METHODE D’ECHANTILLONAGE EN VUE D’UNE ANALYSE GRAIN PAR GRAIN

Réf. : BE 103 D 8909

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DIRECTIVE ANALYTIQUE
BE – 103 – D/8909

METHODE D’ECHANTILLONAGE EN VUE D’UNE ANALYSE GRAIN PAR GRAIN

M. BERGER - J. LE BRUN ARCAM ITCF

SEPTEMBRE 1989

Bureau Inter Professionnel d’Etudes Analytiques
BIPEA – 6/14 avenue Louis Roche 92230 GENNEVILLIERS Tél. : 01.47.33.54.60

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Table des matières
1. INTRODUCTION ………………………………………………………………….. 2. DIVISEURS ET HOMOGENEISEURS ………………………….…………….. 2.1. LEURS UTILISATIONS 2.2. LEURS CARACTERISTIQUES ET LIMITES 3. SCHEMA DE PRINCIPE …………………………………………………………. 4. PROCEDURE ET COMMENTAIRES …………………………………………… 4.1. HOMOGENEISATION DE L’ECHANTILLON INITIAL 4.2. CALCUL DE LA MASSE DE LA FRACTION DU SOUS ECHANTILLON A OBTENIR 4.3. OBTENTION DU SOUS-ECHANTILLON 4.3.1. Exemple d’un calcul de division avec échantillonneur à rifles (division en fraction) 4.3.2. Exemple d’un calcul de division avec le diviseur tournant Retsch (division en 8 fractions) 4.4. OBTENTION DE L’ECHANTILLON FINAL PAR PRELEVEMENT DE 1 GRAIN SUR 10 5. CONTROLE DES DIVISEURS …………………………………………………. 11 5.1. CONSTITUTION DE L’ECHANTILLON DE REFERENCE 5.1.1. 5.1.2. 5.1.3. 5.2.1. Obtention de grains de différents calibres Coloration des grains Constitution du mélange Du sous-échantillonnage 8 9 5 6

5.2. PROCEDURE DE CONTROLE (exemple d’une division en 2 fractions) 5.2.1. Echantillon final

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AVERTISSEMENT

Ce travail a été réalisé à la demande des membres de la Commission Electrophorèse du BIPEA. Il fait suite à la directive analytique BV 51 M 8601 (J. LE BRUN et Y. BEAUX) applicable à la méthode en gel d’amidon.

Bien que rédigé à l’intention des utilisateurs de l’électrophorèse en gel de polyacrylamide, ce document peut trouver des applications dans toute méthode qui fait appel à une réduction importante d’échantillon (sensibilité à l’eau, test de germination, mitadinage, voire détermination des impuretés dans le cas des diviseurs tournants).

Ce document n’a pour but que d’attirer l’attention sur les différentes précautions à prendre en matière d’échantillonnage. Bien que détaillé, il ne peut couvrir tous les problèmes ponctuels que seule une bonne compréhension des mécanismes relevant avant tout du bon sens et l’emploi de méthodes de calculs statistiques simples arriveront à résoudre.

M. BERGER - ARCAM - GRANDS MOULINS DE PANTIN Président de la Commission et du Groupe d’Experts Electrophorèse du BIPEA J. LE BRUN - ITCF Expert Electrophorèse du BIPEA

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1. INTRODUCTION

Le but de l’électrophorèse est d’identifier et de quantifier les variétés présentes dans un lot de blé par une analyse grain par grain. Compte tenu des contraintes de ces techniques, ce travail ne peut être réalisé que sur un nombre limité de grains. Il est donc nécessaire de disposer d’une procédure assurant à tout moment la réalisation d’un échantillonnage représentatif, c’est-à- dire juste et fidèle. Il est évident que quelles que soient les précautions prises au niveau du laboratoire, la validité des résultats obtenus ne pourra être étendue au lot commercial que si l’échantillon reçu est lui-même parfaitement représentatif du camion, du wagon, de la péniche ou du silo dont il provient. Pratiquement, on est obligé de procéder en deux étapes, car il n’existe pas actuellement d’appareil pouvant, à partir d’un échantillon de grains de l’ordre du kilogramme, fournir directement une fraction de quelques dizaines de grains représentatifs du lot initial.

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2. DIVISEURS ET HOMOGENEISEURS
2.1. LEURS UTILISATIONS
1 Kg ≈ 30000 grains COMMENT ?

HOMOGENEISER : Eviter phénomènes de classement.

des

Plusieurs passages successifs dans un diviseur Homogénéiseur à rifles ou conique.

PESER : Connaître la masse totale de l’échantillon nécessaire au schéma de division.

BALANCE Détermination de la masse de 1000 grains → NORME AFNOR NF V 03 702

ESTIMER LE POIDS DE 500 (400) GRAINS : calculer la masse intermédiaire d’où l’on prélèvera les 50 (40) grains.

Réaliser la division de l’échantillon selon le schéma qui permettra d’obtenir ces X grammes.

DIVISER : Obtenir la fraction intermédiaire des 500 (400) grains X grammes.

PRELEVER 50 (40) GRAINS : Réaliser l’analyse de l’électrophorèse.

Prélever 1 grain sur 10 au moyen du Numigral micro-diviseur.

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2.2. CARACTERISTIQUES ET LIMITES

TYPES MODELES CONSTRUCTEURS / DISTRIBUTEURS Nombre de souséchantillons Masse possible des échantillons Limite supérieure Limite inférieure Réglages et précautions d'emploi Diviseur à rifles TRIPETTE ET RENAUD 2

A FENTES MULTIPLES Jones MINEMET 2 Conique HD 22 TRIPETTE ET RENAUD 2 Conique Boerner TRIPETTE ET RENAUD 2 Carrousel MINEMET 6 ou 8

TOURNANTS PT – PTZPTL LABO MODERNE 8 PK PK2 LABO MODERNE 1

0,5 kg 400 grains Néant Veiller à l'étalement régulier des grains sur toute la longueur du bac

1 à 10 kg Néant

2 kg 0,5 kg Néant

10 kg 0,5 kg Néant

2 kg 0,25 kg Vitesse alimentation

Veiller à ce que le cône de répartition soit bien centré par rapport à la trémie d'alimentation

1 kg 400 grains Vitesse alimentation repère (70-90) Ecart entre la trémie et la rampe vibrante 0,6 cm pour le blé

2 kg 0,2 kg Vitesse alimentation Vitesse rotation Ouverture curseur

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3. SCHEMA DE PRINCIPE
L’organigramme ci-dessous résume les différentes étapes permettant de réaliser cette opération. Echantillon initial

Homogénéisation (A)

Pesée échantillon

P M G (AFNOR V03 – 702) Poids impuretés Poids des grains propres

Calcul de la masse de la fraction du sous-échantillon à obtenir (B)

Obtention du sous-échantillon (C)

Echantillon final (D)

ELECTROPHORESE

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4. PROCEDURE ET COMMENTAIRES
4.1. HOMOGÉNÉISATION DE L’ÉCHANTILLON INITIAL (A)
Matériel préconisé diviseur à rifles ou diviseur conique Homogénéiseurs : 1 – Leurs utilisations). Echantillon initial Diviseur à rifles ou conique 1 2 Répéter l’opération 5 - 7 fois (voir § 2 – Diviseurs et

Réunir les 2 fractions NOTA : Bien que non indispensable, il est toujours préférable de réaliser un prémélange du lot reçu dans un appareil à vis ou autre. Après homogénéisation, peser l’échantillon pour estimer la masse totale de l’échantillon en g.

4.2. CALCUL DE LA MASSE DE LA FRACTION DU SOUS-ÉCHANTILLON À OBTENIR (B)
Formule générale : m = (P * n) / 1000 P = poids de mille grains estimé n = nombre de grains * 10 à prélever pour réaliser l’électrophorèse (30, 40, 50…).

4.3. CALCUL DU SOUS-ÉCHANTILLON (C)
4.3.1. Exemple d’un calcul de division avec échantillonneur à rifles (division en 2 fractions) Masse totale de l’échantillon 1000 493 249 127 64 31 32,1 Conserver ces deux échantillons. 9 33 = 64,5 g 32,4 507 257 130 66 32,5 33,5 = 1000 grammes Poids théorique de la fraction à obtenir = 32,3 g ou 500 grains

Il faut obtenir avant la division finale une fraction ayant un poids le plus proche possible du double du poids théorique à obtenir soit, dans cet exemple : 64,6 g. - Ceci n’est qu’un exemple tendant à montrer que dans la plupart des cas il est nécessaire de procéder par recombinaison de la totalité des sous-fractions pour obtenir la masse d’échantillon la plus proche de la théorie. Ne jamais procéder en complétant directement par prélèvement partiel sur une autre fraction. 4.3.2. EXEMPLE D’UN CALCUL DE DIVISION AVEC LE DIVISEUR TOURNANT RETSCH (DIVISION EN 8 FRACTION) Poids total de l’échantillon Poids théorique de la fraction à obtenir  Schéma théorique de division = 991 g = 23,72 g ou 500 grains

991 g : 8 = 123,9 * 6 = 743 : 8 = 92,9 * 2 = 185,8 : 8 = 23,23 g  Schéma réel 991 g 124,5 125,9 124,3 127,7 748,5 g 93,9 94,4 93,2 92,4 190,4 g 23,1 24,9 24,8 23,2 23,8 23,8 23,4 23,2 94,4 90,0 94,2 96,0 120,0 125,7 124,2 123,9

La dernière masse à mettre en division doit être égale à 23,72 * 8 soit 185,6 g.

4.4. OBTENTION DE L’ÉCHANTILLON FINAL PAR PRÉLÈVEMENT DE 1 GRAIN SUR 10 (D)
Matériel NUMIGRAL modifié permettant la séparation par comptage d’un grain sur dix.

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5. CONTROLE DES DIVISEURS
Les erreurs d’échantillonnage peuvent être minimisées si toutes les règles pour obtenir un bon échantillon sont respectées : Utiliser les échantillonneurs adéquats en tenant compte de leurs limites d’utilisation. Vérifier les qualités demandées à un bon diviseur à savoir : RAPPELS : On appelle : Fidélité d’un appareil : la fidélité = reproductibilité de la mesure. On vérifie que les résultats obtenus à partir d’un même échantillon passé plusieurs fois en division sont peu différents. Bonne répartition quantitative entre les fractions obtenues sur une même division. Cette qualité peut être vérifiée d’une manière générale par une analyse de variance ou dans le cas spécifique du diviseur à rifles par la méthode dite des couples. Conservation des proportions en sous-lots de l’échantillon initial. Le test statistique qui permet de vérifier qu’il y a concordance entre les valeurs observées et les valeurs théoriques est le test de Χ². Pour réaliser le contrôle de ces différentes qualités, il est nécessaire de constituer un échantillon de référence. Celui-ci sera obtenu à partir du mélange en proportion connue de grains sains, colorés, de tailles différentes. La fidélité Bonne répartition quantitative Conservation des proportions.

5.1. CONSTITUTION DE L’ÉCHANTILLON DE RÉFÉRENCE
5.1.1. Obtention de grains de différents calibres - Passer au crible (tamis) une quantité de grains. - Récupérer le refus de 2,8 mm = gros grains PMG > 40 g. - Récupérer les fractions comprises entre 2,2 et 2,4 mm = petits grains PMG d’environ 30 g. 5.1.2. Coloration des grains - Immerger les grains triés, ainsi obtenus, dans une solution aqueuse de bleu de méthylène ou de rouge de méthyle pendant 24 heures. - Mettre à sécher à l’air libre en couche mince. - Déterminer les poids de mille grains de chaque fraction ainsi préparée pour pouvoir exprimer les proportions du mélange en nombre de grains. 11

DIVISEUR A RIFLES
Valeurs théoriques obtenues à partir d’un échantillon de 1 kg et écarts maximaux admissibles entre 2 fractions Ecart maximal admissible par rapport à la théorie

1000 500 250 125 62,5 62,5 62,5 125 62,5 62,5 125 62,5 62,5 250 125 62,5 500 20 g 10 g 5g 3g

31,25 31,25 31,25 31,25 31,25 31,25 31,25 31,25 31,25 31,25 31,25 31,25 31,25 31,25 31,25 31,25

5.1.3. Constitution du mélange Exemple d’un échantillon de 1000 g composé de : 70 % de gros grains non colorés 15 % de gros grains colorés en bleu 15 % de petits grains colorés en rouge. - Peser 700 g de grains incolores, 150 g de grains bleus et 150 g de grains rouges. - Mélanger et homogénéiser suivant procédure 4.1. - Conserver ce lot ainsi constitué dans un flacon à fermeture hermétique à basse température (chambre froide) pour une utilisation ultérieure. 5.2. PROCÉDURE DE CONTRÔLE (exemple d’une division en 2 fractions) 5.2.1. Du sous-échantillonnage (C) Les manipulations proposées ont pour but de vérifier la bonne utilisation du matériel en suivant le principe de l’exemple ci-après. - Diviser successivement l’échantillon de référence suivant le schéma page 12. 12

- Relever les masses obtenues à chacune des étapes. - Répéter en totalité cette opération 3 fois. Comparer les valeurs expérimentales aux valeurs théoriques au regard d’écarts maximum tolérables. Sur les 2 sous-échantillons présentant les écarts maximaux de poids, compter à l’issue de chacune des 3 manipulations le nombre de grains des 3 catégories. Vérifier la concordance avec les valeurs théoriques à l’aide du test du Χ ². valeurs théoriques

-

Χ ² = somme des (valeurs observées – valeurs théoriques) ²
Comparer la valeur obtenue avec la valeur limite considérée comme admissible au seuil de 20 %, à savoir pour 2 ddl = 3,22. Un résultat supérieur permet, si aucune valeur aberrante n’a été relevée dans le poids des fractions, de présumer une homogénéisation initiale insuffisante. Remarque : Cette procédure peut être appliquée au cas du répartiteur Retsch. 5.2.2. Echantillon final Réaliser sur 6 autres échantillons (2 par manipulation) une réduction supplémentaire avec le diviseur pour obtenir des échantillons élémentaires d’environ 15,6 g (ceci pour faciliter le comptage des grains colorés sur une petite quantité). Effectuer la micro-division au NUMIGRAL. Comparer les nombres de grains de chaque catégorie de couleur obtenue aux valeurs de la théorie à l’aide du test du Χ², comme ci-dessus. La présence d’une valeur supérieure à la valeur limite indique, si aucune défaillance n’a été observée sur le sous-échantillonnage, un mauvais fonctionnement du NUMIGRAL (réglage de la vitesse de montée des grains, etc…). Nota : Compte tenu des expérimentations menées par le Service des Etudes Statistiques de l’ITCF, qui montrent que cet appareil réalise une ségrégation des grains en fonction de leur taille et de leur poids, il est impératif que, dans la pratique, le nombre de grains mis dans le bol soit compris entre : 10 fois le nombre de grains à mettre en analyse – 5 grains et 10 fois le nombre de grains à mettre en analyse + 5 grains Exemple : pour 50 grains entre 495 et 505 grains. 13

Il est évident que dans le cas de la valeur inférieure, le dernier grain sur la rampe sera pris en compte. Micro - diviseur

ANNEXE 1
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ECHANTILLONNEURS ET DIVISEURS

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ANNEXE 2

EXEMPLE DU TEST DE X²

ANNEXE 2
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COMPARAISON D’UNE REPARTITION OBSERVEE A UNE REPARTITION THEORIQUE TEST DU X²
Soit la composition d’un lot parfaitement connu : 5 variétés (V₁ - V₂ - V₃ - V₄ - V₅) dans les proportions (grains) suivantes : V₁ V₂ V₃ V₄ V₅ 37 %

29,9 % 16,8 % 9,5 % 6,8 %

Si on tire au hasard un échantillon parfaitement représentatif, on doit théoriquement obtenir en effectifs sur 50 grains : 18,5 – 14,95 – 8,4 – 4,5 – 3,4 : effectifs théoriques (1) Un laboratoire trouve les effectifs suivants : 14 – 20 – 14 – 0 – 2 : effectifs observés On peut se demander si ces effectifs observées (0) sont significativement différents des effectifs théoriques (T), autrement dit les écarts (observés-théoriques) peuvent être attribués à des fluctuations d’échantillonnage, ou si au contraire il s’agit d’une “erreur”. D’où deux manières de poser cette question : - Quel est le risque qu’un tel écart se réalise ? Cet écart observé est-il supérieur ou inférieur à une valeur donnée, correspondant à un niveau de risque choisi à priori ?

Il est d’abord nécessaire de chiffrer les écarts, puis de créer un indice exprimant l’ensemble de ces écarts (somme des carrés de ces écarts relatifs). On cherchera enfin la probabilité correspondante α dans la table du Χ² (voir annexe) pour le nombre de degrés de liberté ddl = nombre de variétés – 1. Si

α

> 5 %, la différence n’est pas significative.

Si α < 5 %, la différence est significative et l’ensemble choisi :

α

mesure son degré de signification dans

Proportion %

V1 37,0

V2 29,9

V3 16,8

V4 9,5

V5 6,8 24

Effectifs théoriques Effectifs observés 1 Ecart (0 – T)

18,5 14,0 4,5 1,09

14,95 20,0 5,05 1,71

8,4 14,0 5,6 3,73

4,75 0 4,75 4,75

3,4 2,0 1,4 0,58

(0 −T ) 2
T
2

0-T  x² = ∑  1,09 + 1,71 + 3,73 + 4,75 + 0,58 = 11,86   T  Le Χ² suit une loi de probabilité qui dépend du nombre de degrés de liberté, ici (5 – 1) = 4 ddl.

En regardant la table de Χ², on voit que la valeur du Χ ² observé (11,86) pour 4 ddl donne une probabilité de réalisation comprise dans l’intervalle suivant : 0,01< P < 0,02 Ce qui peut s’interpréter de la façon suivante : - On a entre 1 et 2 chances sur 100 d’observer de tels écarts entre les effectifs observés et les effectifs théoriques. - Si on consent un risque d’erreur de 5 % (5 chances sur 100 de se tromper), la valeur du Χ ² soit être inférieure à 9,49 (ce qui n’est pas le cas). - On dira alors que les valeurs observées sont significativement différentes des valeurs théoriques.

M.F. BEAUX

(1)

En théorie, le test du Χ ne devrait pas s’appliquer lorsqu’un composant est présent à moins de 10 %. Dans l’exemple cité, on pourrait respecter cette règle en considérant (V₄+V₅) comme un seul composant.

TABLE 4 : TABLE DU X² DE PEARSON
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(1) La table permet de trouver la valeur du Χ ² àν degrés de liberté qui a une probabilité α d’être dépassée. Exemple : Avec un

ν = 3 degrés de liberté et un seuil α

= 0,05, la valeur du Χ ² est de 7,815

Si le Χ ² calculé est supérieur, le test est “significatif” au seuil α = 0,05, il est “non significatif″ dans le cas contraire. (2) La table permet de trouver la probabilité α pour que Χ ² égale ou dépasse une valeur donnée, en fonction du nombre ν de degrés de liberté. Exemple : Avec

ν = 3 degrés de liberté, pour Χ² = 0,584, la probabilité est de α
Quand le nombre de degrés de liberté est

= 0,90 suit

Remarque :

élevé,

approximativement une loi Normale de moyenne

et de variance 1.

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BIBLIOGRAPHIE
* M.F. BEAUX – 1978 L’échantillonnage au laboratoire d’un lot de grains pour déterminer sa composition variétale par la méthode d’électrophorèse des gliadines. Service des Etudes Statistiques et Informatique de l’ITCF BOIGNEVILLE * M.F. BEAUX La réduction d’un échantillon de grains Expérimentation et statistique – Publication ACTA N° 5 – p. 33/48 (1977)

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