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Laboratorio Nº 1

Patrones de Turbidez
Microbiología Industrial
Profesor: José Felix Ortiz Lemus
Departamento de Microbiología
Universidad de Pamplona

Patrón de turbidez: Patrón McFarland


Patrón McFarland:
Para estandarizar la densidad del inóculo se usa una suspensión de sulfato de bario como estándar de turbidez (0.5
de la escala de McFarland). El estándar de McFarland de 0.5 tiene una turbidez comparable a una suspensión
bacteriana que contiene 1.5 x 108 UFC/ml. Actualmente, estos patrones suelen remplazarse con patrones de
turbidez preparados a partir de soluciones de partículas finas de látex o copolimeros como el Estireno Divinil
Benceno (solución al 1% en agua ultra pura-obtenida por osmosis inversa).

Para preparar dicho estándar se


agrega diferentes volúmenes (ml) de
BaCl2 a 0,048M (1,175% P/V
BaCl2*2H2O) a volúmenes (ml) de
H2SO4 al 0,18 M (0,36 N) (1% V/V). Se
debe verificar la densidad correcta de
cada estándar usando un
espectrofotómetro. Así, por ejemplo,
el patrón McFarland 0,5 se prepara
adicionando 0,05ml de BaCl2 2H2O a
9,95 ml de H2SO4 y la absorbancia a
625-600 nm debería ser 0,08 a 0,13.

Posteriormente se debe distribuir en los 10 ml de la solución patrón dentro de tubos similares a los usados para la
preparación de los inóculos y mantener guardados a temperatura ambiente y protegidos de la luz. Los tubos se
deben sellar estrechamente al ser preparados, para evitar la evaporación de la suspensión y como medio de
verificación debe realizarse un nivel de volumen para contrastar la perdida de agua por evaporación, en tal caso, el
volumen debe ser adicionado de nuevo, empleándose agua pura, la misma empleada en la preparación del patrón,
sin embargo si la pérdida es muy grande se recomienda descartar el patrón de turbidez y volverlo a preparar.

Además, se recomiendo agitar vigorosamente con vórtex o manualmente el estándar antes de su uso para lograr
una turbidez homogénea. Remplazar o verificar la confiabilidad de los estándares mensualmente.

En la tabla se presenta una guía para la preparación de los distintos estándares de la escala de nefelométrica.

BaCl2 1% H2SO4 1% Concentración Absorbancia Tramitancia


TUBO
(ml) (ml) U.F.C/ml 600 nm 600 nm
8
0.5 0,05 9,95 1,5 x10 0.132 74.3
8
1 0,1 9,9 3,0x10 0.257 55.6
8
2 0,2 9,8 6,0x10 0.451 35.6
8
3 0,3 9,7 9,0x10 0.582 26.4
9
4 0,4 9,6 1,2x10 0.669 21.5
9
5 0,5 9,5 1,5x10
9
6 0,6 9,4 1,8x10
9
7 0,7 9,3 2,1x10
9
8 0,8 9,2 2,4x10
9
9 0,9 9,1 2.7x10
9
10 1,0 9,0 3,0x10
La utilidad de la escala es poder realizar suspensiones bacterianas ajustadas a un patrón, generalmente se suele
usar el 0,5 McFarland, para esto se toma una muestra de nuestra bacteria y la inoculamos en un tubo con solución
salina (o agua), en el momento en que se produzca un poco de turbidez ya estamos en el 0,5 (de forma visual).

Preparación del inóculo e inoculación de las placas

Se (1) Seleccione 4 ó 5 colonias bien aisladas de igual morfología de la placa


de cultivo. Prepare una suspensión en 4 ó 5 ml de un caldo apropiado (por
ejemplo: Triptosa de Soja) tocando la parte superior de cada colonia o
incube la cepa bacteriana sobre un agar de enriquecimiento como BHI o agar
nutritivo

(2) Incube a 37+/- 2ºC hasta que este alcance o exceda la turbidez del
8
estándar (2-6 hs). Esta suspensión contendrá aproximadamente 1 a 2 x 10
UFC/ml. O recoja con ayuda de una asa redonda, una a cuatro colonias
aisladas y dilúyalas en un volumen de 4 a 6 ml de agua o solución salina
0,8%, homogenice completamente.

(3) Ajuste la turbidez del inóculo con solución salina o agua pura hasta
alcanzar la turbidez de N° McFarland deseado o indicado por el profesor, por
comparación visual con el estándar. Para ello, mire los tubos contra un fondo blanco con una línea negra como
contraste.

NOTA: Nunca use cultivos viejos (incubados por más de 16 a 18 horas).

Para microorganismos de difícil desarrollo:


El inóculo puede ser realizado directamente a partir de colonias seleccionadas de una placa de cultivo no selectivo,
de no más de 18 a 24 horas de incubación. La suspensión debe ser ajustada inmediatamente a la escala 0,5 de
McFarland, sin incubación previa. Este es el método de elección para microorganismos de difícil desarrollo como
Haemophilus spp, Streptococcus pneumoniae y Neisseria gonorrhoeae o para Staphylococcus potencialmente
meticilino resistentes.

Procedimiento McFarland
Reactivos
1% Cloruro de Bario (BaCl2) anhídrido
1% Ácido sulfúrico (H 2SO4) puro y frío

Método de Preparación
1. Añadir los volúmenes de BaCl2 al 1% a los volúmenes de H2SO4 al 1%, según se indicó en la tabla anteriormente
mencionada.
2. Homogenice para mantener en suspensión.
3. Distribuya 5 a 10 ml de la solución de McFarland en tubos de diámetros similares. Se sugiere usar los mismos
tubos que se utilizan rutinariamente para ajustar la densidad de las suspensiones antes de la inoculación.
5. Cuando estos estándares están en suspensión completa, la turbidez equivale a un cultivo que contiene 1,5 x 108
bacterias/ml para el N° 0.5 hasta 3,0 x 109 bacterias/ml para el N° 10.
6. Los tubos que contienen la solución de McFarland se deben guardar al resguardo de la luz y a temperatura
ambiente.

Método de conteo en placa para probar la turbidez estándar de en la escala de McFarland


El objetivo de este procedimiento es determinar el número de bacterias por ml de fluido. Una suspensión
bacteriana equivalente en turbidez a la turbidez estándar de 0,5 de McFarland contiene aproximadamente 108
bact/ml.

1) Prepare una turbidez estándar de 0.5, 1, 2, 3 y 4 en la escala de McFarland, como se ha descrito


anteriormente.
2) Prepare una suspensión de un microorganismo de prueba E. coli para enfrentar a la densidad de la turbidez
estándar de McFarland 0.5, 1 y 2, y para S aureus a McFarland 2, 3 y 4.
3) Haga diluciones seriadas, diluya 10 veces una suspensión bacteriana en un medio o caldo adecuado.
4) Las diluciones seriadas se realizaran hasta 10-7 y se siembra en placa en superficie.
5) Posteriormente de las 4 últimas diluciones se realizará una siembra en superficie (0,1 ml) sobre un medio de
cultivo adecuado, preferiblemente no selectivo, para cada uno de los microorganismos ensayados (Ver diagrama de
Procedimiento para la preparación y el control de calidad de la turbidez estándar de McFarland

1,175% cloruro de bario 1% ácido


(p/v) sulfúrico (p/v)
• Para un 0,5 McFarland,use 0,5 ml • Para un 0,5 McFarland,use 99,5 ml
• Para un 1,0 McFarland,use 0,1 ml • Para un 1,0 McFarland,use 9,9 ml

Mezcle y selle el tubo

Prepare una suspensión


de la cepa control

Ajuste la turbidez añadiendo


solución salina estéril o más
crecimiento bacteriano

Prepare diluciones seriadas

Extienda 0,1 ml de
suspensión en un agar
no-selectivo

Incube las colonias durante toda la noche

Cuente las colonias


en las placas

Calcule UFC/ml
(unidades formadoras
de colonias / ml)

flujo).
La finalidad del presente laboratorio, es establecer una relación entre una precipitación química y una suspensión
bacteriana. Creamos 10 estándares (en la tabla aparece la composición de estos) y por espectrofotometría,
creamos una recta patrón, de forma que vamos a poder detectar la concentración de nuestras diluciones
bacterianas (de manera aproximada, ya que depende de factores como el tamaño de la bacteria, la formación de
agregados,...). La escala se basa en la capacidad de precipitación del cloruro de bario en presencia de ácido
sulfúrico, formándose la sal sulfato bárico.

Interpretación de resultados
En el caso de una turbidez estándar de 0.5 en la escala de McFarland es equivalente a aproximadamente 108 bacterias
por ml. La suspensión bacteriana original que se parece a la turbidez estándar de 0,5 de McFarland podría tener un
rango de 1,0 x108 bacterias/ml a 9,0 x 108 bacteria/ml. Dentro de este rango, la turbidez estándar de 0,5 es exacta; la
diferencia será evidente por el número de bacterias que crezcan en la placa.

Por ejemplo, después que se añadan 0,1ml de la suspensión bacteriana original (la cual es equivalente a la turbidez
estándar de 0,5 en la escala de McFarland) a los 0,9 ml de solución en la primera dilución (10-1) se produce una
suspensión de bacterias que contiene aproximadamente 107 bacterias/ml. En la siguiente dilución (10-2) será de
aproximadamente 106 (1.000.000–9.000.000) bacterias presentes en esa placa. Si las bacterias fueron diluidas
5 -3
correctamente: aproximadamente 10 (ó 100.000 – 900.000) bacterias deben estar presentes en la dilución 10 ,
-4
aproximadamente 10.000–90.000 bacterias en la dilución 10 ; aproximadamente 1.000–9.000 bacterias presentes
en la dilución 10-5; aproximadamente de 100 a 900 bacterias presentes en la dilución (10-6); aproximadamente de 10
a 90 bacterias en la dilución 10-7, y aproximadamente de 1 a 9 colonias bacterianas podrían estar presentes en la
dilución 10-8. Cada placa debe tener la décima parte de las bacterias de la placa con el número mayor inmediato
superior. Por tanto se debe realizar el conteo a partir de la dilución 10-4 hasta 10-8.

Resultados esperados:
Los datos teóricos del patrón McFarland permitirán establecer la correlación que existe entre la concentración
determinada mediante turbidez, con los datos de absorbancia obtenidos en la espectrofotometría a partir de la
solución de cloruro bárico que a su vez serán contrastados con los datos experimentales, de esta forma se
analizaran los resultados y se graficaran los datos teóricos para McFarland y en estas graficas se introducirán los
datos obtenidos experimentalmente a fin de favorecer la discusión.
La presente tabla es una guía para la adquisición de datos experimentales que se han de comparar con los datos
teóricos de McFarland. Ver tabla en la siguiente página.

Las gráficas deben realizarse sobre una misma página, a fin de poder observar y discutir todos los datos, estas son :
 Absorbancias experimentales Vs teóricas de los patrones McFarland.
 Absorbancias suspensiones microbianas Vs teóricas de los Nº McFarland.
 Log de los informes de la concentración experimentales Vs valores de la concentración teórica para los Nº
McFarland, graficándolos bajo una gráfica de Log10 de la concentración teórica Vs Nº McFarland.
Nota: las graficas compuestas pueden ser una forma de presentar resultados, para ello se graficaría en tres ejes; la
absorbancia y la concentración B/ml teórica McFarland en los ejes Y y Z, respectivamente y el Nº McFarland en el eje
X

Cuestionario
 Cuáles son los límites del patrón para ser usado. Aplica para todo tipo de microorganismos.
 Cuáles son sus desventajas como método de medida del crecimiento microbiano.
 Consulte y ejemplifique otras soluciones que puedan ser usadas como patrones de turbidez para determinar la
medida del crecimiento microbiano, cómo están constituidos.
 Relación superficie/volumen: un gran número de fenómenos físicos depende de la relación
superficie/volumen. Por ejemplo, el tamaño. En el caso de un cubo de lado L, el volumen es V = L3 y
el área de su superficie externa, S = 6L2. Es decir, el área por unidad de volumen del cubo, S/V = 6/L,
está en razón inversa con la arista del cubo. Si se trata de una esfera de radio R, sabemos que su
superficie externa es S = 4πR2 y su volumen V = (4/3)πR3; por tanto, S/V = 3/R, es decir, en razón
inverso con su radio. Un resultado análogo se obtiene con un sólido cilíndrico y en general, se
cumple siempre que S/V = 1/T, siendo T el tamaño del sólido.
 Consultar métodos de medida de crecimiento: Citometría de flujo, espectrofotometría (como
funciona un espectrofotómetro), recuento en placa, NMP, filtración por membrana, luminiscencia,
impedancia eléctrica.
 Bacteria más grandes: Averiguar sobre Epulopiscium sp y Beggiatoa sp

Líneas de fondo para ver la turbidez de una suspensión del inóculo en comparación con la turbidez estándar de
McFarland.
Bibliografía
1. Consulte el documento M2 de la NCCLS para más detalles y
también para el procedimiento para el control de calidad en la
preparación del patrón McFarland.
2. McFarland J. 1907. The nephelometer: An instrument
for estimating the number of bacteria in suspensions
used for calculating the opsonic index and for vaccines.
J. Am. Med. Assoc. 9:1176-1178.
3. Finegold S.M y Baron J.E. Bailey and Scott´s Diagnostic
Microbiology 7th. 1986.
4. Lennette, E. H et al, Manual of Clinical Microbiology 4 th.
American Society for Microbiology, Washington.
McFarland Microorganismos
Nº Valores E. coli Salmonella sp S. aureus
Abs. Teórica
Abs. Experimental
Abs. Suspensión M.o
Teórico
0.5
Rcto-Inf-Log

10-6
10-7
10-8
Abs. Teórica
Abs. Experimental
Abs. Suspensión M.o
Teórico
1
Rcto-Inf-Log

10-6
10-7
10-8
Abs. Teórica
Abs. Experimental
Abs. Suspensión M.o
Teórico
2
Rcto-Inf-Log

10-6
10-7
10-8
Abs. Teórica
Abs. Experimental
Abs. Suspensión M.o
Teórica
3
Rcto-Inf-Log

10-6
10-7
10-8

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