Método de confirmação de análise qualitativa de um metabolito específico

da heroína por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrofotometria de

Massa

Ana Pacheco 1, Tenente Nuno Mendes Flores 2, Ana Jaleco 1

1. Universidade Atlântica, Barcarena/Oeiras;
2. Laboratórtio de Análises Farmaco-Toxicologicas da Marinha Portuguesa, Lisboa

Resumo

Os opiáceos são moléculas de origem natural ou sintética, cujos efeitos a nível da célula
são transmitidos por recetores específicos, tanto a nível do sistema nervoso central,
como do sistema nervoso periférico. As principais vias de administração de opiáceos
incluem a via oral e intravenosa, embora os opióides possam também ser inalados ou
fumados. A heroína é o opióide mais comumente vendido no mercado ilegal de drogas,
sendo rapidamente metabolizada por desacetilação em monoacetilmorfina (6-MAM) e
depois em morfina. Neste estudo realizou-se a validação de um método de confirmação
de análise qualitativa do metabolito 6-MAM por cromatografia gasosa acoplada a
espectrofotometria de massa, em urina humana. Para a validação da técnica recorreu-se
a cinco parâmetros de validação, tendo-se obtido resultados aceitáveis. Concluiu-se que
a técnica utilizada é altamente precisa e sensivel. O presente estudo irá permitir efectuar
com rapidez e fiabilidade, as análises rotineiras dos colaboradores da Marinha.

Abstract

Opioids they are molecules of natural or synthetic origin whose effects on the cell are
transmitted by specific receptors at both of the central nervous system as the peripheral
nervous system. The major routes of administration of opioids include oral and
intravenous administration. Although opioids can also be inhaled or smoked. Heroin is
an opioid most common sold on the illegal drug market, being rapidly metabolized
bydeacetylation in monoacetilmorfina , then morphine.This study was performed to
confirm that method of qualitative analysis of the metabolite 6-MAM by gas
chromatography coupled to mass spectrometry in human urine. To validate the
technique we appealed up to five parameters, Having obtained acceptable results. It was
concluded that the technique is highly accurate and sensitive. This study will allow
quickly and reliably perform the routine analysis of employees of the Navy.

Palavras-Chave: Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrofotometria de Massa (CG-

MS), Heroína, 6-monoacetilmorfina (6-MAM), Análise qualitativa
Introdução

As drogas são substâncias psicoativas que, quando ingeridas, bebidas, injetadas,

fumadas ou inaladas, afetam o sistema nervoso central. (1)
Segundo o Relatório Europeu sobre drogas - Tendências e Evoluções (2013), existem
diversas drogas, entre as quais anfetaminas, cocaína, cannabis, ecstasy e drogas
opiáceas, entre as quais se encontram a morfina e a heroína. A cocaína, as anfetaminas e
o ecstasy são os estimulantes ilícitos mais consumidos na Europa. (2)
O consumo de droga encontra-se associado, directa ou indirectamente, a diversas
consequências negativas a nível social e da saúde. Nomeadamente, e
independentemente da substância consumida, o consumo de droga injectável continua a
ser um mecanismo de transmissão de doenças infectocontagiosas, incluindo o
HIV/SIDA e a hepatite C. (2)
O consumo de droga injectada, nos países Europeus, está normalmente associado aos
opiáceos, embora também possa estar associado às anfetaminas, constituindo um
problema grave. (2)
O ópio é obtido através da incisão nas folhas da planta Papaver somniferum, e
apresenta-se com um aspecto leitoso que solidifica rapidamente adquirindo um tom
acastanhados quando em contacto com o ar. (3)
Os opiáceos são moléculas de origem natural ou sintética, cujos efeitos a nível da célula
sao transmitidos por recetores específicos (recetores opiáceos), tanto a nível do sistema
nervso central, como do sistema nervoso periférico. (4) A família de receptores opiáceos
é constituído por três membros, a μ,  . (4)
A heroína, a codeida, a metadona e a
morfina, entre outras substâncias pertencem a este grupo. (4) (5)
As principais vias de administração de opiáceos incluem a via oral e intravenosa,
(6)
embora os opióides possam também ser inalados ou fumados. Na maioria dos países
Europeus, o consumo por via endovenosa está normalmente associado aos opiáceos,
embora em alguns países esteja associado às anfetaminas. (7) A administração através de
inalação (via pulmonar) é a mais utilizada, seguindo-se a administração por via
endovenosa e por fim a administração por via gastrointestinal (ingestão). (7)
O consumo de opiáceos continua a ser responsável por uma percentagem
desproporcionadamente elevada da mortalidade e da morbilidade resultantes do
consumo de droga na Europa. O opiáceo mais consumido é a heroína, que pode ser

1
fumada, inalada ou injetada sendo que no mercado ilícito também estão disponíveis
vários outros opiáceos sintéticos, como a buprenorfina, a metadona e o fentanil. (2)
A heroína (3,6-o-diacetilmorfina, diamorfina, DAM) é o opióide mais comummente
vendido no mercado ilegal de drogas.(8) O consumo de heroína, quando por via
intravenosa, tem efeitos mais violentos. (7) (9)
A heroína é rapidamente metabolizada, tem uma semi-vida de aproximadamente 5
minutos, no organismo, é rapidamente metabolizada por desacetilação em
monoacetilmorfina (6-MAM) e depois em morfina. (5) (8) (10) (11)
A presença de 6- monoacetilmorfina na urina é considerada como um marcador
específico para o uso ilegal de heroína. (8) (11)
As técnicas forenses para a detecção de drogas, como os opiáceos na urina, envolvem a
detecção de morfina ou de codeína, ou de ambas. Normalmente, apenas a morfina total
ou a codeína total é determinada, o que torna difícil determinar a origem dos opiáceos
detetados na urina. (8)
Tanto a cromatografia líquida acoplada à espectrofotometria de massa (LC-MS) como a
cromatografia gasosa acoplada à espectrofotometria de massa (GC-MS) fornecem
resultados precisos, específicos e sem interferência de substâncias semelhantes às
analisadas, sendo também reprodutíveis em amostras de urina. (12)
A GC-MS fornece um processo mais sensível para a quantificação de opiáceos comuns,
utilizando uma pequena quantidade de amostra. É considerado um método sensível e
confiável para a análise de diversas substâncias em simultâneo, incluindo o metabolito
6-MAM, mostrando também ser preciso e exacto. (13)
Segundo Guillot, Lefebvre e Weber, a cromatografia gasosa acoplada à
espectrofotometria de massa (GC-MS) parece ser o método mais adequado para análises
forenses, pois dá-nos uma indicação conclusiva quanto à droga presente na amostra. (14)

Com vista a validar esta mesma técnica e no contexto das análises de rotina realizadas
em urina de colaboradores da marinha portuguesa, propusemo-nos realizar a avaliação
de cinco parâmetros, sendo estes, a especificidade/seletividade, capacidade de
identificação, limite de detecção, arrastamento e repetibilidade, de modo a permitir a
validação de um método de confirmação do consumo de heroína através da detecção do
seu metabolito (6-MAM), com o intuito de permitir futuramente análises mais rápidas,
com elevada fiabilidade e de menor custo com a utilização de um pequeno volume de
amostra permitindo assim a optimização do método.

2
Metodologia

Parâmetros de validação

Para validar o método no equipamento HP GC 6890/MSD 6890, com introdução de

Padrão Interno deuterado e extracção sólido-líquido, foram efectuados os estudos de
validação.
Para a realização desta técnica é sempre necessário um deuterado do
(15)
opiáceo, usado como padrão interno. Esta técnica fornece um processo mais sensível
para a identificação da presença de opiáceos comuns, utilizando uma pequena quantidade
de amostra. (15) É considerado um método sensível e confiável para a análise de diversas
substâncias em simultâneo, incluindo o metabolito 6-MAM, mostrando também ser
preciso e exacto. (6)
De acordo com o método de Cromatografia utilizado temos de ter em conta alguns
fatores:
Rampa de temperatura do aparelho (etapa importante no processamento da amostra no
cromatografo):

Esta rampa de temperatura foi definida, após várias tentativas, anteriormente:

 Temp. inicial é de 170ºC durante 0.30 minutos

 A temp aumenta 10 ºC por mint até atingir os 290ºC e fica nesta temperatura
durante 2.00 minutos

(Este processo de tempo demora no total 14.30 min)

Iões a pesquisar, na pesquisa do metabolito 6-MAM:

 399.0( ião principal, o mais abundante)

 340.0
 287.0
 402.0 ( ião da 6-MAM-D3 )- Padrão interno
Para a realização desta técnica é sempre necessário um deuterado do opiáceo, usado
como padrão interno. (15)

Amostras

3
As urinas utilizadas para a avaliação dos vários parâmetros de validação correspondem a
amostras negativas de urina, oriundas de controlo negativo da Thermo SCIENTIFIC
Level 1 Negative com certificado nº XS12051.

Procedimento geral

Para o pesquisa do metabolito 6-MAM de heroína por GC-MS guiamo nos pelo seguinte
procedimento:

A extracção de do metabolito 6-MAM da heroina realiza se a partir de 2,5 mL de

urina.Utiliza se um Toxitube A (Tubo especifico para extracções de drogas básicas).
Adiciona se 2,5 mL de urina (A bula recomenda 3 mL de urina , mas estamos a tentar
optimizar o método). Adicionar em todas as amostras 50 µl de 6 MAM – D3 a 10 ppm (
Deuterado)- Padrão Interno. Coloca se a rodar (Roda SELECTA) durante 10 minutos.
Centrifuga se a 3000 rpm durante 10 minutos. Separação da fase orgânica por decantação.
Evaporação com azoto e em banho-maria a 50ºC. Reconstituir a amostra com 50 µl de
acetato de etilo (Esterilizar reação de derivação) e 50 µl BSTFA/ TCMS (99:1) –
Reagente de Derivação (Marcar a molécula para melhorar a sua visualização no
ionograma). Aquecer 30 minutos a 60º C num banho seco (otimizar a reação). Transferir
para vials devidamente identificados. Injetar (retirar do vial para o equipamento através
da seringa ejetora) no equipamento, Agilent 6890 Cromatografo / Espectofetometro de
massa. Registar resultados ( programa GS-MS Instrument).

Neste método detecta-se o consumo de opiáceos, nomeadamente o metabolito da heroina

(6-MAM).
As urinas são submetidas a uma hidrólise ácida e após extracção e derivatização são
analisadas por GC/MS. A confirmação qualitativa é realizada por comparação directa dos
tempo de retenção relativo (TRR) e das abundâncias relativas dos iões de diagnóstico da
amostra suspeita e de uma urina controlo.
Para a validação do método de confirmação qualitativa do metabolito da heroína (6-
MAM) por cromatografia gasosa acoplada à espectrofotometria de massa (GC-MS),
foram avaliados cinco parâmetros: especificidade/selectividade, capacidade de
identificação, limite de detecção, arrastamento e repetibilidade.

4
1. Especificidade / selectividade

A especificidade/selectividade foi efectuada da seguinte forma:

 Preparou-se 10 amostras de controlo negativo (alíquotas de 2.5 mL), utilizando o
controlo acima descrito.
 Preparou-se 10 amostras de controlo positivas (alíquotas de 2.5 mL), utilizando o
controlo negativo acima descrito fortificando com o analito de 6- Mam.(200ul)
- Em todas as amostras fortificou se com 200µl de padrão interno 6-MAM D3
(Deuterado).

2. Capacidade de identificação

No estudo de especificidade, foi fortificada uma amostra a uma concentração

correspondente a 200 ng/mL do metabolito pelo que esta mesma amostra foi utilizada
para determinar a capacidade de identificação.

O estudo da capacidade de identificação foi efectuado da seguinte forma:

 Prepararam-se 10 amostras de controlo negativo (alíquotas de 2.5 mL), utilizando
o controlo acima descrito.
 Prepararam-se 10 amostras de controlo positivas (alíquotas de 2.5 mL), utilizando
o controlo negativo acima descrito fortificando o com 200 µl o analito de 6-
MAM.
- Todas as amostras foram fortificadas com 200ul de padrão interno 6-MAM D3
(Deuterado).

Comparação das abundâncias relativas dos iões

Na tabela 1 e 2 apresentam-se os iões diagnóstico seleccionados para cumprimento das
relações iónicas da 6-Mam.

Tabela 1- Iões diagnóstico seleccionados - 6-MAM Tabela 2- Iões diagnóstico seleccionados - 6-MAM D3

Valores m/z dos iões Valores m/z dos iões

399 402
340
287

5
3. Limite de detecção

Foi preparada uma curva de calibração com 10 pontos para a 6-MAM. A fortificação das
urinas foi feita utilizando soluções metanólicas do metabolito 6- MAM. As concentrações
escolhidas para os pontos das curvas de calibração e os respectivos volumes utilizados
das soluções metanólicas apresentam-se na tabela 3. O volume de urina utilizado foi de
2.5 mL, tal como descrito nos parâmetros de validação de confirmação qualitativa da 6-
Mam.
Foram usados como padrões internos uma solução metanólica de 6- MAM-D3,
preparadas a partir de diluições da solução-mãe. O volume utilizado de padrão interno foi
60 L.

Tabela 3
Preparação da curva de calibração do estudo do limite de detecção e quantificação 6-Mam
Concentracção (ng/mL) Volume (L)

1 50 15
2 60 18
3 70 21
4 80 24
5 90 27
6 100 30
7 110 33
8 120 36
9 130 39
10 140 42
11 150 45
12 160 48
13 170 51
14 180 54
15 190 57
16 200 60

Quando o coeficiente de correlação é superior a 0,95, utilizou-se a equação seguinte:

LD = (3.3  Sy/x)/b

onde: Sy/x é o desvio padrão residual da curva de calibração

b é o declive da recta
6
 4. Avaliação do arrastamento

O estudo do arrastamento foi efectuado injectando intercaladamente com cinco amostras

de concentração de gama alta (controlos da repetibilidade de 1000ng) com cinco vails
contento metanol (branco).

5. Repetibilidade

O estudo da repetibilidade foi efectuado utilizando cinco alíquotas contaminadas com 6-

Mam numa concentração de 200 ng/mL e 1000 ng/mL foram extraídas e injectadas.
Foi ainda adicionado a cada alíquota padrão interno -6-MAM D3 numa concentração 200
ng/mL

Resultados/ Discussão

1. Especificidade/ Seletividade

A especificidade ou seletividade é a capacidade de um método discriminar um analíto em

partiular numa mistura complexa, sem interferências significativas dos outros
componentes dessa mistura (ex: componentes de matriz, metabolitos, impurezas,
produtos de degradação ou outros). (16) (17) (18)
A tabela abaixo traduz nos os resultados referentes ao estudo da especificidade e
selectividade.

Tabela 4- Resultados e tratamento dos resultados da especificidade e selectividade.

Parte I
Código da Urina branca Resultado Interferências Observações
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Negativo Negativo Sem interferências Nada a observar
7
PERCENTAGEM DE FALSOS POSITIVOS 0%
Parte II
Código da Urina Positiva Resultado Interferências Observações
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar
Cntrl Positivo Positivo Sem interferências Nada a observar

PERCENTAGEM DE FALSOS NEGATIVOS 0 %

Alguns autores consideram os resultados obtidos através de GC-MS como sendo

(12)
específicos e sem interferência de substâncias semelhantes , tal como podemos
observar nos resultados obtidos na avaliação da especificidade / selectividade, podendo
assim considerar o nosso método bastante específico e selectivo para a confirmação da
presença do metabolito 6-MAM em urina.
A percentagem de falsos positivos deve ser de 0% e a percentagem de falsos negativos
deve ser inferior a 10%. (19) O método não apresenta interferências significativas, pois as
percentagens estimadas de falsos negativos e falsos positivos foram de 0% nos dois
casos.
Assim sendo, o parâmetro avaliado cumpre os critérios de validação impostos, visto ter-
se obtido percentagens estimadas de falsos positivos e de falsos negativos, de 0%.

2. Capacidade de identificação

Para avaliar a capacidade de identificação do método, o analista deverá testar o método

em amostras positivas em condições normais de funcionamento do equipamento. (17) (18)
A abundância relativa dos 3 iões, 399,340 e 287 deve ser superior a 5%. (19) A diferença
das abundâncias relativas correspondentes à amostra suspeita e à urina controlo de cada
um dos iões seleccionados não pode ser superior aos valores apresentados na tabela 5.

8
 Tabela 5- Valores de tolerância máxima para as abundâncias relativas dos iões

Gama Tolerância máxima para as abundâncias relativas (GC/MS)

> 50% 10%

25 - 50% 20%

< 25% 5%

As tabelas abaixo indicam nos os resultados da capacidade de identificação.

Tabela 6- Tratamento dos resultados da capacidade de identificação de 6-MAM

Diferença máxima
Valores m/z Controlo (positivo10) admissivel T.R.R
dos iões
diagnósticos Abundância Abundância Sinal/ruido Diferença Diferença
absoluta relativa absoluta relativa
399 2098 100,0% - -
< 1%

340 1975 94,1% - 84.1-104.1

287 1196 57,0% - 47.0-67.0

Diferença máxima 
Positivo 1 admissivel T.R.R
Valores m/z Sinal/ruido Diferença
dos iões Abundância Abundância Diferença relativa
diagnósticos absoluta relativa (%) absoluta

399 1462 100,0% - -

< 1%
340 1503 88,8% - 84.1-104.1

287 884 57,7% - 47.0-67.0

Diferença máxima 
Positivo 2 admissivel T.R.R
Valores m/z Sinal/ruido Diferença
dos iões Abundância Abundância Diferença relativa
diagnósticos absoluta relativa (%) absoluta

399 1839 100,0% - -

< 1%
340 1620 88,8% - 84.1-104.1

287 1043 57,7% - 47.0-67.0

9
 Diferença máxima 
Positivo 3 admissivel T.R.R
Valores m/z Sinal/ruido Diferença
dos iões Abundância Abundância Diferença relativa
diagnósticos absoluta relativa (%) absoluta
2447 100,0%
399 - - < 1%

2339 88,8%
340 - 84.1-104.1
1406 57,7%
287 - 47.0-67.0

Diferença máxima 
Positivo 4 admissivel T.R.R
Valores m/z Sinal/ruido Diferença
dos iões Abundância Abundância Diferença relativa
diagnósticos absoluta relativa (%) absoluta
1918 100,0%
399 - - < 1%

1706 88,8%
340 - 84.1-104.1
1100 57,7%
287 - 47.0-67.0

Diferença máxima 
Positivo 5 admissivel T.R.R
Valores m/z Sinal/ruido Diferença
dos iões Abundância Abundância Diferença relativa
diagnósticos absoluta relativa (%) absoluta
1856 100,0%
399 - -
1743 88,8% < 1%
340 - 84.1-104.1
1044 57,7%
287 - 47.0-67.0

Diferença máxima 
Positivo 6 admissivel T.R.R
Valores m/z Sinal/ruido Diferença
dos iões Abundância Abundância Diferença relativa
diagnósticos absoluta relativa (%) absoluta
2094 100,0%
399 - - < 1%

1842 88,8%
340 - 84.1-104.1
1194 57,7%
287 - 47.0-67.0

Diferença máxima 
Positivo 7 admissivel T.R.R
Valores m/z Sinal/ruido Diferença
dos iões Abundância Abundância Diferença relativa
diagnósticos absoluta relativa (%) absoluta
2123 100,0%
399 - -
2067 88,8% < 1%
340 - 84.1-104.1
1241 57,7%
287 - 47.0-67.0

10
 Diferença máxima 
Positivo 8 admissivel T.R.R
Valores m/z Sinal/ruido Diferença
dos iões Abundância Abundância Diferença relativa
diagnósticos absoluta relativa (%) absoluta
1689 100,0%
399 - -
1621 88,8% < 1%
340 - 84.1-104.1
951 57,7%
287 - 47.0-67.0

Diferença máxima 
Positivo 9 admissivel T.R.R
Valores m/z Sinal/ruido Diferença
dos iões Abundância Abundância Diferença relativa
diagnósticos absoluta relativa (%) absoluta
2291 100,0%
399 - -
2035 88,8% < 1%
340 - 84.1-104.1
1321 57,7%
287 - 47.0-67.0

Para considerar uma amostra como positiva é necessário que o ião principal,o ião 399,
esteja presente e seja o mais abundante na amostra, correspondendo a uma abundância
relativa de 100%. A abundância relativa dos iões diagnóstico 340 e 287 são obtidos
através da abundância absoluta dos mesmo, quando comparados com a abundância
absoluta e abundância relativa obtidas para o ião 399. Para as amostras serem
consideradas positivas, para além da presença do ião 399, os valores da abundância
relativa dos iões 340 e 287 têm obrigatoriamente que respeitar os critérios de
conformidade baseados nos valores de tolerância máxima para as abundâncias relativas
dos iões admitidos para GC-MS (tabela 5).

Como para todas as amostras testadas os valores da abundância relativa dos iões 340 e
287 respeitam os valores de tolerância máxima admíssivel para GC-MS, valores entre
84.1 e 104.1 para o ião 340 e entre 47.0 e 67.0 para o ião 287, podemos considerar todas
as amostras como positivas. Para a validação do método é necessário que a percentagem
referente aos falsos negativos seja igual ou inferior a 10%.

Com base nestes resultados e nos dados obtidos no parâmetro anterior (especificidade /
selectividade) relativamente à percentagem de falsos negativos, neste caso 0% de falsos
negativos, podemos considerar o método válido.

11
Perante estes resultados concluisse que o método de confirmação qualitativa da 6-Mam
em urina humana por GC/MS possui uma capacidade de identificação conforme com os
resultados acima descritos, pois a percentagem de falsos negativos é inferior a 10%.

3. Limite de Detecção

Quantidade mínima de analito que pode ser detectada por um método mas não
necessariamente quantificada. (17)

Tabela 7- Resultados e tratamento dos resultados do estudo do limite de detecção da 6-MAM

Concentração Área Absoluta Área Absoluta do PI ÁÁrea Relativa tiva

(ng/mL) Área Absoluta bsoluta do PI
50 599 2632 0,2276
60 734 2603 0,2820
70 917 2685 0,3415
80 968 2568 0,3769
90 1154 2674 0,4316
100 1359 2733 0,4973
110 1395 2597 0,5372
120 1567 2607 0,6011
130 1595 2504 0,6370
140 1740 2606 0,6677
150 1793 2336 0,7676
160 1966 2385 0,8243
170 2198 2501 0,8788
180 2286 2384 0,9589
190 2312 2372 0,9747
200 2431 2493 0,9751

LD =13,3631057

Gráfico 1- Curva de quantificação do estudo do limite de detecção da 6-MAM

12
 Obteve se o seguinte resultado:

Limite de detecção para o 6-MAM: 13,4 ng/mL.

Alguns autores consideram esta técnica simples e reprodutível, uma vez que proporciona
um baixo limite de detecção (14), tal como é possível observar pelo resultado obtido para a
avaliação do limite de detecção, cujo resultado é menor que o valor mínimo de detecção.
O método de confirmação qualitativa da 6-MAM em urina humana por GC/MS possui o
limite inferior de detecção de 13,4 ng/mL no equipamento HP GC 6890/MSD 6890
(GCMS01).
Para a validação deste parâmetro é necessário que o limite de detecção obtido seja menor
que o valor mínimo de detecção, sendo que o valor aplicado para o 6-MAM é de 100
ng/mL.
O método cumpre os requisitos definidos para os limites de detecção, atendendo a que o
resultado obtido foi de 13,4 ng/mL pode constatar-se o cumprimento dos requisitos para
os limites de detecção.

4. Avaliação do Arrastamento

O estudo de possíveis fenómenos de arrastamento pode ser efectuado em conjunto com

qualquer dos protocolos descritos anteriormente (Especificidade/selectividade,
capacidade de identificação, limite de detecção e quantificação). O estudo deve ser
executado com gama média ou alta. (17) (18)

Tabela 8- Resultados do estudo do arrastamento

Critério de conformidade

CONTROLO POS ID Abundância Abund. relativa Lim. inferior Lim. superior

Pico base 399 3686 100,0% N/A

Ião Diagnóstico 1 340 3404 92,3% 82,3% 102,3%
Ião Diagnóstico 2 287 2020 54,8% 44,8% 64,8%

7,743 8,143
6MAM 7,943
TR
PI 7,926 ou
TRR 1,002 0,992 1,012

13
 ARRAST-NEG1 ID Abundância Abund. relativa Conformidade

Pico base 399 130 100,0% N/A

Ião Diagnóstico 1 340 60 46,2% Não Conforme
Ião Diagnóstico 2 287 53 40,8% Não Conforme
Ião Diagnóstico 3 -----
Ião Diagnóstico 4 -----
Ião Diagnóstico 5 -----
Ião Diagnóstico 6 -----
7,934 Conforme
6MAM
TR
PI 7,921 1 Cumpre TR

1,002 1 Cumpre TRR

TRR

ARRAST-NEG2 ID Abundância Abund. relativa Conformidade

Pico base 399 130 100,0% N/A
Ião Diagnóstico 1 340 60 46,2% Não Conforme
Ião Diagnóstico 2 287 53 40,8% Não Conforme
Ião Diagnóstico 3 -----
Ião Diagnóstico 4 -----
Ião Diagnóstico 5 -----
Ião Diagnóstico 6 -----
6MAM 7,934 Conforme
TR
PI 7,921 1 Cumpre TR
TRR 1,002 1 Cumpre TRR

ARRAST-NEG3 ID Abundância Abund. relativa Conformidade

Pico base 399 173 100,0% N/A
Ião Diagnóstico 1 340 97 56,1% Não Conforme
Ião Diagnóstico 2 287 79 45,7% Conforme
Ião Diagnóstico 3 -----
Ião Diagnóstico 4 -----
Ião Diagnóstico 5 -----
Ião Diagnóstico 6 -----
6MAM 7,938 Conforme
TR
PI 7,920 1 Cumpre TR
TRR 1,002 1 Cumpre TRR

ARRAST-NEG4 ID Abundância Abund. relativa Conformidade

Pico base 399 130 100,0% N/A
Ião Diagnóstico 1 340 65 50,0% Não Conforme
Ião Diagnóstico 2 287 53 40,8% Não Conforme
Ião Diagnóstico 3 -----
Ião Diagnóstico 4 -----
Ião Diagnóstico 5 -----
Ião Diagnóstico 6 -----
6MAM 7,934 Conforme
TR
PI 7,921 1 Cumpre TR
TRR 1,002 1 Cumpre TRR
14
ARRAST-NEG5 ID Abundância Abund. relativa Conformidade
Pico base 399 130 100,0% N/A
Ião Diagnóstico 1 340 82 63,1% Não Conforme
Ião Diagnóstico 2 287 53 40,8% Não Conforme
Ião Diagnóstico 3 -----
Ião Diagnóstico 4 -----
Ião Diagnóstico 5 -----
Ião Diagnóstico 6 -----
6MAM 7,934 Conforme
TR
PI 7,921 1 Cumpre TR
TRR 1,002 1 Cumpre TRR

Nenhum dos cromatogramas correspondentes aos brancos de metanol evidenciou sinais

da presença de analitos das amostras a concentração de gama alta. Deste modo, pode-se
constatar que não se verifica arrastamento na gama testada. Para que fosse evidenciado o
fenómeno de arrastamento nas amostras testadas (amostras de concentração de gama
alta), as abundâncias relativas dos iões diagnóstico 340 e 287 teriam que ser concordantes
com o intervalo do critério de conformidade respectivo, sendo que o intervalo varia de
82.3% a 102.3% para o ião 340 e de 44.8% a 64.8% para o ião 287.
Visto não haver conformidade entre as abundâncias relativas dos iões diagnóstico e os
intervalos do critério de conformidade, pode-se constatar que não se verifica a existência
de arrastamento na gama testada. Em caso de existência de arrastamento, devem ser
tomadas as medidas de controlo da qualidade consideradas adequadas para eliminar a
possibilidade de arrastamento durante os métodos de confirmação.

5. Repetibilidade

A repetibilidade consiste na aproximação entre os resultados de medições sucessivas da

mesma mensuranda efectuadas nas mesmas condições de medição: mesmo procedimento
de medição, mesmo observador, mesma instrumentação, no mesmo laboratório e num
curto período de tempo. (19) (18)
A repetibilidade deve ser calculada sobre os tempos de retenção e áreas de picos e se
possivel em vários pontos da gama de trabalho.

Os resultados do tratamento do estudo da repetibilidade estão resumidos nas tabela 9 e

tabela 10.

15
 Tabela 9- Tratamento dos resultados do estudo da repetibilidade com gama alta

Área
6-mam 6MamD3 Arel
CTR 200 313 464 0,674569
CTR 200 348 543 0,640884
CTR 200 399 485 0,82268
CTR 200 338 496 0,681452
CTR 200 324 480 0,675
media 0,698917
s 0,06349
cv(%) 9,0841

Tabela 10- Tratamento dos resultados do estudo de repetibilidade com gama baixa

Área
6-mam 6MamD3 Arel
CTR 1000 2252 598 3,765886
CTR 1000 1922 512 3,753906
CTR 1000 1530 401 3,815461
CTR 1000 998 288 3,465278
CTR 1000 1458 398 3,663317
media 3,700133
s 0,123937
cv(%) 3,349535

A cromatografia gasosa acoplada à espectrofotometria de massa é considerada por alguns

autores como sendo um método preciso. (12)
Como este parâmetro avalia a precisão do método, e tendo os resultados obtidos sido
concordantes com os critérios de aceitação definidos pelo LAFTM, podemos considerar o
método de confirmação qualitativa de 6-MAM preciso.
O método de confirmação da 6-Mam pelo equipamento HP GC 6890/MSD 6890
(GCMS01) apresenta coeficientes de variância de 3,35% para gamas altas e 9,0 % para as
gamas baixa. Este valor cumpre os critérios de aceitação de repetibilidade definidos pelo
LAFTM (< 10%). Observou se que a variação entre as amostras não variam 10% entre si.
(16)

Os resultados obtidos nos diversos parametros encontram-se compilados na tabela 11.

Tabela 11- Resumo dos resultados

Parâmetro Resultado

Especificidade/selectividade Sem interferências significativas

Capacidade de identificação 0 % de falsos negativos e 0% de falsos positivos
Limite de detecção - Codeina 13,4 ng/mL
Arrastamento Não se verificou fenómenos de arrastamento
Repetibilidade – 6- MAM 9 % a 200 ng/mL e 3,35 % a 1000 ng/mL

16
O facto de se utilizar 2,5 mL de amostra, leva a que se possa considerar o método como
destrutivo, pois o ideal seria utilizar um menor volume de amostra para cada análise, o
que permitiria realizar uma possível repetição da análise ou até mesmo a realização de
uma contra-prova se assim fosse solicitado, embora a utilização de volumes menores não
proporcione uma capacidade de identificação tão aceitável como a proporcionada pelo
volume utilizado.

Conclusão

Na validação do método em estudo, concluiu-se que este é, sensível, preciso, e confiável

para análise qualitativa do metabolito 6-MAM por cromatografia gasosa acopolada á
espectofotometria de massa, em amostras de urina humana. Nos cinco parâmetros
realizados, obtivémos resultados aceitáveis, sem que houvesse interferências
significativas. Os objetivos inicialmete propostos, sendo estes, a detecção e confirmação
do consumo de heroína, a utilização de um volume de amostra reduzido, e a
possibilidade de diferenciar o doseamento de morfina vs heroína, foram atingidos com
sucesso. Após a validação desta técnica, passará a ser possivel assegurar com precisão a
detecção do metabolito 6- MAM, na urina dos colaboradores da marinha, atraves
darealização de análises rotineiras, mais rápidas, com elevada fiabilidade, e com baixo
custo.

Com base nos conhecimentos já adquiridos relativos à análise qualitativa, seria pertinente
futuramente validar este método, quanto à deteção quantitativa do metabolito 6-MAM,
recorrendo, a um acréscimo de seis parâmetros de validação.

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