You are on page 1of 17

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

Facultad de Ingeniería Ambiental


UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO, CLASIFICACION DE MEDIOS

SEGUNDO LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL - BO-112

CESAR EDUARDO PACHAS ANDRADE – 20140344 I

DOCENTE: MSc. Blgo. ALVARO MARTÍN MARTÍNEZ VILA

Lima, Perú
27 de abril de 2018

1
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniería Ambiental

ÍNDICE

1 RESUMEN ............................................................................................................ 3
2 INTRODUCCIÓN................................................................................................... 5
3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 6
3.1 Objetivos generales .................................................................................... 6
3.2 Objetivos específicos .................................................................................. 6
4 MARCO TEÓRICO ................................................................................................ 6
4.1 MEDIOS DE CULTIVO ................................................................................... 6
4.2 CLASIFICACION DE MEDIOS DE CULTIVO .................................................... 7
4.3 ASPECTOS PARA PREPARAR DE MEDIOS DE CULTIVO ................................ 9
4.4 ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO ..................................... 9
5 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL..................................................................... 10
5.1 Materiales ................................................................................................. 10
5.2 Medios de cultivo...................................................................................... 10
5.3 Soluciones ................................................................................................. 11
5.4 Equipos...................................................................................................... 11
5.5 Metodología .............................................................................................. 11
6 RESULTADOS ..................................................................................................... 12
7 DISCUSIÓN DE RESULTADOS ............................................................................. 12
8 CONCLUSIONES ................................................................................................. 12
9 FUENTES DE INFORMACIÓN ............................................................................. 13
10 ANEXO ........................................................................................................... 14
11 APÉNDICE ...................................................................................................... 17
11.1 Diagrama de flujo ...................................................................................... 17

2
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniería Ambiental
1 RESUMEN

La presente práctica se realizó en el laboratorio de microbiología de la


UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA cuyo objetivo fue conocer la forma
de preparación de los medios de cultivo deshidratadas como el agar plate count,
agua pectonada, caldo nutritivo, caldo BHI para el cultivo de microorganismos
presentes en la muestra a estudiar. Para lo cual se utilizó balanza analítica,
probetas (100ml y 500 ml), Erlenmeyer (250 ml y 500 ml), tubos de ensayo
(16x150), espátulas, cintas ph, algodón, alcohol 70°, papel kraft, mechero,
guantes de asbesto, bombillas, encendedor, pipetas (1 ml y 10 ml), hornilla
eléctrica, rejilla de asbesto, piceta con agua, pabilo, tijeras, pinzas, cuchillo,
gradillas, NaOH 0.1N y HCl 0.1N para ajustar el ph, autoclave para esterilizar, y
refrigeradora para guardar los preparados. En un Erlenmeyer de 500 se pesó
6.75 gr de APC (22.5 gr/L) y se disolvió con agua destilada, luego se llevó a
fundir el agar en una hornilla eléctrica, para luego esterilizarlo en el autoclave y
posterior llevarlo a guardar en el refrigerador. Para el agua peptonada (1 gr/L),
en un Erlenmeyer de 250 ml se pesó 0.15 gr de peptona y se disolvió con 150 ml
de agua destilada para luego distribuirlas en tubos de ensayos con tapas y
forrado con papel kraf, para luego ser llevadas al autoclave y posterior a la
refrigeradora. Para el caldo nutritivo ( 8 gr/L), en un Erlenmeyer de 250 ml se
pesó 1.04 gr del medio y disolver con 130 ml de agua destilada, luego se
distribuyó en tubos de ensayo con tapa y forrado con papel kraf, para luego ser
llevados al autoclave y posterior a la refrigeradora. Para el Caldo BHI (37 gr/L),
en un Erlenmeyer se pesó 4.81 gr de BHI y se disolvió con 130 ml de agua
destilada, luego se distribuyó en tubos de ensayo con tapa y forrado con papel
kraf, para luego ser llevados al autoclave y posterior a la refrigeradora.
Gracias a que todas las herramientas que se utilizan en el laboratorio de
microbiología son óptimas, se logró realizar los medios con éxito para su
posterior uso.

Palabras claves: agar plate count, agua pectonada, caldo nutritivo, caldo BHI

3
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniería Ambiental
ABSTRACT

The present practice was carried out in the microbiology laboratory of the
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA whose objective was to know how
to prepare dehydrated culture media such as plate count agar, pectonated water,
nutritious broth, BHI broth for the cultivation of microorganisms present in the
sample to study. For which analytical balance, test tubes (100ml and 500ml),
Erlenmeyer (250ml and 500ml), test tubes (16x150), spatulas, ph tapes, cotton,
70 ° alcohol, kraft paper, lighter, gloves asbestos, light bulbs, lighter, pipettes (1
ml and 10 ml), electric burner, asbestos grid, water picette, wick, scissors, tongs,
knife, racks, 0.1N NaOH and 0.1N HCl to adjust the pH, autoclave for sterilize,
and refrigerator to store the preparations. In an Erlenmeyer of 500, 6.75 gr of
APC (22.5 gr / L) was weighed and dissolved with distilled water, then the agar
was melted in an electric burner, then sterilized in the autoclave and then taken
to storage in the refrigerator. . For the peptone water (1 gr / L), in a 250 ml
Erlenmeyer, 0.15 g of peptone was weighed and dissolved with 150 ml of distilled
water and then distributed in test tubes with lids and lined with kraf paper. taken
to the autoclave and after the refrigerator. For the nutritious broth (8 gr / L), in a
250 ml Erlenmeyer, 1.04 g of the medium was weighed and dissolved with 130
ml of distilled water, then distributed in test tubes with lid and lined with kraf
paper, to be then taken to the autoclave and after the refrigerator. For the BHI
Broth (37 gr / L), 4.81 gr of BHI was weighed in an Erlenmeyer flask and
dissolved with 130 ml of distilled water, then distributed in test tubes with a lid
and lined with kraf paper, and then taken to the autoclave and after the
refrigerator.
Thanks to the fact that all the tools that are used in the microbiology laboratory
are optimal, it was possible to carry out the media successfully for its later use.

Key words: agar plate count, pectonada water, nutritious broth, broth BHI

4
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniería Ambiental
2 INTRODUCCIÓN

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos


es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en
el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han
preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias
crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de
condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno
adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de
cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe
estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de las bacterias
patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los
líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de
cultivo es una infusión de extractos de pescado y Peptona a la que se añadirán
otros ingredientes. El agar es un elemento solidificarte muy empleado para la
preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del
agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones
no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por
aquellas que crecen en él. La Gelatina es otro agente solidificarte pero se
emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación. En los
diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de
enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc.
Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para
incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de
fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la
sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los
microorganismos menos resistentes. También se añaden colorantes que actúan
como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como
inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa
como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de
Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría de
las bacterias Gram-positivas).

5
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniería Ambiental
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve
afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos,
son ajenos por completo al propio medio.

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivos generales

 Aprender a preparar medio de cultivos

3.2 Objetivos específicos

 Relacionar al alumno con los diferentes instrumentos que


utiliza en un laboratorio de microbiología.
 Aprender a trabajar en un ambiente higiénico.
 Esterilizar todos los medios en la máquina de autoclave

4 MARCO TEÓRICO

4.1 MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones


adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los
microorganismos, estos medios son esenciales en el laboratorio por lo que un
control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegurar la exactitud,
confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. En los laboratorios
se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en
forma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un medio sólido, se
parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el
agar, la gelatina o la sílicagel. Una vez que ha sido preparado, un medio de
cultivo puede ser inoculado (es decir, se le añaden organismos) y a continuación
incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento. El crecimiento de los
microorganismos es el cultivo. Un cultivo axénico o puro contiene un único tipo
de microorganismos. Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y

6
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniería Ambiental
factores de crecimiento necesarios y deben estar exentos de cualquier
microorganismo contaminante. Los medios de cultivo contienen como mínimo:
carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán
necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento.
También se añaden colorantes que actúan como indicadores. El agar es el
principal agente solidificante utilizado en medios. Se disuelve completamente a
100°C y se solidifica al enfriarse a 40°C. (Clavell, 1992).

4.2 CLASIFICACION DE MEDIOS DE CULTIVO

De acuerdo a su consistencia, los medios de cultivo pueden clasificarse en:

• Líquidos: Se utilizan para el crecimiento de cultivos puros en lote. Se


denominan caldos de cultivo y no tienen agar en su formulación.

• Semisólidos: Contienen 0.5% de agar en su formulación.

• Sólidos: Contienen de 1.5 a 2% de agar en su formulación.

De acuerdo a su composición, los medios de cultivo pueden clasificarse en:

• Definidos: es aquél medio de cultivo del cual se conoce su composición


exacta. Son muy utilizados en estudios fisiológicos. Los medios mínimos
son medios definidos que únicamente le proporcionan al microorganismo
los nutrientes necesarios para crecer, pero no para desarrollarse
óptimamente.

• Complejos: es aquél del cual no se conoce la composición exacta del


medio. A menudo, los medios complejos emplean sangre, leche, extracto
de levaduras, extracto de carne u otras sustancias muy nutritivas pero de
las cuales se desconoce la composición química exacta. Estos medios
son muy utilizados para cultivar bacterias desconocidas o bacterias de
requerimientos nutricionales muy complejos.

7
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniería Ambiental
Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus
constituyentes en:

• Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de


origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la
adición de minerales y otras sustancias. en ellos no se conocen todos los
componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.

• Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición
química definida cualitativamente y cuantitativamente. Generalmente se
usan en trabajos de investigación.

De acuerdo al uso del medio de cultivo, éstos se clasifican en:

• Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el


crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten
aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente
contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los
microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.

• Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian


por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de
microorganismos específicos.

• Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos


derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. no
contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana, permiten
revelar características fisiológicas de los microorganismos.

Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno


de sus constituyentes básicos, o por simple rehidratación de productos
asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados), generalmente se
prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de
simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados
reproducibles. (Gutiérrez, 2001).

8
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniería Ambiental
4.3 ASPECTOS PARA PREPARAR DE MEDIOS DE CULTIVO

• Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o


proveedores que suministren productos de calidad.

• Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica


y fisicoquímica adecuada.

Utilizar materiales de vidrio bien lavado y enjuagado con agua destilada o
desmineralizada.

• Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su


esterilización. Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el
fabricante.(Gutiérrez, 2001)

4.4 ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados


bajo las condiciones que señale el fabricante, generalmente se almacenan en un
lugar fresco (entre 15 y 25°), con poca humedad y protegidos de la luz solar
directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente
de calor o vapor.

Una vez que el medio de cultivo ha sid o preparado y ester ilizado se


debe almacenar entre 2 y 8º C, a menos que el medio requiera alguna
condición diferente. Se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar
su deshidratación. Cuando se usa tapón de algodón se debe colocar por encima
una envoltura de papel (Craft). (Dugas, 1999).

9
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniería Ambiental
5 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

5.1 Materiales

• Probetas 100 ml y 500 ml


• Erlenmeyer 250 ml y 500 ml
• Tubos de ensayo 16 x 150
• Espátulas
• Cintas ph
• Algodón
• Alcohol 70°
• Papel kraf
• Mechero
• Guantes de asbesto
• Bombillas
• Encendedor
• Pipetas 1 ml y 10 ml
• Rejilla de asbesto
• Picetas con agua destilada
• Pabilo
• Pinzas
• Tijeras
• Cuchillo
• Gradilla

5.2 Medios de cultivo

• Agar Plate Count


• Agua peptonada
• Caldo nutritivo
• Caldo BHI

10
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniería Ambiental
5.3 Soluciones

• NaOH 0.1N
• HCl 0.1N

5.4 Equipos

• Hornilla eléctrica
• Balanza analítica
• Autoclave
• Refrigeradora

5.5 Metodología

• Leer cuidadosamente la etiqueta en la preparación del medio de cultivo.


• Hacer una relación de gr. de acuerdo a los ml de medio
• Pesar el medio de cultivo, dentro del matraz de Erlenmeyer, luego verter
el agua destilada ya medido en el Erlenmeyer, agitar vigorosamente hasta
que se disuelva el medio
• Colocar el medio (si así lo indica la etiqueta) a la parrilla a calentar a
ebullición; se quita de la parrilla cuando comienza a hervir y se deja enfriar
un poco, para medir pH. .
• Repartir el medio (si así lo indica el responsable del laboratorio) en tubos
de ensayo con tapa.
• Tapar, etiquetar, pegar con cinta testigo.
• Introducir en el autoclave el material por 15Lb/ 15 min.
• Sacar de la autoclave
• Se dejan enfriar y se colocan invertidas en bolsas de plástico, etiquetar
correctamente y se guarda en refrigeración.

11
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniería Ambiental
6 RESULTADOS

PLATE COUNT (22.5 gr/L)


22.5 gr ---------------- 1000 ml
X gr ----------------- 300 ml
X = 6.75 gr
AGUA PEPTONADA (1 gr/L)
1 gr ------------------1000 ml
X gr ------------------ 150 ml
X = 0.15 gr
CALDO NUTRITIVO (8 gr/L)
8 gr ------------------ 1000 ml
X gr ------------------ 130 ml
X = 1.04 gr
CALDO BHI (37gr/L)
37 gr ----------------- 1000 ml
X gr ------------------ 130 ml
X = 4.81 gr

7 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Para este laboratorio el buen uso y el buen estado de los materiales, medios de
cultivo, soluciones y equipos se lograron tener las proporciones exactas de los
medios y solventes que en este caso es el agua destilada para la preparación de
los mismos.

8 CONCLUSIONES
Se logró preparar satisfactoriamente todos los medios
Se logró aprender a utilizar de forma correcta los instrumentos necesarios para
esta prueba como el buen manejo de la balanza, de las pipetas, etc.
Esta prueba pudimos realizarla en una mesa adecuadamente limpia para evitar
agentes contaminantes que perjudiquen nuestra práctica.
Se logró utilizar la máquina de la autoclave la cual permitió esterilizar nuestros
medios.

12
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniería Ambiental
9 FUENTES DE INFORMACIÓN

https://es.scribd.com/doc/232146268/PREPARACION-DE-MEDIOS-DE-
CULTIVO-PARA-MICROBIOLOGIA

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/Pr
ograma_Microbiolog%C3%ADa_2008.pdf

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10
_Preparaci%C3%B3n_de_medios_de_cultivo.pdf

http://annymojica.blogspot.pe/2012/03/practica-no3-preparacion-de-medios-
para.html

https://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8800

https://thunderbooks.files.wordpress.com/2009/05/introduction-to-
biotechnology-and-genetic-engineering-infinity-2008.pdf

http://www.mastgrp.com/IFUS/IFU342_SPA.pdf

http://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a2844b49b1
c6.pdf

13
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniería Ambiental
10 ANEXO
Tabla referencial del medio plate count
Concentración del medio
Triptona 5.0 gr/litro
Dextrosa 1.0 gr/litro
Extracto de levadura 2.5 gr/litro
Agar 12.0 gr/litro
pH final: 7.0 ± 0.2

Tabla referencial del medio agua peptonada


Concentración del medio
Peptona 10.0 gr/litro
Cloruro de Sodio 5.0 gr/litro
Fosfato disódico 3.5 gr/litro
Fosfato monopotasico 1.5 gr/litro
pH final: 7.0 ± 0.2

Tabla referencial del medio caldo nutritivo


Concentración del medio
Pluripeptona 5.0 gr/litro
Extracto de carne 3.0 gr/litro
pH final: 6.9 ± 0.2

Tabla referencial del medio caldo BHI


Concentración del medio
Infusión de cerebro y corazón de
8.0 gr/litro
(solidos)
Digerido péptico de tejido animal 5.0 gr/litro
Digerido pancreático de casina 16.0 gr/ litro
Cloruro sódico 5.0 gr/litro
Glucosa 2.0 gr/litro
Fosfato disódico de hidrogeno 2.5 gr/litro
Agar 13.5 gr/litro
pH final: 7.4 ± 0.2

14
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniería Ambiental
Imagen 1

Medio del cultivo APC y el agua correctamente medidos


Imagen 2

APC disuelto con el agua

15
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniería Ambiental
Imagen 3

Colocando el APC en la estufa para fundirla


Imagen 4

El APC correctamente fundida y protegida con papel kraf para llevarla a la


autoclave

16
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniería Ambiental
Imagen 5

Todos los medios respectivamente etiquetados listos para la autoclave

11 APÉNDICE

11.1 Diagrama de flujo

Leer Hacer una relación Medir el medio y el


cuidadosamente la de gr de acuerdo a agua destilada para
etiqueta en la los ml del medio diluirlo en un matraz
preparación del
medio de cultivo

Colocar el medio a
Repartir en tubos Enfriar y medir su la parrilla si es
de ensayo si es pH del medio necesario para su
necesario con tapa fundición

Introducir en el
Tapar, etiquetar, autoclave el Enfriar, y guardar
pegar con cinta material por 15 lb/ en la refrigeradora
testigo o papel kraf 15 min

17