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Estudando Expressão Genética e Função

Em última análise, queremos determinar como os genes - e as


proteínas que codificam - funcionam no organismo intacto. Embora
possa parecer contraintuitivo, uma das maneiras mais diretas de
descobrir o que um gene faz é ver o que acontece com o organismo
quando esse gene está faltando. Estudar organismos mutantes que
adquiriram alterações ou deleções em suas seqüências
de nucleotídeos é uma prática consagrada na biologia. Como as
mutações podem interromper processos celulares, os mutantes muitas
vezes possuem a chave para entender a função do gene. Na abordagem
clássica do importante campo da genética , começa por isolar os
mutantes que apresentam uma aparência interessante ou incomum: as
moscas da fruta com olhos brancos ou asas curvadas, por
exemplo. Trabalhando para trás dofenótipo - a aparência ou
comportamento do indivíduo - então determina o genótipo do
organismo , a forma do gene responsável por essa característica
( Painel 8-1 ).

Painel 8-1

Revisão da Genética Clássica.


Hoje, com inúmeros projetos de genoma adicionando dezenas de
milhares de sequências de nucleotídeos aos bancos de dados públicos
todos os dias, a exploração da função de genesgeralmente começa com
uma seqüência de DNA . Aqui, o desafio é traduzir a seqüência para a
função. Uma abordagem, discutida anteriormente no capítulo, é
pesquisar bancos de dados para proteínas bem caracterizadas que
possuem seqüências de aminoácidos similares à proteínacodificada
por um novo gene e, a partir daí, empregam alguns dos métodos
descritos na seçãoanteriorpara explorar a função do gene ainda
mais. Mas para abordar diretamente o problema de como um gene
funciona em uma célula ou organismo, a abordagem mais eficaz
envolve o estudo de mutantes que não possuem o gene ou expressam
uma versão alterada do mesmo. Determinar quais processos celulares
foram interrompidos ou comprometidos em tais mutantes irá, com
freqüência, fornecer uma janela para o papel biológico de um gene.
Nesta seção , descrevemos várias abordagens diferentes para
determinar a função de um gene , seja a partir de uma sequência
de DNA ou de um organismo com
um fenótipo interessante . Começamos com a abordagem genética
clássica para estudar genes e função genética. Estes estudos começam
com uma tela genética para isolar mutantes de interesse e, em seguida,
prosseguem para a identificação do gene ou genes responsáveis pelo
fenótipo observado. Em seguida, analisamos a coleção de técnicas que
se enquadram no sistema de genética reversa, no qual um começa com
uma sequência de genes ou genes e tenta determinar sua função. Essa
abordagem geralmente envolve alguma adivinhação inteligente -
buscando seqüências homólogas e determinando quando e onde um
gene é expresso - além de gerar organismos mutantes e caracterizando
seu fenótipo.
Vamos para:

A abordagem clássica começa com a mutagênese


aleatória
Antes do advento da tecnologia de clonagem de genes , a maioria dos
genes foi identificada pelos processos interrompidos quando o gene
foi mutado. Esta abordagem genética clássica - identificando os genes
responsáveis por fenótipos mutantes - é mais facilmente realizada em
organismos que se reproduzem rapidamente e são passíveis de
manipulação genética, como bactérias, leveduras, worms nematóides e
moscas da fruta. Embora os mutantes espontâneos às vezes possam ser
encontrados examinando populações extremamente grandes - milhares
ou dezenas de milhares de organismos individuais - o processo de
isolar mutantes pode ser tornado muito mais eficiente gerando
mutações com agentes que danificam DNA. Tratando organismos com
mutagênicos, um número muito grande de mutantes pode ser criado
rapidamente e depois selecionado para um defeito particular de
interesse, como veremos em breve.
Uma abordagem alternativa à mutagênese química ou à radiação é
chamada de mutagênese de inserção. Este método baseia-se no fato de
que o DNA exógeno inserido aleatoriamente no genomapode produzir
mutações se o fragmento inserido interromper um gene ou suas
seqüências reguladoras. O DNA inserido, cuja sequência é conhecida,
serve como uma etiqueta molecular que auxilia na subsequente
identificação e clonagem do gene interrompido ( Figura 8-
55 ). Em Drosophila , o uso do elemento P transponível para inativar
genes revolucionou o estudo da função gênica na mosca da
fruta. Elementos transponíveis (ver Tabela 5-3, p. 287) também foram
utilizados para gerar mutantes em bactérias, fermento e na planta de
flores Arabidopsis . Retrovírus, que se copiam no genoma do
hospedeiro (ver Figura 5-73 ), foram usados para interromper genes
no peixe-zebra e em camundongos.

Figura 8-55

Mutante inseto do snapdragon, Antirrhinum. Uma mutação em um


único gene que codifica uma proteína reguladora faz com que os
rebentos de folhas se desenvolvam em lugar de flores. A mutação
permite que as células adotem um personagem que seria apropriado
para um diferente (mais ...)
Tais estudos são bem adequados para a dissecação de processos
biológicos em vermes e moscas, mas como podemos
estudar a função genética em seres humanos? Ao contrário dos
organismos que discutimos, os seres humanos não se reproduzem
rapidamente e não são tratados intencionalmente com
mutagênicos. Além disso, qualquer humano com um defeito grave em
um processo essencial, como a replicação do DNA , morreria muito
antes do nascimento.
Há duas respostas à questão de como estudamos genes
humanos. Primeiro, porque genes e funções de genes têm sido tão
altamente conservados ao longo da evolução, o estudo de
menos complexoorganismos modelo revelam informações críticas
sobre genes e processos semelhantes em humanos. Os genes humanos
correspondentes podem então ser estudados ainda mais em células
humanas cultivadas. Em segundo lugar, muitas mutações que não são
defeitos específicos do tecido letal nos lisossomos ou nos receptores
da superfície celular, por exemplo, surgiram espontaneamente na
população humana. As análises dos fenótipos dos indivíduos afetados,
juntamente com os estudos de suas células cultivadas, proporcionaram
muitos pontos de vista únicos sobre funções importantes das células
humanas. Embora tais mutações sejam raras, elas são descobertas de
forma muito eficiente por causa de uma propriedade humana única:
os indivíduos mutantes chamam atenção para si mesmos buscando
cuidados médicos especiais.
Vamos para:

Telas genéticas identificam mutantes deficientes em


processos celulares
Uma vez que uma coleção de mutantes em um organismo modelo ,
como leveduras ou moscas, foi produzida, geralmente é necessário
examinar milhares de indivíduos para encontrar
o fenômenoalterado de interesse. Essa busca é chamada de tela
genética . Como a obtenção de uma mutação em um gene de interesse
depende da probabilidade de o gene ser inativado ou de outra forma
mutado durante a mutagênese aleatória, quanto maior o genoma ,
menos provável é que qualquer gene específico seja mutado. Portanto,
quanto mais complexoO organismo, quanto mais mutantes devem ser
examinados para evitar genes desaparecidos. O fenótipo pesquisado
pode ser simples ou complexo. Os fenótipos simples são mais fáceis
de detectar: uma deficiência metabólica, por exemplo, em que um
organismo não é mais capaz de crescer na ausência de um
determinado aminoácido ou nutriente.
Os fenótipos que são mais complexos , por exemplo, mutações que
causam defeitos na aprendizagem ou memória, podem exigir telas
mais elaboradas ( Figura 8-56 ). Mas mesmo as telas genéticas que são
usadas para dissecar sistemas fisiológicos complexos devem ser tão
simples quanto possível no projeto e, se possível, devem permitir o
exame de um grande número de mutantes simultaneamente. Por
exemplo, uma tela particularmente elegante foi projetada para
procurar genes envolvidos no processamento visual no peixe zebra. A
base desta tela, que monitora a resposta dos peixes ao movimento, é
uma mudança de comportamento. Os peixes de tipo selvagem tendem
a nadar na direção de um movimento percebido, enquanto os mutantes
com defeitos em seus sistemas visuais nadam em direções aleatórias -
um comportamento que é facilmente
detectado. Um mutantedescoberto nesta tela é chamado lakritz , que
está faltando 80% das células ganglionares da retina que ajudam a
retransmitir sinais visuais do olho para o cérebro. Como a organização
celular da retina do peixe-zebra espelha a de todos os vertebrados, o
estudo de tais mutantes também deve fornecer informações sobre o
processamento visual em seres humanos.
Figura 8-56

As telas podem detectar mutações que afetam o comportamento de um


animal. (A) C. elegans de tipo selvagem envolvem-se na alimentação
social. Os vermes nadam até encontrarem seus vizinhos e começam a
se alimentar. (B) Os animais mutantes alimentam por si
mesmos. (Cortesia de Cornelia (mais ...)
Como os defeitos nos genes que são necessários para processos
celulares fundamentais - síntese e processamento de RNA ou controle
do ciclo celular, por exemplo - geralmente são letais, as funções
desses genes são freqüentemente estudadas em mutantes sensíveis à
temperatura. Nestes mutantes,
o produto proteico do gene mutante funciona normalmente a uma
temperatura média, mas pode ser inactivado por um pequeno aumento
ou diminuição da temperatura. Assim, a anormalidade pode ser ligada
e desligada experimentalmente, simplesmente, alterando a
temperatura. Uma célula que contém uma mutação sensível à
temperatura em um gene essencial para a sobrevivência a uma
temperatura não permissiva pode, no entanto, crescer à temperatura
normal ou permissiva ( Figura 8-57). O gene sensível à temperatura
em um tal mutante geralmente contém uma mutação pontualque causa
uma alteração sutil em seu produto protéico.

Figura 8-57

Screening para mutantes bacterianos ou de fermento sensíveis à


temperatura. As células mutagenizadas são plaqueadas à temperatura
permissiva. As colônias resultantes são transferidas para duas placas
de Petri idênticas por replicação; Uma dessas placas é incubada
em (mais ...)
Foram isolados muitos mutantes sensíveis à temperatura nos genes
que codificam as proteínas bacterianas necessárias para a replicação
do DNA , rastreando populações de bactérias tratadas com mutagênios
para células que parem de produzir DNA quando são aquecidas de 30
° C a 42 ° C. Estes mutantes foram mais tarde usados para identificar e
caracterizar as proteínas de replicação de DNA correspondentes
(discutidas no Capítulo 5). Os mutantes sensíveis à temperatura
também levaram à identificação de muitas proteínas envolvidas na
regulação do ciclo celular e na movimentação de proteínas através do
caminho secretor da levedura (ver Painel 13-1). As abordagens de
triagem relacionadas demonstraram a função de enzimas envolvidas
nas principais vias metabólicas de bactérias e leveduras (discutidas no
Capítulo 2), além de descobrir muitos
dos produtos genéticos responsáveis
pelo desenvolvimento ordenado do embrião Drosophila (discutido no
Capítulo 21) .
Vamos para:

Um teste de complementação revela se duas


mutações estão no mesmo ou em genes diferentes
Uma tela genética em larga escala pode representar muitos mutantes
diferentes que mostram o mesmo fenótipo . Esses defeitos podem
estar em diferentes genes que funcionam no mesmo processo, ou
podem representar diferentes mutações no mesmo gene . Como
podemos dizer, então, se duas mutações que produzem o mesmo
fenótipo ocorrem no mesmo gene ou em genes diferentes? Se as
mutações são recessivas - se, por exemplo, representam uma perda de
função de um gene específico - um teste de complementação pode ser
usado para determinar se as mutações caem no mesmo ou em
diferentes genes. No tipo mais simples de teste de complementação,
um indivíduo que é homozigoto para uma mutação - isto é, possui dois
alelos idênticos dagene mutanteem questão - é acoplado com um
indivíduo que é homozigoto para a outra mutação. Se as duas
mutações estão no mesmo gene, a prole mostra o fenótipo mutante,
porque ainda não terão cópias normais do gene em questão (ver Painel
8-1 , pp. 526-527). Se, em contraste, as mutações caírem em genes
diferentes, a descendência resultante mostra um fenótipo
normal. Retêm uma cópia normal (e uma cópia mutante) de cada
gene. As mutações complementam-se mutuamente e restauram um
fenótipo normal. O teste de complementação de mutantes
identificados durante as telas genéticas revelou, por exemplo, que 5
genes são necessários para levedura para digerir
o açúcar galactose; que são necessários 20 genes para E. colipara
construir um flagelo funcional; que 48 genes estão envolvidos na
montagem de partículas virais bacteriophage T4; e que centenas de
genes estão envolvidos no desenvolvimento de um verme de
nematóide adulto a partir de um ovofertilizado .
Uma vez que um conjunto de genes envolvidos em um determinado
processo biológico tenha sido identificado, o próximo passo é
determinar em qual ordem os genes funcionam. Determinar quando
um gene age pode facilitar a reconstrução de rotas genéticas ou
bioquímicas inteiras, e esses estudos têm sido fundamentais para a
nossa compreensão do metabolismo , transdução de sinal e muitos
outros processos de desenvolvimento e fisiológicos. Em essência,
desencadear a ordem em que os genes funcionam requer uma
caracterização cuidadosa do fenótipo causado por mutações em cada
gene diferente. Imagine, por exemplo, que as mutações em um
punhado de genes causam uma prisão na divisão celular durante
o desenvolvimento precoce do embrião. Um exame próximo de
cada mutante pode revelar que algum ato é extremamente cedo,
impedindo o ovo fertilizado de dividir em duas células. Outras
mutações podem permitir as primeiras divisões celulares, mas
impedem que o embrião chegue ao estágio da blastula .
Para testar as previsões feitas sobre a ordem em que os genes
funcionam, podem ser criados organismos que são mutantes em dois
genes diferentes. Se essas mutações afetam duas etapas diferentes no
mesmo processo, esses mutantes duplos devem ter
um fenômeno idêntico ao da mutação que age mais cedo na via. Como
exemplo, o caminho da secreção de proteína na levedurafoi decifrado
dessa maneira. Diferentes mutações nesta via causam a acumulação de
proteínas aberrantemente no retículo endoplasmático ( ER ) ou no
aparelho de Golgi. Quando uma célula é projetada para abrigar uma
mutação que bloqueia o processamento de proteínas no ERe uma
mutação que bloqueia o processamento no compartimento de Golgi ,
as proteínas se acumulam na ER. Isso indica que as proteínas devem
passar pela ER antes de serem enviadas para o Golgi antes da secreção
( Figura 8-58 ).

Figura 8-58

Usando a genética para determinar a ordem de função dos genes. Em


células normais, as proteínas são carregadas em vesículas, que se
fundem com a membrana plasmática e segregam seus conteúdos para
o meio extracelular. No mutante secretor A, as proteínas se
acumulam (mais ...)
Vamos para:

Genes podem ser localizados por análise de


linkagem
Com os mutantes em mãos, o próximo passo é identificar o gene ou os
genes que parecem ser responsáveis pelo fenótipo alterado . Se a
mutagênese de inserção foi usada para a mutagênese original, localizar
o gene interrompido é bastante simples. Os fragmentos
de ADN contendo a inserção (um transposão ou um retrovírus , por
exemplo) são recolhidos e amplificados, e a sequência nucleotídica do
ADN flanqueador é determinada . Esta seqüência é então usada para
pesquisar um banco de dados de DNA para identificar o gene que foi
interrompido pela inserção do elemento transponível .
Se um produto químico de danos ao DNA fosse usado para gerar os
mutantes, identificar o geneinativado é muitas vezes mais laborioso e
pode ser realizado por várias abordagens diferentes. Em um, o
primeiro passo é determinar onde no genoma o gene está
localizado. Para mapear um gene recém descoberto, sua localização
cromossômica áspera é determinada pela primeira vez , avaliando o
quão longe o gene reside em outros genes conhecidos no
genoma. Estimar a distância entre loci genéticos é geralmente feito
por análise de ligação , uma técnica que se baseia no fato de que os
genes que estão próximos um do outro em um cromossomotendem a
ser herdados juntos. Quanto mais próximos forem os genes, maior será
a probabilidade de que eles sejam transferidos para a prole como um
par. Mesmo genes estreitamente ligados, no entanto, podem ser
separados por recombinação durante a meiose . Quanto maior a
distância entre dois loci genéticos, maior a chance de serem separados
por um cruzamento (ver Painel 8-1 , pp. 526-527). Ao calcular a
frequência de recombinação entre dois genes, pode-se determinar a
distância aproximada entre eles.
Uma vez que os genes nem sempre estão localizados o suficiente um
para o outro para permitir uma identificação precisa de sua posição,
as análises de ligação geralmente dependem de marcadores físicos ao
longo do genoma para estimar a localização de
um gene desconhecido . Estes marcadores são geralmente fragmentos
de nucleótidos , com uma sequência conhecida e localização do
genoma, que podem existir em pelo menos duas formas alélicas. Os
polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs), por exemplo, são
sequências curtas que diferem por um ou mais nucleotídeos entre
indivíduos em uma população. Os SNPs podem ser detectados
por técnicas de hibridação . Muitos desses marcadores físicos,
distribuídos ao longo do comprimento dos cromossomos, foram
coletados para uma variedade de organismos, incluindo mais de
106 para humanos. Se a distribuição desses marcadores for
suficientemente densa, pode-se, através de uma análise de ligação que
testar a herança certezada de um ou mais SNPs com
o fenótipo mutante , restringir a localização potencial de um gene a
uma região cromossômica que pode conter apenas alguns sequências
de genes. Estes são então considerados genes candidatos, e sua
estrutura e função podem ser testadas diretamente para determinar
qual gene é responsável pelo fenótipo mutante original.
A análise de ligação pode ser usada da mesma maneira para identificar
os genes responsáveis por distúrbios humanos hereditários. Tais
estudos exigem que as amostras de DNA sejam coletadas de um
grande número de famílias afetadas pela doença. Essas amostras são
examinadas quanto à presença de marcadores físicos, como os SNPs
que parecem estar intimamente ligados ao gene da doença. Essas
seqüências sempre serão herdadas por indivíduos que têm a doença e
não por seus parentes não afetados. O gene da doença é então
localizado como descrito acima ( Figura 8-59 ). Os genes para a
fibrose cística e a doença de Huntington, por exemplo, foram
descobertos desta maneira.

Figura 8-59

Análise de ligação genética usando marcadores físicos no DNA para


encontrar um gene humano. Neste exemplo, estuda-se o imitamento
de um fenótipo humano específico (aqui uma doença genética) com
um marcador SNP. Se indivíduos que herdam a doença quase
sempre (mais ...)
Vamos para:
A procura de homologia pode ajudar a prever a
função de um gene
Uma vez que um gene foi identificado, sua função pode
frequentemente ser predita identificando genes homólogos cujas
funções já são conhecidas. Como discutimos anteriormente, os bancos
de dados que contêm sequências de nucleotídeos de uma variedade de
organismos - incluindo as seqüências completas do genoma de muitas
dezenas de micróbios, C. elegans , A. thaliana , D. melanogaster e
humanos - podem ser pesquisadas por seqüências que são semelhantes
às aqueles do gene alvo não caracterizado.
Ao analisar um genoma recém-seqüenciado , tal pesquisa serve como
uma tentativa de primeira passagem para atribuir funções a tantos
genes quanto possível, um processo chamado de anotação . Novos
estudos genéticos e bioquímicos são então realizados para confirmar
se o gene codifica um produto com a função prevista, conforme
discutimos em breve. A análise de homologia nem sempre revela
informações sobre a função: no caso do genoma de levedura , 30%
dos genes anteriormente não caracterizados podem ser atribuídos a
uma função putativa por análise de homologia; 10% tinham
homólogos cuja função também era desconhecida; e outros 30% não
tinham homólogos em nenhum banco de dados existente. (Os restantes
30% dos genes foram identificados antes de seqüenciar o genoma do
fermento).
Em alguns casos, uma pesquisa de homologia revela um gene no
organismo A que produz uma proteína que, em um organismo
diferente, é fundida com uma segunda proteína que é produzida por
um gene independente no organismo A. Em leveduras , por exemplo,
duas partes separadas os genes codificam duas proteínas que estão
envolvidas na síntese de triptofano; em E. coli , no entanto, esses dois
genes são fundidos em um ( Figura 8-60 ). O conhecimento de que
essas duas proteínas na levedura correspondem a dois domínios em
uma única proteína bacteriana significa que elas provavelmente
estarão associadas funcionalmente e, provavelmente, trabalharão
juntas em um complexo protéico. Mais geralmente, esta abordagem é
usada para estabelecer ligações funcionais entre genes que, para a
maioria dos organismos, estão amplamente separados no genoma.

Figura 8-60
As fusões de domínio revelam relações entre genes funcionalmente
ligados. Neste exemplo, a interação funcional dos genes 1 e 2 no
organismo A é inferida pela fusão de domínios homólogos em um
único gene (gene 3) no organismo B.
Vamos para:

Genes repórteres revelam quando e onde um gene é


expresso
Pistas para a função genética podem ser obtidas freqüentemente ao
examinar quando e onde um gene é expresso na célula ou em todo o
organismo. A determinação do padrão e tempo
da expressãogênica pode ser realizada substituindo a porção de
codificação do gene em estudo com um gene repórter. Na maioria dos
casos, a expressão do gene repórter é então monitorizada por
rastreamento da fluorescência ou atividade enzimática do
seu produto protéico (pp. 518-519).
Conforme discutido em detalhes no Capítulo 7, a expressão gênica é
controlada por seqüências de DNA reguladoras , localizadas a
montante ou a jusante da região de codificação, que geralmente não
são transcritas. Essas seqüências reguladoras, que controlam quais
células expressarão um gene e em que condições, também podem ser
feitas para direcionar a expressão de um gene repórter. Um
simplesmente substitui a sequência de codificação do gene alvo com o
do gene repórter e introduz estas moléculas de DNA recombinante nas
células. O nível, o tempo e a especificidade celular da produção
de proteína repórter refletem a ação das seqüências reguladoras que
pertencem ao gene original ( Figura 8-61 ).

Figura 8-61

Usando uma proteína repórter para determinar o padrão da expressão


de um gene. (A) Neste exemplo, a sequência de codificação para a
proteína X é substituída pela sequência de codificação para a proteína
Y. (B) Vários fragmentos de sequências reguladoras candidatas
contendo DNA são (mais ...)
Várias outras técnicas, discutidas anteriormente, também podem ser
usadas para determinar o padrão de expressão de um gene . As
técnicas de hibridação, como a análise do Norte (ver Figura 8-27 ) e
a hibridação in situ para detecção de RNA (ver Figura 8-29 ) podem
revelar quando os genes são transcritos e em que tecido e
quanto mRNA produzem.
Vamos para:

Microarrays Monitoram a Expressão de Milhares de


Genes de uma vez
Até agora, discutimos técnicas que podem ser usadas para monitorar
a expressão de apenas um único gene por vez. Muitos desses métodos
são bastante intensivos em mão-de-obra: gerar construções de genes
repórter ou fusões GFP requer a manipulação de DNA e a transfecção
de células com as moléculas recombinantes resultantes. Mesmo as
análises do Norte são de alcance limitado pelo número de amostras
que podem ser executadas em um gel de agarose. Desenvolvido na
década de 1990, as microarrays de DNA revolucionaram a forma
como a expressão de genes agora é analisada ao permitir
o RNAprodutos de milhares de genes a serem monitorados de uma só
vez. Examinando simultaneamente a expressão de tantos genes,
podemos agora começar a identificar e estudar os padrões de
expressão gênica subjacentes à fisiologia celular: podemos ver quais
genes são ativados (ou desligados) à medida que as células crescem,
dividem ou respondem aos hormônios ou para toxinas.
As microarrays de DNA são pouco mais do que lâminas de
microscópio de vidro esmagadas com um grande número de
fragmentos de DNA, cada uma contendo uma sequência
de nucleotídeos que serve como sonda para um gene específico . Os
arrays mais densos podem conter dezenas de milhares desses
fragmentos em uma área menor do que um selo postal, permitindo que
milhares de reações de hibridação sejam realizadas em paralelo
( Figura 8-62 ). Alguns microarrays são gerados a partir de grandes
fragmentos de DNA que foram gerados por PCRe depois manchado
nas lâminas por um robô. Outros contêm oligonucleótidos curtos que
são sintetizados na superfície da bolacha de vidro com técnicas
semelhantes às que são usadas para gravar circuitos em chips de
computador. Em ambos os casos, a seqüência e a posição exatas de
cada sonda no chip são conhecidas. Assim, qualquer fragmento de
nucleótido que se hibrida com uma sonda no conjunto pode ser
identificado como o produto de um gene específico simplesmente
detectando a posição a que está ligado.

Figura 8-62

Usando microarrays de DNA para monitorar simultaneamente a


expressão de milhares de genes. Para preparar o microarray,
fragmentos de DNA - cada um correspondente a um gene - são vistos
em um slide por um robô. Arrays preparados também estão
disponíveis comercialmente. (Mais...)
Para usar um microarray de DNA para monitorar a expressão gênica ,
o mRNA das células em estudo é primeiro extraído e convertido
em cDNA (ver Figura 8-34 ). O cDNA é então marcado com
uma sonda fluorescente . O microarray é incubado com esta amostra
de cDNA marcada e a hibridação pode ocorrer (ver Figura 8-62 ). A
matriz é então lavada para remover o cDNA que não está bem ligado,
e as posições no microarray ao qual os fragmentos de DNA rotulados
estão ligados são identificadas por um microscópio automático com
laser de varredura. As posições da matriz são então correspondidas ao
gene particular cuja amostra de DNA foi manchada neste local.
Tipicamente, o ADN fluorescente das amostras experimentais
(marcado, por exemplo, com um corante fluorescente vermelho ) é
misturado com uma amostra de referência
de fragmentos de cDNA marcados com um corante fluorescente de
cor diferente (verde, por exemplo). Assim, se a quantidade
de ARN expresso a partir de um gene particular nas células de
interesse é aumentada em relação à da amostra de referência, o ponto
resultante é vermelho. Por outro lado, se o gene de expressão é
diminuída em relação ao da amostra de referência, o local é
verde. Usando essa referência interna, os perfis de expressão gênica
podem ser tabulados com grande precisão.
Até agora, as microarrays de DNA foram usadas para examinar tudo,
desde a mudança na expressão gênica, que faz com que os morangos
amadureçam até a expressão do gene "assinaturas" de diferentes tipos
de células cancerosas humanas (ver Figura 7-3 ). Arrays que contêm
sondas que representam todos os 6000 genes de levedura têm sido
usados para monitorar as mudanças que ocorrem na expressão de
genes como mudança de fermento de fermentação de glicosepara
crescer em etanol; como eles respondem a uma mudança súbita para o
calor ou o frio; e à medida que passam por diferentes estádios do ciclo
celular. O primeiro estudo mostrou que, à medida que a levedura
utiliza a última glicose no meio, o padrão de expressão de seus genes
muda de forma marcante: quase 900 genes são transcritos mais
ativamente, enquanto outros 1200 diminuem a atividade. Cerca de
metade desses genes não tem função conhecida, embora este estudo
sugira que eles estão de alguma forma envolvidos na reprogramação
metabólica que ocorre quando as células de fermento se deslocam
da fermentação para a respiração .
Estudos abrangentes sobre a expressão de genes também fornecem
uma camada adicional de informações que é útil para prever a função
do gene. Anteriormente, discutimos como a identificação dos
parceiros de interação de uma proteína pode produzir indícios sobre a
função dessa proteína. Um princípio semelhante é válido para os
genes: a informação sobre a função de um gene pode ser deduzida
identificando genes que compartilham seu padrão de
expressão. Usando uma técnica chamada análise de cluster , pode-se
identificar conjuntos de genes que são regulados de forma
coordenada. Os genes que estão ligados ou desligados juntos em uma
variedade de circunstâncias diferentes podem funcionar em conjunto
na célula: eles podem codificar proteínas que fazem parte da mesma
máquina multiproteína, ou proteínas que estão envolvidas em
umaatividade coordenada complexa , como a replicação do DNA ou
o splicamento de ARN . A caracterização da função de um gene
desconhecido, agrupando-a com genes conhecidos que compartilham
seu comportamento transcripcional, às vezes é chamado de "culpa por
associação". As análises de cluster foram usadas para analisar os perfis
de expressão gênica subjacentes a muitos processos biológicos
interessantes, incluindo a cicatrização de feridas em seres humanos
( Figura 8-63 ).

Figura 8-63

Usando análise de cluster para identificar conjuntos de genes que são


regulados de forma coordenada. Os genes que pertencem ao mesmo
cluster podem estar envolvidos em caminhos ou processos celulares
comuns. Para realizar uma análise de cluster, os dados de microarrays
são obtidos a partir de amostras de células (mais ...)
Vamos para:

Mutações direcionadas podem revelar a função


genética
Embora em organismos que reproduzem rapidamente, muitas vezes
não é difícil obter mutantes que são deficientes em um processo
particular, como a replicação do DNA ou o desenvolvimento doolho ,
pode demorar muito tempo a traçar o defeito para uma
determinada proteína alterada . Recentemente, a tecnologia de DNA
recombinante e a explosão na seqüenciamento do genomatornaram
possível um tipo diferente de abordagem genética. Em vez de começar
com um mutantegerado aleatoriamente e usá-lo para identificar
um genee sua proteína, pode-se começar com um gene específico e
proceder a fazer mutações nele, criando células ou organismos
mutantes para analisar a função do gene. Como a nova abordagem
inverte a direção tradicional da descoberta genética - procedendo de
genes e proteínas a mutantes, em vez de vice-versa - é comumente
referido como genética reversa .
A genética reversa começa com um gene clonado , uma proteína com
propriedades interessantes que foi isolada de uma célula, ou
simplesmente uma sequência de genoma . Se o ponto de partida for
uma proteína, o gene que codificá-lo é identificado pela primeira vez
e, se necessário, a sua sequência de nucleótidos é determinada . A
sequência do gene pode então ser alterada in vitro para criar
uma versão mutante . Este gene mutante manipulado, juntamente com
uma região reguladora apropriada, é transferido para uma
célula. Dentro da célula, ele pode se integrar em um cromossomo,
tornando-se uma parte permanente do genoma da célula. Todos os
descendentes da célula modificada agora conterão o gene mutante.
Se a célula original utilizada para a transferência de genes é
um ovo fertilizado , podem ser obtidos organismos multicelulares
inteiros que contêm o gene mutante , desde que a mutação não cause
letalidade. Em alguns desses animais, o gene alterado será
incorporado nas células germinativas - uma mutação da linha germinal
- permitindo que o gene mutante seja transmitido à sua progênie.
As transformações genéticas desse tipo são agora rotineiramente
realizadas com organismos tão complexos como as moscas da fruta e
os mamíferos. Tecnicamente, até mesmo os seres humanos agora
poderiam ser transformados dessa maneira, embora esses
procedimentos não sejam realizados, mesmo para fins terapêuticos,
por medo das aberrações imprevisíveis que podem ocorrer nesses
indivíduos.
No início deste capítulo, discutimos outras abordagens para descobrir
a função de um gene , incluindo a busca por genes homólogos em
outros organismos e determinando quando e onde um gene é
expresso. Este tipo de informação é especialmente útil para sugerir
que tipo de fenótipos procurar nos organismos mutantes . Um gene
que é expresso apenas no fígado adulto, por exemplo, pode ter um
papel na degradação de toxinas, mas não é susceptível de afetar
o desenvolvimento do olho. Todas essas abordagens podem ser usadas
para estudar genes isolados ou para tentar uma análise em larga escala
da função de cada gene em um organismo - um campo emergente
conhecido como genômica funcional .
Vamos para:

Células e animais que contêm genes mutados


podem ser feitos sob encomenda
Vimos que procurar por genes homólogos e analisar os padrões
de expressão gênica pode fornecer pistas sobre a função genética, mas
não revelam o que exatamente um gene faz dentro de uma célula. A
genética fornece uma solução poderosa para esse problema, pois
mutantes que não possuem um gene específico podem revelar
rapidamente a função da proteína que ele codifica. As técnicas de
engenharia genética permitem que um produzisse especificamente
esses knockouts de genes, como veremos. No entanto, também pode-
se gerar mutantes que expressam um gene em níveis anormalmente
elevados (superexpressão), no tecido errado ou no tempo errado
(misexpression), ou em uma forma ligeiramente alterada que exerce
um fenótipo dominante . Para facilitar tais estudos sobre a função
genética, a sequência de codificação de um gene e suas regiões
reguladoras podem ser modificadas para alterar as propriedades
funcionais do produto protéico, a quantidade de proteína produzida ou
o tipo celular específico em que a proteína é produzida.
Os genes alterados são introduzidos nas células de várias maneiras,
algumas das quais são descritas em detalhes no Capítulo 9.
O DNA pode ser microinjetado em células de mamífero com
uma micropipleta de vidro ou introduzido por um vírus que foi
projetado para transportar genes estranhos. Nas células das plantas, os
genes são freqüentemente introduzidos por uma técnica chamada
bombardeio de partículas: as amostras de DNA são pintadas em
pequenas contas de ouro e, em seguida, literalmente disparadas
através da parede celular com uma arma especialmente modificada. A
eletroporação é o método de escolha para a introdução de DNA em
bactérias e algumas outras células. Nesta técnica, um curto choque
elétrico torna a membrana celular temporariamente permeável,
permitindo que DNA estranho entre no citoplasma.
Examinaremos agora como o estudo dessas células e
organismos mutantes permite a dissecação de caminhos biológicos.
Vamos para:

O gene normal em uma célula pode ser substituído


diretamente por um gene mutante de engenharia em
bactérias e alguns eucariotas inferiores
Ao contrário dos eucariotas superiores (que são multicelulares
e diploides ), bactérias, leveduras e o molde de lodo
celular Dictyostelium geralmente existem
como células únicas haplóides . Nestes organismos, uma molécula
de DNA introduzida artificialmente que transporta
um gene mutantepode, com uma frequência relativamente alta,
substituir a única cópia do gene normal
por recombinação homóloga (ver pág. 276), de modo que é fácil
produzir células nas quais o mutante O gene substituiu o gene normal
( Figura 8-64A ). Desta forma, as células podem ser feitas à ordem
que produzem uma forma alterada de
qualquer proteína específica ou RNA molécula em vez da forma
normal da molécula. Se o gene mutante estiver completamente inativo
e o produto genético normalmente desempenha uma função essencial,
a célula morre; mas, neste caso, uma versão menos mutante do gene
pode ser usada para substituir o gene normal, de modo que a célula
mutante sobreviva, mas é anormal no processo para o qual o gene é
necessário. Muitas vezes, o mutante de escolha é aquele que produz
um produto genético sensível à temperatura, que funciona
normalmente a uma temperatura, mas é inativado quando as células
são deslocadas para uma temperatura maior ou menor.

Figura 8-64

Substituição de genes, knockout de genes e adição de genes. Um gene


normal pode ser alterado de várias maneiras em um organismo de
engenharia genética. (A) O gene normal (verde)pode ser
completamente substituído por uma cópia mutante do
gene (vermelho) , um processo chamado substituição de
gene. (Mais...)
A capacidade de realizar substituições directas de genes em eucariotas
inferiores, combinada com o poder das análises genéticas padrão
nestes organismos haploides , explica em grande parte por que os
estudos nesses tipos de células têm sido tão importantes para elaborar
os detalhes dos processos que são compartilhados por todos os
eucariotas. Como veremos, as substituições de genes são possíveis,
mas são mais difíceis de realizar em eucariotas superiores, por razões
que não são inteiramente compreendidas.
Vamos para:

Genes de engenharia podem ser usados para criar


mutações negativas específicas e dominantes em
organismos diploides
Os eucariotas mais elevados, como os mamíferos, moscas da fruta ou
vermes, são diploides e, portanto, têm duas cópias de
cada cromossomo . Além disso, a transfecção com
um gene alterado geralmente leva à adição de genes ao invés de
substituição de genes: as inserções de genes alteradas em uma
localização aleatória no genoma , de modo que a célula (ou o
organismo) acaba com o gene mutado além do seu gene normal
cópias.
Como a adição de genes é muito mais fácil de realizar do que a
substituição de genes em células eucarióticas superiores, é útil
criar mutações negativas dominantes específicas em que
um gene mutante elimina a atividade de suas homólogas normais na
célula. Uma abordagem engenhosa explora a especificidade
das reações de hibridação entre duas cadeias complementares de ácido
nucleico . Normalmente, apenas uma das duas cadeias de DNA em
uma determinada porção de hélice dupla é transcrita em RNA , e é
sempre a mesma cadeia para um determinado gene (veja a Figura 6-
14). Se um gene clonado for projetado de modo que a cadeia de DNA
oposta seja transcrita em vez disso, produzirá moléculas de ARN anti-
sentido que possuem uma sequência complementar aos transcritos de
RNA normais. Esse ARN anti-sentido , quando sintetizado em
quantidades suficientemente grandes, pode, muitas vezes, se hibridar
com o ARN de "sentido" produzido pelos genes normais e assim inibir
a síntese da proteína correspondente ( Figura 8-65). Um método
relacionado envolve a síntese de moléculas de ácido nucleico
antisentido curtas quimicamente ou enzimaticamente e, em seguida,
injetar (ou de entregá-las de outro modo) para células, novamente
bloqueando (embora apenas temporariamente) a produção da proteína
correspondente. Para evitar a degradação do ácido nucleico injetado,
um análogo de ARN sintético estável, chamado morfolino-RNA, é
freqüentemente usado em vez de RNA comum.

Figura 8-65

A estratégia anti-sentido do RNA para gerar mutações negativas


dominantes. Os genes mutantes que foram manipulados para produzir
ARN anti-sentido, que é complementar em sequência ao RNA
produzido pelo gene normal X, podem fazer com que o ARN de
cadeia dupla se forme no interior (mais ...)
À medida que os pesquisadores continuavam explorando
a estratégia anti - sentido do RNA , eles fizeram uma descoberta
interessante. Uma cadeia de ARN antisentido pode
bloquear a expressão de genes , mas uma preparação de RNA de
cadeia dupla (dsRNA), que contém tanto as cadeias sentido e
antisentido de um gene alvo, inibe a atividade dos genes alvo ainda
mais efetivamente (ver Figura 7-107 ). Esse fenômeno,
chamado RNAi (RNAi) , agora foi explorado para examinar a função
do gene em vários organismos.
A técnica RNAi tem sido amplamente utilizada para
estudar a função genética no nematodo C. elegans . Ao trabalhar com
worms, a introdução do ARNdd é bastante simples: o ARN pode ser
injetado diretamente no intestino do animal, ou o sem-fim pode ser
alimentado com E. coli queexpressa o DNA alvo dsRNA ( Figura 8-
66A ). O ARN é distribuído por todo o corpo do verme e é encontrado
para inibir a expressão do gene alvo em diferentes tipos de
tecido. Além disso, como explicado na Figura 7-107 , a interferência é
freqüentemente herdada pela progênie do animal injetado. Porque
todo o genoma de C. elegansfoi sequenciado, o RNAi está sendo
usado para ajudar a atribuir funções a todo o complemento de genes
de vermes. Em um estudo, os pesquisadores conseguiram inibir 96%
dos aproximadamente 2300 genes previstos no cromossomo III de C.
elegans . Desta forma, identificaram 133 genes envolvidos na divisão
celular em embriões de C. elegans ( Figura 8-66C ). Destes, apenas 11
foram anteriormente atribuídos a uma função por experimentação
direta.

Figura 8-66

Mutações negativas significativas criadas pela interferência de


RNA. (A) O ARN de cadeia dupla (dsRNA) pode ser introduzido
em C. elegans (1) alimentando os vermes com E. coli expressando o
dsRNA ou (2) injetando dsRNA diretamente no intestino. (B) embrião
de sem-fim de tipo selvagem. (Mais...)
Por razões desconhecidas, a interferência de RNA não inibe
eficientemente todos os genes. E a interferência às vezes pode
suprimir a atividade de um gene alvo em um tecido e não outro. Uma
maneira alternativa de produzir uma mutação negativa
dominante aproveita o fato de que a maioria das proteínas funciona
como parte de um complexo de proteína maior . Esses complexos
geralmente podem ser inativados pela inclusão de apenas um
componente não funcional. Portanto, criando um gene que produz
grandes quantidades de uma proteína mutante que é inativa, mas que
ainda é capaz de se montar no complexo, muitas vezes é possível
produzir uma célula na qual todos os complexos são inativados apesar
da presença da proteína normal (Figura 8-67 ).

Figura 8-67

Um efeito negativo dominante de uma proteína. Aqui, um gene é


projetado para produzir uma proteína mutante que evita que as cópias
normais da mesma proteína realizem sua função. Neste exemplo
simples, a proteína normal deve formar um complexo
multisubunitário (mais ...)
Se uma proteína é necessária para a sobrevivência da célula (ou do
organismo), um mutantenegativo dominante morre, tornando
impossível testar a função da proteína. Para evitar este problema,
pode-se acoplar o gene mutante para controlar as sequências que
foram projetadas para produzir o produto do gene apenas no comando,
por exemplo, em resposta a um aumento de temperatura ou à presença
de uma molécula de sinalização específica . Células ou organismos
contendo esse gene mutante dominante sob o controlo de
um promotor indutívelpode ser privado de uma proteína específica em
um momento específico, e o efeito pode então ser seguido. Os
promotores indutíveis também permitem que os genes sejam ligados
ou desligados em tecidos específicos, permitindo examinar o efeito do
gene mutante em partes selecionadas do organismo. No futuro, as
técnicas para produzir mutações negativas dominantes para inativar
genes específicos provavelmente serão amplamente utilizadas para
determinar as funções das proteínas em organismos superiores.
Vamos para:

Mutações de ganho de função fornecem pistas para


o papel Genes Play in a Cell or Organism
Da mesma forma que as células podem ser projetadas para expressar
uma versão negativa dominante de uma proteína , resultando em
um fenótipo de perda de função , elas também podem ser projetadas
para exibir um novo fenótipo através de uma mutação de ganho de
função . Tais mutações podem conferir uma nova atividade sobre uma
determinada proteína, ou podem causar uma proteína com atividade
normal a ser expressa em um tempo inadequado ou no tecido errado
em um animal. Independentemente do mecanismo, mutações de ganho
de função podem produzir um novo fenótipo em uma célula, tecido ou
organismo.
Muitas vezes, os mutantes de ganho de função são gerados pela
expressão de um gene em um nível muito maior do que o normal nas
células. Essa superexpressão pode ser conseguida através do
acoplamento de um gene a uma poderosa sequência de promotores e
colocá-lo em um plasmídeomulticopia ou integrá-lo em múltiplas
cópias no genoma . Em ambos os casos, o gene está presente em
muitas cópias e cada cópia direciona a transcrição de números
invulgarmente grandes de moléculas de mRNA . Embora o efeito que
tais sobre- expressão tem sobre o fenótipo de um organismo deve ser
interpretados com cautela, esta abordagem proporcionou insights
inestimáveis para a actividade de muitos genes. Em um tipo
alternativo de ganho de funçãomutação , a proteína mutante é feita em
quantidades normais, mas é muito mais ativa do que sua contrapartida
normal. Tais proteínas são freqüentemente encontradas em tumores e
foram exploradas para estudar caminhos de transdução de sinal em
células (discutidas no Capítulo 15).
Os genes também podem ser expressos no momento errado ou no
lugar errado em um organismo - muitas vezes com resultados
impressionantes ( Figura 8-68 ). Essa misexpression é realizada com
maior freqüência reestruturando os próprios genes, fornecendo-lhes as
seqüências reguladoras necessárias para alterar sua expressão .

Figura 8-68
Implementação ectópica de Wnt, uma proteína de sinalização que
afeta o desenvolvimento do eixo do corpo
no embrião Xenopus inicial . Neste experimento, o mRNA que
codificou Wnt foi injetado no blastomere ventral vegetal, induzindo
um segundo eixo do corpo (discutido em (mais ...)
Vamos para:

Genes podem ser redignos para produzir proteínas


de qualquer sequência desejada
Ao estudar a ação de um gene e a proteína que codifica, nem sempre
queremos fazer mudanças drásticas - inundando células com enormes
quantidades de proteína hiperativa ou eliminando completamente um
produto de gene. Às vezes, é útil fazer pequenas alterações na
estrutura de uma proteína de modo que se possa começar a dissecar as
porções de uma proteína que são importantes para sua função. A
atividade de uma enzima , por exemplo, pode ser estudada alterando
um único aminoácido no seu site ativo . São necessárias técnicas
especiais para alterar genes e seus produtos protéicos, de maneiras tão
sutis. O primeiro passo é muitas vezes a síntese química de
uma molécula de DNA curtacontendo a porção alterada desejada
da sequência de nucleótidos do gene . Este oligonucleótido de DNA
sintético é hibridado com DNA de plasmídeo de cadeia simples que
contém a sequência de DNA a ser alterada, utilizando condições que
permitem que as madeixas de DNA imperfeitamente combinadas
se acoplem ( Figura 8-69 ). O oligonucleótido sintético servirá agora
como um iniciador para a síntese de DNA por DNA polimerase ,
gerando assim uma dupla hélice de ADN que incorpora a sequência
alterada em uma das suas duas cadeias. Após a transfecção , obtêm-se
plasmídeos que transportam a sequência de genes completamente
modificada. O DNA apropriado é então inserido em um vetor de
expressãode modo que a proteína redesenhada pode ser produzida no
tipo apropriado de células para estudos detalhados de sua função. Ao
alterar os aminoácidos selecionados em uma proteína dessa maneira -
uma técnica chamada mutagênese direcionada ao local - pode-se
determinar exatamente quais partes da cadeia polipeptídica são
importantes para processos tais como dobragem de proteínas,
interações com outras proteínas e catálise enzimática.
Figura 8-69

A utilização de um oligonucleótido sintético para modificar a região


de codificação da proteína de um gene por mutagénese dirigida ao
local. (A) Um plasmídeo recombinante contendo uma inserção de
gene é separado nas suas duas cadeias de DNA. Um adesivo
oligonucleotídico sintético correspondente (mais ...)
Vamos para:

Genes de engenharia podem ser facilmente


inseridos na linha de germes de muitos animais
Ao engenharia de um organismo que é para expressar
um gene alterado , idealmente um gostaria de poder substituir o gene
normal pelo alterado para que a função da proteína mutante possa ser
analisada na ausência da proteína normal. Conforme discutido acima,
isso pode ser facilmente realizado em alguns organismos haploides e
unicelulares. Devemos ver na seguinte seção que procedimentos muito
mais complicados foram desenvolvidos que permitem substituições de
genes desse tipo em camundongos. DNA estrangeiropode, contudo,
ser facilmente integrado em posições aleatórias de muitos genomas
animais. Em mamíferos, por exemplo, os fragmentos de DNA lineares
introduzidos nas células são rapidamente ligados de ponta a ponta
pelas enzimas intracelulares para formar arrays longos em tandem,
que geralmente se tornam integrados em um cromossomo em um local
aparentemente aleatório. Os ovos de mamíferos fertilizados se
comportam como outras células de mamíferos a este respeito. Um ovo
de rato injetado com 200 cópias de uma molécula de DNA
linear geralmente se desenvolve em um mouse contendo, em muitas
de suas células, uma série de cópias do gene injetado em um único
local aleatório em um dos seus cromossomos. Se o cromossomo
modificado estiver presente na linha germinativa células (óvulos ou
esperma), o mouse passará esses genes estranhos para sua progênie.
Os animais que foram permanentemente reengenhariaados
por inserção de genes , deleção de genes ou substituição de genes são
chamados de organismos transgênicos , e quaisquer genes estrangeiros
ou modificados que são adicionados são
chamados transgenes . Quando o gene normal permanece presente,
somente os efeitos dominantes da alteração aparecerão nas análises
fenotípicas. No entanto, animais transgênicos com genes inseridos
forneceram informações importantes sobre como os genes de
mamíferos são regulados e como certos genes alterados (chamados
oncogenes) causam câncer.
Também é possível produzir moscas de frutas transgênicas, nas quais
cópias únicas de um gene são inseridas aleatoriamente no genoma
de Drosophila . Neste caso, o fragmento de DNA é primeiro inserido
entre as duas sequências terminais de um transposão
de Drosophila chamado elemento P. As seqüências terminais
permitem que o elemento P se integre
nos cromossomos Drosophilaquando a enzima transposase do
elemento P também está presente (ver pág. 288). Para fazer moscas
transgênicas da fruta, portanto, o fragmento de DNA adequadamente
modificado é injetado em um embrião de mosca de fruta muito jovem,
juntamente com um plasmídeo separadocontendo o gene que codifica
a transposase. Quando isso é feito, o gene injetado geralmente entra
na linha germinalem uma única cópia como resultado de um evento
de transposição .
Vamos para:

Gene Targeting torna possível produzir ratos


transgênicos que estão faltando genes específicos
Se uma molécula de DNA que transporta um gene de rato mutado é
transferida para uma célula de rato, ela geralmente insere nos
cromossomos ao acaso, mas cerca de uma vez em mil vezes, substitui
uma das duas cópias do gene normal por recombinação homóloga . Ao
explorar esses raros eventos de "direcionamento de genes", qualquer
gene específico pode ser alterado ou inativado em uma célula de rato
por uma substituição direta do gene. No caso especial em que o gene
de interesse é inativado, o animal resultante é chamado de "mouse
knockout".
A técnica funciona da seguinte maneira: no primeiro passo,
um fragmento de DNA contendo um gene mutante desejado (ou um
fragmento de DNA projetado para interromper um gene alvo) é
inserido em um vetor e depois introduzido em uma linha especial de
células estaminais do mouse derivadas de embriões , chamadas células
estaminais embrionárias ou células ES, que crescem em cultura celular
e são capazes de produzir células de vários tipos de tecido
diferentes. Após um período de proliferação celular, as colônias raras
de células em que um evento
de recombinação homóloga provavelmente causaram a ocorrência de
uma substituição de gene são isoladas. As colônias corretas entre estas
são identificadas por PCR ou por Southern Blot : eles
contêm sequências de DNA recombinantes nas quais o fragmento
inserido substituiu a totalidade ou parte de uma cópia do gene
normal. No segundo passo, as células individuais da colônia
identificada são levadas para uma micropipeta fina e injetadas em um
embrião de rato precoce. As células estaminais derivadas de embriões
transfectadas colaboram com as células do embrião hospedeiro para
produzir um mouse de aparência normal; grandes partes deste animal
quimérico, incluindo - em casos favoráveis - células da linha
germinativa , muitas vezes derivam das células tronco artificialmente
alteradas ( Figura 8-70 ).

Figura 8-70

Resumo dos procedimentos utilizados para a substituição de genes em


camundongos. No primeiro passo (A), uma versão alterada do gene é
introduzida em células cultivadas de ES (células
embrionárias). Apenas algumas raras células ES terão seus genes
normais correspondentes substituídos (mais ...)
Os ratos com o transgene em sua linha germinativa são criados para
produzir um animal masculino e um animal feminino, cada um deles
heterocigoto para a substituição do gene (isto é, eles têm
uma cópia normal e uma mutante do gene). Quando esses dois
camundongos são, por sua vez, acasalados, um quarto de sua progênie
será homozigoto pelo gene alterado. Estudos destes homozigotos
permitem a função do gene alterado - ou os efeitos da eliminação de
uma atividade genética - a serem examinados na ausência do gene
normal correspondente.
A capacidade de preparar camundongos transgênicos que não possuem
um gene normal conhecido tem sido um grande avanço, e a técnica
agora está sendo usada para dissecar as funções de um grande número
de genes de mamíferos ( Figura 8-71 ). Técnicas relacionadas podem
ser usadas para produzir mutantes condicionais, em que um gene
selecionado se torna interrompido em um tecido específico em um
determinado momento em desenvolvimento . A estratégia aproveita
um sistema de recombinação específico do site para consumir
impostos e, assim, desativar o gene alvo em um determinado local ou
em um determinado momento. O mais comum desses sistemas de
recombinação chamado Cre / lox , é amplamente utilizado para
engenharia de substituições de genes em camundongos e plantas
(ver Figura 5-82). Neste caso, o gene alvo em células ES é substituído
por uma versão totalmente funcional do gene que é flanqueada por um
par de sequências de DNA curtas , chamadas sites lox, que são
reconhecidas pela proteína Cre recombinase . Os camundongos
transgênicos que resultam são fenotípicamente normais. Eles são
então acasalados com camundongos transgênicos que expressam o
gene Cre recombinase sob o controle de um promotor indutível . Nas
células ou tecidos específicos em que Cre é ligado, ele catalisa a
recombinação entre as sequências lox - excisando um gene alvo e
eliminando sua atividade. Sistemas de recombinação semelhantes são
utilizados para gerar mutantes condicionais em Drosophila (ver Figura
21-48 ).

Figura 8-71

Rato com defeito de engenharia no fator de crescimento de fibroblasto


5 (FGF5). O FGF5 é um regulador negativo da formação de
cabelo. Em um mouse que não possui FGF5 (à direita) , o cabelo é
longo comparado com o seu heterossexual
heterossexual (esquerda) . Ratinhos transgênicos com fenótipos
que (mais ...)
Vamos para:
As plantas transgênicas são importantes tanto para
a biologia celular quanto para a agricultura
Quando uma planta está danificada, muitas vezes pode reparar-se por
um processo no qual as células maduras diferenciadas
"desdiferenciam", proliferam e, em seguida, se redesfiferem em outros
tipos de células. Em algumas circunstâncias, as células
desdiferenciadas podem até formar um meristema apical , que pode
então dar origem a uma nova planta inteira, incluindo gametas. Esta
extraordinária plasticidade de células de plantas pode ser explorada
para gerar plantas transgênicas de células que crescem em cultura.
Quando um pedaço de tecido vegetal é cultivado em meio estéril
contendo nutrientes e reguladores de crescimento apropriados, muitas
das células são estimuladas a proliferar indefinidamente de maneira
desorganizada, produzindo uma massa de células relativamente
indiferenciadas chamadas calo. Se os nutrientes e os reguladores de
crescimento são cuidadosamente manipulados, pode-se induzir a
formação de um tiro e, em seguida, os meristemas
de apical radiculares dentro do calo e, em muitas espécies, uma nova
planta pode ser regenerada.
As culturas de calão também podem ser dissociadas mecanicamente
em células únicas, que crescerão e se dividirão como uma cultura em
suspensão. Em várias plantas - incluindo tabaco, petúnia, cenoura,
batata e Arabidopsis - uma célula única de tal cultura em suspensão
pode ser cultivada em um pequeno grupo (um clone ) a partir do qual
uma planta inteira pode ser regenerada. Essa célula, que tem a
capacidade de dar origem a todas as partes do organismo, é
considerada totipotente . Assim
como os camundongos mutantes podem ser derivados por
manipulação genética de células estaminais embrionárias em cultura,
as plantas transgênicas podem ser criadas a partir de células de plantas
únicas totipotentes transfectadas com DNA em cultura ( Figura 8-72 ).

Figura 8-72
Um procedimento usado para fazer uma planta transgênica. (A)
Esboço do processo. Um disco é cortado de uma folha e incubado em
cultura com Agrobacteria que carregam um plasmídeo recombinante
com um marcador selecionável e um transgene desejado. As células
feridas em (mais ...)
A capacidade de produzir plantas transgênicas tem um progresso
bastante acelerado em muitas áreas de biologia celular de
plantas. Tiveram um papel importante, por exemplo, no isolamento de
receptores para reguladores de crescimento e na análise dos
mecanismos de morfogênese e de expressão gênica em
plantas. Também abriu muitas novas possibilidades na agricultura que
poderiam beneficiar o agricultor e o consumidor. Possibilitou, por
exemplo, modificar o armazenamento
de lipídeos , amidos e proteínas reservados em sementes, para
conferir resistência às pragas e vírus às plantas e para criar plantas
modificadas que tolerem habitats extremos, como pântanos salgados
ou solo estressado .
Muitos dos principais avanços na compreensão
do desenvolvimento animal vieram de estudos sobre a Drosophila
da mosca da fruta e o verme nematóide Caenorhabditis elegans , que
são passíveis de ampla análise genética, bem como a manipulação
experimental. O progresso na biologia do desenvolvimento das plantas
tem sido, no passado, relativamente lento por comparação. Muitas das
plantas que se mostraram mais acessíveis a análises genéticas - como
o milho e o tomate - têm ciclos de vida longos e genomas muito
grandes, fazendo com que a análise genética clássica e molecular seja
demorada. Por conseguinte, é dada uma atenção crescente a uma
pequena erva daninha de crescimento rápido, o berço
comum (Arabidopsis thaliana), que tem várias vantagens como uma
"planta modelo" (verFiguras 1-46 e 21-107 ). O genoma relativamente
pequeno de Arabidopsis foi o primeiro genoma da planta a ser
completamente sequenciado.
Vamos para:

Grandes coleções de Knockouts com etiqueta


fornecem uma ferramenta para examinar a função
de cada gene em um organismo
Estão em curso esforços colaborativos extensivos para gerar
bibliotecas abrangentes de mutações em vários organismos modelo,
incluindo S. cerevisiae, C. elegans , Drosophila , Arabidopsis e o
mouse. O objetivo final em cada caso é produzir uma coleção
de cepas mutantes em que cada geneno organismo tenha sido
sistematicamente excluído ou alterado de forma que possa ser
condicionalmente interrompido. As coleções deste tipo fornecerão
uma ferramenta inestimável para investigar a função do gene em uma
escala genômica. Em alguns casos, cada um dos mutantes individuais
dentro da coleção irá dispor de uma marca molecular distinta -
um DNA únicoSeqüência projetada para tornar a identificação do
gene alterado rápido e rotineiro.
Em S. cerevisiae , a tarefa de gerar um conjunto de 6000 mutantes,
cada uma faltando apenas um gene , é simplificada pela propensão
do fermento para a recombinação homóloga . Para cada gene, prepara-
se uma " cassete de deleção ". A cassete consiste em uma molécula
de DNA especial que contém 50 nucleótidos idênticos em sequência a
cada extremidade do gene alvo, envolvendo um marcador
selecionável. Além disso, uma etiqueta de sequência especial de
"código de barras" está incorporada nesta molécula de DNA para
facilitar a posterior identificação rápida de
cada estirpe mutante resultante ( Figura 8-73). Uma grande mistura de
tais mutantes de genes knockout pode então ser cultivada sob várias
condições de teste seletivo - como privação nutricional, mudança de
temperatura ou a presença de vários medicamentos - e as células que
sobrevivem podem ser rapidamente identificadas por suas tags de
seqüências únicas. Ao avaliar o quão bem cada um dos mutantes da
mistura é bom, pode-se começar a avaliar quais genes são essenciais,
úteis ou irrelevantes para o crescimento sob várias condições.

Figura 8-73

Fazendo coleções de organismos mutantes. (A) Uma cassete de


deleção para uso em levedura contém sequências homólogas para cada
extremidade de um gene alvo x (vermelho), um marcador
selecionável (azul) e uma sequência única de "código de barras",
aproximadamente 20 nucleótidos (mais ...)
O desafio de derivar a informação do estudo de tais mutantes
de fermento reside na dedução da atividade de um gene ou papel
biológico baseado em um fenótipo mutante . Alguns defeitos - uma
incapacidade de viver sem histidina, por exemplo - apontam
diretamente para a função do gene do tipo selvagem . Outras conexões
podem não ser tão óbvias. O que poderia uma súbita sensibilidade ao
frio indicar sobre o papel que um determinado gene desempenha na
célula de levedura? Tais problemas são ainda maiores em organismos
que são mais complexos do que o fermento. A perda de função de um
único gene no mouse, por exemplo, pode afetar muitos tipos de tecido
diferentes em diferentes estágios de desenvolvimento- como a perda
de outros genes não tem efeito óbvio. Caracterizar adequadamente os
fenótipos mutantes em camundongos, muitas vezes requer um exame
completo, juntamente com o conhecimento extenso de anatomia do
mouse, histologia, patologia, fisiologia e comportamento complexo.
As idéias geradas pelo exame de bibliotecas mutantes , no entanto,
serão ótimas. Por exemplo, estudos de uma extensa coleção de
mutantes em Mycoplasma genitalium - o organismo com o
menor genoma conhecido - identificaram o complemento mínimo de
genes essenciais para a vida celular. A análise da associação de
mutantes sugere que 265-350 dos 480 genes codificadores
de proteína em M. genitalium são necessários para o crescimento em
condições laboratoriais. Aproximadamente 100 desses genes
essenciais são de função desconhecida, o que sugere que um número
surpreendente de mecanismos moleculares básicos que sustentam a
vida celular ainda não foram descobertos.
Vamos para:

Resumo
Genética e engenharia genética fornecem ferramentas poderosas para
o estudo da função genéticaem células e organismos. Na abordagem
genética clássica, a mutagênese aleatória é acoplada com rastreio para
identificar mutantes que são deficientes em um processo biológico
particular. Estes mutantes são então utilizados para localizar e estudar
os genes responsáveis por esse processo.
A função genética também pode ser determinada por técnicas
genéticas reversas. Os métodos de engenharia do DNA podem ser
usados para mutar qualquer gene e para reinserí-lo nos cromossomos
de uma célula para que ele se torne uma parte permanente
do genoma . Se a célula usada para esta transferência de gene é
um ovo fertilizado (para um animal) ou uma célula vegetal totipotente
em cultura, podem ser produzidos organismos transgênicos que
expressam o gene mutante e passam-no para a sua
progênie. Especialmente importante para a biologia celular é a
capacidade de alterar células e organismos de maneiras altamente
específicas, permitindo discernir o efeito sobre a célula ou o
organismo de uma mudança projetada em uma
única proteína ou molécula de ARN .
Muitos desses métodos estão sendo expandidos para
investigar a função de genes em uma escala de todo
o genoma . Tecnologias como microarrays de DNA podem ser usadas
para monitorar simultaneamente a expressão de milhares de genes,
fornecendo instantâneos detalhados e abrangentes dos padrões
dinâmicos de expressão gênica subjacentes a processos
celulares complexos . E a geração de bibliotecas mutantes em que
cada gene em um organismo foi sistematicamente excluído ou
interrompido proporcionará uma ferramenta inestimável para explorar
o papel de cada gene na elaborada colaboração molecular que dá
origem à vida.
De acordo com o editor, este livro é acessível pelo recurso de pesquisa, mas não pode ser
navegado.
Copyright © 2002, Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts e
Peter Walter; Copyright © 1983, 1989, 1994, Bruce Alberts, Dennis Bray, Julian Lewis, Martin
Raff, Keith Roberts e James D. Watson.