplicación se trans- taje de sobrevivencia de las
firieron a un medio de cultivo semi- vitroplantas de zábila.
sólido de igual composición al descri- En cada fase de la
to en la fase de establecimiento exen- micropropagación los datos de las va-
to del regulador de crecimiento (BAP). riables estudiadas fueron evaluados
Estas vitroplantas se incubaron por mediante un análisis de varianza sim-
un período de 21 días, con la finali- ple y prueba de comparación de me-
dad de inducir el enraizamiento de las dias por Tukey, excepto las variables
mismas. expresadas en porcentaje donde se
Después del enraizamiento, las realizó la comparación de proporcio-
vitroplantas se clasificaron en tres nes complementado con la prueba
grupos de acuerdo al tamaño: peque- exacta de Fisher. Todos los análisis
ñas (<5 cm), medianas (5 a 10 cm) y estadísticos se realizaron con el pro-
grandes (>10 cm) y se evaluó el efecto grama computarizado Statistix ver-
del tamaño de la vitroplanta sobre la sión 8.0 para ambiente Windows de
sobrevivencia en condiciones ex vitro. Microsoft®.

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a b

c d

Figura 1. Micropropagación de zábila. a: corte transversal del explante;


b: corte transversal-longitudinal parcial; c: multiplicación en
medio semi-sólido; d: multiplicación en medio líquido en
agitación y e: plantas adaptadas a condiciones ex vitro.

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Resultados y discusión
Fase de establecimiento obtenido en esta investigación fue me-
Después de 15 días de cultivo en nor que el señalado por Matos et al.
medio de establecimiento, no se detec- (9) quienes reportaron un 24% de con-
taron diferencias estadísticas (P<0,05) taminación al utilizar 15% de una so-
para el porcentaje de mortalidad al lución de cloro comercial (5,25% de
usar NaClO en concentraciones de 1, NaClO), seguido de la aplicación de un
2 y 3% por un periodo de 10 min. Sin producto antibacterial y antimicótico
embargo, se observó ennegrecimiento (Gerdex) por 20 min, en cada caso. Sin
de los explantes a medida que se au- embargo, en ambos trabajos los agen-
mentó la concentración de NaClO. tes contaminantes observados en ma-
El análisis estadístico detectó yor proporción fueron hongos y leva-
diferencias significativas (P<0,05) para duras. En esta investigación la dife-
el porcentaje de contaminación. A me- rencia en cuanto al porcentaje de con-
dida que aumentó la concentración del taminación pudo ser debida al uso de
NaClO disminuyó la incidencia de con- un explante de tamaño pequeño (1 cm
taminantes, obteniendo menor conta- de altura y 0,5 cm de diámetro aproxi-
minación con la concentración del 3% madamente), y al uso de plantas
(9,09%), seguido del 2% (14,25%) y del donadoras creciendo en condiciones de
1% (20%) de NaClO (figura 2). umbráculo, tal como es recomendado
El porcentaje de contaminación en la literatura (2).

25
c
Porcentaje de contaminacion (%C)

20
b
15
a
10

0
1 2 3
Concentracion (%) de hipoclorito de sodio (NaClO)

Figura 2. Efecto de la concentración de hipoclorito de sodio (NaClO)


sobre el porcentaje de contaminación de los explantes de Aloe
vera L, después de tres semanas de cultivo. Letras distintas
de una misma columna difieren estadísticamente para P<0,05
según la prueba de comparación de proporciones
complementada con el test exacto de Fisher.

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Liao et al. (8), utilizaron un pro- Los resultados obtenidos en esta


tocolo de desinfección previamente es- investigación favorecen la elección de
tablecido más complejo, que consistió medios de cultivo líquidos para el es-
en un lavado con agua corriente bajo tablecimiento de un protocolo más
chorro durante 24 h; seguido de una sencillo, eficiente y rentable en la fase
desinfección superficial con etanol al de multiplicación; ya que la exclusión
70% v/v durante 1 min y luego una del agar o cualquier otro agente
desinfección en 0,1% de HgCl2 p/v gelificante en los medios de cultivo
durante 10 min, finalmente realiza- puede disminuir hasta un 60% los cos-
ron cinco enjuagues con agua tos del medio (13). Además la etapa
desionizada esterilizada. Es evidente de elaboración de los medios de culti-
que el protocolo de desinfección pro- vo se simplifica y se agiliza el proceso
puesto en esta investigación es más de transferencia de los explantes en
sencillo que el reportado por Matos et el nuevo medio de cultivo; ya que sólo
al. (9) y Liao et al. (8). se agregan al envase, a diferencia de
Fase de multiplicación la transferencia al medio semi-sólido
Después de 21 días de cultivo en que requiere el cuidado de colocarlos
el medio de multiplicación el análisis en la posición y profundidad adecua-
estadístico no detectó diferencias para da. Por otra parte el uso de medios
el efecto del estado físico del medio de líquidos abre la posibilidad de la
cultivo (semi-sólido y líquido en agi- automatización de la micropropa-
tación) en interacción con el manejo gación (13).
del explante, sobre el CM (cuadro 1); El estado físico del medio arrojó
obteniéndose un promedio general de diferencias significativas (P<0,01)
3,75 brotes por explante inoculado. No para la variable: altura de las
obstante, en A. vera var. chinensis vitroplantas (cuadro 1). Se obtuvieron
(Haw) y A. barbadensis, se han repor- vitroplantas de mayor altura con un
tado CM superiores de 15 y 9, brotes/ promedio de 3,85 cm al usar el medio
explante respectivamente (8, 10); en de cultivo líquido en agitación; mien-
medios semi-sólidos, pero la composi- tras que, en medio de cultivo semi-
ción del medio de cultivo varió funda- sólido se obtuvo un promedio de 2,83
mentalmente en las concentraciones cm. Este señalamiento es similar al
y relaciones de los reguladores de cre- reportado por Kawiak et al. (7) en
cimiento. Drocera anglica, quienes obtuvieron

Caudro 1. Efecto del estado físico del medio de cultivo sobre la alturade
la vitroplanta de Aloe vera L., después de 21 días de cultivo.
Letras distintas difieren estadísticamente para P<0,01 según
la prueba de comparación de media de Tukey.

Estado físico del medio de cultivo altura de vitroplanta (cm)

Líquido en agitación 3,85a


Semi-sólido 2,83b

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mayor crecimiento al cultivarla en adaptación a las condiciones ex vitro


medio de cultivo líquido en agitación. (figura 1e), todas las plantas estaban
La mayor altura de las vivas y mostraron un crecimiento uni-
vitroplantas de zábila en el medio de forme a pesar de las diferencias de
cultivo líquido pudo ser una conse- tamaño al momento del transplante.
cuencia de una mayor disponibilidad Durante las fases iniciales de la
de los nutrientes; ya que se ha seña- micropropagación las vitroplantas
lado que la absorción de éstos se en- crecen en medios de cultivo que con-
cuentra reprimida en los medios semi- tienen azúcares, vitaminas y otras
sólidos (17). Sin embargo, una de las sustancias orgánicas, lo que determi-
desventajas del uso de medios de cul- na el desarrollo heterótrofo o
tivo líquidos es la hiperhidricidad que mixótrofo de los mismas (nula o baja
pueden desarrollar las vitroplantas (3, capacidad fotosintética, respectiva-
5). Este fenómeno no fue observado mente). Sin embargo, durante la fase
en esta investigación, probablemente de adaptación estas plantas son for-
por la acción de agitar constantemen- zadas a ser completamente autótrofas
te el medio de cultivo. La agitación y a sintetizar los compuestos orgáni-
constante permite una mayor airea- cos necesarios a partir de minerales,
ción del medio de cultivo líquido sien- agua, CO2 y luz.
do una de las recomendaciones en la Es muy probable que la capaci-
literatura para evitar o disminuir el dad de las vitroplantas de zábila para
efecto de la hiperhidricidad de los te- adaptarse a condiciones ex vitro sin
jidos (12). mayor inconveniente, se debió a que
Fase de aclimatización. esta especie posee un mecanismo
Previo a la fase de fotosintético ácido crasuláceo y al pa-
aclimatización se observó que las sar de la condición heterótrofa (in
vitroplantas comenzaron a emitir raí- vitro) a autótrofa (ex vitro) posee ma-
ces después del sexto día de cultivo in yor resistencia a la pérdida de agua
vitro en medio sin regulador de creci- por excesiva transpiración; lo cual se
miento y al cabo de tres semanas mos- ha reportado como una de las princi-
traron un buen desarrollo del siste- pales causas de muerte de
ma radical. Igualmente Roy y Sarkar vitroplantas en esta fase (1).
(15) observaron el desarrollo de raí- Queda demostrado que las
ces en el medio MS sin regulador de vitroplantas de zábila pueden supe-
crecimiento después de cinco semanas rar la adaptación a condiciones ex
y un sistema radical bien desarrolla- vitro, siendo este uno de los objetivos
do después de siete semanas en la de la fase de aclimatización como es
micropropagación de A. vera. señalado por Agramante (1).
El análisis estadístico no mos- Con esta metodología es posible
tró diferencias significativas (P<0,01) obtener una planta de zábila adapta-
para el porcentaje de sobrevivencia en da a condiciones ex vitro aproximada-
función del tamaño de las mente en tres meses.
vitroplantas. Después de 60 días de

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Conclusiones
La desinfección de los explantes vitroplantas en el medio de cultivo lí-
para la fase de establecimiento fue quido.
exitosa al utilizar 3% de NaClO duran- La metodología seguida para la
te 10 minutos, en agitación constante. fase de aclimatización fue exitosa y
En la fase de multiplicación se se logró obtener vitroplantas adapta-
logró un mayor tamaño de las das a condiciones ex vitro.

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