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ÍNDICE

1. Objetivos…………………………………………………………………..……..2

2. Fundamento Teórico……………………………………………………..……..2

3. Datos y resultados………………………………………………………..….....3

4. Experiencias………………………………………………………………..……6

4.1. Experiencia Nº1: Cromatografía de capa fina ……………………….…6

4.1.1. Diagrama de flujo del proceso…………………………….…...…6

4.1.2. Observaciones…………………………………………….…..……6

4.1.3. Conclusiones……………………………………………………….7

4.2. Experiencia Nº2: Cromatografía de columna…………………….…..…8

4.2.1. Diagrama de flujo del proceso………………………….…...……8

4.2.2. Observaciones…………………………………………..….…..….8

4.2.3. Conclusiones…………………………………….……………..…..9

5. Apéndice……………………………………………………………………...….9

6. Bibliografía…………………………………………………………………..….12

LABORATORIO DE QUÍMICA ORGÁNICA I 1


TÉCNICAS DE SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA

1. OBJETIVO:
 Conocer las diferentes técnicas por cromatografía en diferentes
solventes.
 Aprender sobre las técnicas de separación de pigmentos naturales.

2. FUNDAMENTO TEÓRICO:

CROMATOGRAFÍA:

Es una de las principales técnicas para la separación de especies químicas


relacionadas en una mezcla. Está basado en la distribución de los componentes
de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil.
En todas las separaciones cromatográficas la muestra se disuelve en una fase
móvil, que puede ser un gas un líquido o un fluido supercrítico. Esta fase móvil
se hace pasar a través de una fase estacionaria inmiscible, la cual se mantienen
fija en una columna o sobre una superficie sólida.
Las fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se
distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos
componentes que son retenidos con más fuerza por la fase estacionaria se
mueven lentamente con el flujo; por el contrario los componentes que unen
débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia
de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas
discriminadas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.
La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen
mutuamente:
- Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que
puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis).
- Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En
este caso, las cantidades de material empleadas suelen ser muy pequeñas.

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3. DATOS Y RESULTADOS:

 Datos registrados

Cromatografía de Capa Fina

Producto obtenido Lab. Pigmento color verde (clorofila +


N°3 carotenoides)

Silica + Agua Color blanco lechoso (papilla)

Tiempo para la
70 minutos
activación de la placa

Altura desde la base para


la siembra de pigmento 1 cm
en la placa
 Eter de Petroleo
 Acetona
Solventes  Eter de Petroleo + Acetona
3:1

Altura de la fase móvil


0.5 cm
en el vaso de 250 mL

Cromatografía de Columna

Producto obtenido Lab. N°3 1 mL Pigmento color verde (clorofila


+ carotenoides)

1er solvente Éter de Petróleo

1er vertido de éter de petróleo Aprox. Por encima del corcho

Hasta altura aprox. 10-12 cm, a 2-3


2do vertido de éter de petróleo cm de la boca de la columna de
cromatografía

Sustancia sólida en la columna Alúmina

2da solvente Mezcla Éter de Petróleo-Acetona 3:1

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 Resultados obtenidos

Cromatografía de Capa Fina

DISTANCIA DISTANCIA DISTANCIA


SOLVENTES
CLOROFILA (B) CAROTENO (A) SOLVENTE
ETER DE 4.9 cm
0.7 cm 1.2 cm
PETROLEO
ACETONA - - -

MEZCLA
ETER DE
PETROLEO- 3.5 cm 4.9 cm 5.3 cm
ACETONA
3:1

Cromatografía de Columna

SOLVENTES PIGMENTOS SEPARADOS


ETER DE PETROLEO CAROTENO (AMARILLO)
MEZCLA ETER DE PETROLEO-
CLOROFILA (VERDE)
ACETONA 3:1

 Propiedades Fisicoquímicas y Peligrosidad de los reactivos:

SUSTANCIAS PROPIEDADES
ACETONA Propiedades Fisicoquímicas
Es un líquido transparente incoloro,
con olor característico, de Pto. de
ebullición: 56.5 °C, Pto. de fusión: -
94°C. Miscible en agua, alcohol y éter.
Peligrosidad:
Fácilmente inflamable. Irrita los ojos.
La exposición repetida puede
provocar sequedad o formación de
grietas en la piel. La inhalación de
vapores puede provocar somnolencia
y vértigo, contribuye a la
contaminación del suelo, la
exposición a la luz y al aire favorece
la formación de peróxidos. Los gases

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/ vapores pueden formar mezclas
explosivas con el aire.

ETER DE PETROLEO Propiedades Fisicoquímicas


Llamado bencina de petróleo o nafta,
es un líquido incoloro apolar que se
utiliza para análisis de química
orgánica fina. Es una mezcla de
hidrocarburos compuesta por n-
hexano y 3-metilpentano. Es
inmiscible en agua. Punto inicial de
ebullición e intervalo de ebullición: 60
- 80 °C Punto de inflamación: - 18 °C.
Peligrosidad
Provoca vapores muy inflamables,
irritación cutánea, perjudica la
fertilidad si su uso no es con
seguridad. Tóxico para el medio
ambiente con efectos nocivos
severos, además de ser cancerígeno.
ALUMINA Propiedades
Es un sólido polvo cristalino de color
blanco y de cierto olor característico,
insoluble en agua y otros compuestos
polares, además de un pH 9-10 y
densidad a 20°C: 3.6-3.9 g/cm3. Se
usa para análisis en cromatografía
como fase adsorbente.
Peligrosidad
Puede producir irritación leve si hay
inhalación y/o ingestión. Al añadir
agua puede producir calentamiento
modificando su estabilidad

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4. EXPERIENCIAS:

4.1. EXPERIENCIA Nº1: CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA:

4.1.1. DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO:

4.1.2. OBSERVACIONES:

 Se prepara la papilla que consiste en una mezcla de sílica con


agua, se observa que esta “papilla” es color blanco y de
consistencia viscoso lechoso.
 Las 3 placas una vez bien lavadas y secadas, se les añadió la
“papilla” y se observó que existía uniformidad sin rastros de grumo

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o que se rompa la consistencia de la papilla, al cabo de un rato se
observó un cierto brillo en las placas.
 Las placas son llevadas a la estufa durante 70 minutos
aproximadamente, se observó que las placas se encontraban
activadas, listas para el desarrollo de la cromatografía.
 Se observó que durante la siembra en las placas, mediante el uso
del capilar, a la 1era gota (punto) el tono del pigmento no era
notorio, por lo que se añadió 2 gotas (puntos) más en el mismo
punto.
 En el desarrollo del 1er cromatograma, se usó como solvente el
éter de petróleo y se observó un rastro verde largo que pertenece
a la clorofila, mientras que terminado ese trayecto, luego se
observó una mancha amarilla que pertenecía al caroteno.
 En el desarrollo del 2do cromatograma, se usó como solvente la
acetona y se observó un rastro verde largo de bandas que
pertenece a la clorofila, mientras que no se observa mancha que
corresponda al caroteno.
 En el desarrollo del 3er cromatograma, se usó como solvente la
mezcla éter de petróleo-acetona 3:1 y se observó un rastro verde
de la clorofila más pequeño en un primer instante comparado con
el uso de éter de petróleo puro, además de una mancha amarilla
que corresponde al caroteno.

4.1.3. CONCLUSIONES:

 Se introdujo el papel de filtro rodeando las paredes del vaso de


cromatografía con la fase móvil (éter de petróleo, acetona, mezcla
de éter y acetona) para saturar la atmosfera del vaso con el vapor
del disolvente y prevenir la evaporación del mismo sobre la placa
cromatografía.
 Según los resultados de la constante Rf (factor de retención) la
polaridad de la mezcla éter y acetona es la correcta, mientras el
éter solo es poco polar y la acetona demasiado polar.

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4.2. EXPERIENCIA Nº2: CROMATOGRAFÍA DE COLUMNA:

4.2.1. DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCESO:

4.2.2. OBSERVACIONES:

 Durante la instalación de la columna de cromatografía, se colocó


un pedazo de algodón en la parte inferior, luego se observa que
no existe aire a la altura de la manguera luego de añadir el éter de
petróleo, además se realizó 2 vertidos de petróleo, para realizar
con cuidado el escape de aire en la manguera con la llave.
 Se observó que la alúmina es un polvo cristalino blanco, y que al
añadirlo (después de añadido el éter de petróleo a la columna) en
la columna, se observa que éste cae de manera casi uniforme, sin
embargo se fue añadiendo con cuidado para mantener la
uniformidad. Luego se observó unas minúsculas burbujas en el
sólido al inferior, sin embargo se realizó golpes suaves y se
uniformizo por completo la alúmina en el éter de petróleo.

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 Se observa que al añadir posteriormente un poco de arena no
existe cambio visible alguno en el sistema. Esta arena debe estar
siempre humedecida con el solvente a usar.
 Cuando se añade la muestra (pigmento verde) al sistema, se
observa que la filtración ocurre de manera lenta, sin embargo se
controla mediante la línea de vacío. Al rato se deposita solución
amarilla pálida al tubo de ensayo que se encuentra dentro del
kitasato. El solvente aquí fue el éter de petróleo.
 Después de 2 ensayos seguidos con el solvente éter de petróleo,
se observa que la solución obtenida en el tubo de ensayo es de
pigmento amarillo fuerte, que corresponde a los carotenos.
 Al añadir la mezcla éter de petróleo-acetona al sistema, la
filtración da una pigmentación verde en el tubo de ensayo, este
pigmento verde corresponde al de la clorofila.

4.2.3. CONCLUSIONES:

 En la cromatografía de columna, no se debe secar la fase


estacionaria (alúmina) porque forma burbujas y canales
provocando una separación muy pobre.
 Se usó un solvente polar para extraer el caroteno y se cambió por
otro solvente apolar para extraer la clorofila, de lo contrario la
extracción de la clorofila hubiese tomado mucho tiempo.

5. APÉNDICE:

5.1. Cálculos de Rf CAROTENO:

Distancia recorrida por el caroteno


Rf =
Distancia recorrida por el eluyente

DISTANCIA X DISTANCIA Y
SOLVENTE (Distancia (Distancia
Rf
(ELUYENTE) recorrida por recorrida por
el Caroteno) el efluente)
Éter de Petróleo 1.2 cm 4.9 cm 0.245

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Mezcla Éter de
Petróleo- 4.9 cm 5.3 cm 0.925
Acetona 3:1

5.2. Cromatografía en Papel:

Es una técnica barata y lenta en cromatografía además de no ser aplicable


en todas las formas. Es una cromatografía de partición y adsorción en
combinación, donde la fase estacionaria es el agua líquida que se absorbe
en el papel, y la fase móvil es un solvente, en este caso orgánico. Para evitar
que el agua evapore, se cuelga el papel dentro de una cámara de tal forma
que la mancha (siembra) pueda ser irrigada con la fase móvil sea hacia
arriba (efecto de capilaridad) o hacia abajo (efecto de gravedad). Cuando la
fase móvil satura el papel en una cierta distancia logrando la separación
cromatografía, se retira de la cámara y se añade agentes reveladores
durante el desarrollo del cromatograma. El desarrollo de esta técnica es
similar al de la cromatografía en capa fina.

5.3. Cromatografía liquida en alta resolución:

Hay cuatro tipos básicos de cromatografía en los que la fase móvil es un


líquido:
 Cromatografía de reparto, para especies poco polares pero no iónicas de
masa molecular < 104 g/mol.
 Cromatografía de adsorción o cromatografía líquido-sólido, para
especies no polares, isómeros estructurales y grupos de compuestos de
masa molecular < 104 g/mol.
 Cromatografía de intercambio iónico, para especies iónicas de masa
molecular < 104 g/mol.
 Cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía en geles, para
solutos con masa molecular >104 g/mol.
Teniendo estos tipos básicos de cromatografía, se realizaron los primeros
ensayos de cromatografía en columna, donde el desarrollo se realizaba
hasta en horas y teniendo en cuenta la velocidad en la que el soluto se efluye
y la eficacia que daba la separación de los componentes de una muestra
tanto de manera cualitativa como de manera cuantitativa, resultaba de

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manera lenta el desarrollo, es por ello que se procede a una mejora de la
cromatografía líquida. La cromatografía líquida de alta eficacia o HPLC es el
método más sofisticado y moderno de la cromatografía líquida, que utiliza
partículas de fase estacionaria para el interior de la columna con diámetros
muy pequeños para aumentar la eficiencia, en torno a 3-10 µm. Así, se ha
conseguido reducir el tamaño de la columna a 10-30 cm de largo y 4-10 mm
de diámetro en la HPLC, y el tiempo necesario para la separación, de
minutos a 1h.

5.4. Aplicaciones Industriales de Cromatografía HPLC:

El uso de la técnica de la cromatografía HPLC permite buenas


separaciones e identificaciones de sustancias en un tiempo reducido y
eficaz. Generalmente es usado en la industria de alimentos como por
ejemplo:

 Detección y cuantificación de sacarina, benzoatos, cafeína y


aspartame en refrescos.
 Detección de ciclomato en jugos de fruta.
 Separación de ésteres de ácidos grasos por fase inversa y con
argentización de columnas (Silicato de Al con Ag).
 Separación de Triglicéridos por la longitud de la cadena y el
grado de insaturación por fase inversa y detector de dispersión
luminosa, para el estudio de aceites y grasas adulteradas.
 Determinación del contenido de Vit A y sus precursores (α y β
caroteno) en margarina y aceites de hígado por fase inversa.
 Determinación del contenido en Vit D en leche en polvo y
cereales por fase normal.

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Sin embargo también se usa la técnica de cromatografía en
aplicaciones como el análisis de la sangre, en medicina farmacéutica y
petróleo.

6. BIBLIOGRAFÍA:

 Tierras industriales Herran y Diez S.A. 27-09-2015.


http://www.tierrasindustrialeshyd.com/pdf/msdsaluminaspsm.pdf
 La cromatografía y sus aplicaciones. 27-09-2015.
http://www.academia.edu/4376306/La_cromatografia_y_sus_aplicacion
es_Bibliograf%C3%ADa_de_consulta_L%C3%ADquido_Gravedad_Rep
arto_Adsorci%C3%B3n_C._sobre_geles_Sol._Gel_poroso_L%C3%AD
quido_Gravedad_Tama%C3%B1o
 Cromatografía principios y aplicaciones. 27-09-2015.
https://es.scribd.com/doc/19050563/Cromatografia-Principios-y-
Aplicaciones#scribd

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