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IFRJ – Campus Rio de Janeiro

Coordenadoria de Biotecnologia
Turma: BM181
Professores: Dirceu (SOBRENOME)
José Ricardo Hossel
Thiago Rocha

Relatório de Tecnologia das Fermentações


Aula Prática n° 4: Fermentação Alcoólica

Alunos:
Alexandre Garcez
Beatriz Alexandre
Caio Ramiro
Juliana Wergles
Larissa Rodrigues
Mayra Maia
Paulo Rezende
Sabrina Fausto

Rio de Janeiro, 05 de dezembro de 2011.


Sumário

Introdução Página: 3

Objetivos Página: 5

Materiais Utilizados Página: 5


Metodologia Página: 6

Resultados Página: 9

Discussão Página: 12

Bibliografia Página: 15

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I) Introdução

A fermentação é um processo de transformação de uma substância em outra que


pode ser realizada por microorganismos, tais como fungos, bactérias, ou até o próprio
corpo. Existem vários tipos de fermentação por exemplo: fermentação alcoólica,
fermentação butírica, fermentação glicerina, fermentação acética, fermentação láctica,
fermentação quimiossíntese.
Há pouco mais de um século Pasteur demonstrou ser a fermentação alcoólica
realizada por microorganismos na ausência de oxigênio. Atualmente, fermentação alcoólica
é entendida como um conjunto de reações bioquímicas provocadas por microorganismos
chamados leveduras, que atacam fundamentalmente os açúcares, transformando-os
principalmente em álcool etílico e gás carbônico.
As leveduras mais utilizadas no processo de fermentação alcóolica são espécies
originárias do gênero Saccharomyces, sendo uma das principais a Saccharomyces
cerevisiae.

Figura 1: Microscopia eletrônica de Saccharomyces cerevisiae.

A fermentação alcoólica ocorre devido ao fato de que as células de levedo produzem


a energia que lhes é necessária para sobreviver, através de dois fenômenos de degradação
da matéria orgânica: a respiração, de forma aeróbica, ou a fermentação, de forma
anaeróbica. Na fermentação alcoólica, a levedura necessita transformar muito açúcar em
álcool para assegurar suas necessidades energéticas. Nessas condições a multiplicação da
levedura é pequena.
A composição exata do açúcar foi determinada por Gay-Lussac. É ainda de sua
autoria a equação que descreve a fermentação alcóolica:

C6H12O6  2 C2H5OH + 2 CO2

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Ou seja, partindo de 180g de glicose, obtém-se 92g de álcool etílico e 88g de CO 2,
caso a eficiência da reação seja de 100% (ou 95%, considerando o efeito Pasteur. Esta
reação representa a parte fundamental do processo, pois outras substâncias se formam além
do álcool etílico e CO2.
O termo destilação corresponde à separação das substâncias voláteis presentes no
fermentado, estas são inicialmente transformadas em vapor e depois condensadas. O
princípio da destilação se baseia na diferença entre o ponto de ebulição da água (100°C) e
do álcool (78,4°C). A mistura da água com o álcool apresenta ponto de ebulição variável
em função do grau alcoólico. Assim, o ponto de ebulição de uma solução hidroalcoólica é
intermediário entre aquele da água e do álcool e será tanto mais próximo deste último
quanto maior for o grau alcoólico da solução.
O Ebuliômetro é um aparelho capaz de medir a quantidade de álcool presente em
uma solução hidroalcoólica através da diferença do ponto de ebulição das duas substâncias.
Ele é composto por uma caldeira, onde fica a amostra a ser analisada, um condensador, que
é acoplado a caldeira onde são condensados os vapores provenientes da solução
hidroalcoólica contida na caldeira, e uma lamparina, que fornece aquecimento a caldeira do
ebuliômetro.

Figura 2: Ebuliômetro.

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II) Objetivos

Desenvolver experimentalmente e acompanhar um processo de fermentação


alcoólica, utilizando como matéria prima o caldo de cana e como microorganismo
fermentador uma levedura comercial. Além disso, determinar a concentração de produto
obtido no processo, avaliando assim seu rendimento e a eficiência da reação de fermentação
alcoólica.

III) Materiais Utilizados

Microorganismo:
 Levedura comercial (Saccharomyces cerevisae).

Materiais:
 Balões volumétricos de 50,0; 200,0; e 500,0 mL;
 Bastão de vidro;
 Béchers de 100mL;
 Câmara de Neubauer;
 Cubetas Plásticas;
 Estante para tubos;
 Espátula;
 Erlenmeyer 2L;
 Frasco de 2,5L com tampa rosqueada;
 Lamínula;
 Lenços de papel;
 Parafilm ®;
 Pérolas de vidro;
 Pipetas de 1,0; 2,0; 10,0; e 20,0 mL;
 Pipeta Pasteur;
 Pró-pipetes;
 Provetas de 250 e 500mL;
 Tubos de Follin Wu;
 Tubos de ensaio.
Soluções:
 Solução de HCl 2N;
 Solução de NaOH 1N;
 Reagente DNS (3,5-dinitrosalicilato);
 Solução padrão de glicose 4 µmoles/mL;

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 Caldo de cana;
 Água deionizada.

Equipamentos:
 Balança analítica Eletronic Balance® FA104N;
 Banho-maria à 70°C;
 Ebuliômetro;
 Equipamento de destilação simples;
 Espectrofotômetro UNICAM® modelo: 5625;
 Manta de aquecimento;
 Microdestilador;
 Microscópio Ótico de Inversão PZO® 98499;
 Papel Indicador de pH;
 Placa aquecedora LUCLL®;
 Placa aquecedora Nova Ética®;
 Refratômetro de mão ATAGO® N-3E;
 Régua de correlação;
 Sacarímetro de Brix (0-30) Incoterm® 17604;
 Termômetro.

IV) Metodologia

Determinação dos Açúcares Redutores Totais (ART) do caldo de cana:


Para dois tubos de ensaio devidamente rotulados transferiu-se 1,0 mL de caldo de
cana. Aos tubos adicionou-se igual volume de solução de ácido clorídrico ([HCl] = 2N) e
estes foram então incubados em banho-maria a 70ºC por 10 minutos. Após os tubos serem
resfriadoa, adicionou-se 3,0 mL de solução de hidróxido de sódio ([NaOH] = 1N) a cada
um deles. Em seguida, todo o conteúdo dos tubos (5 mL) foram transferidos para dois
balões volumétricos de 200,0 mL, respectivamente, adicionando água destilada até o traço
de aferição. Os balões foram fechados e homogeneizados. Pipetou-se 1,0 mL das novas
soluções diluídas para dois tubos de Follin Wu, rotulados como “ART”. A um terceiro tubo
de Follin Wu rotulado como “Branco”, adicionou-se 1,0 mL de água destilada e, a outros
dois tubos, adicionou-se 1,0 mL da solução padrão de glicose ([Glicose] = 4 µmoles/mL).
Adicionou-se 1,0 mL de reagente DNS aos cinco tubos Follin Wu e estes foram
levados ao banho-maria a 100ºC por 10 minutos. Então, os tubos foram resfriados e
avolumados com água deionizada até 12,5 mL. Estes foram tampados com Parafilm® e
homogeneizados. Os conteúdos dos tubos foram transferidos para cubetas plásticas e as
absorbâncias foram lidas a 540 nm no espectrofotômetro calibrado com o conteúdo do tubo

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“Branco”.
Os resultados da leitura foram utilizados para determinar as concentrações de
açúcares redutores totais antes do processo de fermentação alcoólica.

Determinação do °Brix do caldo de cana:


A uma proveta de 250 mL adicionou-se certo volume de caldo de cana suficiente
para não permitir que o sacarímetro de Brix tocasse o fundo da vidraria. O sacarímetro foi
mergulhado na solução e, através da localização do menisco superior, foi feita a leitura do
°Brix do caldo de cana.

Preparo do inóculo:
Primeiramente, ajustou-se o pH de 1,6L de caldo de cana para 4,5 com uma solução
de ácido sulfúrico ([H2SO4] = 1M). Esse volume foi transferido para o frasco de 2,5L com
tampa para rosquear.
Pesou-se, com o auxílio de uma espátula, 15,0042 g de fermento comercial em
balança analítica. Tais células de levedura foram ressuspendidas em um bécher com 100
mL de caldo de cana-de-açúcar e homogeneizadas. A suspensão foi diluída 1000 vezes para
posterior contagem em câmara de Neubauer. A partir do resultado obtido com a contagem,
foram inoculadas 107células por mililitro de caldo de cana-de-açúcar. Efetuado o inóculo, a
tampa do frasco foi frouxamente rosqueada.

Determinação do °Brix do mosto:


Após algumas horas, com o auxílio de uma pipeta Pasteur, adicionou-se uma gota
do mosto a um refratômetro de bolso. Então, observando o refratômetro contra a luz, foi
feita a leitura do °Brix do mosto.

Determinação dos Açúcares Redutores Totais (ART) do mosto fermentado:


Após duas semanas da adição do inóculo ao caldo de cana, obteve-se um mosto
fermentado. Pouco mais de 1L do mosto foi transferido para um erlenmeyer de 2L onde
este foi homogeneizado por agitação. Em seguida, pipetou-se 1,0 mL do mosto para um
tubo de ensaio. Então, adicionou-se 1,0 mL de ácido clorídrico ([HCl] = 2N) ao tubo e este
foi incubado em banho-maria a 70ºC por 10 minutos. Após a incubação, o tubo foi resfriado
a temperatura ambiente e, adicionou-se 3,0 mL de hidróxido de sódio ([NaOH] = 1N). O

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conteúdo do tubo foi transferido e avolumado em um balão volumétrico de 50,0 mL. Esta
nova solução diluída foi homogeneizada e a dosagem dos açúcares redutores totais foi feita
da mesma maneira que a explicada no primeiro item deste tópico, sendo a única diferença o
fato de não ter sido feita uma determinação utilizando uma solução padrão.
O valor de absorbância obtido foi utilizado para determinar a concentração de
açúcar no mosto fermentado.

Destilação simples do mosto fermentado:


Adicionou-se ao destilador simples 500 mL do mosto fermentado. Coletaram-se os
primeiros 10 mL do destilado e este foi reservado em uma garrafa de vidro rotulada como
“Cabeça”. Em seguida, foram coletados os 40 mL seguintes do destilado, reservando-o em
outra garrafa rotulada como “Coração”. O resto do destilado foi coletado e reservado em
uma terceira garrafa de vidro rotulada como “Cauda”.

Microdestilação do mosto fermentado:


Foram adicionados cerca de 50 mL do mosto fermentado bem homogeneizado ao
microdestilador ligado e com caldeira previamente aquecida. Após a destilação, foi
recolhido todo a solução hidroalcoólica resultante (cerca de 15mL). Tal solução foi
transferida para um balão volumétrico de 50,0 mL e avolumada até o traço de aferição com
água destilada. Esta solução diluída foi utilizada para a determinação da concentração de
etanol pelo método da ebuliometria.

Determinação do teor alcoólico por ebuliometria:


Primeiramente, determinou-se a temperatura de ebulição da água no ebuliômetro e
este valor foi marcado na régua, coincidindo com o zero e assim o ebuliômetro foi
calibrado.
Acrescentou-se ao equipamento todo o volume do balão volumétrico contendo a
solução hidroalcoólica diluída (50,0 mL). Observou-se atentamente o termômetro até que a
temperatura se estabilizasse. O valor desta temperatura foi marcado na régua contra a
temperatura inicial de ebulição da água. Assim obteve-se o valor correspondente a
alcoolatura da solução hidroalcoólica em °GL.

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V) Resultados

Na determinação do °Brix do caldo de cana, o menisco superior alcançou o marco


de 22°Brix. Como a temperatura da amostra naquele momento era de 18 °C, torna-se
necessário subtrair o fator de correção, que é igual a 0,12, de acordo com a tabela fornecida
pelo professor. Desta forma, o caldo de cana possuía 21,88 °Brix.
Através da contagem na câmara de Neubauer, observou-se uma concentração de
1,545 x 109 células de levedura/mL. Assim, foi possível calcular o volume de suspensão
necessário para inocular 107 células/mL de caldo de cana:

1 mL de solução – 107 células


1600 mL de solução – X
X = 1,6 x 1010 células.

1,545 x 109 células – 1mL de suspensão


1,6 x 1010 células – Volume necessário para inoculação
Volume necessário para inoculação = 10,36 mL.

Para calcular a concentração de células no fermento comercial, foram feitos os


cálculos abaixo:

1,545 x 109 células – 1mL de suspensão


Y células – 100mL de suspensão
Y = 1,545 x 1011 células.

1,545 x 1011 células – 15,0042 g de fermento


Z células – 1 g de fermento
Z = 1,030 x 1010 células.
[células de levedura no fermento comercial] = 1,030 x 1010 células/g de fermento.

Algumas horas após a inoculação, quando foi feita a determinação do Brix


refratométrico, obteve-se o resultado de 23,5 °Brix. Porém, a temperatura do mosto era de
18 °C. Logo, realizando a devida correção, tem-se o resultado de 23,38 °Brix.

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Na tabela a seguir encontram-se os valores de absorbância obtidos na leitura
espectrofotométrica durante as determinações. Como a primeira determinação foi feita em
duplicata, os valores representados correspondem à média dos valores obtidos. Para obter o
valor de ART na segunda avaliação utilizou-se como padrão o valor obtido na primeira
avaliação.

Amostra 1ª Determinação 2ª Determinação


Padrão (0,378 + 0,356)/2 = 0,367 -
ART (0,514 + 0,423)/2 = 0,4685 0,262

A partir destes valores, calculou-se a concentração de açúcares redutores totais


(ART) do mosto fermentado nas duas avaliações:

1ª Determinação (caldo de cana):


0,367 – 4 µmoles/mL
0,4685 – ART1 diluído
ART1 diluído = 5,11 µmoles/mL

Como a solução foi diluída 200 vezes em balão volumétrico, tem-se:


ART1 = 200 x 5,11 = 1022 µmoles/mL = 1,022 moles/L

A massa molar da molécula de glicose é igual a 180 g/mol. Logo:

1 mol – 180g
1,022 moles – X
X = 183,96 g

183,96 g – 1000 mL de solução


Y – 100 mL de solução
Y = 18,396 g
ART1 = 18,4 % (m/v), aproximadamente.

2ª Determinação (mosto fermentado):

10
0,367 - 4 µmoles/mL
0,262 – ART2 diluído
ART2 diluído = 2,85 µmoles/mL

Como a solução foi diluída 50 vezes em balão volumétrico, tem-se:


ART2 = 50 x 2,85 = 142,5 µmoles/mL = 0,1425 mol/L

Para transformar o valor calculado em %(m/v), realiza-se o cálculo de maneira


análoga ao realizado na 1ª determinação:

1 mol – 180g
0,1425 mol – X
X = 25,65 g

25,65 g – 1000 mL de solução


Y – 100 mL de solução
Y = 2,565g
ART1 = 2,6 % (m/v), aproximadamente.

Partindo destes resultados, foi possível calcular a variação da concentração do


substrato, isto é, principalmente da sacarose, no mosto:

ΔART = ΔSubstrato = ART1 – ART2 = 18,4 – 2,6 = 15,8% (m/v).

Através da determinação do teor alcoólico por ebuliometria, obteve-se uma


concentração de etanol igual a 10,65 °GL. Esta determinação foi feita de acordo com a
temperatura observada no termômetro durante o processo, que foi de 92,3 °C. Ajustando-se
o zero da régua com a temperatura de ebulição da água destilada do laboratório (100,3°C),
foi possível determinar o teor em ° GL da amostra.
Como a densidade do etanol é igual a 0,7894, 10,65 °GL corresponderá a 10,65 x
0,7894 = 8,41% (m/v), aproximadamente.
A partir deste valor, calcula-se o rendimento prático (Rp):

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Rp = ΔProduto/ ΔSubstrato = 8,41/15,8 = 0,532, aproximadamente.

É sabido que o rendimento teórico (Rt) da reação de fermentação alcoólica a partir


da sacarose é de aproximadamente 0,538. Então, é possível calcular a eficiência da reação:

Eficiência (considerando o efeito Pasteur) = 95(Rp/Rt) = 95(0,532/0,538) = 93,94%.


Eficiência (sem o efeito Pasteur) = 100(Rp/Rt) = 100(0,532/0,538) = 98,88%.

VI) Discussão

O ajuste de pH realizado no caldo de cana é um passo importante para evitar a


contaminação da amostra. Com um pH 4,5 não há a proliferação de muitos
microorganismos, mas a levedura se mantém estável. Após o processo fermentativo, houve
uma queda do pH pelo fato da existência das leveduras no mosto e o processo fermentativo
em si, que gera uma acidificação do meio.
Através da avaliação dos valores de °Brix antes e depois da fermentação também foi
possível observar o desenvolvimento do processo fermentativo. Mesmo se tivesse sido
consumida toda a sacarose no decorrer do processo, o °Brix não chegaria a zero, pois este
não mede especificamente a sacarose, mas sim a quantidade de sólidos em 100mL de
solução. Contudo, existem outras partículas que interferem nessa medição como
aminoácidos, proteínas e sais (K e Na). Especialmente em nosso caso, o °Brix aumentou
em relação ao medido antes da fermentação, isto pode ter ocorrido por conta da
solubilização de substâncias entre nossas medições, inclusive algumas partes do
metabolismo dos microorganismos presentes, por conta do efeito Pasteur, que diz que nem
toda a energia é utilizada para fermentação alcoólica sendo uma pequena porcentagem
destinada para outras vias. Diz também que esta porcentagem pode aumentar ou diminuir
dependendo das condições das leveduras. Alguns dos fatores que podem interferir na
eficiência da fermentação são o pH do meio, que altera com o tempo de fermentação, a
concentração de substrato existente, as condições de anaerobiose das leveduras, etc. Mesmo
havendo consumo de açúcar o valor de °Brix pode não refletir isto, sendo assim, no
momento em que ensaios simples como o Brix se tornam imprecisos é necessário procurar
outros métodos baratos, simples e rápidos, com maior precisão, para que se possa
acompanhar o processo fermentativo.

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Através do valor de ART podemos relacionar a quantidade de açúcar disponibilizada
para as leveduras com a eficiência de fermentação. Todavia, como esta leitura é realizada
através de um espectrofotômetro é necessária a elaboração de uma curva padrão. Nesta
prática realizamos a leitura em duplicata de um padrão de 4µmol/L. O ideal seria a
construção simultânea a dosagem de uma curva padrão com diferentes diluições da solução
padrão e, a partir da equação da reta, interpolar as absorbâncias obtidas com a leitura das
amostras e obter assim suas respectivas concentrações. Como isto não foi feito, as
concentrações obtidas foram calculadas a partir de uma regra de três simples considerando
a absorbância da solução de concentração conhecida. Tal determinação possui uma margem
de erro considerável, pois não houve construção da curva padrão. Uma possibilidade seria
utilizar a equação da curva padrão construída em uma aula experimental anterior. Contudo,
este procedimento também teria uma margem de erro representativa, pois as condições
durante o preparo das reações, como temperatura e soluções utilizadas, variam de um dia
para o outro.
As destilações foram realizadas com o intuito de separar o produto obtido do mosto
fermentado. Na destilação simples, a fração representativa corresponde aos 40 mL
coletados e chamados de “Coração”. É nesta fração que se obtém a maior concentração do
produto.
A determinação da concentração de etanol por ebuliometria é um método fácil,
direto e relativamente rápido, mostrando-se vantajoso para fins industriais. Com o valor
obtido, foram calculados o rendimento teórico e a eficiência da reação de fermentação
alcoólica. Os resultados estavam de acordo com o esperado, já que se obteve uma eficiência
(desconsiderando o efeito Pasteur) de aproximadamente 99%. Pode-se concluir, portanto,
que as técnicas foram bem executadas e as células de levedura estavam em condições
ótimas para exercer seu metabolismo.

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VII) Bibliografia

1. AUTOR DESCONHECIDO. Fermentação alcoólica. Disponível em:


<http://www.virtual.epm.br/material/tis/curr-io/trab99/alcool/fermentacao.htm>.
Acessado em: 18/11/2011.

2. AUTOR DESCONHECIDO. Fermentação alcoólica. Disponível em:


<http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/alcoolismo/fermentacao-alcoolica.php>.
Acessado em: 18/11/2011.

3. AUTOR DESCONHECIDO. Ebuliômetro. Disponível em:


<http://www.revitec.com.br/img/acess6.jpg>. Acessado em: 03/12/2011.

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