You are on page 1of 15

UNIVERSITATEA DE VEST TIMIȘOARA

FACULTATEA DE CHIMIE

Aparatura cromatografiei de lichide

Student:
Alexandru Maria

Ianuarie 2018

Termenul de cromatografie de lichide este utilizat pentru a denumi o gama extinsa


de sisteme cromatografice care au în comun faptul ca utilizeaza o faza mobila lichida.
Comparativ cu cromatografia de gaze, cea de lichide are avantajul ca permite si
analizarea probelor greu volatile sau instabile termic, iar faptul ca si faza mobila participa
la separare ofera posibilitati suplimentare pentru realizarea unor separari eficiente.
Cromatografia de lichide clasica a fost caracterizata de utilizarea unor coloane
cu diametre mari, umplute cu particule de faza stationara de o granulatie fina si prin care
faza mobila trecea sub influenta fortei gravitationale. Aceste sisteme, care se mai folosesc
azi în separarile cromatografice lichid-solid, au permis realizarea separarii unor
amestecuri complexe de substante în conditii foarte bune, însa viteza de separare este
mica iar analiza suplimentara a compusilor separati prin metode spectroscopice este mai
dificila. Aparitia cromatografiei de lichide de înalta performanta (HPLC) a permis
eliminarea acestor deficiente si chiar impunerea cromatografiei de lichide ca o metoda
mai performanta de analiza decât cromatografia de gaze. Principalele avantaje ale
cromatografiei de lichide de înalta performanta sunt:
- Capacitate de separare ridicata
- Viteza ridicata a separarii
- Posibilitatea monitorizarii continue a efluentului coloanei
- Realizarea unor analize repetate si reproductibile utilizând aceeasi coloana
- Automatizarea procedurii analitice si a prelucrarii datelor.
Primul cromatograf de lichide modern a fost construit de Csaba Horváth la
Universitatea din Yale în 1964 si a tehnica fost denumita cromatografie de lichide de
înalta presiune (HPLC). În continuare, termenul care s-a impus a fost cel de
cromatografie de lichide de înalta performanta. Prima separare realizata de grupul lui
Horváth a fost cea a unor componente ale acizilor nucleici. Dezvoltarea extraordinara a
acestei tehnici în ultimii zeci de ani se datoreste în mare masura faptului ca a permis
analiza unor compusi care puteau fi separati foarte greu pe alte cai, de exemplu a
biomoleculelor.
Principalele tipuri de cromatografie de lichide sunt:
- cromatografia de adsorbtie lichid-solid (LSC)
- cromatografia de repartitie lichid-lichid (LLC)
- cromatografia ionica (IC)
- cromatografia prin excluziune (SEC)

 Tehnica cromatografiei lichid-solid pe coloana


Cromatografia de adsorbtie este potrivita mai ales pentru separarea compusilor cu mase
moleculare medii, polari si nepolari dar fara sarcini electrice.
Cromatografia de lichid-solid se poate realiza prin trei tehnici posibile:
- cromatografie lichid-solid clasica, pe coloana;
- cromatografie în strat subtire;
- cromatografie lichid-solid de înalta performanta.
Dintre acestea, cromatografia lichid-solid pe coloana se utilizeaza practic numai în
scopuri preparative, în timp ce cea de înalta performanta se utilizeaza mai ales în scop
analitic, dar si preparativ.
Pentru a testa posibilitatea separarii unui amestec de compusi prin cromatografie lichid-
solid este indicata cromatografia în strat subtire. În acest scop se foloseste adsorbentul
care se preconizeaza a se utiliza în separarea LSC (alumina sau silicagel în majoritatea
cazurilor) si prin TLC se poate stabili eluentul sau sistemul de eluenti cel mai potrivit.
Pentru realizarea unei separari corespunzatoare sunt importante natura adsorbentului,
dimensiunile sale, dimensiunile coloanei si viteza de elutie.
Coloanele utilizate în LSC sunt confectionate în general din sticla, având lungimea
cuprinsa între 10-90 cm si diametrul interior între 1-5 cm. Raportul dintre lungimea si
diametrul coloanei trebuie sa fie in intervalul 10-20. Aceste coloane pot fi prevazute cu
slifuri la ambele capete, pentru a permite atasarea unei pâlnii de separare pe post de
rezervor de solvent în partea superioara, respectiv a unui vas de tip Büchner în partea
inferioara pentru colectarea fractiunilor eluate (Figura 1).
Figura 1. Coloana utilizata pentru cromatografia lichid-solid
Tehnica cromatografiei LSC pe coloana consta din trei etape principale:
- umplerea si pregatirea coloanei;
- încarcarea probei;
- elutia componentelor probei.

Figura 2. Realizarea gradientului de faza mobila


Detectarea componentelor separate în coloana se poate face prin diferite metode.
Pentru aceasta, se colecteaza în general fractiuni de volume egale, manual sau utilizând
un colector de fractiuni. Aceste fractiuni se analizeaza prin cromatografie în strat subtire,
cromatografie de gaze sau spectrofotometrie în UV, apoi fractiunile cu compozitie
identica se reunesc si se supun evaporarii pentru indepartarea solventului. Aceasta
evaporare se face în general la un evaporator rotativ de vid. Exista si posibilitatea
utilizarii unor detectoare UV-VIS automate care se conecteaza la iesirea din coloana si
permit monitorizarea componentelor eluate, cu conditia ca acestea sa absoarba în
domeniul UV sau vizibil, iar eluentul utilizat sa nu aiba absorbtie (Figura 3).
Figura 3. Detectarea si colectarea fractiunilor eluate

 Cromatografia de repartitie lichid-lichid


Cromatografia lichid-lichid (LLC) are acelasi principiu ca si extractia, adica se
bazeaza pe distributia moleculelor solutului între doua faze lichide nemiscibile, în
conformitate cu solubilitatea acestora în cele doua faze. Mediul care realizeaza separarea
consta dintr-un suport inert (silicagel, kieselguhr) pe care este depus un strat de faza
stationara lichida, iar separarea se realizeaza prin trecerea unui flux de faza mobila ce
contine proba analizata peste faza stationara. Faza stationara se poate gasi împachetata
într-o coloana sau dispusa în strat subtire pe o placa de sticla sau folie de aluminiu.
Faze stationare. Faze stationare legate chimic
Cromatografia lichid-lichid se clasifica în functie de polaritatea relativa a fazei
stationare si fazei mobile în doua categorii:
- Cromatografie lichid-lichid pe faze normale, în care faza stationara este
polara iar faza mobila nepolara;
- Cromatografie lichid-lichid pe faze inverse, în care faza stationara este
nepolara iar faza mobila polara.

 Aparatura utilizata în cromatografia lichid-lichid


Cromatografia de lichide de înalta performanta s-a dezvoltat dupa ce teoria
separarilor cromatografice a demonstrat ca pentru obtinerea unei eficiente de separare
ridicate, comparabila cu cea realizata în cromatografia de gaze, este nevoie de utilizarea
unor umpluturi cu granulatie fina, de ordinul a 5-10 μm. Pentru a avea însa viteze de
elutie corespunzatoare, în aceste situatii se impune folosirea unor presiuni ridicate la
intrarea eluentului în coloana. Pe de alta parte, folosirea unor coloane scurte a dus la
scaderea importanta a capacitatii de încarcare cu proba, ceea ce a necesitat construirea
unor detectoare de mare sensibilitate.

Figura 4. Schema unui cromatograf de lichide de înalta performanta (HPLC)


Principalele componente ale cromatografului de lichide sunt:
- sistemul de alimentare cu faza mobila
- dispozitivul pentru introducerea probei
- una sau doua pompe
- coloana
- detectorul
- sistemul de prelucrare a datelor
Sistemul de alimentare cu faza mobila
Cuprinde urmatoarele dispozitive, care pot fi asamblate în diferite configuratii:
- rezervoarele de solventi
- dispozitivul pentru degazarea solventilor;
- dispozitivul pentru realizarea gradientului de solventi.
Figura 5. Rezervor de solvent utilizat în cromatografia HPLC

Figura 6. Dispozitiv de degazare a solventilor cu vid

Dispozitivul pentru alimentarea cu solventi poate fi foarte diferit ca si


complexitate, de la un simplu rezervor de solventi în cazul elutiei izocratice pâna la un
programator de eluent pentru doi sau trei solventi.
Prin elutia cu gradient de solvent se poate realiza separarea componentelor care
nu se separa prin elutie izocratica. Este foarte eficienta mai ales daca polaritatea
componentelor analizate difera foarte mult.
Exista doua tipuri de sisteme de elutie cu gradient de solvent:
1. Sistemul cu gradient de joasa presiune
Figura 7. Formarea gradientului de solventi cu ajutorul sistemului cu
valva de proportionare

2. Sistemul cu gradient de înalta presiune, care opereaza cu câte o pompa pentru


fiecare solvent. În general, aceste pompe sunt deservite de motoare pas cu pas, iar debitul
pompei este controlat de frecventa de alimentare a motorului respectiv. Acest sistem este
mai scump decât celalat, însa reproductibilitatea rezultatelor este mai buna.
o Dispozitive pentru introducerea probei
Introducerea probelor poate fi realizata în doua moduri: prin injectie cu ajutorul
unei seringi sau prin folosirea unei valve (robinet) de injectie cu mai multe canale.
Injectia cu seringi se aplica mult mai putin decât în cromatografia de gaze pentru ca ea
necesita seringi rezistente la presiune ridicata si un septum construit dintr-un material
care sa nu permita extragerea unor compusi de catre faza mobila, care sa dea nastere unor
picuri-fantoma.
Valvele de injectie permit introducerea reproductibila a probelor în coloanele
cromatografice aflate sub presiune, fara întreruperea curgerii fazei mobile. Proba este
incarcata la presiune atmosferica într-o bucla exterioara a valvei de injectie si este apoi
introdusa în faza mobila printr-o simpla rotire a valvei. Volumul de proba introdusa
variaza între 2μl si mai mult de 100 μl si poate fi modificat prin schimbarea buclei de
injectie sau folosind valve speciale cu volum variabil de proba. Pentru analize în serie se
recomanda folosirea unor dispozitive de introducere automata a probelor.

Figura 8. Dispozitiv pentru introducerea probei cu bucla de proba cu volum determinat


 Coloana cromatografica

La ora actuala exista un mare numar de pompe care pot fi utilizate în


cromatografia de lichide, dintre care unele sunt destinate numai unor aplicatii specifice.
Aceste pompe sunt de doua tipuri:
- pompe pneumatice, care sunt pompe cu presiune constanta;
- pompe mecanice, care sunt pompe cu debit constant.
Cel mai simplu, mai ieftin si drept urmare mai folosit tip de pompa este pompa cu
un singur piston (cu miscare alternativa - "reciprocating"). Aceasta a fost prima pompa de
presiune înalta folosita pentru coloane cu particule de dimensiuni mici. Schema acestei
pompe este prezentata în Figura 7.

Figura 9. Pompa de înalta presiune cu un singur piston

Aceasta pompa consta dintr-un piston confectionat din safir, în mod uzual având
diametru de 3-4 mm si lungime de aproximativ 4 cm care se gaseste într-un cilindru din
otel inoxidabil. Miscarea pistonului este comandata de un rotor excentric care are un
profil special ce permite ca miscarea de refulare sa fie liniara si uniforma iar cea de
aspiratie neliniara si rapida. Întoarcerea pistonului pentru cursa de aspiratie este
determinata de un arc de întoarcere. Intrarea si iesirea solventului din pompa sunt reglate
cu ajutorul a doua robinete cu o singura cale, care nu permit deplasarea sa decât într-o
singura directie. Volumul de solvent pompat la o cursa a pistonului este în mod uzual în
jur de 250 μl, dar poate fi redus pâna la 2-5 μl daca se utilizeaza coloane înguste.
Exista doua variante de asemenea pompe lipsite de pulsatii. Prima este pompa cu
doua capete si dublu efect, care a fost realizata prima oara de firma Waters si consta în
utilizarea a doua pompe cuplate astfel încât atunci când una este în faza de umplere
cealalta sa fie în faza de refulare (Figura 4.18). Acest lucru este asigurat prin proiectarea
corespunzatoare a rotorului excentric, care comanda miscarea ambelor pistoane.
Figura 10. Reprezentarea schematica a unei pompe cu dublu efect si doua capete
1- piston; 2- rotor excentric; 3- arc; 4- corpul (cilindrul) pompei.
Exista si un alt tip de pompa cu piston care se foloseste în cromatografia de
lichide, pompa cu membrana. În acest caz, pistonul nu mai este în contact direct cu faza
mobila ci doar cu un fluid numit fluid de actionare (driving fluid)

Figura 11. Pompa cu diafragma

Utilizarea pompelor trebuie facuta cu multa atentie, nefiind voie ca ele sa


functioneze în gol, fara solvent. Utilizarea ca solventi a acizilor clorhidric si bromhidric
trebuie evitata deoarece acestia corodeaza chair si otelurile inoxidabile. De asemenea,
daca se folosesc ca faze mobile solutii tampon, în special cele care contin cloruri, acestea
nu trebuie sa ramâna în pompa dupa terminarea analizei, deoarece pot cauza coroziune.
 Detectoare utilizate în cromatografia de lichide
Clasificarea detectoarelor se poate face în doua categorii:
- Detectoare care masoara modificarea unei proprietati fizice a efluentului
coloanei.
- Detectoare care masoara modificarea unei proprietati a solutului.
La ora actuala exista un mare numar de detectoare folosite în cromatografia de
lichide. Cele mai importante, împreuna cu caracteristicile lor, sunt prezentate în tabelul 1.

Tabelul 1. Principalele detectoare folosite în cromatografia de lichide


Denumirea Limita de detectie Elutie cu Caracteristici
detectorului (μg/ml) gradient
-4
Spectrofotometric 10 DA Selectiv, versatil
UV-VIS
Fluorescenta 10-5 DA Selectiv, aplicabil la un
numar limitat de
compusi
Chemiluminiscenta 2 x 10-7 DA Selectiv, aplicabil la un
numar redus de
compusi
Flourescenta indusa Scazuta DA Selectiv, aplicabil la un
prin laser numar limitat de
compusi
FT-IR 1 DA Selectiv, versatil
Conductivitate 10-2 DA/NU Aplicabil pentru ioni si
specii ionizabile
Amperometric 10-5 NU Selectiv, aplicabil
pentru compusi cu
caracter oxidant sau
reducator
Indice de refractie 10-2 NU Detector universal
Spectrometru de masa 10-5 DA Detector universal
Activitate optica 10-4 NU Aplicabil pentru
compusi chirali
ICP-MS 2,5 x 10-3 DA Aplicabil pentru metale
(ICP = inductive
coupled plasma)

Detectorul spectrofotometric în UV-VIS


Se bazeaza pe masurarea transmitantei celulei de masura atunci când aceasta este
strabatuta de eluentul care contine componentele separate în coloana cromatografica.
Conditia necesara este ca aceste componente sa aiba absorbtie suficient de mare în
domeniul spectral în care functioneaza detectorul, iar eluentul sa fie transparent în
domeniul respectiv. Detectoarele spectrofotometrice în UV-VIS se pot utiliza pentru
analiza compusilor aromatici si a celor care poseda legaturi p conjugate: olefine, compusi
carbonilici, dervati azoici, nitroderivati, dar si a proteinelor, enzimelor, acizilor nucleici si
steroizilor.
Exista trei tipuri de detectoare în UV-VIS:
- Detectorul cu lungime de unda fixa
- Detectorul cu lungime de unda variabila
- Detectorul cu sir de diode.
Detectorul cu lungime de unda fixa poate fi realizat în varianta cu un singur
fascicul sau cu doua fascicule. Detectorul cu doua fascicule este prezentat schematic în
Figura 4.20.

Figura 12. Schema detectorului UV-VIS cu dublu fascicul


Lumina provenita de la o sursa de radiatii (în general o lampa de mercur) este
focalizata cu ajutorul unui sistem de lentile pe cele doua celule, celula de masura si celule
de referinta, apoi ajunge pe doua celule fotolelectrice. Semnalul acestor fotocelule este
modificat electronic si apoi reprezinta semnalul de intrare pentru sistemul de achizitii de
date al unui calculator sau integrator. Volumul celulei trebuie sa fie cât mai mic cu
putinta pentru a reduce dispersia picurilor si a asigura o separare corespunzatoare.
Coloanele moderne sunt capabile sa reduca volumul în care elueaza un pic la câtiva μl si
daca volumul celulei este prea mare în celula va intra mai mult decât un pic, ceea ce va
face imposibila rezolutia picurilor respective. Volumul celulei de masura la un detector
modern nu are voie sa fie mai mare decât 5 μl si este recomandat sa fie mai putin de 2 μl.
Deoarece absorbanta este proportionala cu lungimea celulei, rezulta ca pentru a avea o
celula cu sensibilitate mare ar fi indicata marirea lungimii acesteia. Cresterea lungimii
celulei este însa limitata de necesitatea ca volumul celulei sa fie cât mai mic
Detectorul cu lungime de unda variabila utilizeaza drept sursa o lampa care emite
o radiatie pe un spectru larg de lungimi de unda (de exemplu o lampa de deuteriu) si prin
utilizarea unui monocromator se poate selecta o radiatie cu o anumita lungime de unda
dorita, în intervalul 190-350 nm.
Detectorul cu sir de diode utilizeaza o lampa de deuteriu sau de xenon care emite
pe tot domeniul spectrului de UV. Lumina acestei lampi este focalizata cu ajutorul unui
sistem de lentile prin celula de masura si apoi ajunge pe o retea de difractie . Lumina
dispersata de aceasta retea cade pe un sir de diode. Fiecare dioda masoara câte o banda
îngusta a spectrului (aproximativ 2 nm), iar masuratoarea are loc într-un timp extrem de
scurt (mai putin de 10 milisecunde).

Figura . 13 Schema detectorului UV-VIS cu sir de diode

Detectorul cu fluorescenta
Este probabil cel mai sensibil detector folosit in cromatografia de lichide,
cantitatea minima detectabila fiind de pâna la 100 de ori mai mica decât în cazul
detectoarelor UV-VIS. El poate detecta compusii care prezinta fluorescenta sau pe aceia
care pot fi transformati în compusi flourescenti.

Figura 14. Detectorul cu fluorescenta


Detectorul refractometric diferential
Este un detector universal, cu buna stabilitate dar mai putin sensibil, care masoara
variatia indicelui de refractie în prezenta componentelor separate în coloana
cromatografica.
Exista doua tipuri de detectoare refractometrice: cu deflectie si cu reflexie sub unghi
limita (de tip Fresnel).

Figura 15 Detectorul refractometric diferential


Raza de lumina incidenta, provenita de la un bec cu incandescenta, în general o
lampa cu filament de wolfram, trece printr-o lentila de focalizare si este dirijata pe celula
detectorului. La trecerea din celula de referinta în cea de masura, raza va fi deviata cu un
unghi proportional cu diferenta dintre indicii de refractie ai lichidelor care se gasesc în
cele doua celule. Raza reflectata de oglinda trece din nou prin cele doua celule, dupa care
este focalizata de o alta lentila pe o celula fotoelectrica. Când raza de lumina îsi schimba
pozitia pe celula, semnalul pe care acesta îl emite se va modifica, iar diferenta fata de
semnalul de baza este amplificata si constituie de fapt raspunsul detectorului, fiind
proportionala cu concentratia componentei în celula refractometrului.

 Cromatografia ionica
Cromatografia ionica (IC) reprezinta de fapt versiunea de înalta performanta a
cromatografiei de schimb ionic clasice. Poate fi realizata atât utilizând echipamente
HPLC uzuale cât si cromatografe construite special pentru aceasta tehnica. Se pot separa
atât cationi cât si anioni, folosind rasini schimbatoare de ioni corespunzatoare, însa
schimbatorii coventionali au creat probleme pentru separarile HPLC datorita vitezei mici
de difuzie prin masa de rasina si datorita compresibilitatii materialului. Aceste probleme
au fost rezolvate prin legarea rasinii pe suprafata unor particule sferice de sticla cu
diametre cuprinse între 30-50 μm, realizând o umplutura peliculara, sau prin legare de
suprafata unor microparticule rigide, realizând o umplutura de tip faza inversa. Asemenea
faze stationare pot fi folosite pentru separarea cu rezolutii ridicate atât ale unor
amestecuri continând cationi cât si a celor care contin anioni. Eluarea se face cu o faza
mobila tamponata si cu tarie ionica crescatoare.

 Cromatografia prin excluziune


Cromatografia prin excluziune (SEC) se bazeaza pe separarea moleculelor de solut
în conformitate cu marimea lor. Tehnica separarii compusilor solubili în apa si care are
loc în solutii apoase este denumita cromatografie prin gel-filtrare si este utilizata de
exemplu pentru purificarea proteinelor. Separarile care au loc în solutii neapoase sunt
cunoscute sub numele de cromatografie de permeatie prin gel. În ambele cazuri
mecanismul separarii este identic si se bazeaza doar pe marimea relativa a porilor fazei
stationare comparativ cu marimea moleculelor de solut, neavând loc interactiuni între
solut si faza stationara.
Fazele stationare utilizate în acest tip de cromatografie sunt materiale porase cu
porozitate strict controlata, iar mecanismul retentiei consta în penetrarea diferita a
moleculelor de solut în interiorul particulelor de gel. Moleculele mari nu vor putea
patrunde în interiorul gelului si vor fi antrenate de faza mobila prin spatiile dintre
particulele retelei de gel. Moleculele mici vor putea patrunde în interiorul gelului, în
functie de dimensiunile lor si dimensiunile porilor si deci vor fi retinute mai puternic.
BIBLIOGRAFIE

1. Vâtca Gheorghe, Lucrari practice de analiza instrumentala, Ed. Risoprint, Cluj –


Napoca, 2002
2. D. I. Pietrzyk, C. W. Frank, Chimie analitică, Ed. Tehnică, Bucureşti, 1989.
3. Vâtca Gheorghe, Lucrari practice de analiza instrumentala, Ed. Risoprint, Cluj –
Napoca, 2002
4. H. Albu, Alina Simion, C. Simion, Aida Uzunu, Determinări fizico-chimice în
controlul calităţii alimentelor. Îndrumar de laborator, Ed. Universitatea „Politehnica”
Bucureşti, Bucureşti, 2006.
5. T. Dippong , C. Mihali, Analiza fizico-chimică a alimentelor utilizând metode
instrumentale de analiză, Editura Risoprint , Cluj Napoca , 2015