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Lezione 04 | Immunologia | 08/03/2017

Docente: S.
Sbobinatore: Dov

Nelle lezioni precedenti è stato visto come funziona l’immunità innata, quali sono le cellule dell’immunità
innata e come fanno queste cellule a riconoscere i segnali che richiedono la loro attivazione e cosa fanno
quando si attivano.

RECLUTAMENTO DEI LEUCOCITI NEI TESSUTI

Una grossa componente delle cellule dell’immunità innata risiede nel sangue e da ciò si avrà la loro maggiore
presenza nei vasi, oltre ad essere presenti in proporzioni minori in altri organi e tessuti dove verrà visto che i
neutrofili non sono presenti. Prendendo come esempio una situazione in cui viene procurata una lesione al
dito si creerà presenza di germi, e quindi infezione, nel tessuto mentre le cellule che possono riconoscerli si
troveranno nei vasi. Se la situazione rimanesse così non avverrebbero reazioni ma in una situazione reattiva
avviene il processo di extravasazione leucocitaria con la quale i globuli bianchi nel vaso escono dall’endotelio
e penetrano nei tessuti dirigendosi al focolaio infettivo per riconoscere i microbi e poter intervenire.

Quando avviene la lesione le cellule residenti, cellule miste che in massima parte non sono del sistema
immunitario, riconoscono un’alterazione dell’omeostasi e iniziano a produrre le citochine che sono il
linguaggio del sistema immunitario. Si tratta di proteine che vengono rilasciate e diffondono fino ad arrivare
a contatto con l’endotelio attivandolo. Questa attivazione è messa in evidenza dalla comparsa di nuove
strutture sulla superficie dell’endotelio e vengono prodotte altre citochine che diffondono e alcune vengono
presentate alla superficie dell’endotelio stesso al quale si attaccano.
Normalmente i leucociti vengono trasportati dal torrente ematico a una velocità di circa 500 km/h, una
velocità incredibilmente elevata, e sono più grossi delle altre cellule determinando una situazione fluidica in
cui risultano al centro del vaso senza entrare in contatto con l’endotelio. A causa di ciò non sarebbero in
grado di riconoscere che è successo qualcosa salvo per la presenza di recettori sull’endotelio che danno un
segnale a queste cellule per farle rallentare [Esempio del docente: se si viaggia a 130 km/h in auostrada e si
vedono delle fiaccole a bordo della carreggiata saremo indotti a rallentare in quanto ci viene segnalato
nonostante non siamo a conoscenza del motivo delle fiaccole].
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Si tratta quindi di segnali di pericolo che fanno parte della grande famiglia delle molecole di adesione:
strutture presenti sull’endotelio e i leucociti che interagendo fra di loro fanno sì che i leucociti possano
aderire alle cellule dell’endotelio. Il processo infiammatorio è solitamente associato a una vasodilatazione e
quindi il sangue arriva in quantità maggiore ma il flusso rallenta e insieme a esso le cellule le quali possono
così entrare in contatto con l’endotelio dove trovano queste strutture con le quali iniziano a interagire.
Le prime molecole che entrano in gioco in questa interazione sono molecole con bassa affinità che
determinano un continuo attaccarsi e staccarsi della cellula generando così il fenomeno di rolling. Questo è
definito come una serie di interazioni successive che provoca rotolamento che oltre a fare rallentare ha la
funzione di far interagire le molecole sulla superficie del leucocita con le molecole presenti sulla superficie
dell’endotelio. Queste proteine caricate negativamente che aderiscono molto a proteine caricate
positivamente, parasulfati e strutture zuccherine presenti sull’endotelio, attraverso associazioni non
specifiche prendono il nome di fattori chemiotattici.
Si ha quindi riconoscimento tra recettori specifici e proteine appiccicate sull’endotelio presenti in caso di
tessuto infiammato. Il recettore una volta attivato manda dei segnali all’interno della cellula che hanno lo
scopo di riattivare la cellula che normalmente nel sangue è in fase di riposo. Questa riattivazione permette
che le proteine cambino formazione e passino da molecole di adesione a bassa affinità ad alta affinità.
Con la presenza di molecole ad alta affinità la cellula va incontro a una adesione ferma sull’endotelio e inizia
il processo di extravasazione (o diapedesi) attraverso il quale la cellula fuoriesce dal torrente ematico
passando tra giunzione dell’endotelio, che normalmente è liscio e molto chiuso, ma in questo caso risulta
infiammato e perciò contratto e ha allentato le giunzioni cellula-cellula. Questo processo è importante per la
extravasazione della cellula ma è anche uno degli elementi che portano alla formazione dell’essudato,
un’infiammazione caratterizzata da gonfiore e fuoriuscita di componenti liquide dai vasi. È stato inoltre
documentato che in una percentuale molto bassa che si aggira intro al 0.5% i leucociti possono fuoriuscire
dal torrente ematico con un processo alternativo fondendo la propria membrana con quella della cellula
endoteliale entrando da una parte e uscendo da quella a opposta con un processo chiamato transcitosi.
La cellula a questo punto passa attraverso l’endotelio e si ritrova nel tessuto dove viene guidata dalle stesse
proteine prodotte dal sito infiammatorio.

MOLECOLE DI ADESIONE ESPRESSE DAI LEUCOCITI E DALLE CELLULE ENDOTELIALI

Riassumendo le fasi a cui va incontro la cellula leucocitaria:

1. Rotolamento
2. Attivazione
3. Adesione ferma
4. Extravasazione
5. Migrazione

Si tratta di un processo continuativo di fasi sequenziali e ciò vuol dire che se viene interrotta una qualsiasi
fase tutto il processo viene interrotto.
Queste fasi sono caratterizzate da diversi tipi di interazioni tra molecole diverse.

SELECTINE
La prima famiglia di molecole di adesione responsabile del rotolamento è la famiglia delle selectine che sono
essenzialmente due proteine:

 P-selectina:
1. scoperta per la prima volta prodotta dalle piastrine
2. distribuzione  granuli delle cellule endoteliali e granuli delle piastrine
3. ligandi  glicani sialilati di tipo Lewis X, PSGL-1

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 E- selectina:
1. scoperta per la prima volta prodotta dall’endotelio
2. distribuzione: endoteli attivati da citochine
3. ligandi: TNF, IL-1

Scoperte successive hanno confermato che possono essere entrambe prodotte da un endotelio attivato.

Nel giro di pochi minuti la P-selectina viene espressa sulla membrana dell’endotelio e raggiunge un picco in
circa mezz’ora/un’ora. Questa cinetica di attivazione estremamente rapida non è compatibile con una
neosintesi proteica ciò vuol dire che la P-selectina è già presente formata nelle cellule endoteliali ed è
conservata in particolari granuli che l’endotelio ha al suo interno. Quando le cellule endoteliali si attivano
questi granuli vengono esocitati e il contenuto portato in superficie con un rapido meccanismo per
rispondere ai segnali di attivazione.
La E-selectina è più lenta, presenta infatti un picco a 4 ore, ed è frutto di neosintesi proteica in quanto viene
trascritta attivamente.

Queste proteine riconoscono sul leucocita un recettore che definisce un sistema a velcro dove ognuna è il
controrecettore dell’altra. Questi controrecettori sono zuccheri con residui di acido sialico che determinano
una struttura zuccherina chiamata Lewis X.
Sul leucocita queste glicoproteine sono espresse in modo costitutivo ovvero ogni leucocita esprime queste
strutture tuttavia normalmente non sono attive in quanto un endotelio non attivato non esprime mai la
selettina e quindi manca il controrecettore.
Esiste anche una terza selectina che prende il nome di L-selettina in quanto espressa dai leucociti e riconosce
sempre delle glicoproteine presenti sull’endotelio. Struttura molto importante anche per il reclutamento dei
linfociti T naïve nei linfonodi [verrà visto in lezioni successive] in quanto riconoscono nel linfonodo due
strutture diverse che sono GLYCAM1 e CD34.

INTEGRINE
I fattori chemiotattici sono una serie di molecole appartenenti a una famiglia piuttosto
variegata che interagiscono sempre con dei recettori che hanno una particolare
struttura che ha 7 domini della membrana come nel caso del TLR che è un pattern
recognition receptor di membrana a 7 domini transmebrana chemiotattico o anche
recettori fagocitici o recettori per peptidi fornilati.

- Chemiotassi: migrazione direzionata in un punto ben preciso. Il leucocita che lascia il vaso per andare nel
punto in cui c’è il focolaio infettivo.
- Chemiochinesi: movimento random della cellula. Fibroblasto che si muove durante il riparo di una ferita.

L’attivazione che si viene a creare determina l’attivazione delle integrine che sono la seconda famiglia
responsabile dell’adesione ferma all’endotelio in quanto sono espresse dal leucocita e trovano un
controrecettore sull’endotelio.

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Normalmente l’integrina è costituita da 2 catene α e β in
una conformazione inattiva e quando il leucocita si attiva
cambia conformazione divenendo attiva e si sposta sulla
superficie di membrana. Infatti le integrine sono
normalmente distribuite in maniera regolare su tutta laa
cellula e quando si attiva si spostano tutte nel sito di
contatto con l’endotelio e questo posizionarsi vicine è un
segnale di attivazione delle integrine.
La prima fase di attivazione delle integrine è la fase in cui si si
radunano.
Nella seconda fase c’è un vero e proprio colpo di frusta in cui
la proteina da ripiegata chiusa si libera cambiando
confermazione e interagisce con il controrecettore della famiglia ICAM.
Queste proteine sono presenti in bassissimo livello nell’endotelio non attivato e ciò determina una cinetica
più lenta e duratura di quella delle selectine.
ICAM-1 e VCAM sono i controrecettori delle integrine di tipi differenti dati dall’esistenza di più catene β e più
catene α che si possono associare in maniera molto promiscua.
Un’integrina importante da ricordare è α 4-β 1  viene chiamata anche VLA-4 (very late antigen), prodotta
da un gene espresso nelle fasi tardive di attivazione dei leucociti (forse uno dei più tardivi) e ha come
controrecettore VCAM-1.
Per le cellule dell’immunità innata sono importanti tre integrine della famiglia β 2 chiamate LFA-1, MAC-1 e
P150/95 che sono espresse dal leucocita e mediano ICAM-1 espresso dall’endotelio.
Un’altra espressa è α 4-β 7 e si tratta di una proteina cruciale per far arrivare le cellule del sistema
immunitario nei tessuti mucosali come intestino e polmoni ma verranno trattate più avanti.

In un tessuto infiammato c’è una cinetica di reclutamento molto ben ordinata che generalmente è sempre la
stessa: prima i neutrofili in pochi minuti; poi i monociti e poi le cellule T. Uno dei motivi per questo ordine è
da considerarsi proprio nel fatto che questi 3 tipi cellulari usano in maniera preferenziale molecole di
adesione che hanno cinetica diversa di espressione.

A evidenziare maggiormente il fatto che il processo di reclutamento cellulare è processo a fasi successive in
cui troviamo sempre il leucocita ed è molto importante per le difese sono le mutazioni genetiche. Un
prototipo di neutrofilo normale esprime β 2 integrine, esprime i ligandi della P-selectina e avrà recettori
chemiotattici.
Vi sono però delle mutazioni genetiche presenti nell’uomo.
Alcuni soggetti hanno un difetto di adesione leucocitaria di tipo 1 (LAD-1)  questi soggetti hanno un difetto
che fa sì che le cellule non esprimano le β 2 integrine e quindi non si può formare il dimero con la catena α.
È stata vista una variante chiamata variante di LAD-1  questi soggetti possiedono integrine β 2 ma non
funzionano e si è scoperto che c’è una alterazione in un gene che non codifica una proteina Kindlin-3, una
proteina importante nella fase di attivazione delle integrine e questa variante oggi è chiamata LAD-3 in
quanto era già stata scoperta LAD-2 con la quale i pazienti esprimono integrine funzionanti ma hanno una
mutazione in un enzima fucosiltransferasi che è adibito a montare i gruppi zuccherini, in particolare Lewis X,
sulle glicoproteine che vanno poi a legare le selectine.

Riassumendo si può affermare che le mutazioni LAD-1/3 presentano un difetto su β 2 integrine e quindi
hanno problemi nella fase di adesione ferma. LAD-2 invece non possono fare rolling ma possono aderire in
una situazione statica per esempio in vitro ma mai in una situazione fisiologica in vivo.

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Questi soggetti non riescono quindi a portare nel tessuto infiammato i leucociti per fare il loro dovere perciò
si tratta di un difetto dell’immunità innata.
Se si attivano in vitro dei neutrofili normali questi si attaccano tra di loro mentre se prendiamo dei LAD-1
nonché attivati non riescono ad aderire tra loro.
Questi difetti del sistema immunitario hanno ripercussioni più evidenti nel cavo orale dove è costantemente
presente una situazione di equilibrio tra l’immunità e la flora batterica.

RUOLO DEI FATTORI CHEMIOTATTICI


Il fattore chemiotattico possiede due ruoli che apparentemente sembrano slegati tra loro:

- attivare le integrine
- indirizzare le cellule

[Visione filmato anni ‘50 che fa vedere una goccia di sangue messa sotto il microscopio, in cui è visibile un
grosso neutrofilo al centro, alcuni globuli rossi e dei puntini più piccoli che sono spike di Escherichia Coli
aggiunti di proposito. Il neutrofilo quando migra all’inseguimento del Coli assume una conformazione
polarizzata che lo identifica in una testa detta lamellipodio e una coda detta idrolipodio. Il neutrofilo è in
grado di riconoscere il batterio perché qualsiasi cellula di qualsiasi natura rilascia microvescicole di membrana
che contengono peptidi fornilati (questo risulta un campo di ricerca attivissimo negli ultimi anni) e si tratta
del modo con cui le cellule comunicano tra loro. Ci sono diverse cose che non sappiamo, per esempio nel video
la cellula si trova davanti a una scelta tra due batteri ma non sappiamo come ne sceglie uno al posto dell’altro.
https://www.youtube.com/watch?v=JnlULOjUhSQ]

Il fattore chemiottatico quindi è qualcosa che induce il movimento direzionato per far si che le cellule siano
nel posto giusto nel momento giusto e riesce a farlo perché la cellula discrimina gradienti di concentrazione.
Questa capacità di discriminare differenze e di concentrazione minime è una dote conservata nell’evoluzione
ed è presente anche nei batteri dove la cellula migra in cerca dei nutrienti infatti la cellula migra verso la
concentrazione maggiore.

[Visione di un video in cui un neutrofilo segue la micropipetta che appoggiandosi


sul vetrino indica un picco di concentrazione chemiotattica
https://www.youtube.com/watch?v=FMG415YNEO0]

Quando un recettore chemiotattico viene attivato in quanto lega il suo ligando viene attivata una cascata di
trasmissione del segnale biochimica piuttosto complessa dove il primo step consiste nell’associarsi alle
proteine G quindi se si bloccano queste proteine G si blocca tutta la cascata di attivazione. Un altro punto
cruciale della cascata è l’enzima PI3K-γ questo enzima è il responsabile del direzionamento delle cellule e
come una sorta di bussola indica alle cellule dove andare.

FAMIGLIE FATTORI CHEMIOTATTICI

1. Origine batterica (fMLP)


2. Origine lipidica prodotte dalle cellule attivate (PAF, LTB4, S1P)  in particolare PAF è un utile fattore
di aggregazione delle integrine
3. Origine proteica:
- Cascata del complemento C5a C3a
- Citochine IL-5, M-CSF
- Chemokine

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L’attivazione della cascata del complemento genera dei frammenti di proteina chemiotattiche che
chiameremo anafilotossine e che hanno il ruolo di promuovere l’infiammazione e il richiamo di leucociti.
Questi fattori sono molto importanti perché vengono prodotti molto rapidamente per esempio i lipidi sono
prodotti nel giro di secondi in quanto si tratta di proteine già sintetizzate che devono essere solo tagliate
dalle proteasi per essere rese attive.
Ci sono altre proteine importanti ma richiedono ore perché devono essere sintetizzate e quindi sono una
seconda linea di reclutamento e tra queste sono presenti le chemokine.

CHEMOKINE
Questo nome, nato in Italia nel ‘91 a Stresa è la fusione di chemotactic-
cytokines, identifica qualcosa di unico nel nostro genoma, infatti la famiglia
delle chemokine comprende circa 50 proteine codificate da 50 geni diversi tutte
apparentemente con la stessa funzione. Si tratta di un sistema di ridondanza
molecolare unico ed è ciò che mette in evidenza l’importanza di questo sistema
che si è evoluto per far si di evitare assolutamente che per qualche ragione non
funzioni.
Il prototipo di chemokina è una proteina di circa 80 amminoacidi con 4 cisteine
che formano 2 posti disolfuro e prevedono una divisione in 4 famiglie distinte
sul motivo strutturale

CXC  sono 15; i residui di cisteina sono intervallati da un amminoacido; reclutano neutrofili e linfociti T
CC  sono 28; i residui di cisteina sono adiacenti; reclutano monociti e linfociti T
C  è 1; un solo residuo di cisteina; reclutano linfociti T
CX3C  è 1; i residui di cisteina sono intervallati da 3 amminoacidi; reclutano linfociti T

Questi motivi strutturali identificano la capacità di legare certi recettori invece che altri e ciò determina che
tessuti che esprimono chemokine diverse ricevono cellule diverse.
In alcune situazioni infatti l’ordine di intervento delle cellule immunitarie, prima citato, non viene rispettato
come per esempio nelle infezioni di protozoi, elminti o allergie durante le quali non si hanno neutrofili ma
una grossa componente di eosinofili e basofili in quanto in queste situazioni vengono prodotte determinate
chemokine specifiche per questo tipo di cellule.

Mentre le chemokine sono in totale circa una cinquantina, i recettori per esse si limitano a circa 20. Questa
incongruenza trova risposta nel fatto che una chemokina lega più di un recettore, il quale a sua volta può
legare diverse chemokine nonostante sia provato che ci sono recettori molto più specifici rispetto ad altri per
determinate chemokine.

Altro punto importante da considerare è che le chemokine, e in generale i fattori chemiotattici, sono
mediatori della risposta infiammatoria che entrano in gioco in una situazione reattiva in quanto normalmente
in fase di omeostasi non sono prodotte, ma vengono appunto prodotte in seguito ad attivazione cellulare.
Questo vale per la grande maggioranza delle chemokine ad eccezione delle chemokine costitutive che
vengono prodotte in maniera costante, in situazione normale senza bisogno di uno stimolo, nei tessuti dove
c’è un infiltrato leucocitario come un linfonodo o la milza.
Tutto ciò vale però per organismi in omeostasi non in situazione patologica, per esempio si può osservare
che qualsiasi cellula tumorale produce tante chemokine differenti in continuazione e la ragione di ciò è che
alcune di queste proteine fanno da fattore di cresciuta, o comunque ne favoriscono la proliferazione, facendo
sì che il tumore tragga vantaggio ad avere un infiltrato leucocitario.

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L’importanza delle chemokine è corroborata da una serie di lezioni che abbiamo appreso, da cui è stato
dimostrato che se si fa Knock-Out per un qualsiasi recettore per chemokina si ha sempre fenotipo in cui si
evidenzia un difetto della risposta immunitaria. Ciò vuol dire che anche se sono 50 proteine, che
apparentemente svolgono la stessa funzione, in vivo risultano situazioni in cui chemokine sono più importanti
di altre.

1. Lezione 1 da KO animals: esempio di modello di topo, alimentato con una dieta ricca di grasso, che
sviluppa in 12 settimane placche aterosclerotiche, formazione che ha un forte infiltrato di lipidi in cui
vengono reclutati monociti che si accumulano determinando il crearsi di una situazione
infiammatoria. Se si toglie selettivamente un gene per chemokina con codifica per MCP-1 (Monocyte
Chemoattractant Protein-1 CC chemokina) si osserva che la formazione della placca è
estremamente ridotta rispetto al topo normale e ciò dimostra che non tutte le chemokine sono
uguali.
2. Lezione 2 da virus (HIV): nella storia della biologia i virus fanno da protagonisti, soprattutto quelli
con grosso patrimonio genetico hanno imparato a codificare delle proteine che sono dei veri e
propri recettori per le chemokine piuttosto che fare delle chemokine. Questo vuol dire che durante
l’evoluzione i virus hanno capito che se riuscivano a interferire con il sistema di reclutamento
leucocitario operato dalle chemokine loro ne avevano vantaggio e sono riusciti a farlo in quanto
molto spesso i virus fondono il loro materiale genetico con quello della cellula indettata e così
facendo staccandosi riescono a portare via alcune parti del genoma ospite da cui hanno tratto
vantaggio evolutivo portandolo avanti. Un esempio del ruolo dei recettori per chemokine
nell’infezione si ha avuto quando è stato appreso che il 4-16% della popolazione europea è CCR5-
Δ32 omozigote, una variante allelica che determina che mancano di 32 basi che provocano un
frameshit nel gene CCR5, il principale recettore di infezione del virus dell’HIV. Ne risulta quindi che
questi soggetti sono resistenti all’infezione del virus e mentre hi è eterozigote per questa
mutazione è maggiormente resistente, chi è omozigote è tonalmente immune [dilungazione sulla
storia della scoperta di questa mutazione che si è generata del Nord Europa intorno al ‘500, ndr].

Tra i vari polimorfismi per recettori per chemokine che possono avere un impatto su varie patologie abbiamo
inoltre l’esempio di un polimorfismo di CXCR4, uno dei recettori fedeli che lega la proteina SDF-1. Questo
recettore è stato visto essere cruciale per trattenere all’interno del midollo osseo i precursori ematopoietici
e questa cosa risulta importante nell’ambito del trapianto di midollo in quanto uno dei metodi per prelevarlo
è quello di far migrare questi precursori nel sangue da cui si possono prelevare per leucoaferesi.
Generalmente per ottenere ciò vengono usati fattori di crescita che sono G-CSF e GM-CSF ma in alcuni
soggetti non funzionano e quindi viene utilizzato un antagonista recettoriale per CXCR4 per indurre la
mobilitazione periferica dei precursori emopoietici a cui viene tolto un importante blocco determinato da
questo recettore. Si è inoltre visto che un polimorfismo di questo recettore è presente anche in altri pazienti
che sono caratterizzati da infezioni cutanee e ulcere per cui oggi viene utilizzato questo antagonista
recettoriale anche per curare questi soggetti che risultano essere tanto rari da non destare interesse alle case
farmaceutiche.

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