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EXTRACCIÓN DE ARN EN LEVADURAS

1. INTRODUCCION

El ARN, a diferencia del ADN, se distribuye en toda la célula. La mayoría del ARN se encuentra en el
citoplasma como ARN soluble ribosomal, pero aproximadamente el 10% se encuentra en el núcleo y un poco
cantidad se halla en las mitocondrias. Para que le ADN y ARN pueda ser analizados y estudiados por los
diferentes métodos propuestos, es necesario que previamente éstas macromoléculas sean aisladas de la estructura
celular.

Según el método de extracción, el método PLUMMER, el ARN se obtiene de un homogenizado de


células de levaduras al cual se le agregará una solución de fenol concentrada. Esta solución de fenol concentrada
rompe los enlaces de hidrógeno en la macromolécula, causando desnaturalización de la proteína. La suspensión
turbia se centrifuga y aparecen dos fases: la fase inferior de fenol contiene ADN y la superior acuosa contiene
carbohidratos y ARN. La proteína desnaturalizada se halla presente en ambas fases y puede removerse por
centrifugación.

El ARN se precipita luego con etanol. El producto obtenido no contiene ADN pero generalmente está
contaminado con polisacáridos. Se puede obtener mayor purificación tratando esta preparación conamilasa.Para
determinar la presencia de ARN extraído se puede utilizar métodos espectrofotométricos como la absorción
ultravioleta (basado en el gran poder de absorción de los ácidos nucleicos en la región UV del espectro), o
métodos químicos colorímetros (basados en la capacidad de determinados compuestos para formar complejos
carnogénicos al reaccionar con los ácidos nucleicos).La presente experiencia de laboratorio tiene como finalidad
extraer o aislar ARN de células de Saccharomyces cerevisae “levadura de pan o vino”. El reactivo de orcinol, en
presencia de cloruro férrico como catalizador, reacciona con furfural, formado por calentamiento de la pentosa
con HCLcc, para dar un color verde

2. OBJETIVOS
 Obtener una suspensión de componentes moleculares.
 Aislar ARN a partir de levadura Saccharomyces cerevisae seca.
 Evaluar el aislamiento de moleculas de ARN.

3. MATERIAL METODOS
 Material Biologico: Levadura Saccharomyces cerevisae (10g de levadura seca)
 Reactivos y soluciones: Solución concentrada de fenol Acetato de potasio al 20%Alcohol etílico comercial
Mezcla etanol:agua (3:1) Reactivo orcinol Agua destilada
 Material y equipos de laboratorio: Balanza y centrifuga Bagueta y gotero de punta fina. Vaso de
precipitados Pipetas. Tubos de ensayos Baño maría

4.PROCEDIMIENTO:
A. AISLAMIENTO DE ARN
 Suspender 10g de levadura seca activa en 40 ml de agua destilada a temperatura de 37°C e incubar por 15
min a esta temperatura
 Retira el beaker, agregar 5oml de solución concentrada de fenol (muy corrosivo) y agitar mecánicamente la
suspensión durante 30 min a T° ambiente
 Centrifugar en frio a 4000 rpm durante 10 min para romper la emulsión
 Con una pipeta de punta fina trasvasar cuidadosamente la capa superior acuosa a un tubo de ensayo y
centrifugar en frio a 4000 rpm durante 10 min más para separar la proteína desnaturalizada
 Medir el volumen de sobrenadante obtenido, trasvasar a un beaker de100 ml y agregar acetato de potasio al
20% hasta obtener una concentración final de 2% (20g/L) de la sal
 Precipitar el ARN añadiendo dos volúmenes de alcoholo etílico comercial. Lugo, colocar el sistema en
hielo y dejarlo allí por una hora (este tiempo estará en función de una franca y mayor precipitación del
ARN)
 Separar el precipitado por centrifugación en frio a 3500 rpm por 5minutos. Opcionalmente, se puede
eliminar por decantación unacantidad prudencial del volumen total antes de centrifugar
 Lavar el precipitado con 8ml de una mezcla etanol:agua (3:1),disolviendo con una bagueta y centrifugar a
3500 rpm por 5 minutos
 Lavar el precipitado con 8ml de etanol, centrifugar a 3500 rpm por 5minutos y eliminar el sobrenadante, el
precipitado es ARN

B. EVALUACION DEL AISLAMIENTO DE ARN (REACCION DEORCINOL)

Componentes (mL) y Sistema (tubos)


proceso 1 2
Agua destilada 1 1
Precipitado (ARN) Pizca -------
Reactivo orcinol 1 1
Calentar en baño de agua de ebullición por 5 a 10 min. Retirar
los tubos y enfriar.
Agua destilada 2 2
Mezclar y observar una coloración verde, la cual indica
presencia de ARN

La intensidad del color verde estará expresada que tanto se ha aislado el ARN

5. DISCUSIÓN (análisis de cada paso y cada reactivo agregado en el proceso)


6. CONCLUSIONES
7. BIBLIOGRAFÍA
8. CUESTIONARIO.
1. ¿Cuál es el efecto del fenol sobre las levaduras?
2. ¿Por qué se utiliza el acetato de potasio en la extracción del ARN?
3. ¿Cuál es el efecto del etanol en el proceso de extracción del ARN?
4. ¿Cuáles son los constituyentes del ARN?
5. ¿Por qué se emplea el reactivo de orcinol?
6. ¿Qué tipos de ARN conoces? Señale las características de cada uno de ellas.
7. ¿Todos los organismos vivos presentan ARN?.
8. ¿Cuál es el papel biológico del ARN?
9. ¿en qué se diferencia las moléculas de ARN de la ADN?
10. ¿A qué se debe la coloración verde luego de adiciona el reactivo de orcinol