You are on page 1of 149

Ứng Dụng Các Kỹ Thuật

Sắc Ký Lỏng Hiện Đại
Trong Kiểm Nghiệm Thuốc

PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn
Bộ môn Phân tích – Kiểm nghiệm
Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Sắc Ký Lỏng Hiện Đại Trong Kiểm Nghiệm Thuốc

Mục tiêu
 Trình bày được xu hướng nghiên cứu hiện nay trong sắc ký
lỏng và các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng
 Trình bày được cấu hình và lợi điểm của các hệ thống UHPLC,
và UPLC
 Biết được nguyên tắc chuyển đổi một quy trình phân tích bằng
HPLC sang UPLC và ngược lại

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Sắc Ký Lỏng Hiện Đại Trong Kiểm Nghiệm Thuốc

Nội dung
 Xu hướng nghiên cứu hiện nay trong sắc ký lỏng
 Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng
 Kỹ thuật UHPLC (Ultra High Performace Liquid Chromaography)
 Kỹ thuật UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography)
 Chuyển đổi phương pháp phân tích HPLC sang UPLC và ngược lại

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Sắc Ký Lỏng Hiện Đại Trong Kiểm Nghiệm Thuốc Xu hướng nghiên cứu hiện nay trong sắc ký lỏng Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Xu hướng nghiên cứu hiện nay trong sắc ký lỏng  Pha tĩnh và cột sắc ký  Thiết bị phân tích  Kỹ thuật phân tích Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

thiết bị. nhiều phòng thí nghiệm Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM . vận hành. phòng thí nghiệm)  Phân tích tự động và liên tiếp với nhiều phương pháp  Chuyển đổi phương pháp phân tích mà không cần thẩm định lại  Tiện lợi cho người phân tích  Quản lý. xử lý và lưu trữ dữ liệu của 1 hệ thống. nhiều hệ thống trong phòng thí nghiệm.Xu hướng nghiên cứu hiện nay trong sắc ký lỏng Mục đích  Phân tích nhanh (high-throughput)  Hiệu năng cao (phương pháp phân tích.

Xu hướng nghiên cứu hiện nay trong sắc ký lỏng Những tiến bộ về kỹ thuật phân tích sắc ký Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Các kỹ thuật phân tích bằng sắc ký Phân tích chất bay hơi và không phân cực dựa vào chương trình nhiệt GC • Hiệu năng thấp (đơn vị chiều dài) [N] • Độ chọn lọc giới hạn [α] Gas Chromatography Phân tích các chất không bay hơi và các chất phân cực dựa vào hiệu năng cột gia tăng LC • Hiệu năng vừa phải [N] • Độ chọn lọc vừa phải [α] Liquid Chromatography Việc phân tích dựa vào độ chọn lọc chuyển pha • Hiệu năng cao [N] SFC • Độ chọn lọc cao [α] Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Sắc ký lỏng siêu tới hạn Sắc ký lỏng siêu tới hạn (SFC. Supercritical Fluid Chromatography)  Khởi đầu vào những năm 1990  Khắc phục một số nhược điểm của GC và HPLC Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Chất lỏng siêu tới hạn là gì ? Tăng nhiệt độ và Tăng nhiệt độ và áp suất áp suất Lỏng/khí Điểm tới hạn Lỏng siêu tới hạn Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

3 1071.3 Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .0 551.1 CO2 31.7 NH3 132.3 n-butan 152.Một số chất lỏng siêu tới hạn Lỏng Nhiệt độ tới hạn Áp suất tới hạn siêu tới hạn (oC) (psi) N2O 36.5 1653.5 1053.

dung môi ổn định và không phân cực • Không độc và không cháy • Dễ bay hơi • Dễ kiểm soát trạng thái vật lý • Luôn có sẳn – Sản phẩm phụ của quá trình lên men • Được xem như khí “Xanh” – Định nghĩa khí “Xanh”: • Ngăn chặn/giảm tối thiểu chất thải • Giảm độc • Tái sử dụng • Giảm tối thiểu năng lượng sử dụng Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .Lợi điểm của CO2 • Tinh khiết hóa học.

Thuận lợi của SFC Khuếch tán Độ nhớt Hạn chế của sắc ký khí (cm2/s) (g/cmxs)  Phải tạo dẫn xuất với chất không Khí 10-1 10-4 bay hơi. phân cực và hấp phụ Lỏng siêu 10-4 – 10-3 10-4 – 10-3  Hợp chất không bền với nhiệt tới hạn Như chất như chất khí  Hợp chất cao phân tử lỏng Lỏng < 10-5 10-2 Lỏng siêu tới hạn Hạn chế của sắc ký lỏng Khuếch tán thấp hơn chất khí.  Hợp chất bay hơi độ nhớt thấp hơn chất lỏng  Hợp chất khó tan dẫn đến sắc ký nhanh và hiệu quả Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Tại sao ? • Thiếu ổn định – Thời gian lưu thay đổi Nếu tất cả các – Thể tích tiêm có độ đúng thấp vấn đề trên – Việc phân phối dung môi không ổn định khi tỷ lệ được giải dung môi dưới 5% quyết ? • Thiết bị vận hành kém – Độ tin cậy của thiết bị không đủ (hệ thống bơm. nhưng chưa bao giờ được chấp nhận rộng rãi …. bộ phận điều hoà áp suất cột) – Sự khuếch tán và thể tích hệ thống lớn nên ngăn chặn sự dung nhận các hạt pha tĩnh nhỏ và thời gian phân tích không nhanh • Độ nhạy thấp – Độ nhiễu cao do bơm và đầu dò – Ảnh hưởng bởi chỉ số khúc xạ của CO2 Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .Tại sao SFC không được chấp nhận ? Mặc dù SFC có những ưu điểm. kiểu tiêm.

Ultra Performance Convergence Chromatography)  Khởi đầu vào năm 2012  Phát triển từ SFC Hệ thống UPCC-PDA-MS Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .Sắc ký hội tụ siêu hiệu năng Sắc ký hội tu siêu hiệu năng (UPCC.

có độ tin cậy và ổn định. Switzerland Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM . Jean-Luc Veuthey LCAP. Sắc ký hội tụ Data courtesy of Davy Guillarme.Sự kỳ vọng từ UPCC SFC UPCC = UPC2 UPCC là kỹ thuật phân tích được phát triển từ kỹ thuật SFC. University of Geneva.

2 Mạnh Acetonitrile 0.22 2.43 5.1 khai sắc ký Chloroform 0.3 Pha đảo Methanol 0.43 4.Lựa chọn dung môi Sức dung môi CO2 siêu tới hạn được Năng lực Độ phân Dung môi rửa giải [Eo] cực [P’] sử dụng trong sắc ký hội CO2 siêu tới hạn Pentane.5 lực rửa giải khác nhau.8 Sắc ký hội tụ THF 0.22 2.5 Ethyl acetate 0. Hexane.4 DMSO 0.60 3.9 Ethanol 0.50 7.1 Heptane các dung môi có năng Xylene 0.1 Dioxane 0.30 3.29 2.73 5.48 2.48 4.8 Isopropanol 0. tụ có thể hỗn hòa với 0 0.52 5.68 4.31 4.0 MTBE 0.1 Nước 10.2 Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM . Yếu Toluene 0.8 nhiều dung môi khi triển Dichloromethane 0.48 4.1 Pha thuận Pha thuận Acetone 0.4 cho phép lựa chọn được Diethyl ether 0.

Lựa chọn pha tĩnh Lựa chọn pha tĩnh Sắc ký hội tụ có thể sử dụng cả cột pha thuận và Silica / BEH pha đảo. cho phép có 2-ethylpyridine nhiều lựa chọn khi triển khai sắc ký Cyano Pha thuận Aminopropyl Diol Sắc ký hội tụ Amide PFP Phenyl Pha đảo C18 < C8 Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

4 dioxan 2.5 mL/phút x 2 phút 2 1) 4.15 mL Methanol (3%) Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .85 mL CO2 CO2 0.Sử dụng/thải bỏ dung môi – LC và UPCC Sử dụng Chất thải 2 mL/phút x 20 phút 1) 40 mL heptan 41 mL dung môi LC 2) 1.15 mL Methanol UPC 2) 0.2 mL 1.

Các thuốc chẹn beta (β-blockers) β-blockers Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

1659 FFA: C8 to C24 C10 0.25mg/mL 0.60 1.52 311.00 2.91 199.40 0.60 2.18 Gradient: 1 to 10% over 5 minutes* C14 255.5ul inj 15CV0 17:14:13 03-Aug-2012 TAGs_08022012_026 1: TOF MS ES- 100 C20 1. 2% B Isocratic results in similar runt time (see next slides) Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .79 171.2894 C24 Method Conditions: Instrument: ACQUITY UPC2 C16 1.2587 1.3502 Co-solvent: MeOH w/ 2g/L Ammonium Formate 1.5 minutes is gradient slope is maintained.1348 C8 0 Time 0.1970 CCM Pressure: 1885 Injection Vol: 0.2276 Flow: 2.05 227.20 0.3196 BPI 1.40 2.Phân tích acid béo bằng UPCC C22 FFA Mix 1 FFA Method 0.00 1.2mL/min of 0.20 2.80 1.1% formic acid Splitter: Upchurch cross 1/16 PEEK C12 Sample Concentration: 0.80 2.5uL % Make-up flow: 0.71e5 C18 1.93 Column: ACQUITY UPC2 HSS C18 SB 367.5 mL/min Temperature: 600C 1.72 339.20 1.35 283.60 0.80 *Run time can be shortened to 2.40 1.

Khả năng ứng dụng của UPCC Thân nước Độ phân cực Thân dầu Khả năng Không bay GC Bay hơi bay hơi hơi HPLC Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Ưu điểm của UPCC Kiểm soát tiến độ nghiên cứu chiết xuất Dịch chiết với dung môi phân cực Dịch chiết với dung môi không phân cực Chiết tiếp với Tiêm trực Bốc hơi và hòa Tiêm trực dung môi không tiếp vào tan lại trong dung tiếp vào LC phân cực để phân GC môi phân cực để tích bằng GC phân tích bằng LC Tạo dẫn xuất ! Dịch chiết với dung môi phân cực hoặc không phân cực Phân tích trực tiếp bằng UPC2 Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

đường kính trong cột từ 2. đồng phân quang học.1 – 3. đồng phân dia và các hợp chất bất đối Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .Nhận xét về UPCC  UPCC gia tăng hiệu năng và tính chọn lọc cho các phòng thí nghiệm phân tích bằng sắc ký  UPC2 cải thiện công tác thực nghiệm  Cung cấp thêm nhiều khả năng để kiểm soát tính chọn lọc  Triển khai phương pháp phân tích nhanh  Hiệu năng của UPCC là do:  Hạt pha tĩnh dưới 2 µm.0 mm  Làm giảm thể tích hệ thống và khuếch tán  UPCC có thể được áp dụng để phân tích nhiều loại hợp chất  80 – 85% số hợp chất được phân tích bởi SFC và RPLC  Thích hợp để phân tích đồng phân vị trí.

000 Hiệu năng cao hơn 100% 200.0 µm giảm Particle Size Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .7 µm 1.000 18.5 µm 150.000 giảm và khuếch tán hệ thống 0 5 µm 3.000 so với cỡ hạt 1.5 µm 1.000 Hiệu năng cột tăng do cỡ hạt 50.4 µm 1. LC độ nhạy và tốc độ phân tích UPLC Sắc ký lỏng 500.000 30.Sự tiến bộ trong sắc ký lỏng UHPLC.000 100.000 so với cỡ hạt 3.000 psi ACQUITY UPLC I- Class System 250.000 Hiệu năng cao hơn 70% 400.000 psi Plates/meter 300. Cải thiện đáng kể độ phân giải.7 µm 350.000 psi 450.000 130.

Sắc Ký Lỏng Hiện Đại Trong Kiểm Nghiệm Thuốc • Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Tỷ số giữa chiều dài cột (L) và cỡ hạt pha tĩnh (dp) Cho biết khả năng đạt độ phân giải tối đa Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Tỷ số giữa chiều dài cột (L) và cỡ hạt pha tĩnh (dp) Cho biết khả năng đạt độ phân giải tối đa Mẫu rất khó Mẫu khó Mẫu trung bình Mẫu dễ Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng Sự khác nhau giữa 3 kỹ thuật phân tích Tăng độ phân giải Giảm thời gian sắc ký Tăng độ nhạy Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

sự mở rộng dãi (tăng chiều rộng pic ở đáy) của chất phân tích là do ảnh hưởng của cột sắc ký (động học khuếch tán và chuyển khối phụ thuộc vào cỡ hạt pha tĩnh và tốc độ dòng) và ảnh hưởng của hệ thống (đường kính trong và chiều dài của ống mao quản.Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng Nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau về hiệu năng giữa 3 kỹ thuật phân tích  Sự phân tán (dispersion) – n. thể tích tế bào dòng của đầu dò …. bộ phận kết nối thiết bị.)  Hiệu năng tách thật sự bị ảnh hưởng bởi sự phân tán hệ thống cùng với một khoảng tốc độ dòng để mang lại hiệu năng cao nhất có thể với một cột sắc ký nhất định Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Hệ thống HPLC
1. Nguồn heli
1
2. Bình dung môi
3. Đầu phun
8 4. Đầu lọc
5. Van tỷ lệ dung môi
6. Bơm
6
9
10 7. Van kiểm tra vào
7
8. Van kiểm tra ra
2 3
4
11
9. Khử xung
10. Đầu thải
11. Van xả
12
12. Mồi bơm
5
13. Lọc dung môi
detector 14. Điều hòa áp suất
18 17 15 14 13 ngược
15. Chuyển đổi áp suất
16
16. Van tiêm mẫu
17. Cột bảo vệ + cột sắc ký
18. Tới detector
Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng
Ảnh hưởng của cỡ hạt và tốc độ dòng lên sự phân tán trong cột
(hiệu năng cột)

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng

Ảnh hưởng của sự phân tán hệ thống lên độ phân giải

400.00

Hệ LC có sự
mAU

200.00
Rs = 0,52 Rs = 1,53 phân tán hệ
thống cao hơn

0.00

0.40

Hệ LC có sự
AU

phân tán hệ
0.20
Rs = 1,44 Rs = 2,84 thống thấp hơn

0.00
1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60
Minutes

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng Chi phí cho một lần phân tích sẽ giảm từ HPLC  UHPLC  UPLC do thời gian phân tích ngắn hơn và tốc độ dòng thấp hơn Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng UHPLC là cầu nối của hai kỹ thuật phân tích HPLC và UPLC HPLC UHPLC UPLC Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

6 mm 4.0 – 3.6 .10 µm • Cỡ hạt: 1.30 µL < 12 µL Cột sắc ký Cột sắc ký Cột sắc ký • Đường kính trong (ID): • Đường kính trong: 2.5 µm • Cỡ hạt: 1.7 . 2.0 – 4.000 – 15.1 mm ID.1 – • Đường kính trong: 1.0 mm ID. 5 µm • 3.6 mm • Cỡ hạt: 3 . 1.000 – 15.5 µm Tối ưu Tối ưu Tối ưu • 4.7 µm Áp suất vận hành Áp suất vận hành: Áp suất vận hành: • < 6.6 mm 4.6 mm ID.000 PSI Gia tăng tính linh hoạt và phù hợp với các mẫu có đặc tính khác nhau Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .000 PSI • 6.000 PSI • 9.x µm • 2.Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng Thể tích phân tán hệ Thể tích phân tán hệ thống Thể tích phân tán hệ thống thống > 30 µL 12 .

20 0.00 0.00 1.50 1.20 0.00 1.00 3.00 1.60 AU AU AU 50 mm 0.40 0.80 2.00 1.50 1.20 0.60 0.60 0.50 1.40 0.60 0.00 0.40 0.7 μm 0.1 mm ID 0.00 0.50 0.20 0.40 0.50 2.00 1.50 2.00 4.00 1.50 2.40 0.60 AU AU AU 75 mm 0.6 mm ID 0.50 1.00 1.40 0.80 0.00 UPLC 2.00 1.00 0.50 1.60 AU AU AU 75 mm 0.50 1.50 2.20 0.0 mm ID 0. UHPLC và UPLC (kỹ thuật phân tích không phù hợp với cột sắc ký) 1.00 1.00 1.00 1.60 0.00 0.20 0.50 1.00 1.80 0.50 2.20 0.50 2.40 0.00 1.7 μm 0.00 0.50 0.00 0.40 0.00 Minutes Minutes Minutes 1.50 0.00 0.50 2.80 0.00 UHPLC 1.40 0.60 0.50 2.80 0.00 0.50 2.20 0.00 Minutes Minutes Minutes Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .80 0.80 0.00 2.00 0.00 HPLC 1.80 2.00 0.20 0.00 2.00 0.60 0.Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng Ảnh hưởng của thể tích cột lên hiệu năng: phân tích với chương trình đẳng dòng giữa HPLC.6 μm 0.50 1.00 Minutes Minutes Minutes 1.00 2.50 1.80 1.

012 0.50 2.5 Rs = 1.00 3.000 1.8 0.048 UHPLC 1 Acid 6 carboxylic Thể tích phân tán 2 0.75 2.036 Thể tích phân tán Định lượng Diclazuril theo USP ngoài cột < 10 µL AU 0. Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng Ảnh hưởng của thể tích phân tán hệ thống lên hiệu năng: phân tích với chương trình gradient giữa UHPLC và UPLC Stt Hợp chất 0.50 3.0 Rs = 2.012 1 4 Ketone 4 5 6 0.036 ngoài cột 25 µL 3 2 6-carboxamide 3 Diclazuril AU 0.7 0.75 3.048 UPLC Cột C18 2.024 Rs = 2.00 2.000 5 Dẫn xuất 4-amino 6 Dẫn xuất des-cyano 0.25 2.25 3.024 Rs = 1.75 4.00 Minutes Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .1x 50 mm 0.

Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng Kỹ thuật phân tích phù hợp với cột sắc ký  hiệu năng cao nhất Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

0 µL AU 0.6 ml/phút Rs (2.5 ml/phút Rs (2.00 0.3) = 2.20 1.00 4.29 0.00 0.00 2.00 Minutes 10.10 Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .3) = 2.10 Tốc độ dòng = 0.80 1.50 3.Tại sao cần UPLC ? 0.60 0.40 0.00 6.5 µm – 100 mm Thể tích tiêm = 3.00 0.5 µL AU 0.00 Minutes 1.20 1.20 0.3 µL HPLC AU 0.00 0.20 2.00 3.20 0.28 0.00 1.80 1.20 3.00 0.32 0.34 0.00 8.00 0.5 µm – 75 mm Thể tích tiêm = 2.60 0.50 Minutes 4.7 µm – 50 mm Thể tích tiêm = 1.20 5 µm – 150 mm Thể tích tiêm = 5.3 ml/phút 0.00 0.40 1.00 0.10 Tốc độ dòng = 0.50 2.50 1.80 Minutes 2.00 0.7 µL UPLC® AU 0.10 Tốc độ dòng = 0.3) = 2.00 1.40 0.60 1.10 Tốc độ dòng = 0.00 2.00 Rs (2.3) = 2.2 ml/phút Rs (2.

Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng CAO Hiệu quả kinh tế CAO HPLC UHPLC Chi phí ban đầu Tổng chi phí UPLC UPLC UHPLC HPLC THẤP Vòng đời thiết bị THẤP Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

79 USD 78 Lít $7.33 USD 544 Lít $54.776 USD gian phân tích 5 phút) Tiết kiệm với hệ UPLC $11.54 USD 466 lít $46.432 USD phân tích 45 phút) Hệ UHPLC sử dụng cột UHPLC 2.Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng Hiệu quả kinh tế Dung môi sử Chi phí/năm/định Chi phí/mẫu dụng/năm lượng 12000 mẫu Hệ UHPLC sử dụng cột HPLC 5 µm (Thời gian $12.870 USD hệ UHPLC Hệ UPLC sử dụng cột UPLC 1.60 USD 156 Lít $15.7 µm (Thời $0.656 USD Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .x µm (Thời $2.73 USD 388 Lít $38.562 USD gian phân tích 11 phút) Tiết kiệm với $9.

phát triển công thức bào chế thuốc ở giai đoạn đầu)  Việc ứng dụng các kỹ thuật sắc ký lỏng này trong các phòng thí nghiệm phân tích thường qui chỉ xảy ra sau khi có sự chấp nhận các qui trình phân tích trong các giai đoạn đầu tiên của vòng đời sản phẩm  Các kỹ thuật này phải cho kết quả lặp lại.Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng Ứng dụng các kỹ thuật sắc ký lỏng hiện đại tại các phòng thí nghiệm phân tích thường qui  Các kỹ thuật sắc ký lỏng mới được ứng dụng đầu tiên trong các giai đoạn đầu của quá trình nghiên cứu phát triển thuốc mới (khám phá thuốc mới. ổn định và tin cậy  Việc áp dụng các kỹ thuật này phải duy trì được sự tuân thủ khi triển khai các qui trình phân tích đã được xây dựng và thẩm định  Các kỹ thuật này cũng phải duy trì sự tương hợp với các điều kiện phân tích đang được sử dụng Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng • Kỹ thuật UHPLC Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

5 – 2.7 µm Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .Kỹ thuật UHPLC Thiết bị UHPLC có tính đa dụng  Triển khai các qui trình định lượng bằng HPLC đã được xây dựng  Dễ dàng chuyển đổi phương pháp HPLC sang UHPLC bằng cách điều chỉnh thể tích dừng (delayed volume) và thời đểm trộn dung môi  Công nghệ đa dòng chảy hình cung (Arc Multi- flow path) giúp  Chuyển đổi các phương pháp HPLC đang được ứng dụng bằng cách thiết lập thể tích dừng gradient của hệ HPLC  Triển khai phương pháp với cột UHPLC có hiệu lực cao hơn với thể tích dừng gradient của hệ UHPLC  Cải thiện năng suất phân tích và giảm chi phí phân tích khi sử dụng cột UHPLC có cỡ hạt 2.

Kỹ thuật UHPLC

Thiết bị UHPLC có tính đa dụng
 Dễ dàng ứng dụng và cho kết quả lặp lại các
phương pháp HPLC đã được xây dựng trên thiết bị
HPLC của các nhà cung cấp thiết bị khác nhau
 Chấp nhận phương pháp UPLC trong các giai
đoạn đầu tiên của quá trình phát triển thuốc, sử
dụng pha tĩnh với cỡ hạt dưới 2 µm được điều
chỉnh thành 3 – 5 µm cho mục đích phân tích
thường qui
 Tự chuẩn bị pha động trên dòng dung môi (on-
line) giúp làm giảm các sai số khi chuẩn bị pha
động thủ công với người chuẩn bị và ngày chuẩn
bị khác nhau

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Kỹ thuật UHPLC
Lặp lại kết quả phân tích từ các phương pháp đã được xây dựng với công
nghệ đa dòng chảy hình cung

0.08

6.239

8.224
5.551
AU

6.684

10.423
3.891

4.600
3.131

4.262
0.04
Agilent LC System

0.00

0.08

6.298

8.186
5.577

6.703
AU

10.313
3.755

4.450
3.033

4.119

0.04
ACQUITY Arc System

0.00
0.00 1.50 3.00 4.50 6.00 7.50 9.00 10.50 12.00 13.50 15.00
Minutes

Điều kiện sắc ký giống nhau giữa 2 hệ thống: 5 - 60% MeOH trong 15 phút; Pha động A: HCCOH 0,1% trong nước,
pha động B: HCCOH 0,1% trong MeOH; F = 2,9 mL/phút; Cột: XSelect CSH C18 (4,6 x 150 mm, 5 µm); 45oC; UV
270 nm; 10.0 µL

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Kỹ thuật UHPLC
Lặp lại và cải thiện phương pháp HPLC - Điều chỉnh phương pháp UPLC
4
0.050
7 ACQUITY UPLC H-Class System
0.040 5 ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 µm 2.1 x 50 mm
1 3 6 Flow Rate = 0.61 mL/min
0.030
2
Inj. Vol. = 0.7 µL
AU

0.020

0.010

0.000
0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70 1.80
1.80 min
0.050

0.040 ACQUITY Arc System

Điều chỉnh
0.030 XBridge C18 2.5 µm 3.0 x 75 mm XP
AU

Flow Rate = 0.85 mL/min

Cải thiện
0.020 Inj. Vol. = 2.1 µL
0.010

0.000
0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.60 min

0.050

0.040
ACQUITY Arc System
0.030 XBridge C18 5 µm 4.6 x 150 mm
AU

0.020 Flow Rate = 1.0 mL/min
Inj. Vol. = 10.0 µL
0.010

0.000
2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
15.00 min
15.00

The ACQUITY Arc System enables support HPLC and UHPLC methods on a single platform.50 to 80% MeOH; Temp = 40 oC; UV @ 254 nm; (1) prednisone, (2)
hydrocortisone, (3) dexamethazone, (4) estradiol, (5) 17α – hydroxyprogesterone, (6) levonorgestrel, (7) progesterone

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

UV/Vis.500 PSI  Van lựa chọn 4 trong số 6 dung môi khi trộn Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM . ELSD.Kỹ thuật UHPLC Thích hợp với nhiều loại đầu dò  Hiệu năng tối đa (HPLC và UHPLC)  Độ nhạy cao  Khoảng tuyến tính rộng  PDA. MS Bộ trộn gradient “thông minh” (Gradient SmartStart)  Tự điều chỉnh đồng thời thời gian bắt đầu gradient và các bước trước khi tiêm mẫu nên làm giảm thời gian trống giữa các lần phân tích và rút ngắn thời gian phân tích  Tự điều chỉnh thể tích dừng mà không cần thay đổi chương trình gradient Bộ trộn dung môi tứ phân  Trộn đúng và chính xác đồng thời 4 dung môi với tốc độ dòng đến 5 ml/phút và áp suất đến 9. RI. FD.

002%) Với thiết kế kiểu tiêm mẫu “dòng chảy qua kim” (flow-through-needle) làm giảm tối thiểu lượng mẫu tồn dư do kim được rửa sạch trong thời gian phân tích Có thể cài đặt nhiều chương trình rửa kim khác nhau nên phù hợp với các nền mẫu phức tạp Buồng điều nhiệt cột sắc ký  Kích thước 30 cm  Điều nhiệt ổn định. đồng nhất trong khoảng nhiệt độ rộng  Đảm bảo độ lặp lại của phương pháp khi thay đổi phòng thí nghiệm  Van chuyển cột nhanh và tự động Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .Kỹ thuật UHPLC Lượng mẫu tồn dư không đáng kể (< 0.

Kỹ thuật UHPLC Công nghệ trộn dung môi tự động  Theo chương trình gradient pH và % dung môi mữu cơ Công nghệ đa dòng chảy hình cung  Giảm sai số khi chuẩn bị pha  Giúp triển khai phương pháp HPLC và động thủ công UHPLC  Rút ngắn thời gian thẩm định độ  Giúp lặp lại hoặc cải tiến phương pháp đang ổn định của phương pháp sắc ký sử dụng với việc lựa chọn thể tích dừng theo từng kỹ thuật HPLC hoặc UHPLC Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Kỹ thuật UHPLC
Bộ trộn dung môi tứ phân Chuyển đổi áp suất Bộ phận đa dòng chảy hình cung

Van kiểm tra
tình trạng
không hoạt
Bơm rửa
động của
vòng đệm
bơm
(seal)

Van chọn
dung môi

Van tỷ lệ dung môi Khử khí dung môi

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Kỹ thuật UHPLC
Công nghệ đa dòng chảy hình cung (Arc Multi-flow pathTM Technology) giúp
chọn đường đi của dòng chảy phù hợp với kỹ thuật sắc ký được ứng dụng

UHPLC: thể tích
hệ thống nhỏ hơn

700 µL

Tới bộ phận tiêm mẫu và cột

1100 µL

HPLC: thể tích
hệ thống lớn hơn

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

Kỹ thuật UHPLC
Công nghệ đa dòng chảy hình cung (Arc Multi-flow pathTM Technology) giúp
lặp lại kết quả phân tích của phương pháp đã xây dựng trên hệ thống sắc ký
khác

Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM

00 15.00 10.Kỹ thuật UHPLC Giải quyết những khó khăn trong chuyển đổi phương pháp Lặp lại sự vận hành của hệ thống ban đầu Những thách thức khi chuyển đổi Gradient UHPLC thực tế UPLC trace phương pháp giữa các hệ thống sắc ký lỏng Programmed Chương trình gradient gradient Gradient HPLC HPLC trace thực tế  Chương trình gradient yêu cầu sự phù hợp giữa thể tích dừng và Thể tích Gradient dừng của kiểu trộn dung môi delay UPLC hệ UHPLC  Sự đồng nhất về nhiệt độ trong Gradient Thể tích delay buồng cột dừng của hệ HPLC HPLC  Sự phân tán ngoài cột phải tương Cân bằng Equilibration đương hoặc tốt hơn hệ thống 0.00 25.00 5.00 phân tích ban đầu Minutes Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .00 30.00 20.

d: đường kính trong cột sắc ký. L: chiều dài cột Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM . dc: đường kính cột. dp: cỡ hạt pha tĩnh.Kỹ thuật UHPLC Hướng dẫn về chuyển đổi phương pháp theo USP 37-NF 32 (1/8/2014) F: tốc độ dòng.

Kỹ thuật UHPLC So sánh hướng dẫn về chuyển đổi phương pháp theo USP 37- NF 32 (1/8/2014) và EP Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Kỹ thuật UHPLC Công nghệ đa dòng chảy hình cung (Arc Multi-flow pathTM Technology) Thể tích trộn lớn hơn làm “phân tán” đường biên của chương trình gradient giống như HPLC Path 1 Gradient Delay Volume = 1100μL Thể tích dừng = 700 μL Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

ngay khi và sau khi tiêm) giúp bù trừ cho việc chuyển đổi phương pháp Arc Multi-flow pathTM technology được xây dựng từ các hệ thống sắc ký lỏng có thể tích dừng khác nhau  Không ảnh hưởng đến chương trình rửa giải gradient đã được xây dựng. phù hợp với hướng dẫn của USP37-NF32 Bô trộn gradient “thông minh” về việc chuyển đổi phương pháp sắc ký với chương trình rửa giải gradient được xây dựng trên các hệ sắc ký lỏng khác nhau Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .Kỹ thuật UHPLC Lặp lại sự vận hành của hệ thống ban đầu nhờ công nghệ đa dòng chảy hình cung (Arc Multi-flow pathTM Technology) và bộ trộn gradient “thông minh”  Thể tích dừng có thể được lựa chọn giúp tái lặp cả thể tích hệ thống và kiểu Lựa chọn đường đi của dòng chảy 1 hoặc 2 trộn dung môi như hệ thống ban đầu  Điều chỉnh thời điểm bắt đầu chương trình gradient so với thời điểm tiêm mẫu (trước.

Kỹ thuật UHPLC Bộ trộn gradient “thông minh” (Gradient SmartStart) Thể tích bù từ bộ trộn gradient = 100 μL Thể tích dừng theo con đường 1 = 1100 μL Tổng thể tích dừng với hệ HPLC = 1200 μL Hệ HPLC ban đầu có thể tích dừng là 1200 μL Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

030 Hệ UHPLC ACQUITY Arc ACQUITY Arc System 2 8 5 6 9 7 AU 0.00 4.00 7.000 0.030 2 3 Impurity A 6 4 Impurity G 5 8 5 Impurity 9 AU 0.015 7 6 Impurity H 1 4 9 3 7 Impurity C 8 Impurity D 9 Impurity B 0.50 9.000 0.015 1 4 3 0.50 3.50 15.00 10.50 6.50 12.00 1.5 mg/mL và nồng độ tạp chất là 1.00 13.Kỹ thuật UHPLC Lặp lại kết quả của phương pháp đã xây dựng với công nghệ đa dòng chày hình cung No.00 Minutes Metoclopramid 0. Analyte Hệ LC Agilent Agilent 1260 Infinity LC System 1 2 Impurity F Metoclopramide 0.0% của metoclopramid Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Kỹ thuật UHPLC Thích hợp với nhiều phương pháp giúp tăng năng suất thiết bị Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Kỹ thuật UHPLC Công nghệ trộn dung môi tự động Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

75 tránh chuẩn bị thủ công pha động có pH mong muốn 3.95  Thẩm định phương pháp: công cụ hiệu quả trong việc rút ngắn thời gian thẩm định độ ổn định  Triển khai phương pháp: pH 3.00 (Phút) Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .00 5.00 7.00 6.00 4.Kỹ thuật UHPLC Công nghệ trộn dung môi tự động  Phân tích thường qui: chuẩn bị pha động có nồng độ và pH mong muốn pH 2.

Kỹ thuật UHPLC Bộ phận tiêm mẫu theo kiểu dòng chảy qua kim (Flow-through needle) Nút chuyển đổi khay chứa mẫu Van tiêm với thể tích vòng chứa mẫu 50 µL Bơm tiêm 2 khay chứa mẫu Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

42 2 0.00 0.80 2.2 – 5.40 1.90 0.01 5.00 Trung bình 0.20 0.40 0.00 0.70 5.0 – 50.40 0.2 – 5.9998 -15.0 µL 0.9999 0.00 0.50 càng tốt) AU 0.20 0.30  Hệ số tương quan bình phương: R2 > 0.0 µL và 0.60 1.60 5.0 – 50.40 0.02 0.80 2.20 1.00 1.05 0.0 – 50.80 1.60 0.9999 1.50 0.Kỹ thuật UHPLC Bộ phận tiêm mẫu theo kiểu dòng chảy qua kim (Flow-through needle) – Tính tuyến tính  Thể tích tiêm mẫu tuyến tính: 0.9999 -33.80 1.50 Trung bình 0.0 µL 0.0 µL 0.97 Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .60  Tung độ gốc (hệ số b) tính bằng nL (càng nhỏ 0.0 µL 3 0.9999 -22.80 0.9999 -19.01 0.00 Minutes 1.2 – 5.00 Minutes 1 0.30 1 0.20 0.9999 1.20 1.10 3 0.20 2 0.60 0.40 AU 0.0 µL 0.999 0.9999 0.40 1.10 Thể tích tiêm mẫu n R2 Hệ số b 0.70 0.00 0.60 1.

002% Sau khi tiêm mẫu trắng. không phát hiện mẫu tồn dư Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .0 mg/mL Chất đối chiếu 0.Kỹ thuật UHPLC Bộ phận tiêm mẫu theo kiểu dòng chảy qua kim (Flow-through needle) – Lượng mẫu tồn dư không đáng kể (< 0.002%) Mẫu nồng độ rất cao 5.

Kỹ thuật UHPLC 30-cm CH và CHC Buồng điều nhiệt cột sắc ký  Phân tán nhiệt đều ngay cả nhiệt độ lên tới 65oC  Van lựa chọn một trong 3 cột CH30-A  Khởi động trong 0.005 giây và điều nhiệt chính xác tới 90oC Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Kỹ thuật UHPLC Thích hợp với nhiều loại đầu dò Huỳnh quang PDA  Tế bào dòng  Tế bào dòng với thể tích với thể tích phân tán thấp phân tán thấp UV/Vis ELSD  Tế bào dòng với thể tích phân tán thấp RI MS Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

50 3.00 10.8 309.0 – Imp.02 0. A Imp. B 202.0 – Imp.0 271.1 212. F 316.00 Minutes Imp. G 213.0 213.04 300. D 196.0 211.0 – Imp. F API Imp.50 6.0 Phổ khối 288.0 316.00 7. C 286.1 – Imp. 9 258.Đầu dò MS giúp có thêm thông tin về mẫu phân tích ACQUITY Arc System 0.1 – Imp.50 12.9 317.0 302.00 1.50 15.9 263.0 – Imp. G 342.1 – Imp.1 .00 0.API 224.Kỹ thuật UHPLC Thích hợp với nhiều loại đầu dò .5 272.1 300.9 Phổ UV 286.0 306.5 307.8 311.1 342.00 13. A AU 0.1 343.00 4.9 Apex Apex Apex Apex Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .0 – Imp.5 272.50 9. H 182.

Kỹ thuật UHPLC Thích hợp với nhiều loại đầu dò .Đầu dò MS giúp có thêm thông tin về mẫu phân tích Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

5 – 10 µm Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM . FLR. UPLC = 7 µL)  Thích hợp với cột có đường kính trong 3. 2. điều nhiệt tới 90oC Bộ phận tiêm mẫu theo kiểu dòng chảy qua kim  Thể tích tiêm mẫu tới 1000 µL  Tự động thêm mẫu tiêm và pha loãng  Điều nhiệt mẫu từ 4 .0/4.Kỹ thuật UHPLC Tóm tắt đặc điểm của hệ thống UHPLC Thích hợp với nhiều loại đầu dò  PDA.40oC Bộ phận trộn dung môi tứ phân  Trộn dung môi tự động ở tốc độ dòng 5 ml/phút với áp suất 9.6 mm.500 PSI  Công nghệ đa dòng chảy hình cung giúp lựa chọn thể tích dừng Hiệu năng hệ thống  Thể tích phân tán hệ thống trung bình 25 µL (HPLC = 34 µL. MS Buồng điều nhiệt cột sắc ký  Kích thước 30 cm. UV/Vis. RI. ELSD.

020 min SD (whichever is < 0.01 to 2 mL/min) 95% Compositional precision < 0.1% or 10 µL/min +/.0.2% RSD or < 0.06% RSD or < 0.0.07% RSD or < 0.04 min +/. optional solvent One to f our One to f our select valve (D1-6) Flow precision < 0.1% at 0.01-2 mL/min) mL/min (whichever is greater) Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .000 mL/min 0. 3.5% (0.Kỹ thuật UHPLC So sánh tiêu chuẩn kỹ thuật của một số hệ thống UHPLC Specification / Feature ACQUITY Arc Agilent Infinity 1260 Shimadzu Nexera-i Quaternary SL Total system dwell volume Path 1 = 1100 µL 800 to 1100 µL 460 µL Path 2 = 700 µL System dispersion 25 µL 25 µL TBD (band spread) Flow rate range 0.1% (0.020 min SD (whichever < 0.5.5% absolute f rom 5 to Not stated +/.0 +/.020 min SD (whichever greater) is greater) is greater) Flow Accuracy +/.0 mL/min 0.15% RSD or +/.075% RSD or < 0.001 to 10.0 and 5.500 PSI (655 bar) up to 5 8700 PSI (600 bar) up to 5 9572 PSI (660 bar) up to 3 mL/min mL/min mL/min 2950 PSI (200 bar) f rom 5 to 6381 PSI (440 bar) f rom 3 to 10 mL/min 5 mL/min 3190 PSI (220 bar) f rom 5 to 10 mL/min Compositional accuracy +/.0.0001 to 10 mL/min Maximum operating pressure 9.001 to 5.1% RSD SD (whichever is greater) SD (whichever is greater) Number of solvents One to f our.04 min < 0.0.

25% RSD 5 to 100 µL <0. 2 x 96 well plates.0 to 5.002% caf f eine (UV) <0.5 to 1. up to 1500 0.Kỹ thuật UHPLC So sánh tiêu chuẩn kỹ thuật của một số hệ thống UHPLC Specification / Feature ACQUITY Arc Agilent Infinity 1260 Shimadzu Nexera-i Quaternary SL Injection volume range 0.0 µL Not specif ied >0.0 to 1.9999 1. 216 Vials (1. 2 x 384 well plates 336 vials (1 mL) Temperature Control 4 – 40 o C (optional) 10 o C below ambient to 80 o C 4 – 45 o C Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .5 to 0.20% RSD 5.2 µL Not specif ied +/.0 to 1000 µL <0.0.0% RSD 1.0 to 4.0 to 2000 µL Injector accuracy +/.1%.9 µL <0.0% RSD 0.25% RSD 5.0 µL <1.1 – 50 µL standard.999. up to 0.0025% caf f eine (UV) needle wash Sample capacity (Def ault) 96 vials (2 mL). 100 vials (2 mL) 112 vials (4 mL).1 – 100 µL standard.9 µL <0. up to 1000 µL (optional) µL (optional) 2000 µL (optional) Injector precision <1.5 mL).5 to 50.5% RSD 1.1% Injector linearity >0.5% RSD 1.0% RSD 0.1 – 50 µL standard.9 µL <0.05% with external < 0. 0. < 0.0 to 100 µL Sample carryover < 0.0 µL <0.25% RSD 2.0 to 5.0 µL <1.

Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng • Kỹ thuật UPLC Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Lịch sử phát triển UPLC  Waters cung cấp hệ thống UPLC đầu tiên trên thế giới vào năm 2004. I-class. M-class Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM . Giải thưởng Vàng tại hội nghị Pisttcon 2014  Từ 2004 đến nay Waters đã nghiên cứu và cải thiện các sản phẩm UPLC với rất nhiều tính năng ưu việt  H-class.

010 0.00 20.00 18.010 0.00 22.00 4.4 0.00 0.00 16.020 0.00 28.000 0.000 0.050 UPLC® 0.00 3.050 0.Kỹ thuật UPLC So sánh HPLC và UPLC 0.7 0.00 2.030 Rs = 2.8 AU 0.2 AU 0.50 3.020 Rs = 2.00 26.030 Rs = 1.00 10.00 14.00 12.040 0.00 30.00 1.00 Minutes Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .50 1.00 6.50 2.040 HPLC 0.00 Minutes Rs = 1.00 2.50 4.00 8.00 24.

MS Buồng điều nhiệt cột sắc ký Bộ phận tiêm mẫu theo kiểu dòng chảy qua kim  Bộ phận trộn dung môi tứ phân  Trộn dung môi tự động Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM . PDA. FLR.Kỹ thuật UPLC Hệ thống UPLC Đầu dò UV. ELSD.

 Phát hiện sự rò rĩ dựa vào độ trôi áp suất Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM . bao gồm thời gian giữa các lần tiêm dưới 15 giây và dung lượng mẫu mở rộng tới 8542 mẫu. thẩm định độ ổn định của phương pháp và khi ghép nối với đầu dò MS nhằm làm tăng độ ổn định và hiệu năng của phương pháp  Đầu vào lý tưởng của khối phổ  Lượng mẫu tồn dư thấp nhất nên đạt được độ nhạy cao nhất khi áp dụng kỹ thuật LC-MS  Phần mềm và phần cứng hỗ trợ cho các ứng dụng phân tích nhanh. độ nhạy. giảm thời gian phân tích và cải thiện tốc độ phân tích mẫu  Công nghệ trộn dung môi tự động và trực tuyến giúp tạo ra các hệ pha động khác nhau để hỗ trợ khi xây dựng phương pháp. UHPLC đã được xây dựng và xây dựng phương pháp UPLC để phân tích các mẫu phức tạp  Phần mềm hỗ trợ chuyển đổi phương pháp HPLC sang UPLC để cải thiện độ phân giải.Kỹ thuật UPLC Ưu điểm  Hệ sắc ký lỏng sử dụng hệ bơm tứ phân có thể tích phân tán hệ thống thấp nhất  HIỆU NĂNG UPLC THẬT SỰ  Áp dụng phương pháp HPLC.

000 PSI Tiêm mẫu theo kiểu dòng chảy Có thể lựa chọn 4 trong số 6 dung qua kim môi Khoảng thể tích tiêm từ 0. sắc ký rây thời gian trước khi tiêm giúp làm phân tử giảm thời gian giữa các lần tiêm Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM . MS tích phân tán < 10 μL nên đạt độ phân giải cao nhất Buồng điều nhiệt cột linh hoạt  Thích hợp với cột dài tới 30 cm Bộ phận hứng mẫu  Chuyển đổi 6 cột Nhiệt độ được kiểm soát và phù  Điều nhiệt riêng từng cột và hợp với pic UPLC hẹp tăng/giảm nhiệt nhanh Bộ phận tiêm mẫu linh hoạt Bộ trộn dung môi tứ phân Hỗ trợ lọ và đĩa đựng mẫu. rửa vòng đệm (seal) theo thấp chương trình giúp đạt độ chính xác. FD. Bộ trộn gradient “thông minh” độ đúng và độ tin cậy tối đa Điều chỉnh thể tích hệ thống dễ dàng khi chuyển đổi phương pháp Trộn dung môi tự động và trực tuyến được xây dựng từ các hệ thống  Theo pH và nồng độ đệm. Mở Trộn dung môi theo chương trình rộng dung lượng mẫu tới 8542 mẫu gradient ở áp suất lên tới 15.Kỹ thuật UPLC Thể tích phân tán thấp Thích hợp với nhiều loại đầu dò Hiệu năng UPLC thật sự với thể PDA. Tự động điều chỉnh sắc ký pha đảo và trao đổi ion.1 . ELSD. hỗ trợ cho LC khác nhau. khử khí dung μL với lượng mẫu tồn dư vô cùng môi.1000 Tự động nén dung môi. RI. UV/Vis.

00 0.84 thống thấp hơn 0.20 Rs = 1.30 1.00 1.00 Rs = 0.40 Hệ LC có thể AU tích phân tán hệ 0.44 Rs = 2.52 Rs = 1.Kỹ thuật UPLC Hiệu năng UPLC thật sự Sử chromatographic Same dụng cùng cộtcolumn sắc ký 400.00 Hệ LC có thể mAU 200.20 1.40 1.10 1.53 tích phân tán hệ thống cao hơn 0.50 1.60 Minutes Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Kỹ thuật UPLC Hiệu năng UPLC thật sự Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Kỹ thuật UPLC Thể tích phân tán thấp nhất và chiều rộng pic do cột nhỏ nhất Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

00 224.0 thẩm định phương 202.1 khiển 3 kiểu tiêm 316. 270 nm 5 – 60% MeOH trong 5 phút  Phần mềm hỗ trợ 224. 45°C .00 Minutes Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .0 286.1 300.1 286. 202.00 0.0 196.0 182.1 258.0 lập 0. AU trong số 6 dung môi 0.0 182.Kỹ thuật UPLC Hệ thống linh hoạt khi xây dựng phương pháp CSH C18 .1 1316.00 2.40 pH 3.1 258.1  Điều nhiệt 6 cột độc 1 182.0  Phần mềm điều 202.0 286.1 316.20 xây dựng phương pháp có hệ thống 0.15 342. 0  Van lựa chọn 4 342.20  Trộn dung môi tự động 0.50 4.00 0.40 pH 4.0 0.20  Kết nối đầu dò PDA và MS 0.1 pháp AU  Phần mềm hỗ trợ 0.1 342.50 3.1 258.1 0.00 3.40 300.00 1.1 pH 2.50 2.00 224.1 196.0 300.1 196.50 1.1 mẫu AU 0.

Kỹ thuật UPLC Chức năng trộn dung môi tự động và trực tuyến Sử dụng chức năng trộn dung môi tự động và trực tuyến để khảo sát ảnh hưởng của pH pha động lên sự rửa giải 3- benzoylpyridin (gia tăng khi pH pha động lớn hơn pKa) Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Kỹ thuật UPLC Chức năng trộn dung môi tự động với sắc ký pha đảo pH tăng làm thay đổi thứ tự rửa giải Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

00 14.10 Friday Night AU 0.00 24.00 34.00 54.05 0.00 12.00 46.05 0.00 26.05 0.00 Minutes Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .05 0.10 Sunday Morning AU 0.00 22.00 28.00 32.00 50.00 30.00 42.00 48.05 0.10 Saturday Afternoon AU 0.10 Sunday Afternoon AU 0.00 10.10 Sunday Night AU 0.00 16.Kỹ thuật UPLC Chức năng trộn dung môi tự động .00 20.00 44.00 40.Kết quả ổn định và lặp lại 0.00 36.05 0.05 8.00 52.00 18.00 38.10 Saturday Morning AU 0.10 Saturday Night AU 0.

Kỹ thuật UPLC Tiêm mẫu theo dòng chảy qua kim .1 – 25 µL 0.Khuyến cáo thể tích tiêm Thể tích kim Vòng chứa mẫu Thể tích tiêm mẫu R2 > 0.999 15 µL 0.1 .2 – 25 µL Bất kỳ 50 µL Tối đa 50 µL 2 – 50 µL Bất kỳ 100 µL Tối đa 100 µL 10 – 100 µL Bất kỳ 250 µL Tối đa 250 µL 25 – 250 µL Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .2 – 10 µL 30 µL 0.10 µL 0.

0 µL Benzocain Tetracain Procain R2 = 0.999908 R2 = 0.999970 Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .1 – 2.999977 R2 = 0.Kỹ thuật UPLC Tiêm mẫu theo dòng chảy qua kim – Tính tuyến tính 0.

999989 Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .999997 R2 = 0.5 – 10.Kỹ thuật UPLC Tiêm mẫu theo dòng chảy qua kim – Tính tuyến tính 0.0 µL Benzocain Tetracain Procain R2 = 0.999991 R2 = 0.

1 µL (200 µg/mL) Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .0 µL (20 µg/mL) 0.Kỹ thuật UPLC Tiêm mẫu theo dòng chảy qua kim – Hàm lượng mẫu được tiêm không ảnh hưởng khi thay đổi thể tích tiêm và nồng độ mẫu 10.0 µL (2 µg/mL) 1.

0 µL (2 µg/mL) Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .5 µL (200 µg/mL) 5.0 µL (20 µg/mL) 50.Kỹ thuật UPLC Tiêm mẫu theo dòng chảy qua kim – Hàm lượng mẫu được tiêm không ảnh hưởng khi thay đổi thể tích tiêm và nồng độ mẫu 0.

giảm khoảng cách đến lỗ của kim tiêm và do đó làm giảm thể tích và sự phân tán  Khả năng tiêm lặp lại từ 1 tới 99 lần với bất kỳ lọ đựng mẫu nào Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .Kỹ thuật UPLC Điểm nổi bật của bộ phận tiêm mẫu theo dòng chảy qua kim  Thể tích của bộ phận tiêm mẫu < 20 µl. không cần vòng chứa mẫu  Có chức năng khử khí cho từng dòng dung môi khi tiến hành với bất kỳ mẫu nào  Được tích hợp hệ thống rửa kim tiêm: vừa rửa trong và rửa ngoài kim. Điều kiện này phải được điều chỉnh khi triển khai mỗi phương pháp để giảm thiểu lượng mẫu tồn dư  Có cơ chế quay khay đựng mẫu để đảm bảo xoay mẫu vào đúng vị trí.

chịu được áp suất tới 15. đường kính cột từ 1. Buồng cột có thể tùy chọn gia nhiệt hoặc không. thích hợp khi triển khai nhiều phương pháp với các cột khác nhau và kéo dài tuổi thọ cột  Ghi nhận tình trạng cột: lưu tất cả dữ liệu cho 50 mẫu chạy trên cột Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .  Thể tích trễ của bộ quản lý buồng cột < 5 μL bao gồm bộ làm nóng và van chuyển đổi cột  Bộ quản lý buồng cột có thể lựa chọn đến 6 cột.034 bar.5 μL.  Kiểm soát nhiệt độ độc lập cho từng cột riêng biệt.Kỹ thuật UPLC Buồng cột  Thể tích trễ < 2.000 psi hoặc 1.  Buồng cột được gia nhiệt trước giúp tăng cường chuyển đổi phương pháp trong buồng cột.0 mm đến 4.6 mm và chiều dài 150 mm.

Kỹ thuật UPLC Buồng cột Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Kỹ thuật UPLC Công cụ xây dựng phương pháp và chuyển đổi phương pháp Biểu đồ và bảng chuyển đổi cột Chức năng tính toán khi chuyển đổi cột HPLC  UPLC  HPLC Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

00045 AU 0. Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .Kỹ thuật UPLC Độ nhạy cao và thời gian phân tích nhanh với cột HPLC khi triển khai trên hệ UPLC 0.125 mg/L 15 min.

0045 AU 10X ↑ 0.125 mg/L ↑ 5X 3 min. Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .Kỹ thuật UPLC Độ nhạy rất cao và thời gian phân tích rất ngắn khi chuyển đổi cột UPLC 0.

Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng • Chuyển đổi phương pháp phân tích HPLC  UPLC Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Chuyển đổi phương pháp phân tích HPLC  UPLC Cải thiện độ phân giải khi gia tăng độ chọn lọc Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Chuyển đổi phương pháp phân tích HPLC  UPLC Ảnh hưởng của sự mở rộng dãi lên độ phân giải Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Chuyển đổi phương pháp phân tích HPLC  UPLC Xét 3 trường hợp chuyển đổi phương pháp Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Chuyển đổi phương pháp phân tích HPLC  UPLC Xét 3 trường hợp chuyển đổi phương pháp  Trường hợp 1: khai thác tối đa việc sử dụng thiết bị sắc ký lỏng  Áp dụng phương pháp HPLC đã xây dựng trên hệ UPLC  Thay đổi phương pháp HPLC đã xây dựng cho phù hợp với các hệ thống sắc ký lỏng khác nhau  Trường hợp 2: Chuyển đổi phương pháp HPLC sang UPLC  Trường hợp 3: Chuyển đổi phương pháp UPLC sang HPLC  Khai thác ưu điểm của UPLC để xây dựng phương pháp nhanh và hiệu quả  Chuyển đổi phương pháp đã xây dựng trên hệ UPLC tới các phòng thí nghiệm được trang bị hệ thống HPLC Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Chuyển đổi phương pháp phân tích HPLC sang hệ UPLC  Đầu tư thiết bị phân tích mới để áp dụng phương pháp HPLC đã xây dựng và xây dựng phương pháp UPLC để phân tích các mẫu mới  Chuyển đổi phương pháp HPLC đã xây dựng sang một hệ thống sắc ký lỏng khác  Phải bù trừ sự khác nhau về thể tích hệ thống khi chuyển đổi Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Chuyển đổi phương pháp phân tích HPLC sang hệ UPLC Do giá trị nCV = (thể tích hệ thống/thể tích cột) của hệ UPLC nhỏ hơn so với hệ HPLC nên cần phải điều chỉnh chương trình gradient với thời điểm ban đầu lâu hơn hoặc bắt đầu chương trình gradient sau khi tiêm mẫu Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Trường hợp 1: áp dụng phương pháp HPLC đã xây dựng trên hệ UPLC Sử dụng chức năng tính toán của hệ UPLC để chuyển đổi các điều kiện sắc ký  Xác định mục đích chuyển đổi  HPLC  HPLC  HPLC  UPLC  UPLC  HPLC  Cung cấp các thông số của hệ thống sắc ký và của phương pháp đã xây dựng  Tính toán các thông số của phương pháp mới Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

332 x 1.47 phút = 2.17 ml/phút) = 0.45 phút + 0.542 – 0.21 = 0.551 ml : 1.92 phút)  Sự chuyển đổi này được tính toán tự động Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .551 ml  Vì vậy giai đoạn đẳng dòng trong chương trình gradient cần kéo dài thêm: (0.Trường hợp 1: áp dụng phương pháp HPLC đã xây dựng trên hệ UPLC  Hiệu số của giá trị CV giữa 2 hệ thống CV = 0.45 phút tăng lên thành 2.332 = 0.47 phút (từ 2.66 = 0.

Trường hợp 1: áp dụng phương pháp HPLC đã xây dựng trên hệ UPLC Kết quả Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

0 và độ phân giải giữa galantamin và tạp chất số 4 phải lớn hơn 4.Trường hợp 2: chuyển đổi phương pháp HPLC sang UPLC trên hệ UPLC Làm giảm thời gian phân tích  Sử dụng pha tĩnh < 2 µm  Yêu cầu: hệ số kéo đuôi < 2.5 Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Trường hợp 2: chuyển đổi phương pháp HPLC sang UPLC trên hệ UPLC Hướng dẫn về chuyển đổi phương pháp theo USP 37-NF 32 (1/8/2014) F: tốc độ dòng. dp: cỡ hạt pha tĩnh. d: đường kính trong cột sắc ký. L: chiều dài cột Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM . dc: đường kính cột.

000 50.000 85.Trường hợp 2: chuyển đổi phương pháp HPLC sang UPLC trên hệ UPLC Mối liên quan giữa hiệu lực cột (N) và tỷ số L/dp  L/dp tỷ lệ thuận với N và năng suất phân giải  Chọn cột sắc ký có giá trị L/dp phù hợp với “độ khó” của mẫu phân tích Chỉ số tách Ví dụ về đối tượng áp dụng Hiệu lực cột (N) L/dp Dễ Xác định độ đồng đều hàm lượng 5.000 Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .000 30.000 15.000 Rất khó Định danh chất chuyển hóa 35.000 Khó Khảo sát độ tinh khiết 20.000 Trung bình Định lượng tạp chất liên quan 12.

Trường hợp 2: chuyển đổi phương pháp HPLC sang UPLC trên hệ UPLC Nguyên tắc chuyển đổi  Giữ L/dp tương đương  Khai thác triệt để việc sử dụng thiết bị: sử dụng hạt pha tĩnh < 2 µm Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Trường hợp 2: chuyển đổi phương pháp HPLC sang UPLC trên hệ UPLC  Thể tích tiêm mẫu được điều chỉnh phù hợp để đảm bảo hàm lượng mẫu được tiêm không thay đổi  Chương trình gradient được bắt đầu trước khi tiêm mẫu  Giá trị nCV không thay đổi trong từng bước gradient  Các chuyển đổi trên được tính toán tự động Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Trường hợp 2: chuyển đổi phương pháp HPLC sang UPLC trên hệ UPLC Kết quả  Giảm thời gian phân tích 4.3 lần mà không thay đổi kết quả so với phương pháp ban đầu  Hệ số kéo đuôi và độ phân giải đạt yêu cầu Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Trường hợp 2: chuyển đổi phương pháp HPLC sang UPLC trên hệ UPLC Với chương trình rửa giải đẳng dòng Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Trường hợp 3: chuyển đổi phương pháp UPLC sang HPLC trên hệ HPLC Khai thác triệt để việc sử dụng thiết bị  Chuyển đổi phương pháp UPLC tới phòng thí nghiệm có sẳn hệ HPLC  Vẫn duy trì độ chọn lọc của pha tĩnh khi thay đổi cỡ hạt Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Trường hợp 3: chuyển đổi phương pháp UPLC sang HPLC trên hệ HPLC Sử dụng chức năng tính toán của hệ UPLC để chuyển đổi tự động Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Trường hợp 3: chuyển đổi phương pháp UPLC sang HPLC trên hệ HPLC  Thể tích tiêm mẫu được điều chỉnh phù hợp để đảm bảo hàm lượng mẫu được tiêm không thay đổi  Chương trình gradient được điều chỉnh để giữ cho giá trị nCV không thay đổi trong từng bước gradient  Các chuyển đổi trên được tính toán tự động Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

000 Tạp B 1.939 0.867 0.890 0.950 Clozapin 1.000 1.500 1.895 Tạp A 0.865 Tạp C 0.513 Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .Trường hợp 3: chuyển đổi phương pháp UPLC sang HPLC trên hệ HPLC Thời gian lưu tương đối so với clozapin Pic Hệ UPLC Hệ HPLC Tạp D 0.

Các kỹ thuật phân tích hiện đại trong sắc ký lỏng • Ví dụ minh họa về việc chuyển đổi phương pháp phân tích HPLC sang UPLC Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Định lượng tạp chất trong thuốc ngừa thai dùng đường uống Mục tiêu  Chuyển đổi phương pháp HPLC đã xây dựng sang phương pháp UPLC Cập nhật kỹ thuật phân tích mới  Hợp nhất các phương pháp  Giảm thời gian phân tích  Giảm tiêu tốn dung môi  Giảm chi phí xử lý chất thải  Tăng độ ổn định của phương pháp  Tăng năng suất phân tích Giảm chi phí mua sắm thiết bị phục vụ cho sản xuất thuốc Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Bước 1: chuyển đổi phương pháp từ HPLC sang UPLC  Hợp nhất tất cả các phương pháp sắc ký đã được xây dựng để định lượng tạp chất liên quan thành 1 phương pháp. sử dụng kỹ thuật UPLC  Thuốc ngừa thai dùng đường uống chứa hai thành phần desogestrel và ethinyl estradiol Tổng thời gian phân tích 153.1 phút Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Bước 1: chuyển đổi phương pháp từ HPLC sang UPLC Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Bước 2: áp dụng 1 phương pháp chuyển đổi UPLC để định lượng tạp chất Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

So sánh 2 phương pháp HPLC và UPLC Một phương pháp UPLC tách hoàn toàn tất cả các tạp chất liên quan Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống Kết quả của 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

4 ml/phút (giảm 96% thể tích pha động) Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .6 phút (giảm 88%)  Tốc độ dòng: 0.Lợi điểm của việc chuyển đổi sang phương pháp UPLC  Thời gian phân tích: chỉ còn 18.

Tóm tắt về việc chuyển đổi phương pháp phân tích  Việc chuyển đổi phương pháp được thực hiện dễ dàng  Tùy thuộc vào thiết bị. chiều dài cột và cỡ hạt pha tĩnh  Hoàn toàn tuân thủ theo qui định của cơ quan quản lý về thuốc  Khi chuyển đổi phương pháp từ HPLC sang UPLC. tiết kiệm thời gian và pha động  Chuyển đổi phương pháp từ UPLC sang HPLC giúp khai thác triệt để việc sử dụng thiết bị có sẳn trong phòng thí nghiệm Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM . sử dụng hạt pha tĩnh < 2 µm sẽ làm tăng hiệu lực cột.

Sắc ký pha liên kết – Pha tĩnh ổn định pH 1 .12 Hạt silica Hạt polymer Bề mặt hạt silica được Độ bền cơ học cao Ổn định ở pH 1 -14 ghép với lớp silica hữu cơ Hiệu năng cao Độ bền cơ học kém Độ bền cơ học cao Ổn định ở pH 2 – 7 Hiệu năng thấp Hiệu năng cao Ổn định ở pH 1 – 12 Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

12 Hạt silica Hạt silica ghép với lớp silica hữu cơ Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .Sắc ký pha liên kết – Pha tĩnh ổn định pH 1 .

B (ACN) Gradient: t A B 0’ 95 5 8’ 20 80 10’ 20 80 Hypersil F = 1. Acid 3-methyl-4-nitrobenzoic. Nortriptylin.5). base và chất trung hòa Pha động không bay hơi Gemini NX XBridge NX 5 m C18 5 m C18 Kích thước cột: 150 x 4. Hexanophenon Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM . Pyridin. 2. C18 5. Phenol. UV: 254 nm Zorbax 5 m GOLD Extended-C18 1. Sulfathiazol. Alcol benzylic. Quinidin. 4.Sắc ký pha liên kết – Pha tĩnh ổn định pH 1 – 12 Phân tích hỗn hợp acid.6 mm Pha động: A (phosphat 20 mM pH 2. 7. 6. Methyl salicyladehyd. Triprolidin. 10. 9. 5 m 3.5 ml/phút. 8.

Quinidin.1% trong nước).5 ml/phút. 2.6 mm Pha động: A (acid formic 0. 9. Triprolidin. UV: 254 nm 5 m 1. 6. Sulfathiazol. Pyridin. 8. Alcol benzylic. Phenol. Hexanophenon Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM . Sắc ký pha liên kết – Pha tĩnh ổn định pH 1 . C18 3.1% trong ACN) Gradient: t A B 0’ 95 5 8’ 20 80 Zorbax 5 m Hypersil 10’ 20 80 Extended-C18 GOLD F = 1. B (acid formic 0. base và chất trung hòa Pha động bay hơi Gemini NX XBridge NX 5 m C18 5 m C18 Kích thước cột: 150 x 4. 4. Methyl salicyladehyd. Nortriptylin. 5. 7. 10. Acid 3-methyl-4-nitrobenzoic.12 Phân tích hỗn hợp acid.

1% Extended-C18 GOLD trong ACN) 5 m Gradient: t A B C18 0’ 95 5 10’ 05 95 F = 1 ml/phút. B (acid formic 0.6 mm Pha động: A (acid formic 0. thân dầu ở pH thấp Gemini NX XBridge NX 5 m C18 5 m C18 Kích thước cột: 150 x 4. Promethazin Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .1% Zorbax 5 m Hypersil trong nước). Diltiazem 2. UV: 254 nm 1.Sắc ký pha liên kết – Pha tĩnh ổn định pH 1 .12 Phân tích dược chất base.

10.6 mm Pha động: A (amoni carbonat 10 mM.12 Phân tích các chất có tính base yếu. Labetolol (cặp đồng phân dia). pH 10. 4. Bisoprolol. B (ACN) Gradient: t A B 0’ 85 15 15’ 70 30 20’ 50 50 XBridge NX 25’ 50 50 5 m C18 F = 1. 5. 2. phân cực ở pH cao Ví dụ: các thuốc chẹn beta Gemini NX 5 m C18 Kích thước cột: 150 x 4. 7. 8. Alprenalol Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM . Propranolol. Nadolol (cặp đồng phân dia).5).5 ml/phút. Metoprolol. Sotalol. Atenolol. Bisoprolol 9. UV: 230 nm 1. 3.Sắc ký pha liên kết – Pha tĩnh ổn định pH 1 . 6. Pindolol.

6 mm Pha động: A (acid formic 0. phân cực ở pH thấp Ví dụ: các thuốc kháng histamin Gemini NX 5 m C18 Kích thước cột: 150 x 4. UV: 210 nm 5 m C18 1. 5.12 Phân tích các chất có tính base yếu. 4. B (acid formic 0. 3. 6. Brompheniramin. Tripelennamin. Cloropyramin.5 ml/phút. 2.1% trong ACN) Gradient: t A B 0’ 90 10 10’ 50 50 XBridge NX F = 1.Sắc ký pha liên kết – Pha tĩnh ổn định pH 1 . Loratadin Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM . Pyrilamin. 7.1% trong nước). Clorpheniramin. Diphenhydramin.

Sắc ký pha liên kết – Pha tĩnh ổn định pH 1 .12 Hạt XTerra  Nhóm methylsiloxan thay thế nhóm -OH trên bề mặt (1/3 nhóm silanol) và bên trong chất nền silica Hạt XTerra liên kết với độ đồng đều cao  Tăng hiệu năng cột  Cải thiện tính đối xứng của pic  Ổn định ở pH 1 .12 Hạt XTerra không liên kết Cột XTerra Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .

= 20 l 1. Vinj. B (MeOH). 3. 4. 7. Epigallocatechin gallat.6 mm. 2. 5 m) Pha động: A (H2O).Sắc ký pha liên kết – Pha tĩnh ổn định pH 1 . Gallocatechin gallat. 5. Epigallocatechin. Epicatechin.45) Gradient: t’ A B C 0’ 84 15 1 10’ 84 15 1 15’ 69 30 1 45’ 69 30 1 F = 1 ml/phút. Acid gallic. 9.5 Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM . 8.12 Cột sắc ký (150 x 4. pH 2. Catechin. C (HCOOH 50 mM. Epicatechin gallat. Caffein. Catechin gallat Phân tích các catechin ở pH 2. 6. UV = 280 nm.

12 Hệ đệm sử dụng cho cột XTerra (pH 1 – 7) Chất thêm vào pKa Khoảng đệm Bay hơi hoặc Khuyến cáo sử dụng với cột X Terra hoặc hệ đệm (pH  1) không bay hơi TFA < 1.75 2.0%) Amoni acetat 4.1%) Acid acetic 4. Nồng độ đệm thấp và nhiệt độ cột thấp sẽ kéo dài tuổi thọ cột Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .20 Không bay hơi pH > 7 làm giảm đáng kể tuổi thọ cột.15 Không bay hơi Được Phosphat 2 7.15 1.76 Bay hơi Được (0.2 6.20 – 8.15 – 3.76 3.0 Bay hơi Được (0.75 – 4.Sắc ký pha liên kết – Pha tĩnh ổn định pH 1 .76 Bay hơi Được (1 – 10 mM) Amoni format 3.75 Bay hơi Được (0.0%) Acid formic 3.1 – 1.1 – 1.75 Bay hơi Được (1 – 10 mM) Phosphat 1 2.76 – 5.02 – 0.

4) điều chỉnh pH với NH4Cl hoặc CH3COOH Amoni acetat hoặc 9.3 Không bay hơi Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .3 – 12.2 – 10.4 Bay hơi Được (10 mM) Amoniac 9.3 (HCO3-) 9.2 nguồn nhiệt > 150oC) 7.8 (H2CO3) 6.3 9.Sắc ký pha liên kết – Pha tĩnh ổn định pH 1 .2 – 10. pH mặt nhiên 8.2 Không bay hơi 1-methyl-piperidin 10.2 (NH4+) 8.2 Bay hơi < 10 mM và < 30oC Amoni bicarbonat 10.3 Bay hơi Được (acetat hoặc format) Triethylamin (acetat 10.8 (không sử dụng CO32-) (pH 6 – 11.3 – 11.8 – 8.3 – 11.7 – 11.3 – 13.3 Bay hơi Được (5 – 10 mM) (giữ 9.2 – 10.3.2 8.3 Bay hơi Phosphat 3 12.7 9.7 Bay hơi Được (0.2 8.3 11.12 Hệ đệm sử dụng cho cột XTerra (pH 7 – 12) Chất thêm vào hoặc pKa Khoảng đệm Bay hơi hoặc Khuyến cáo sử dụng hệ đệm (pH  1) không bay hơi với cột X Terra 4-methyl-morpholin ~ 8.1 – 1%) hoặc format) Pyrrolidin 11.3 10.2 Bay hơi Được (1 – 10 mM) format Borat 9.

rửa giải sớm  Tồn tại cả 2 dạng ion và trung hòa: pic bất đối hoặc mở rộng  Dạng ion tham gia vào các tương tác không mong muốn (với nhóm silanol tự do. tạp kim loại): pic không đối xứng và thời gian lưu không lặp lại Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .Triển khai phương pháp sắc ký theo pH pha động Sắc ký pha đảo  Cơ chế tách chính: tương tác thân dầu giữa pha tĩnh và chất phân tích  Các chất có khả năng ion hóa: có 3 ảnh hưởng đến sự tương tác  Dạng ion phân cực hơn dạng trung hòa: ít tương tác với pha tĩnh.

2: ion pH = pKa: trung hòa và ion (1:1) pH = pKa + 2: trung hòa pH pha động – pKa chất phân tích Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .2: trung hòa pH = pKa: trung hòa và ion (1:1) % ion hóa pH = pKa + 2: ion Base yếu pH = pKa .Triển khai phương pháp sắc ký theo pH pha động Mối liên quan giữa pH pha động và trạng thái ion của chất phân tích Acid yếu pH = pKa .

F = 1. B (acid formic 0. Pha động: A (acid formic 0.1% Cột sắc ký: Gemini NX C18 (150 x 4. giữ trong 2 phút.5 ml/phút.6 mm.1% trong nước). UV: 254 nm. 5 m).5) Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM . Gradient: A/B (95:5) – A/B (5:95) trong 10 phút. Mẫu phân tích: Nicotin (pKa = 8.1% trong ACN).Triển khai phương pháp sắc ký theo pH pha động Dạng ion Dung dịch nicotin trong acid formic 0.

pH 10. Mẫu phân tích: Nicotin (pKa = 8.5 ml/phút. giữ trong 2 phút. 5 m). B (ACN).5) Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM . UV: 254 nm. Pha động: A (amoni bicarbonat 10 mM.6 mm. Gradient: A/B (95:5) – A/B (5:95) trong 10 phút. F = 1.5 Cột sắc ký: Gemini NX C18 (150 x 4.Triển khai phương pháp sắc ký theo pH pha động Dạng trung hòa Dung dịch nicotin trong amoni bicarbonat pH 10.5).

Triển khai phương pháp sắc ký theo pH pha động Ảnh hưởng của pH pha động lên hình dạng pic và thời gian lưu của 1 acid yếu Ví dụ: naproxen (pKa 4.0 Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .5 pH 7.5 pH 4.5) OH O- O O H3CO H3CO pH 2.

0 Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .0 N N pH 9.4) H+ pH 7.4 pH 12.Triển khai phương pháp sắc ký theo pH pha động Ảnh hưởng của pH pha động lên hình dạng pic và thời gian lưu của 1 base yếu Ví dụ: amitriptylin (pKa 9.

2. Toluen Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .6 mm.1%/H2O) B (ACN) B (HCOOH 0. (5:95) trong 10’. Amitriptylin. giữ 2’ giữ 2’ A (amoni bicarbonat 10 mM A (amoni acetat 10 pH 10. acid yếu và base yếu A (đệm phosphat 20 mM. 3. Mẫu phân tích: 1. F = 1. (5:95) trong 10’. Naproxen. pH 7.8) B (ACN) B (ACN) A/B (95:5) tới A/B A/B (95:5) tới A/B (5:95) trong 10’. UV: 254 nm. 5 m). pH 4.1%/ACN) A/B (95:5) tới A/B A/B (95:5) tới A/B (5:95) trong 10’. giữ 2’ giữ 2’ Cột sắc ký: Gemini NX C18 (150 x 4.5 ml/phút.0) A (HCOOH 0.5) mM.Triển khai phương pháp sắc ký theo pH pha động Ảnh hưởng của pH pha động lên hình dạng pic và thời gian lưu của các chất trung hòa.

MacMillan Publishing. 1981 Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .Triển khai phương pháp sắc ký theo pH pha động Giá trị pKa của một số nhóm chức có khả năng ion hóa* * Introduction to organic chemistry – Streitwieser and Healthcock.

(pK1) 6.2 – 10.0 10.5 Có CH3COOH 4.5 Có PO43.(pK2) 10.3 9. tính chất cặp ion  Tính tương hợp với MS Đệm pKa Khoảng Tương Đệm pKa Khoảng Tương đệm (pH) hợp MS đệm (pH) hợp MS TFA <2 < 2.8 Có Ethanolamin 9.0 – 12.0 Có Triethanolamin 7.3 – 13.1 – 3.4 – 7. Phenomenex.Triển khai phương pháp sắc ký theo pH pha động Lựa chọn hệ đệm phù hợp cho pha động*  pKa gần pH mong muốn của pha động.5 – 10.8 Có PO43. JJ Kirkland and JL Glajch.2 Có HCOOH 3. L. Snyder.2 6.3 * Practical HPLC Method Development.8 6.5 – 11.3 11.9 7.  TFA có thể được sử dụng ở nồng độ thấp trong LC/MS nhưng có thể ảnh hưởng đến độ nhạy của MS Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM .5 Có Diethanolamin 8. Wiley Interscience.8 – 4.5 8. TP Bradshaw.8 – 8.8 Có CO32.3 Có CO32.(pK3) 12.4 Có Diethylamin 10.5 9.9 – 9.1 1.1 Amoniac 9. 1998.8 2.9 Có H3PO4 (pK1) 2.2 8.(pK2) 7.2 – 8. nồng độ ion.4 5.8 – 5.8 3.2 Triethylamin 11. 1997 and Introduction to Protein and Peptide HPLC.R.3 – 11.