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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA 2018-1

Laboratorio de Química Analítica Instrumental I


Reporte de laboratorio

PRACTICA N°4
DETERMINACIÓN DE CAFEÍNA POR ESPECTROFOTOMETRÍA DERIVATIVA

Fecha:

Día Mes Año


09 Abril 2018

1. Objetivos
Determinación de cafeína en bebidas gasificadas (PEPSI) a través del método de
espectrometría UV derivativa.

2. Instrumento utilizado

Marca: Shimadzu UV 1800 Análogo Digital: X

Rango de lectura de 200 nm Hasta 400 nm

Técnica: Espectroscopia UV

Método instrumental: Espectrofotometría derivativa

Cuidados y precauciones:

 Para sostener la celda se debe hacer por el lado opaco y no por el lado traslúcido, evitando
dejar huellas o manchas que interfieran en las medidas por realizar.
 Al iniciar las medidas, es necesario hacer un background del blanco para eliminar esta
señal de las posteriores.
 Se debe enjuagar la celda de cuarzo antes de cada lectura de absorbancia a realizar,
primero con agua destilada y luego con la misma solución en análisis. Esto con el único
objetivo de garantizar que el resultado obtenido de absorbancia sea únicamente de la
muestra en análisis.
 El secado de la celda de cuarzo se debe realizar suavemente con papel óptico para evitar
rayaduras en ella.
 Para evitar que las muestras con mayor concentración de analito afecten el análisis de las
soluciones diluidas, las lecturas de absorbancias se deben realizar de menor a mayor
concentración.
 El equipo debe de mantenerse cerrado mientras no sea usado, con el fin de evitar
exposición solar.
.

3. Calibración analítica

a. Barrido espectral (determinación por espectrofotometría derivativa la absorbancia


de la cafeína)
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Estándar Concentración Absorbancia 2da derivada

1 2 0.0005

2 4 0.00125

3 6 0.002

4 8 0.00275

5 10 0.00325

 Concentración de la solución patrón de cafeína: 500 ppm.


 Concentración de la solución patrón diluida de cafeína: 50 ppm.
 Rango de longitud de onda 190 – 350 nm.

 Graficar la curva espectral, absorbancia versus longitud de onda (nm), identificando la


máxima absorbancia para la cafeína (anexo 1).

b. Preparación de curva de calibración


 Método de calibración: Regresión lineal
 Solución madre patrón: 500 ppm.
 Solución patrón diluido: 50 ppm

 Graficar la curva de calibración absorbancia versus mL de cafeína (anexo 2)

3. Lecturas de la muestra problema

 Muestra problema: Bebida gasificada Pepsi de 500mL.


 Interferentes: fructuosa, ácido fosfórico, ácido cítrico, sacarosa, vainilla,
aceites, pepsina y granos de nuez de cola.

N° muestra Volumen total (mL) Absorbancia de la 2da derivada

1 25 0.00125

2 25 0.001

4. Tratamiento de datos

a. Determinación de los parámetros de calidad del método:

 Determinar los siguientes datos estadísticos: Coeficiente de correlación r, la recta de


regresión de y sobre x, el límite de detección (LDD) del método aplicado, la desviación
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estándar de la regresión, del intercepto y de la pendiente, así como sus respectivos límites
de detección. (anexo 3)

Calculo de la concentración de cafeína:

Promedio de absorbancia de la muestra: 0.001125

Reemplazando en la ecuación de la recta: Absorbancia 2da derivada = - 0.000150 + 0.000350


Concentración (ppm).
⇒ Concentración de solución de la muestra = 3.643 ppm, entonces en 25 mL habrá 0.0912 mg

de cafeína

Concentración de cafeína en la muestra: 0.0912 mg / 1mL = 91 ppm.

 Determine la desviación estándar de la muestra debido a los errores por uso de la curva de
calibración. Hallar los límites de confianza de la muestra al 90, 95 y 99 % de confianza.
(anexo 4)

 Hacer un ensayo entre los resultados de sus demás compañeros y obtener un promedio
de la concentración de AAS en la aspirina. ¿Hubo algún valor discrepante? ¿Se puede
eliminar ese valor?

5. Discusión de resultados

Curva de calibración, calculada para un 𝜆 = 273 𝑛𝑚 y elaborada con los datos


obtenidos a esta longitud de onda en el espectro de la segunda derivada vs la
concentración de los estándares usados. Los cálculos están basados en la relación
lineal que existe entre la segunda derivada de la absorbancia y la concentración
de cafeína, pues según la ley de Lambert-Beer se tiene que la absorbancia está en
función a el coeficiente de extinción molar (𝜀), el ancho de celda (b) y la
concentración (C):
𝐴 = 𝜀. 𝑏. 𝑐
Al aplicar la segunda derivada sobre esta expresión se obtiene qué:

El coeficiente de extinción está en función a la longitud de onda, la cual será


𝜕2 𝜀
constante por ello, se puede decir que 𝜕𝜆2 es un término constante y característico
del sistema. De esta forma se demuestra la linealidad y relación existente entre la
2da derivada y la concentración. Elaborada la curva de calibración, se realiza una
interpolación con los valores de Absorbancia de la 2da derivada calculada para las
muestras calculando las concentraciones respectivas.
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La aplicación de la segunda derivada para los espectros fue necesaria debido al


tipo de muestra analizada, la cual es una bebida gasificada de color oscuro lo cual
dificulta la absorción de la radiación UV por el analito (presente en bajas
concentraciones). Además debido a la presencia de interferentes los cuales
también pueden absorber parte de la radiación emitida y ocasionar solapamiento
de bandas espectrales, es necesario realizar todos los cálculos basados en la curva
de calibración elaborada con los puntos de la 2da derivada espectral.

6. Conclusiones

Se determinó la concentración de cafeína en una muestra de gaseosa Pepsi obteniendo 91


ppm de cafeína, por espectrometría derivativa..

7. Cuestionario

1. Qué factores afectan al cálculo de las derivadas, en la espectroscopia derivativa.


Explique brevemente.

En todo espectro de absorción se tiene la relación Señal/ruido ligada a la sensibilidad del


método usado. Este factor influye notablemente en la obtención de una derivada de orden
n, distorsionándola a medida que aumenta la diferencia entre la longitud de onda, es decir,
para mayores intervalos de longitud de onda habrá mayor distorsión de las derivadas
calculadas disminuyendo la precisión y sensibilidad de los datos obtenidos. [1], [2]
Esto se puede observar matemáticamente de la siguiente manera, el cociente de la relación
S/N de la n-ésima derivada (RSN)n y la relación S/N normal (RSN)o aumenta a medida
que el orden de la derivada es mayor, debido a que los parámetros 𝑐𝑛 𝑦 𝛼𝑛 (factor de
atenuación de la n-ésima derivada) son directamente proporcionales al orden de la
derivada. [1]

2. Mencione 3 aplicaciones de la espectroscopia derivativa. Explique brevemente


cada una de ellas.

-Determinación cuantitativa en muestras turbias, debido a que la técnica funciona como


una especie de filtro, resolviendo las bandas traslapadas (hombros). Las disoluciones
turbias presentan habitualmente un aumento continuo de absorbancia hacia longitudes de
onda más cortas y no originan ninguna variación espectral apreciable en la primera y
segunda derivada. Al operar con espectros derivados de muestras turbias, se elimina el
efecto de la absorción de fondo debido a la turbidez.
-Medición en sistemas de dos o más componentes, a través de la espectroscopia de
derivadas se puede determinar sustancias con bandas de absorción relativamente
estrechas que estén solapadas con una banda ancha de un segundo componente,
permitiendo bajo ciertas condiciones hacer determinaciones analíticas.
-Determinación de trazas de compuestos aromáticos en hidrocarburos saturados. [1]
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3. La espectroscopia derivativa genera varias ventajas, dos de estas ventajas son
las medidas exactas de la longitud de onda del máximo y la mejor resolución de
los espectros. Explique brevemente sobre ellas.

-Mejoramiento de la resolución de un espectro de absorción debido a que reduce la


interferencia del ruido de fondo y resuelve las bandas anchas obtenidas en los espectros
UV-vis (2da derivada asociada al cambio de flexión en un punto máximo).
-Determinación precisa de la longitud de onda máxima, observada directamente en el
espectro derivado debido a que corta el eje de abcisas ya que la primera derivada de una
función anula los valores máximos y mínimos. [1]

8. Bibliografía

[1] López de Alba, P.., & López Matínez, L. (1992). Una Introducción a la Espectrometría de
Derivadas. Educación Química, 112, 11.

[2] PUCP, Departamento de Ciencias, Sección Química 179. (1991), V.

[3]Rodríguez, A. (2001). Determinación De Cafeína En Bebidas Gasificadas Oscuras Y


Determinación De Caseína En Leche; Aplicación De La Espectrofotometría De Segunda
Derivada. Revista Peruana de Química E Ingeniería Química, 4(2), 72–77.

[4] Castaño, J. L. (1991). Espectrometria Derivada en Quimica Clinica. Química Clínica, 10(5),
347–359.

[5]. J. Miller (1999). Estadistica y quimiometría para química analítica 4ta edición. Métodos de
calibración en análisis instrumental: regresión y correlación. España: Prentice Hall. 112-114.

[6]. D. Skoog, J Holler (2000). Principios de análisis instrumental quinta edición. Introducción.
México: Mc Graw Hill. 12-13.
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ANEXO 1. Graficas de los espectros de absorbancia para la cafeína (E1, E2, E3, E4 y E5) y las
muestras (M1 y M2)

Leyenda

Fecha: 09/04/18

Analista: Choquehuanca, A.

Espectrómetro:

Marca Shimadzu

Lampara Arco de Tugsteno

λ= 200-400 nm
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ANEXO 2

Gráfica de línea ajustada


Absorbancia 2da derivada = - 0.000150 + 0.000350 Concentración
0.0035
S 0.0000913
R-cuad. 99.5%
R-cuad.(ajustado) 99.3%
0.0030
Absorbancia 2da derivada

0.0025

0.0020

0.0015

0.0010

0.0005

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Concentración (ppm)

H0: no existe una relación lineal entre el volumen y la absorbancia. (β = 0)

H1: Existe una relación lineal entre el volumen y la absorbancia. (β ≠ 0)

Análisis de regresión: Absorbancia 2da derivada vs. Concentración

La ecuación de regresión es
Absorbancia 2da derivada = - 0.000150 + 0.000350 Concentración

S = 0.0000912871 R-cuad. = 99.5% R-cuad.(ajustado) = 99.3%

Análisis de Varianza

Fuente GL SC MC F P
Regresión 1 0.0000049 0.0000049 588.00 0.000
Error 3 0.0000000 0.0000000
Total 4 0.0000049

Conclusión:

Existe evidencia suficiente al nivel de significancia de 0.05 para indicar que los datos están
relacionados linealmente
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ANEXO N° 3

 COEFICIENTE DE CORRELACIÓN (r):

r = 0,9962

 LA RECTA DE REGRESIÓN DE Y SOBRE X:


y = 0,00035 x - 0,00015

 LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE RESIDUOS, DEL INTERCEPTO Y DE LA


PENDIENTE:

Sy/x = 0,000397911213 Sa = 0,000417332801 Sb = 0,00006291528698

 LÍMITES DE CONFIANZA:

 Número de puntos en la recta de regresión: n=5


 Grados de libertad: (n-2) = 3

NC 90% (t3 = 2.35) NC 95% (t3 =3.18) NC 99% (t4 = 5.84)

LC(a)= a ± t Sa 0,00015 ± 0,00098 0,00015 ± 0,00133 0,00015 ± 0,00244

LC(b)= b ± t Sb 0,00035 ± 0,00015 0,00035 ± 0,00020 0,00035 ± 0,00037

 LIMITE DE DETECCIÓN: y = yB +3 SB

 Señal del blanco: yB = Intercepto


 Desviación estándar del blanco: SB= Sy/x = 0,000398

Teniendo en cuenta las consideraciones, se obtiene que:


y = Intercepto +3 Sy/x → y – Intercepto = 3 Sy/x

Luego, usando la recta de regresión:

𝑦 − 𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜
𝑦 = 𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜 + 𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑥 → 𝑥=
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
Finalmente:
3 𝑆𝑦/𝑥
𝐿𝐷𝐷 = 𝑥 =
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒

LDD = 3,41143 ppm


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ANEXO N° 4

 ECUACIÓN DE REGRESIÓN:

Absorbancia = 0,00035 Concentración de cafeína - 0,00015

 LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LA PREDICCIÓN:

 Promedio de las 2 señales: y0 = 0,001125


 Número de réplicas: m = 2
 Número de puntos en la recta de regresión: n=5

2
𝑠𝑥0 = 1,118187422

𝑠𝑥0 = 1,057443815

LIMITES DE CONFIANZA PARA LA MUESTRA:

 x0 = 3,642857 𝑝𝑝𝑚 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑓𝑒í𝑛𝑎


 Desviación de la predicción: 𝑠𝑥0 = 1,057443815

‘t’ se lee en la tabla de Student de 2 colas para (m+n-3)=4 grados de libertad

NC 90% (t4 = 2.13) NC 95% (t4 = 2.78) NC 99% (t4 = 4.60)

3,642857 ± 1,592656 ppm 3,642857 ± 2,078677 ppm 3,642857 ± 3,439538 ppm