You are on page 1of 10

1.

2 Definisi Masalah
1.2.1 Analit bersifat non-volatil atau tidak mudah menguap.
Analit yang akan dianalisis yaitu ketamine, dimana ketamine bersifat non-volatil
atau tidak mudah menguap. Agar dapat dianalisis menggunakan kromatografi gas, maka
analit yang memiliki sifat non-valatil harus mengalami proses derivatisasi.

1.2.2 Sampel yang digunakan untuk menganalisis ketamine adalah berasal dari sampel
plasma dan urine.
Sampel plasma yang dapat digunakan untuk analisis ketamine berada dalam jumlah
yang sedikit. Selain itu pada sampel plasma diperlukan suatu preparasi sampel untuk
menghilangkan kandungan protein yang akan mengganggu proses analisis selanjutnya.
Ketamine mempunyai waktu paruh 2,5 jam. Sedangkan sampel urin dapat yang dapat
digunakan untuk suatu proses analisis berada dalam jumlah yang lebih banyak dari
jumlah sampel plasma dan juga tidak terdapat protein seperti pada plasma. Namun
kelemahan dari penggunaan sampel urine ini yaitu kemungkinan ketika diekskresikan ke
urine suatu obat dapat berubah menjadi metabolitnya, sehingga sulit dalam pendeteksian.
kurang dari 4% dosis ketamin dapat ditemukan dalam air seni tanpa perubahan.
Untuk memperoleh suatu senyawa atau analit yang diinginkan, maka perlu
dilakukan suatu preparasi sampel untuk memisahkan analit yang diinginkan dengan
bahan tambahan atau matriks pada sampel yang digunakan. Hal tersebut bertujuan agar
proses untuk analisis analit tersebut tidak terganggu oleh adanya bahan tambahan atau
matriks yang ada pada sampel.

1.2.3 Target nilai LOD dan LOQ yang diinginkan berdasarkan faktor-faktor yang
mempengaruhinya seperti jenis detektor dan bentuk puncak yang dihasilkan
Jenis detektor yang digunakan untuk menganalisis suatu senyawa mempengaruhi
nilai deteksi dan kuantifikasi dari senyawa tersebut. Dalam menganalisis ketamine dalam
plasma dan urin ini digunakan detektor spektrometri massa. Spektrometri massa ini
bekerja dengan molekul pengion yang akan memilih dan mengidentifikasikan ion
menurut massa sesuai dengan fragmentasi (m/z). Detektor menghitung muatan yang
terinduksi atau arus yang dihasilkan ketika ion dilewatkan atau mengenai suatu
permukaan. Sinyal dihasilkan dalam detektor selama proses scanning massa dan
menghitung ion sebagai m/z. Detektor spektrometer massa mampu memberikan informasi

kinerja pemisahan dan atau sensitivitas. dilakukan analisis ketamine dalam urin dan plasma. Selain jenis detektor. oleh karena itu diperlukan suatu derivatisasi. berat molekul. dan puncak asimetri yang memiliki nilai tailing factor (TF ≠ 1). dan jenis sampel yang dianalisis. sehingga rentang akurasi yang ditargetkan adalah %Recovery 85-115%. dimana jika nilai tailing factor lebih dari satu (TF > 1) maka akan menghasilkan bentuk kromatogram dengan puncak yang asimetris. Faktor-faktor yang mempengaruhi tercapainya rentang akurasi tersebut diantaranya adalah preparasi sampel. dan waktu retensi. sehingga diperlukan suatu proses preparasi sampel yang tepat untuk dapat menarik ketamine dari dalam sampel tersebut sehingga tidak mengganggu proses analisis selanjutnya. Dalam penelitian ini. m/z. faktor lainnya yaitu bentuk puncak yang dihasilkan juga mempengaruhi nilai LOD dan LOQ. dan jumlah sampel yang digunakan Cara menentukan akurasi menurut ICH yaitu kumpulan data dari sembilan kali penetapan kadar dengan tiga konsentrasi yang berbeda (misalnya tiga konsentrasi dengan tiga kali replikasi) data harus dilaporkan sebagai persentase perolehan kembali (%Recovery). stabilitas. proses pemisahan. Dalam penelitian ini. kelimpahan. 1. Tailing disebabkan oleh adanya interaksi antara analit dengan fase diam yang terlalu besar dan konsentrasi analit yang terlalu tinggi. Preparasi Sampel Ketamine merupakan salah satu senyawa yang memiliki sifat non-volatil. Tailing factor mempengaruhi bentuk kromatogram yang dihasilkan. proses pemisahan. yang berupa tablet dan serbuk suspensi oral.data struktur kimia senyawa yang tidak diketahui. Ada dua jenis puncak asimetris yaitu tailing dan fronting. Derivatisasi pada GC dapat didefinisikan sebagai proses kimia untuk memodifikasi senyawa dalam rangka peningkatan volatilitas. a. Pada penelitian ini dilakukan analisis terhadap kandungan lumefantrine pada sediaan Fixed-Doses Combination (FPPs).4 Target rentang akurasi yang diinginkan berdasarkan faktor-faktor yang mempengaruhi tercapainya target tersebut seperti preparasi sampel. Data yang dihasilkan berupa peak. Terdapat dua jenis bentuk puncak yang dapat dihasilkan. Proses Pemisahan . yaitu puncak simetri dengan nilai tailing factor (TF = 1). b.2.

Resolusi Resolusi (Rs) dari dua puncak berdekatan didefinisikan sebagai perbandingan jarak antara dua puncak. 2017). Jenis Sampel Dalam penelitian ini. maka diperlukan suatu proses pemisahan menggunakan pelarut yang sesuai untuk menarik analit yang diinginkan tanpa melalui proses sentrifugasi. Namun. Faktor selektivitas merupakan rasio koefisien partisi antara satu komponen dengan komponen lainnya yang dapat menentukan keterpisahan dua komponen dalam elusi (Vitha. Untuk sampel plasma. c. dikarenakan di dalam plasma masih terdapat kandungan protein. Faktor-faktor yang mempengaruhi nilai resolusi yang dihasilkan yaitu selektifitas dan jumlah lempeng. sehingga diperlukan suatu preparasi sampel yang tepat. Dalam penelitian ini. dan sebagainya.5. Presisi diperoleh menggunakan sampel yang homogen dan otentik. a.5 Target presisi yang diinginkan berdasarkan faktor-faktor yang mempengaruhi tercapainya target tersebut seperti resolusi dan waktu retensi. Resolusi merupakan parameter pemisahan pada kromatografi. presisi yang ditargetkan yaitu %RSD ≤ 2%. ammonia. Yang perlu diperhatikan dari kedua sampel tersebut adalah matriks sampel yang mungkin dapat mengganggu proses analisis selanjutnya. Proses pemisahan terhadap analit yang diinginkan terjadi di kolom pada GC. dibagi denganrata-rata lebar puncak. Resolusi yang baik yaitu ≥ 1. dimana faktor-faktor yang mempengaruhi proses pemisahan tersebut yaitu pemilihan kolom yang tepat. Faktor-faktor yang mempengaruhi tercapainya presisi yang ditargetkan adalah resolusi dan waktu retensi. dan juga jenis detektor. Selain resolusi. Sedangkan dalam sampel urin yang diperkirakan mengandung garam mineral. pemilihan fase diam dan fase gerak atau gas pembawa yang sesuai. maka diperlukan suatu proses sentrifugasi dan mengambil supernatant yang dihasilkan untuk digunakan dalam analisis selanjutnya. sampel yang digunakan yaitu sampel urin dan plasma. terdapat parameter lain yang digunakan.2. standar deviasi atau koefisien variasi dari serangkaian pengukuran. . urobilin. jika tidak mungkin untuk mendapatkan sampel yang homogen dapat diselidiki menggunakan sampel yang dibuat secara artifisial atau larutan sampel. Ketepatan prosedur analitis biasanya dinyatakan sebagai varians. yaitu faktor selektivitas. 1.

. Namun semakin tinggi suhu kolom menyebabkan pemisahan yang terjadi kurang baik dan kemungkinan tidak akan terdapat jarak antara puncak-puncak dalam kromatogram akibat waktu untuk melewati kolon terlalu cepat. Waktu Retensi Waktu retensi merupakan waktu yang diperlukan analit untuk melewati kolom menuju detektor yang dihitung dari awal sampel diinjeksikan hingga keluar dari kolom. Faktor-faktor yang mempengaruhi waktu retensi suatu analit yaitu: . Suhu kolom Suhu kolom yang tinggi dapat mempersingkat waktu retensi. maka akan memiliki waktu retensi yang relative lebih lama. Titik didih analit Analit yang memiliki titik didih yang lebih tinggi dari suhu kolom. Untuk menghasilkan pemisahan dan puncak kromatogram yang baik maka pengaturan suhu kolom sangat diperlukan.b. Maka dari itu perlu dilakukan pemisahan dengan menggunakan suhu yang berubah secara terkendali atau yang disebut dengan pemisahan suhu terprogram. begitu pula seblaiknya. .

Validasi metode dilakukan dalam analisis ketamine dalam urin dan plasma yaitu linearitas.. Ketamine merupakan senyawa yang tidak mudah menguap sehingga tidak dapat langsung dianalisis menggunakan metode kromatografi gas. Adapun tahapan pelaksanaan dalam penelitian ini dibagi menjadi beberapa tahap. Pada penelitian ini digunakan sistem Kromatografi gas dengan gas pembawa helium dan fase diam kolom silika kapiler (HP-5 MS. Analisis Ketamine dalam plasma dan urin menggunakan metode komatografi gas – spektrometri massa (GC-MS) Proses Derivatisasi dan Validasi Analisis Ketamine optimasi ekstraksi cari-cair Metode dengan GC-MS . kinerja pemisahan dan atau sensitivitas. Derivatisasi pada GC dapat didefinisikan sebagai proses kimia untuk memodifikasi senyawa dalam rangka peningkatan volatilitas. stabilitas.D. Pengembangan metode untuk analisis Ketamine yang dilakukan pada penelitian ini didasarkan pada sifat fisikokimia ketamine itu sendiri. dan batas kuantifikasi (LOQ). panjang 30 m x 0. yaitu proses pengoptimasian.1 Rancangan Metode Pada penelitian ini dilakukan analisis penetapan Ketamine dalam urin dan plasma dengan menggunakan metode Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) dengan derivatisasi menggunakan reagen sodium nitrit. batas deteksi (LOD). pada penelitian ini dilakukan proses derivatisasi menggunakan sodium nitrit. presisi. proses preparasi sampel yang meliputi proses derivatisasi dan ekstraksi cair-cair. dengan tebal lapisan 0. danproses analisis Ketamine dalam urin dan plasma dengan menggunakan GC-MS.25 mm I. proses validasi metode. Oleh karena itu.25 µm). akurasi.BAB III METODE 3. Ketamine merupakan amina sekunder dan dapat bereaksi dengan nitrit untuk menghasilkan N-nitrosamine dalam kondisi asam.

. Penangas es f. es batu 3.3. Pipet volume h.2. Pipet mikro c.3. Alat vortex e. Alat sentrifugasi d. Sampe plasma d.2 Bahan a.2 Alat dan Bahan 3. n-heksana k.3 Prosedur 3. Natrium nitrit g. karbon disulfide m. Kemudian dilakukan penambahan HCl 1 mol/L dengan rentang jumlah HCl 25-250 µL.1 Alat a. Sampel urin c. Ketamin b. n-pentana l.5 µg/mL. Gelas beker b. 1 set kromatografi gas – spektrometri massa (GC-MS) i. Optimasi Penambahan HCl Disiapkan larutan standar ketamine 0.2. Diklorometana i. etil asetat j. Botol vial 3. Metanol e.1 Proses Pengoptimasian a. Pipet ukur g. Asam klorida f. Kloroform h.

kemudian dicampur dan didiamkan selama 1 menit.5 µg/mL. kemudian ditentukan reagen ekstraksi yang cocok untuk menarik ketamine dari matriks sampel. Kemudian ditentukan jumlah natrium nitrit jenuh yang menghasilkan reaksi derivatisasi yang paling efektif dan efisien. Masing-masing reagen ditambahkan ke dalam larutan standar ketamine. Kemudian dilakukan Optimasi suhu pada 0oC (dalam icebath). kemudian ditambahkan 2 mL larutan stok standar Ketamine dan 150 µL HCl 1 mol/L pada masing-masing sampel yang telah dimasukkan ke dalam tabung gelas 10 mL dan dihomogenkan di atas penangas es. 10oC. 20oC. Optimasi reagen ekstraksi Disiapkan larutan standar ketamine 0.0 mL diklorometana sebagai . Kemudian ditentukan pada waktu berapakah hasil reaksi derivatisasi dapat berlangsung secara optimum. 30oC. diklorometana. Optimasi Penambahan NaNO2 Disiapkan larutan standar ketamine 0. Ditentukan suhu optimumnya dilihat dari kurva yang diperoleh.3. n-heksana. d. Kemudian ditentukan jumlah HCl yang menghasilkan hasil yang paling optimum. 3. etil asetat. 40oC.2 Proses Derivatisasi dan Ekstraksi Cair-cair Sampel yang digunakan adalah tiga sampel urin dan empat sampel plasma.0 mL. 50oC dan 60oC. Kemudian dilakukan optimasi reagen ekstraksi dengan menggunakan enam pelarut organik yaitu kloroform. c. dilakukan pula sekaligus pengoptimasian waktu reaksi dengan rentang 1-60 menit. Dalam proses pengoptimasian suhu.5 µg/mL. Setelah itu dilakukan ekstraksi cair-cair dengan penambahan 2. Kemudian sebanyak 200 µL natrium nitrit jenuh ditambahkan secara perlahan. n-pentana dan karbon disulfida. Disiapkan sampel urin dan plasma sebanyak 2. Kemudian dilakukan penambahan natrium nitrit jenuh pada rentang 50 sampai 300 µL. Optimasi Suhu dan waktu reaksi Disiapkan larutan standar ketamine 0.5 µg/mL. b.

lalu 2 mL diklorometan ditambahkan ke dalamnya. dan diuapkan dengan aliran nitrogen yang lambat pada suhu kamar. Sebanyak 1. lalu ditempatkan pada tabung kaca 10 mL dalam ice bath. Larutan sampel yang telah diuapkan pelarutnya dilarutkan dalam 100 µL etil asetat sebelum analisis dengan kromatografi gas (GC).5 mL lapisan organik dipindahkan dengan pipet mikro ke botol yang sesuai.3. Efek matriks dievaluasi dengan membandingkan kurva kalibrasi larutan standar dalam air destilasi dengan larutan standar dalam sampel plasma dan urin. Linearitas Dibuat larutan seri ketamine dengan konsentrasi 0.pelarutnya.04 sampai 20 µg/mL dengan cara menambahkan larutan standar ketamin ke dalam sampel urin dan plasma normal. Kemudian sampel kering dilarutkan dengan 100 µL etil asetat sebelum diinjeksikan ke dalam GC.5 mL lapisan organic dipindahkan kedalam vial dan dikeringkan menggunakan nitrogen pada suhu ruangan. kemudian untuk larutan dengan sampel plasma disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit. 1.3 Validasi Metode a. 3. Seluruh larutan campuran tersebut divortex selama 1 menit. Kemudian diaduk dan tambahkan 200 µL natrium nitrit jenuh. Akurasi . Pengujian efek matriks Pengujian efek matriks dilakukan dengan 2 mL sampel urin dan plasma ditambahkan sejumlah larutan stok standar ketamine dengan konsentrasi yang berbeda dan 150 µL HCl 11 mol/L. sedangkan untuk larutan dengan sampel urin tidak perlu sentrifugasi. c. Campuran larutan dalam plasma di vortex selama 1 menit dan disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit dan campuran larutan dalam urin dibiarkan selama 10 menit. diaduk dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian plotkan dalam bentuk kurva kalibrasi dan ditentukan nilai koefisien regresinya. b.

2. dioperasikan dalam mode dampak elektronik (EI). Dilakukan pengkondisian instrumen detektor spektrometri massa. kemudian dicatat fragmentasi yang diperoleh dan dilihat spektrum massa yang dihasilkan. 10. Akurasi diuji dengan menggunakan sampel urine dan plasma dengan 3 konsentrasi yang berbeda yaitu 0.0. serta dibandingkan dengan pustaka. Untuk detektor spektrometri massa. Presisi Presisi metode dinilai dari keterulangan dari metode diuji dengan menggunakan sampel urine dan plasma dengan 3 konsentrasi yang berbeda (0.0 µg /mL. suhu quadrupole MS sebesar 150oC dan pelarut mengalir selama 2 menit. dan 10. 3. diatur suhu awal oven 150oC selama 1 menit. Suhu jalur transfer MS diadakan pada 280 ◦C.0. Jumlah replikasi setiap level konsentrasi dan hari dibuat sebanyak 5 replikasi (n=6).2.4 Analisis Ketamine dengan GC-MS Sampel yang digunakan adalah tiga sampel urin dan empat sampel plasma. dan mode pemantauan ion (SIM) yang dipilih digunakan untuk identifikasi dan kuantifikasi KT.3. 2. Dilakukan pengkondisian instrumen kromatografi gas. Kemudian seluruh larutan sampel dilarutkan dalam 100 µL etil asetat diinjeksikan pada alat kromatografi gas.1 mL/menit. 2.0 µg /mL). kemudian suhu dinaikkan 20oC setiap 1 menit sampai mencapai suhu 250oC dan ditahan selama 5 menit. d. yang dibuat dengan metode spike blank urin dan plasma dengan ketamin standar untuk setiap konsentrasi tersebut. yang dibuat dengan metode spike blank urin dan plasma dengan ketami standar untuk setiap konsentrasi tersebut. . Gas pembawa yang digunakan adalah helium dengan kecepatan alir 0. Kemudian dianaisisis sesuai dengan metode yang dikembangkan dan direplikasi untuk penentuan presisi interday dan intraday. Setelah dilakukan pemisahan pada kromatografi gas dan pendeteksian pada detektor spektrometri massa. Split injeksi sebanyak 1 mikroliter diatur suhunya sebesar 250oC. suhu sumber ion sebesar 230oC. Electron impact (EI) menggunakan energi sebesar 70eV.