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Práctica - Manual Biotecnología

Biotecnología Ambiental (Instituto Politécnico Nacional)

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BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL

2014
MANUAL DE PRÁCTICAS

[http://planetabeta.com/aprendiendo-cuidar-ambiente]

Dra. Estela Flores Gómez


Dra. Elvia Inés García
Peña
Dra. Margarita Ivonne Garrido Gutiérrez

M. en C. Flor Selene Villalobos


M. en C. Jessica Batalla

1er Revisión

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NORMAS GENERALES DE TRABAJO EN EL LABORATORIO

El laboratorio de biotecnología es un lugar adecuado para llevar a cabo prácticas


de las diversas áreas de trabajo, cuenta con material de vidrio, equipo básico de
laboratorio, así como reactivos y medio de cultivo.

Es necesario cumplir con los REQUISITOS BÁSICOS:

1. Pase de lista a los 10 min de la hora de entrada.


2. Traer lo indispensable para su trabajo dentro del laboratorio (cinta maskin,
encendedor, plumon indeleble, tijeras, franela limpia, etc) de no ser así se le
bajaran 5 puntos de su trabajo de laboratorio cada vez que carezca de
material de trabajo.
3. Evitar la contaminación con microorganismos ajenos a nuestro sistema de
estudio

Para mantener estás condiciones también es necesario respetar una serie de


NORMAS DE SEGURIDAD:

1. Entrar con la bata puesta, abotonada y limpia. si va a trabajar extra clase


avisar al profesor que este en clase que actividad realizará y quién es su
profesor.
2. No comer dentro del laboratorio.
3. Limpiar mesa con franela limpia y de su propiedad.
4. Checar al inicio del laboratorio la tarja que le corresponde, no deberá existir
material roto o sucio, si no es reportado dicho material será su
responsabilidad lavarlo y/o pagarlo.
5. En caso de que exista material limpio y seco, este será guardado
inmediatamente en su lugar asi prevenimos que se rompa el mismo.
6. Dejar limpio su lugar de trabajo en la parte superior e inferior.
7. Colocar su mochila en la parte inferior de la mesa de trabajo de lo contrario
se le quitaran 5 ptos de trabajo de laboratorio cada vez que se le llame la
atención.
8. No está permitido abrir sus maquinas portátiles para realizar tareas ajenas
al laboratorio, de lo contrario se le recogerá y se entregara al final de la
sesión del laboratorio.
9. No está permitido contestar llamadas de celular durante la discusión de lo
contrario se quedará con cero.
10. Se les asignara una gaveta y un lugar en el refrigerador por grupo, mismos
que tendrán que mantenerse limpios y ordenados.
11. Se deberá mantener una conducta adecuada dentro del laboratorio, se
hablarán con respeto y manteniendo un nivel óptimo de sonido.
12. Etiquetar todo su material y reactivos con plumón indeleble o se desechara.
13. Usar agua destilada para preparar soluciones y/o enjuagar material, ésta
agua se tomará del área de bioingeniería ya que el equipo dentro del

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laboratorio nos proporciona agua desionizada y miliQ misma que será


usada según se requiera.
14. Si va a utilizar la campana de extracción colocar un papel en la base para
evitar que se manche el acero con los diferentes reactivos.
15. Cuando requiera trabajar extra clase, lo hará en la parte del fondo del
laboratorio y pedirá acceso al profesor que se encuentre en ese momento,
solo tiene que decir: EXTRACLASE del profesor ______________

EVALUACIÓN

INICIO DE PRÁCTICA:

1. Se entregará bitacora con diagrama de flujo metodología y cuestionario


contestado al inicio de cada sesion, misma que será presentada en una
libreta exclusiva de la materia. o bien hojas sueltas que al final de la materia
se mostrarán engargoladas con las 6 prácticas realizadas junto con reporte
c/u.

2. Como parte de su trabajo de laboratorio se le preguntará al alumno la


metodología a realizar y en caso de que no sepa se le descontarán 5
puntos.

3. El laboratorio de biotecnología ambiental tiene un valor de 30 % de la


calificación final que se califican de la siguiente manera:

Bitácora 10% diagrama flujo metodología y cuestionario


Examen 20% escrito
Trabajo Experimental 35% desempeño global en el laboratorio
Discusión 10% será realizada por los alumnos
Informe de la práctica 25%

Se entregará en la libreta u hojas sueltas consta:


 Portada
 Titulo
 Introducción
 Objetivos
 Resultados y análisis de resultados
 Conclusiones
 Referencias Bibliogràficas
 Anexo: Cuestionario

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4. Se requiere de un mínimo de 80% de asistencia a las sesiones prácticas


para acreditar el laboratorio.

5. Recuerde que si no acredita laboratorio no puede acreditar la teoria.

FINAL DE PRÁCTICA:

1. Al final de cada sesión se entregará mesa y material limpio.

2. Al final del semestre se entregará una libreta con las bitácoras y/o las hojas
engargoladas y se anexarán sus reportes de cada práctica.

3. Al final del semestre durante la última sesión de laboratorio se entregará su


gaveta y lugar de refrigerador vacio y limpio.

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INDICE

PRÁCTICA Página
6
Práctica 1. Extracción de ADN genómico de suelo
Dra. Estela Flores Gómez

14
Práctica 2. RAPD
Dra. Margarita Ivonne Garrido Gutiérrez

18
Práctica 3. Degradación de fenoles.
Dra. Elvia Inés García Peña

25
Práctica 4. PRODUCCIÓN DE BIOCOMBUSTIBLES (Biogás)

Dra. Estela Flores Gómez

33
Práctica 5. Producción de bioetanol
Dra. Elvia Inés García Peña

39
Práctica 6. Determinación del Kla por el método del sulfito
M. en c. Jessica Batalla Mayoral

47
Práctica 7. Biodisel
M. en C. Flor Selene Villalobos

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Práctica 1

EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS ADN genómico de suelo


I. INTRODUCCIÓN

Podemos considerar el ADN o ácido desoxiribonucleico, como el }cerebro~


celular que regula el número y naturaleza de cada tipo de estructura y
composición celular, transmitiendo la información hereditaria y determinando la
estructura de las proteínas, que a través de enzimas determinará el resto de
funciones celulares. A finales del siglo pasado se descubrió también la existencia
de una segunda clase de ácido nucleico, denominado ácido ribonucleico (ARN). El
ARN se encuentra tanto en el núcleo (concretamente en el nucléolo) como en el
citoplasma de las células de manera abundante.

Ambos tipos de ácido nucleicos, ADN y ARN, se encuentran simultáneamente en


organismos eucariotas (con células de núcleo diferenciado) y procariotas
(bacterias, etc.), y sólo uno de ellos en los virus.

Para una extracción de ADN efectiva se deberá conocer las características


básicas de la muestra con la que trabajará, se debe conocer si el ADN a ser
extraído proviene de una célula procariótica o eucariótica dado que los
componentes que forman la pared y membrana celular de estos organismos es
distinta. Existen diversos métodos de extracción de ADN que se ajustan a las
necesidades de cada tipo de muestra, estos incluyen tratamientos físicos,
químicos, enzimáticos o una combinación de los mismos.

Por otro lado, la Ingeniería Genética (IG) es una herramienta que trabaja
básicamente con ácidos nucleicos. Su análisis, manipulación o clonaje requieren
poder disponer de una cantidad adecuada de material y en estado suficientemente
puro para su utilización con garantías; en general, se podría definir como un
conjunto de metodologías que permite transferir genes de un organismo a otro y
expresarlos (producir las proteínas para las cuales estos genes codifican) en
organismos diferentes al de origen. El ADN que combina fragmentos de
organismos diferentes se denomina ADN recombinante. Así, es posible no sólo
obtener proteínas recombinantes de interés sino también mejorar cultivos y
animales. Los organismos que reciben un gen que les aporta una nueva
característica se denominan organismos genéticamente modificados (OGM) o
transgénicos. A su vez, la IG es lo que caracteriza a la biotecnología moderna que
implementa estas técnicas en la producción de bienes y servicios útiles para el ser
humano, el ambiente y la industria.

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II. Objetivos

Objetivo General

Extraer ADN genómico de suelo y conocer la utilidad de la ingeniería genética para


el desarrollo de organismos útiles para el ambiente.

Objetivos Específicos

a) Comprender los fundamentos del proceso de extracción de ADNg


b) Analizar la calidad del DNAg a través de la electroforesis en gel de
agarosa.
c) Analizar la pureza y concentración del DNAg.
d) Obtener el Peso Molecular del DNAg
e) Discutir la importancia de la Ing. Genética en el desarrollo de organismos
genéticamente modificados y estudio de poblaciones en sistemas con
estrés biótico o abiótico.

III. Material y reactivos

- Micropipeta 1 ml, 200 y 20 ul

- Puntas para micropipeta 1 ml, 200 ul y 20 ul estériles

- Tubos de plástico de 5 ml estériles

- Tubos para microcentrifuga eppendorf 2 ml

- Un cuadrito de parafilm

- 300-400 mg de suelo.

- Guantes

EQUIPO

- Microcentrífuga

- Espectrofotómetro

- Celdas de cuarzo.

- Cámara de Electroforesis

- Campana de extracción

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REACTIVOS

-Buffer de extracción CTAB

- Cloroformo:Octanol (24:1)

- Fenol:Cloroformo (1:1)

- Isopropanol frío

- NaCl 5.0 M pH 5.2

- EtOH

- Solución de lavado 1: 76% EtOH, 0.2 M NaOAc

- Solución de lavado 2: 76% EtOH, 10 mM NH4OAc

- Buffer TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM Na2EDTA, pH 8.0)

- Buffer de corrimiento TAE 50X (Trisbase, Ac. acético glacial, Na 2EDTA pH 8.0)

- Buffer de carga (Tris, azul de bromofenol y glicerol)

-Rojo Texas.

- Marcador de peso molecular 1Kpb (axygen) como control.

- RNAsa (10mg/ml)

IV. METODOLOGIA

3.1 Extracción de ADN genómico de suelo

1. PONTE TUS GUANTES Y CUBREBOCAS

2. Pesar 300-400 mg de suelo en un tubo de centrifuga de polipropileno de 15 ml.

3. Adicionar 9.0 ml de CTAB precalentado (65°C) al suelo y mezclar suavemente


por inversión varias veces.

Nota: Se recomienda distribuir el suelo a lo largo del tubo antes de añadir el buffer,
para evitar el aglutinamiento del suelo en el fondo del tubo.

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4. Incubar 60-90 min a 65 °C con agitaciones continúas.

5. Sacar los tubos de la incubadora y esperar de 4–5 min que se enfríen, y


después adicionar 4.5 ml cloroformo:octanol (24:1). Cerrar el tubo para mezclar de
5-10 min.

6. Centrifugar por 10 min a 3200 rpm a Temperatura Ambiente (TA).

OJO: debajo de 15°C el complejo CTAB/ADN puede precipitar, por lo tanto evitar
esta condición.

7. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo de 15 ml. Adicionar 4.5 ml de


cloroformo/octanol y mezclar suavemente por 5-10 min.

8. Centrifugar por 10 min a 3200 rpm a TA.

9. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo de 15 ml que contenga 30 ul de


RNAsa (10mg/ml) precalentada. Mezclar por inversión e incubar 30 min a TA.

10. Adicionar 6 ml de isopropanol (2-propanol). Mezclar suavemente por inversión.

11. Remover el ADN precipitado con una varilla de vidrio en forma de gancho o
bien centrifugar para obtener la pastilla de ADN.

Extracción con Fenol para obtener ADN de alta pureza

Ésta opción es altamente recomendada para análisis de ADN basados en la


reacción en cadena de la polimerasa (PCR), así como RAPDs.

12. Colocar el ADN en un microtubo eppendorf de 2 ml que contenga previamente


1 ml de TE; suavemente girar el gancho hasta depositar el ADN del paso anterior.
Tapar los tubos y mezclar, dejar toda la noche a que se disuelva el ADN a TA.

13. Añadir 1 vol de fenol:cloroformo en relación 1:1. Centrifugar los tubos a 3200
rpm durante 10 min.

14. Transferir la fase acuosa a un tubo eppendorf nuevo estéril de 2 ml. Extraer el
ADN con 1 ml (1X volumen TE original) de cloroformo:octanol. Centrifugar la
muestra 10 min a 3000-3200 rpm.

15. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo eppendorf de 2ml estéril.

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Precipitación con Etanol

16. Precipitar el ADN adicionando 50 ul de NaCl 5 M y después 1 ml de EtOH


absoluto. Mezclar suavemente por inversión.

17. Centrifugar a 12000 rpm, 1 min para recuperar la pastilla de ADN.

Lavados de la pastilla

18. Añadir 2 ml solución de lavado 1. Dejar la pastilla 10-20 min agitando


suavemente de manera continua.

19. Centrifugar a 12000 rpm, 1 min para recuperar la pastilla y decantar


sobrenadante.

20. Adicionar la solución de lavado 2 y enjuagar la pastilla de ADN. Centrifugar


para recuperar la pastilla de ADN 12krpm, 1 min.

21. Decantar la solución de lavado 2 y dejar secar la pastilla.

22. Adicionar 0.3 a 0.5 ml de TE al tubo eppendorf hasta que se disuelva la pastilla
de ADN. Tapar el tubo y dejar toda la noche disolver el ADN a TA. Almacenar las
muestras a 4 °C.

3.2 Electroforesis en gel de agarosa.

La calidad de ADN se determina mediante una corrida de electroforesis en gel de


agarosa al 1%.

1. Pesar 1 gr de agarosa y añadir Buffer TAE 1X para completar 100 ml.


2. Se funde en un horno de microondas y se añaden 5 ul de BrET

Nota: La adición del BrEt puede hacerse de diferentes formas.

3. Se deposita en el carro con peine para el gel.


4. Se deja solidificar en una campana de extracción.
5. Se desmonta y se coloca en la cámara de corrimiento con Buffer TAE 1X
que tape el gel de agarosa.
6. Para cargar la muestra, se coloca 5 ul de ADN y una gota de buffer de
carga sobre un cuadrito de parafilm, se mezclan y se cargan en el gel.
Nota: se puede colocar marcador de peso en el primer carril (1Kb).
7. Se carga el gel de agarosa.

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8. Se conecta la fuente de poder y se corre el gel a un voltaje de 70-90 V


según el tamaño de la cámara.
9. Una vez que se separaron los dos colorantes y estos llegaron ¾ partes del
gel, se saca el gel de la cámara de corrimiento y se observa en el
transiluminador con la luz UV.

3.3 Estimación de la concentración de ADN

a. Diluir 20 ml de muestra de ADN en 980 ml de agua desionizada y estéril


(dilución 1/50)
b. Medir absorbancia por espectrofotometría a una DO 260 nm usando
celdas de 1 ml de cuarzo.
c. La concentración de ADN a DO260 = 1.0 en una celda de 1 cm equivale a
50 mg de ADN por ml de agua. Para calcular la concentración de la
muestra:

Concentración de ADN [ug/ul] = 50 mg / ml x DO260 x 50 (factor de dilución)

1000

[ADN total] = [ADN] x volumen eluído en ml

3.4 Estimación de la pureza del ADN

El grado de pureza o ausencia de proteínas y otros contaminantes de una


disolución de ADN puede estimarse calculando el cociente A260/A280.

Cuando este se encuentra entre 1.8-2.0 la muestra contiene casi exclusivamente


ADN.

3.5 Realizar Regresión Lineal para el Cálculo aproximado del PM (pares de bases,
pb)

a)Gráficar en el eje de las Y, el log10 del PM (pb) y en el eje de las X, la distancia


en cm a cada banda. Es importante medir de arriba hacia abajo tomando como
base el borde superior del gel. Sacar la ecuación de la regresión lineal y=mx+b,

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sustituir la distancia a la banda del DNAg y sacar el antilogaritmo del valor Y para
tener el PM en pb.

V. Resultados y Análisis de Resultados

a) Discute los resultados obtenidos en tu práctica:

 Obtención de ADN
 Electroforesis en gel (FOTO GEL con ubicación de tu carril de corrimiento)
 Espectrofotometría (Concentración y pureza del ADN)

b) Elabore un dibujo de la cámara de electroforesis donde muestras el corrimiento


de tu gel y las características de la corrida.

VI. CUESTIONARIO PREVIO (Entregar junto con la bitácora al inicio de la


práctica)

1. Lleve a cabo un diagrama de proceso en donde coloque el fundamento de


todos los reactivos utilizados en el proceso de obtención de ADN y
electroforesis.

2. ¿Cuál es la importancia de conocer las poblaciones microbianas del suelo?

3. ¿Qué otra aplicación podrías obtener del estudio del ADNg obtenido en ésta
práctica?

4. ¿Existen otros colorantes además del Rojo Texas para hacer visible el ADN en
el gel de agarosa?

5. ¿Por qué se utilizan celdas de cuarzo y no de plástico para leer ADN en el


espectrofotómetro?

6. ¿Por qué se lee el ADN a una absorbancia de 260 y 280 para valorar su
pureza?

7. ¿Cómo se llama el equipo que te permite visualizar el DNAg?

8. ¿Cuál es el porcentaje adecuado de agarosa para realizar tu gel de acuerdo al


PM (pb)? ¿Por qué?

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9. Investiga que es un marcador de peso molecular y pega la imagen del patrón


de bandeo del MPM que utilizaste en esta práctica.

10. Cálcula el PM de tu banda a través de una regresión lineal en donde obtengas


una ecuación en donde X (distancia a cada banda en cm midiendo a partir de
la parte superior del gel a cada banda) y Y (log 10 de cada peso molecular de tu
marcador de PM).

VII. Conclusiones

Coloca las conclusiones de acuerdo a tus resultados y objetivos propuestos.

VIII. REFERENCIAS

- Perera J, Tormo A y García JL. 2002. Ingeniería Genética (Vol.1): Preparación,


análisis, manipulación y clonaje de ADN. Ed. Síntesis, S.A. Madrid, España.

- Hoisington D, Khairallah M. y González de León D. 1994. Laboratory Protocols


CIMMYT Applied Molecular Genetics Laboratory. Second edition. México,
D.F.:CIMMYT

- www.cuadernosdebiotecnologia.ar Cuaderno No 4

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Práctica 2

DNA polimórfico amplificado al azar (RAPD)

I. Introducción

La técnica de RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA, por sus siglas en


inglés) ha sido la tecnología más ampliamente usada en la PCR para diferentes
propósitos, usa oligonucleótidos pequeños de secuencias aleatorias que tienen un
contenido de GC mayor a 50 %. Estos oligos se pegan a distintos sitios en un
genoma, si es que existen diferentes sitios blanco para ellos. La unión es
reconocida por la DNA Polimerasa que inicia el alargamiento del iniciador a partir
del extremo 3´. El producto de la amplificación se acumula en un gran número de
copias (~10 6) y puede ser visualizado por electroforesis. Una amplificación es
exitosa, sólo si el sitio blanco para el iniciador está localizado en ambas cadenas
del DNA molde en polaridad opuesta y a una distancia de 50 – 6 000 pares de
bases (pb) en promedio.

El procedimiento de RAPDs es relativamente rápido, sólo se requieren pequeñas


cantidades de DNA, mismo que no necesita estar extremadamente puro, además
no involucra radiactividad ni requiere de transferencia tipo Southern. La técnica
genera marcadores dominantes, ya que los polimorfismos se detectan por la
presencia o ausencia de bandas. Éstas resultan de inserciones o deleciones en
las regiones amplificadas, o a partir de cambios de bases con lo que se altera la
unión del iniciador.

Para la reproducibilidad de la técnica de RAPD, es absolutamente necesario


optimizar las cantidades de DNA, MgCl 2, iniciadores y dNTPs. También la clase e
inclusive la fuente de DNA Polimerasa termoestable debe de mantenerse
constante, así como e l uso del mismo termociclador. Cualquier cambio, afecta la
reproducibilidad de los patrones.
Los marcadores RAPDs proporcionan un método rápido para generar mapas
genéticos y analizar poblaciones provenientes de diversas fuentes como las que
se presentan en los suelos contaminados.

II. Objetivo

Objetivo General

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Analizar diversos DNAs de suelos contaminados por medio de la técnica de


RAPDs para obtener patrones moleculares.

Objetivos específicos

a) Evaluar la técnica de RAPD como herramienta molecular para la


descripción de perfiles de amplificación de segmentos de ADN.
b) Conocer la técnica de PCR y sus fundamentos.
c) Elaborar el diseño de primers utilizando algoritmos computacionales.

III. Materiales y Equipo

Materiales
Reactivos Tabla 1.
Equipo
Termociclador
Cámara de lectroforesis

IV. Metodología

Encender el termociclador. Preparar la mezcla maestra para el número de


reacciones correspondiente al total de los equipos y considerando a los controles
positivos y negativos, como se muestra en la siguiente tabla 1. El volumen total
por reacción será de 25 µL. Todo se debe de hacer en un baño de hielo.

Tabla 1. Preparación de la mezcla maestra para RAPDs.


Reactivos Volumen para una Volumen para _____
reacción (µL) reacciones (µL)
Agua miliQ 4.7
Mezcla de dNTPs 10.0
Amortiguador de la 2.5
enzima DNA Taq
polimerasa
MgCl2 (50 mM) 1.0

Mezclar perfectamente, dar un spin en la microcentrífuga y adicionar a un tubo de


0.2 mL lo que se indica en la tabla 2.

Tabla 2. Componentes finales de la reacción para los RAPDs.


Mezcla maestra 18.2 µL
Iniciador 4.0 µL (20 pMol final)

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DNA 2.5 µL (100 ng final)


DNA Taq polimerasa 0.3 µL (1.5 U)

Los iniciadores que se usarán en la práctica se muestran en la tabla 3. Mezclar por


repipeteo sin generar burbujas, cerrar perfectamente los tubos y dar un spin de 10
segundos en la microcentrífuga usando tubos de 1.5 mL como soporte para los de
0.2 mL. Sumergir de nuevo los tubos en el baño de hielo y programar el
termociclador como se muestra en la tabla 4.

Tabla 3. Secuencia de los iniciadores para el RAPD con DNA de suelo contaminado
Iniciador Secuencia 5´ a 3´
70-31 GCCCCTCTTG
70-34 GGACCGCTAG
70-35 CATGTCCGCC
70-37 CTATCGCCGC
70-40 CGCAGACCTC
SP GCGTCGAATTAAGCCACA

Tabla 4. Programa para el termociclador para la técnica de RAPD con DNA de suelos
contaminados
Ciclos Tiempo (segundos) Temperatura (°C)
1 60 94
3 ciclos 30 94
30 35
90 72
38 15 94
30 35
90 72
1 150 72
1 ∞ 4

Colocar los tubos en la parte central de la placa del termociclador y correr el


programa. Analizar los productos de RAPDs por electroforesis. Hacer un gel de
agarosa al 1.5 % en TAE (ver procedimiento en práctica 1), documentar el gel
después de exponerlo a la luz UV.

V. Resultados y Análisis de Resultados

a) Discute los resultados obtenidos en tu práctica:

 Obtención de patrón de bandeo en la electroforesis en gel de agarosa


(FOTO GEL con ubicación de tu carril de corrimiento)

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 ¿Qué es un marcador molecular y cuál es su función?

 Investiga y discute otras técnicas similares al RAPD

b) Elabore el primer directo y reverso a partir de una secuencia de un organismo


del suelo de interés ambiental.

c) Investigue y discuta la importancia de las herramientas de Ing. Genética en la


biotecnología ambiental

VI. CUESTIONARIO PREVIO (Entregar junto con la bitácora al inicio de la


práctica)

1. Explica que es un polimorfismo y da 3 ejemplos.


2. Explicar las causas por las cual se dan los polimorfismos en el DNA de los
organismos.
3. Menciona las características de la PCR.
4. Explica las diferencias entre las técnicas moleculares de PCR y RAPDs.
Puedes hacerlo en un cuadro comparativo.
5. Explica la causa por la cual se usan gran variedad de primers en la técnica
de RAPD.
6. Explicar el criterio para seleccionar a los primers como adecuados para la
técnica de RAPD.

VII. Conclusiones

Coloca las conclusiones de acuerdo a tus resultados y objetivos propuestos.

VIII. REFERENCIAS

 http://www.ucla.edu.ve/bioagro/Rev13(3)/1.%20Uso%20de%20la%20t
%C3%A9cnica.pdf

 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechRAPD.shtml

 http://www.encuentros.uma.es/encuentros49/marcadores.html

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Práctica 3

Degradación de contaminantes: cinéticas de crecimiento y degradación.

I. Introducción

Los compuestos fenólicos forman una parte importante de la gran fracción de


contaminantes que ingresan al medio ambiente día a día. Las aguas residuales
generadas por las industrias químicas, petroquímicas y del acero contienen con
mucha frecuencia altas concentraciones de compuestos fenólicos [11], los cuales
representan un serio problema ecológico debido a su uso extenso, a su toxicidad y
a que también se generan a través de los procesos aerobios en el ambiente [21].
Los fenoles son intermediarios en la producción de algunos otros químicos, la
producción global de resinas fenólicas en el año 2001 fue estimada de 2.9
millones de toneladas. También se desechan en las corrientes acuosas de las
industrias refineras de petróleo, obtención y conversión de carbón, plantas
químicas, fundidoras de metal y plantas de papel [2, 17,48].

Los compuestos fenólicos se utilizan para diversos propósitos en muchas áreas,


por ejemplo los compuestos fenólicos clorados se utilizan específicamente como
preservativos de la pintura, cuero, mercancías textiles y como agentes
antimicrobianos. Se producen en plantas petroquímicas y procesos de blanquear
corteza durante la producción de papel [52]. Debido al tratamiento incorrecto de
estos materiales, se han contaminado extensamente el suelo y el agua
subterránea y su toxicidad afecta seriamente organismos vivos. Estos son agentes
carcinógenos y se sospecha como precursores de la dioxina [10].

Los compuestos fenólicos clorados y otros derivados son usados extensamente


como insecticidas, fungicidas y herbicidas por la industria y usos agrícolas
alrededor del mundo. Estos compuestos tienden a incrementar su toxicidad con el
aumento del grado de cloración. Algunos clorofenoles tienden a ser

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bioacumulables dentro del medio ambiente pudiendo llegar a ser un peligro público
[26].

Algunos procesos de refinería producen pequeños volúmenes de agua, con altas


concentraciones de fenoles y alquilfenoles, los datos reportados son de 16.3 g/L y
20.1 g/L, donde regularmente el 75% es fenol y el 10% son compuestos alquilos-
sustituidos, como lo son los cresoles, xilenos y etilfenoles [24].

El fenol es un agente potencialmente carcinógeno humano y es de considerable


preocupación para la salud, aun a concentraciones bajas. En México en la NOM-
127-SSA1-1994 el límite máximo permisible de fenol es de 0.001 mg/L en agua
potable. Por lo tanto, el tratamiento de las aguas residuales que contienen fenol es
una necesidad.

Se han investigado muchas tecnologías para la remoción y/o desintoxicación de


los compuestos fenólicos en aguas residuales, esta puede llevarse a cabo
mediante distintos procesos físicos, químicos o biológicos entre los que se
Incluyen, la adsorción [42], la biodegradación [35], UV/Fe +3 [52], extracción por
membrana líquida [32] y oxidación [5,15,46]. El reto para la biotecnología es
generar métodos de bioremediación con altas eficiencias, relación costo-
efectividad y ambientalmente seguros, para reemplazar la tecnología existente y
promover soluciones para la remediación de sitios contaminados. Los tratamientos
enzimáticos son una tecnología relativamente nueva en el tratamiento de aguas
residuales y promueven una alternativa ambiental para el sanamiento de efluentes
peligrosos o contaminantes orgánicos xenobioticos [27].

Para tratar compuestos fenólicos, los métodos biológicos muestran algunas


ventajas sobre los métodos físicos y químicos, ya que estos son económicos y no
generan subproductos. Muchos estudios apoyan el tratamiento biológico de aguas
residuales o del agua subterránea. Los microorganismos usados son
generalmente aerobios, incluyendo Pseudomonas sp. [13,16, 23], Alcaligenes sp.
[22,47], Azotobacter sp. [31], Rhodococcus sp. [3,40], Phanerochaete sp. [30,41],
y Cryptococcus sp. [37]. Estos cultivos aerobios son más eficientes en degradar

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compuestos tóxicos debido a que crecen más rápidamente que los anaerobios y
transforman generalmente los compuestos orgánicos a compuestos inorgánicos
(CO2, H2O).

La diferencia de la estructura y de la toxicidad entre los compuestos fenólicos


requiere que varias bacterias tengan cualidades específicas para degradar cada
compuesto y un cultivo mixto puede ser aplicado. El cultivo mixto significa que
varias clases de microorganismos son cultivados simultáneamente. El cultivo mixto
se divide en tipos indefinidos y definidos. Los lodos activados constituyen un
ejemplo de un cultivo mixto indefinido. El lodo activado es un grupo complejo de
microorganismos que pueden oxidar las aguas residuales bajo condiciones
aerobias. Para tratar aguas residuales especiales, incluyendo compuestos muy
tóxicos y recalcitrantes mediante un lodo activado, la adaptación es generalmente
necesaria. Si se agregan los microorganismos que pueden degradar estos
materiales, el tiempo de la adaptación puede ser reducido y las eficiencias se
pueden incrementar. Para hacer esto, un estudio de cultivos puros o cultivos
mixtos definidos es importante.

Las células inmovilizadas han sido bien definidas como células que son atrapadas,
asociadas a una matriz insoluble. Mattiasson [33] discutió varios métodos de
inmovilización: pares covalentes, adsorción, atrapamiento en una red de polímero
tridimensional, confinamiento en una emulsión liquido-liquido, y atrapamiento con
una membrana semipermeable. Bajo algunas condiciones, las células
inmovilizadas, tienen ventajas sobre las células libres y enzimas inmovilizadas. El
uso de células inmovilizadas permite la operación de bioreactores a flujos que son
independientes de la velocidad de crecimiento de los microorganismos empleados
[39]. La estabilidad catalítica puede ser mas grande por las células inmovilizadas
que por las células libres, y algunos microorganismos inmovilizados son tolerantes
a las altas concentraciones de compuestos tóxicos en comparación con las células
libres [19, 29]

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La degradación del fenol por microorganismos puros y consorcios mixtos ha sido


extensamente estudiada. [1,11,14,21,43,44]. La mayoría de los cultivos evaluados
son capaces de degradar el fenol en bajas concentraciones.

Un gran número de los estudios en la degradación del fenol se han realizado con
cepas puras de bacterias, principalmente del género de las Pseudomonas.
[1.21.51] Un gran número de levaduras y hongos filamentosos tienen una
capacidad que degradar fenol. Entre los tipos de levaduras, la Candida tropicalis
ha sido la más estudiada. C. tropicalis es una levadura hidrocarbonoclastica capaz
de degradar el fenol, derivados del fenol y compuestos alifáticos, en
concentraciones relativamente altas (<3,000 ppm). [11,43] Sin embargo, como en
muchos otros microorganismos, el fenol inhibe el crecimiento de la C. tropicalis y
pueden también causar lisis.[43]

Existen también algunos estudios llevados a cabo con cultivos mixtos. Morsen y
Rehm [36] estudiaron un cultivo mixto de Psuedomonas putida y Cryptococcus
elinovii para degradar fenol. Oh et al.[38] reportan un cultivo mixto de una bacteria
conocida y un lodo para el tratamiento de aguas residuales. También, Wiesel et al.
[50] usaron 5 tipos de bacterias para tratar hidrocarburos aromáticos policíclicos.
En estos estudios varias interacciones entre estos microorganismos pudieron ser
analizadas

Arthrobacter chlorophenolicus A6 es un actinobacterium Gram positivo que fue


aislado previamente de una mezcla del suelo enriquecida con el aumento de
concentraciones de 4-clorofenol (4CF) [49]. Esta bacteria puede degradar
concentraciones inusualmente altas de 4-CF hasta 2.7 mM y otros fenoles p-
substituidos, tales como 4-nitrofenol y 4-bromofenol [49]. Además, A.
chlorophenolicus A6 puede degradar 4-CF a bajas temperaturas (5°C) y durante
fluctuaciones entre 28°C y 5°C [6]. La A6 fue marcada previamente con los genes
del marcador que codificaban la proteína fluorescente verde (gfp) o luciferasa (luc)
para establecer específicamente su capacidad de sobrevivir en suelo no estéril
degradando 4-CP [20]. Las células marcadas con luciferasa sobrevivieron bien y
eran metabólicamente activas en el suelo contaminado con 4-CP [20,25]. Una

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fracción importante de la población microbiana se mantuvo viable después de la


incubación en suelo a 5°C [7].

II. Objetivos.

Objetivo General

Observar, describir y analizar la degradación de fenoles en cultivo en lote con un


consorcio microbiano especializado.

Objetivos Específicos

 Evaluar la degradación de un contaminante orgánico como el fenol


realizando ensayos a diferentes concentraciones (50, 100, 200, 400, 800 y
1000 mg/L) y control medio adicionado con Glucosa.

 Analizar la cinética de crecimiento bacteriano y obtener los parámetros de


velocidad de crecimiento y consumo de sustrato.

 Discutir el uso de microorganismo degradadores de fenol.

III. Materiales y Equipo

Materiales

Matraces Erlenmeyer de 250 ml para cada concentración y control

Tubos eppendorf para toma de muestra de la cinética (3 por muestra)

Filtros millipore con membrana de 0.22 um

Sol. Stock de Fenol 100 mg/ml

Sales para medio Basal

Equipo

Incubadora con agitación

Centrífuga

Espectrofotómetro

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Celdas plásticas

IV. Metodología

Inoculo y medio de cultivo.

El consorcio microbiano fue donado de la UAM-I de un proyecto de degradación de


solventes orgánicos. Como medio de cultivo se utilizó medio mineral basal (10X),
con las siguientes componentes (por litro de agua destilada): NH 4SO2, 3g; KH2PO4
0.60 g; K2HPO4 2.4 g; MgSO4 1.5 g; FeSO4 0.03 g/L. Usar el medio 10X para activar
el inóculo y 5X para los matraces de la cinética.

El medio será inoculado con 10% de del consorcio microbiano.

La práctica se llevara a cabo en matraces de 200 o 250 mL a los cuales se les


agregaran 125 mL de medio de cultivo estéril. Cada equipo preparará una
concentración diferente de contaminante. Se tomaran muestras diarias durante una
semana para determinar el crecimiento y la degradación. Es importante que las 3
primeras concentraciones tomen muestras cada 4 horas durante el día ya que el
consumos de sustrato es más rápido.

Técnicas analíticas

Determinación de consumo de sustrato. Espectrofotometría UV.

Los compuestos fenólicos seran analizados con una previa filtración a través de un
filtro de membrana de celulosa de 0.45 µm con el fin de capturar material
biológico para que no exista interferencia en las lecturas por espectrofotometría
usando espectrofotómetro UV Beckman DU 650 y UNICO. La absorbancia sera
medida a una longitud de onda de 254 nm.

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La biomasa producida se determinara en la región visible a 650 nm.

Se determinara la concentración final de CO2 por cromatografía de gases.

V. Resultados y Análisis de Resultados

a) Discute los resultados obtenidos en tu práctica.

 Consumo de sustrato (Fenol)

 Biomasa

b) Realice un análisis de consumo de sustrato a través del modelo de Monod.

c) Investigue y discuta la importancia de organismos degradadores de fenoles y su


uso industrial.

VI. CUESTIONARIO PREVIO (Entregar junto con la bitácora al inicio de la


práctica)

1. ¿Por qué se requiere degradar compuestos fenólicos?


2. ¿Cuál es el principio que se utilizara para la determinación del consumo de
sustrato?
3. ¿Cuál es el modelo de crecimiento bacteriano más conocido?
4. Describa los parámetros de dicho modelo.

VII. Conclusiones

Coloca las conclusiones de acuerdo a tus resultados y objetivos propuestos.

VIII. REFERENCIAS

 Tesis de Licenciatura. Héctor Huerta Arellanes. “Biodegradación de


compuestos fenólicos en agua mediante un biolavador”. UPIBI, Junio 2008.

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 Tesis
http://dgsa.uaeh.edu.mx:8080/bibliotecadigital/bitstream/231104/361/1/Biode
gradacion%20de%20fenol.pdf

 http://www.ingenieroambiental.com/4014/diazve.pdf

Práctica 4

PRODUCCIÓN DE BIOCOMBUSTIBLES (Biogás)

I.INTRODUCCIÓN

¿Qué son los biocombustibles?

A diferencia de los combustibles fósiles que provienen de la energía almacenada


durante largos períodos en los restos fósiles, los biocombustibles provienen de la
biomasa, o materia orgánica que constituye todos los seres vivos del planeta. La
biomasa es una fuente de energía renovable, pues su producción es mucho más
rápida que la formación de los combustibles fósiles.
Entre los cultivos posibles de utilizar para la elaboración de biocombustibles, están
los de alto tenor de carbohidratos (caña de azúcar, maíz, mandioca), las
oleaginosas (soja, girasol, palmas) y las esencias forestales (eucalipto, pinos).
La siguiente tabla resume los biocombustibles, que se pueden obtener a partir de
la biomasa:

Tipos de combustibles obtenidos de la biomasa

Sólidos Líquidos Gaseosos

Paja Alcoholes Gas de


Gasógeno
Leña sin procesar Biohidrocarburos
Biogás
Astillas Aceites vegetales y ésteres
derivados Hidrógeno
Briquetas
Aceites de pirolisis
Carbón vegetal

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Fuente: http://usuarios.lycos.es/biodieseltr/hobbies4.html

En gran parte del mundo, la leña (o carbón vegetal) que se obtiene a partir de la
madera sigue siendo el principal biocombustible empleado para la cocina, la
calefacción y la luz. Esta fuente de energía es un recurso renovable si se obtiene a
partir de bosques convenientemente reforestados. Asimismo, muchos vehículos
utilizan biocombustibles a base de metanol y etanol mezclado con gasolina. Se
puede obtener etanol a partir de la caña de azúcar, de la remolacha o el maíz. En
algunos países como la India y la China producen biogás a partir de la
fermentación natural de desechos orgánicos (excrementos de animales y residuos
vegetales).
La obtención de biocombustibles
Según la naturaleza de la biomasa y el tipo de combustible deseado, se pueden
utilizar diferentes métodos para obtener biocombustibles: procesos mecánicos
(astillado, trituración, compactación), termoquímicos (combustión, pirolisis y
gasificación), biotecnológicos (micro bacterianos o enzimáticos) y extractivos. En
la siguiente tabla se presenta una síntesis de estos principales procesos de
transformación y de los biocombustibles derivados, así como las aplicaciones más
frecuentes en cada uno de ellos. Cada uno de estos procesos se inicia con la
biomasa vegetal que se forma a partir del proceso de fotosíntesis, con el aporte de
la energía solar que captan y transforman estos organismos.

Proceso de obtención de biocombustibles

Mecánicos
Termoquímicos Biotecnológicos Extractivos
Astillado Pirolisis Gasificación Fermentaci Digestión Extracción
Técnicas ón anaerobia físico-
Trituración química
Compactació
n

Productos Leñas Carbón Gas de Etanol Biogás Aceites


gasógeno
Astillas Aceites Varios Co2, CH4 Ésteres

Briquetas Hidrocarburo
s
Aserrín

Aplicacion Calefacción Calefacción Calefacción Transporte Calefacción Transporte


es
Electricidad Electricidad Electricidad Industria Electricidad Industria
química química
Transporte Transporte

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Industria Industria
química química
Fuente: http://usuarios.lycos.es/biodieseltr/hobbies4.html

Cada técnica depende del tipo de biomasa disponible. Si se trata de un material


seco puede convertirse en calor directo mediante combustión, el cual producirá
vapor para generar energía eléctrica. Si contiene agua, se puede realizar la
digestión anaeróbica que lo convertirá en metano y otros gases, o fermentar para
producir alcohol, o convertir en hidrocarburo por reducción química. Si se aplican
métodos termoquímicos es posible extraer metanol, aceites, gases, etc. El método
de la digestión por el cual se obtiene biogás es el más empleado.

El Biogás
Casi tres mil millones de personas en el mundo emplean todavía la leña como
fuente de energía para calentar agua y cocinar, lo que provoca, entre otros
efectos, la pérdida de millones de hectáreas de bosques tropicales y zonas
arboladas.

En respuesta a esta situación surgen otras alternativas para obtener energía, entre
ellas, la producción de biogás a partir de la fermentación de la materia orgánica.
Para la obtención de biogás se puede utilizar como materia prima la excreta
animal, la cachaza de la caña de azúcar, los residuales de mataderos, destilerías y
fábricas de levadura, la pulpa y la cáscara del café, así como la materia seca
vegetal.

Esta técnica permite resolver parcialmente la demanda de energía en zonas


rurales, reduce la deforestación debida a la tala de árboles para leña, permite
reciclar los desechos de la actividad agropecuaria y, es un recurso energético
“limpio” y renovable.

El biogás que se desprende de los tanques o digestores es rico en metano que


puede ser empleado para generar energía eléctrica o mecánica mediante su
combustión, sea en plantas industriales o para uso doméstico.

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Digestor doméstico Digestor industrial

Las fotografías muestran digestores de uso doméstico y otros industriales para la


obtención de biogás. La primera instalación doméstica para producir biogás se
habría construido en la India alrededor del 1900. Actualmente funcionarían en ese
país alrededor de 200 mil biodigestores, y en China alrededor de 6 millones. Las
instalaciones industriales de producción de biogás emplean tanques de metal que
sirven para almacenar la materia orgánica y el biogás por separado. Debido al
gran volumen de materia orgánica que necesita para garantizar la producción de
biogás y la cantidad de biofertilizante que se obtiene, se diseña con grandes
estanques de recolección y almacenamiento construidos de ladrillo u hormigón.

Fuente: http://www.cubasolar.cu/biblioteca/energia/Energia22/HTML/articulo04.htm

El biogás se obtiene al descomponerse la materia orgánica debido a la acción de


cuatro tipos de bacterias, en ausencia de oxígeno:

a. las hidrolíticas, que producen ácido acético, compuestos monocarbonados,


ácidos grasos orgánicos y otros compuestos policarbonados;
b. las acetogénicas, productoras de hidrógeno;
c. las homoacetogénicas, que pueden convertir una cantidad considerable de
compuestos carbonados en ácido acético;
d. las metanogénicas, productoras del gas metano, principal componente del
biogás, con una proporción de 40 a 70 % de metano (CH4).

Algunas ventajas del empleo de biogás:


1. Permite disminuir la tala de los bosques al no ser necesario el uso de la leña
para cocinar.
2. Presenta diversidad de usos: alumbrado, cocción de alimentos, producción de
energía eléctrica, transporte automotor y otros.

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3. Produce biofertilizante rico en nitrógeno, fósforo y potasio, capaz de competir


con los fertilizantes químicos, que son más caros y dañan el medio ambiente.
4. Elimina los desechos orgánicos, por ejemplo, la excreta animal, contaminante
del medio ambiente y fuente de enfermedades para el hombre y los animales.

II. Objetivos

Objetivo General

Establecer un sistema para la producción de biogás a partir de residuos orgánicos.

Objetivo específicos

a) Conocer las fases de los consorcios microbianos durante la producción de


biogás.

b) Discutir los usos de fuentes alternativas de biocombustibles.

III. Materiales

Materiales

 botella plástica de dos litros de capacidad, con tapa


 manguera de goma
 pinza Mohr o llave para cerrar la manguera
 tapón de corcho agujereado por donde atravesar la manguera de goma o un
tubo de vidrio al que se unirá la manguera de goma
 mechero
 agua hervida (sin cloro)
 agua de cal (se utiliza para comprobar la presencia de dióxido de carbono).

Alternativa: Botella serológica de 125 ml pero se requerirá N 2 gaseoso para dejar


los sistemas en anaerobiosis.

Residuos de frutas, verduras u otros

Inóculos

Estiércol de caballo, de vaca o de aves y restos vegetales


Inóculo de biorreactor anaerobio

Equipo

 Incubadora a 37 °C

 Licuadora para fragmentar los residuos orgánicos

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 Cromatógrafo de gases para analizar las etapas en la producción de biogás


a partir de muestras de las botellas serológicas.

 Campana de extracción.

IV.Métodología: Producción de biogás.

El biogás es un gas producido por la acción de microorganismos sobre materia


orgánica de desecho, por ejemplo restos vegetales (cáscaras de frutas, hojarasca,
etc.) o estiércol (excremento de animales). Durante este proceso de
transformación de la materia los microorganismos obtienen energía mediante
diferentes procesos. Algunos de los microorganismos liberan dióxido de carbono
en el proceso de respiración, que otros microorganismos emplean en la
fermentación y producen metano que liberan al entorno.

El metano producido por este método es una fuente de energía alternativa,


denominada bioenergía, que puede reemplazar a las fuentes tradicionales de
energía.

Propósito de la actividad

La experiencia consiste en la construcción de un digestor de materia orgánica,


donde se podrá comprobar la producción de biogás por la acción de los
microorganismos anaerobios (bacterias metanógenas), que están presentes en los
desechos orgánicos. Mediante esta experiencia es posible demostrar la acción de
un tipo de microorganismos que se incluye en el grupo de los extremófilos: las
bacterias metanógenas que viven en ausencia de oxígeno.

Construcción del digestor de materia orgánica

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Armado del digestor

 colocar los restos orgánicos dentro de la botella hasta la mitad de su capacidad;


 llenar la botella con agua hasta cubrir la materia orgánica (y un poco más);
 cerrar la botella con el tapón que ya tiene atravesada la manguera o el tubo de
vidrio;
 además de poner el tapón se puede sellar la botella con una resina o con la
misma tapa a rosca de la botella (que debe estar perforada para que entre el
tapón) para evitar la fuga de gas o que el tapón se libere (ya que puede ser
despedido por la presión que ejerce el gas que se acumula en la botella);
 unir la manguera al mechero y cerrarla con la pinza.
 colocar la botella dentro de la incubadora para mantener la temperatura a 37-
40oC aproximadamente.
 Oprimir las botellas para desplazar el O2 y dejar paso al CO2 que se producirá
en la primer fase.
 Mantener vigilado el sistema durante la producción de biogás cuidando que no
se inflen demasiado y exploten. Para evitarlo desplazar continuamente el gas
producido dentro de una campana de extracción.

Desarrollo

 Al cabo de 7 - 10 días, aproximadamente, el líquido de la botella tendrá


burbujas. al tocar la manguera que la cierra, es posible comprobar que la
presión es diferente a ambos lados de la llave.
 Colocar el extremo de la manguera dentro de un recipiente con agua de cal.
Abrir la manguera para dejar salir el gas acumulado en la botella. Si el agua se
pone turbia indica que la manguera despidió dióxido de carbono que se produjo
en la botella. “Estrangular” la botella para sacar la mayor cantidad posible de
dióxido de carbono.
 Volver a cerrar la llave de la manguera.

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 A partir de este momento, habiendo poco oxígeno en la botella (consumido en


una primera etapa por la respiración de algunos microbios) se intensifica la
producción de gas metano por otro tipo de bacterias que no necesitan oxígeno.
La producción de biogás (metano) lleva varios días y, a medida que se produce,
la botella “estrangulada” se hincha.
 Para comprobar la producción de biogás abrir la llave de la manguera y prender
el mechero.

V. Resultados y Análisis de Resultados

a) Discuta la dinámica poblacional de los microorganismos presentes durante la


producción de metano.

b) Discuta los picos de gases obtenidos de un cromatógrafo de gases en cada


fase durante la producción de metano

c) Investigue y discuta las diversas fuentes alternativas de energía.

d) Investigue empresas relacionadas con la producción de biocompbustibles en


México.

e) Analice el uso de biogás como fuente alternativa de energía en sistemas


sustentables.

f) Describa que es sustentabilidad

VI. CUESTIONARIO PREVIO (Entregar junto con la bitácora al inicio de la


práctica)

a) ¿Cuál es el significado del término “bioenergía”?


b) ¿Cómo se denomina al tipo de bacteria responsable de la producción de
metano?
c) ¿Por qué será necesaria una temperatura de 40 oC para lograr la producción
de biogás?
d) ¿Se obtendrían los mismos resultados si se realizara esta experiencia a
0ºC o a 100ºC? ¿Por qué?
e) ¿A qué se debe la aparición de burbujas en el líquido y la presión que se
siente en la manguera a los 7-10 días de la experiencia?
f) ¿Por qué se debe eliminar del digestor el dióxido de carbono que se genera
en la primera etapa?
g) ¿Cuál es la ventaja de la utilización del biogás como fuente de energía?

VII. Conclusiones

Coloca las conclusiones de acuerdo a tus resultados y objetivos propuestos.

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VIII. REFERENCIAS

Actividad adaptada de El Libro de la Naturaleza y la tecnología 8, EGB. Editorial


Estrada (1998), y Biología II. Polimodal. Ecología y Evolución. Editorial Estrada
(2001) visto en cuadernos de biotecnología No 58.
(http://www.porquebiotecnologia.com.ar/educacion/cuaderno/ec_58.asp?
cuaderno=58)

PRACTICA 5
PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR DE COMPUESTOS
LIGNOCELULÓSICOS.

I. INTRODUCCIÓN

La creciente demanda energética por parte de la población mundial ha alcanzado


niveles que no pueden ser mantenidos con las actuales reservas de combustibles
fósiles. De acuerdo al informe de Fatih Birol, economista jefe de la Agencia
Internacional de la Energía (AIE), durante el World Energy Outlook 2007 (WEO
2007), “[…] La demanda energética mundial se incrementará en un 55%, con los
combustibles fósiles cubriendo el 84% de dicho aumento [...]”, lo cual “[...] se
traducirá para el 2030 en un aumento del 57% de las emisiones de CO2.” Ante
esto, la búsqueda de fuentes alternativas de energía ambientalmente sostenibles y

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económicamente rentables ha pasado ser el eje central de diversas


investigaciones. La CONAE ha realizado estudios en los cuales describe la
situación actual de las diversas fuentes de energía alternas, que se resumen en la
tabla 1.1:

Tabla 1.1. Fuentes alternas de Energía (CONAE, 2005)

Por su impacto mundial la CONAE ubica a las energías eólica, de biomasa y


geotérmica como las más prometedoras. De estas, la energía proveniente de
biomasa tiene como principal inconveniente su alto costo.

Los autotransportes cubren gran parte del consumo de energéticos derivados del
petróleo. Los alcoholes han sido utilizados como combustibles a partir de la crisis
del petróleo en los 70’s, por lo que diversos países implementaron programas
para el desarrollo de nuevos combustibles a partir de materias primas económicas,
accesibles y renovables. Así, desde 1980 el etanol es usado como un combustible
alterno en diferentes países. Existen tres métodos principales para la producción
de etanol (Morrison & Boyd, 1983). Estos son: (a) hidratación de alcanos
provenientes del cracking del petróleo; (b) hidrólisis quimica de compuestos
celulósicos ya sea en medios ácidos o básicos; y (c) Fermentación de

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carbohidratos. Estos métodos pueden clasificarse en sintéticos /químicos (a, b) y


biológicos (b, c), siendo este último grupo el que reporta menor impacto ambiental.
De esta forma, al etanol producido por estas vías se le conoce como bioetanol.

La transformación de azucares a etanol mediada por microorganismos ha


sido ampliamente estudiada, se lleva a cabo principalmente por levaduras y
bacterias acido-lácticas. Microorganismos como Saccharomyces cerevisiae,
Zymomonas mobilis y Escherichia coli han sido utilizados como modelos para
estos análisis, siendo la primera la levadura mas usada. El siguiente esquema
muestra de forma general la asimilación de azucares y su transformación a etanol
(fermentación alcohólica):

Figura 1.1 Mapa metabólico general para la producción de etanol. (a)


Ciclo de las pentosas fosfato; (b) Glucolisis; (c) Ciclo Entner-Doudoroff
(Zaldivar, 2001)

Como se aprecia en el esquema, la fermentación de azucares simples es proceso


relativamente sencillo, siendo glucosa, xilosa, manosa, arabinosa y galactosa los
azucares asimilados más fácilmente por las células. Las levaduras poseen una
maquinaria metabólica capaz de asimilar azucares complejos como dímeros

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(galactosa, sacarosa) o polímeros (celulosa, celobiosa, almidón), mediante la


síntesis de enzimas llamadas celulasas.

Dentro de las diversas formas de biomasa, la biomasa lignocelulosica es


considerada una excelente fuente de energía (y de carbono) debido a su gran
disponibilidad y bajo costo. En México, la industria azucarera genera alrededor de
6.5 km de toneladas métricas de bagazo de caña, compuesto lignocelulósico
considerado subproducto del proceso y utilizado comúnmente como combustible
en los ingenios azucareros. Comparando el rendimiento energético del bagazo de
caña contra el de etanol producido a partir del mismo así como el impacto
ambiental originado por la combustión de estos compuestos, el etanol resulta más
conveniente.

En una fermentación alcohólica, es posible obtener teóricamente 51.4 g de


etanol a partir de 100 g de glucosa 1 (Demirbaş, 2005), algunos estudios reportan
rendimientos porcentuales en base al teórico desde 10.6% (Tantirungkij et al.,
1993) hasta 102% (Ohta et al.,1991). Sin embargo, han sido pocos los estudios
realizados utilizando fuentes de carbono complejas y organismos diferentes a S.
cerevisiae, Z. mobilis o E. coli.

La producción de etanol se da bajo condiciones de anaerobiosis dentro de


un cultivo, aunque se ha comprobado la producción del alcohol en condiciones
aerobias muy especificas.

II. OBJETIVOS

General

Se evaluará la capacidad de la levadura Saccharomyces cerevisiae de


producir etanol a partir de diferentes compuestos.

Específicos

1
Cuando se trata de compuestos lignocelululósicos, se consideran los equivalentes de glucosa de acuerdo al
número de monómeros contenidos en el polímero.

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 Preparar diferentes medios de cultivo variando la fuente de carbono para el


crecimiento de la levadura S. cerevisiae en un sistema de lote.

 Monitorear la cinética de crecimiento de la levadura S. cerevisiae y la


producción de etanol en los diferentes medios preparados.

 Comparar los rendimientos obtenidos en cada ensayo.

III. MATERIALES Y MÉTODOS

Se conseguirá una cepa de S. cerevisiae comercial o de resiembra. Esta será


activada en medio complejo PDA. Se prepararán 100 mL de medio PDA y se
vaciaran las cajas (5). Sembrar la levadura por técnica de estría cruzada, a fin de
obtener colonias aisladas y asegurar la axenía de los experimentos. Incubar a
30°C hasta el inicio de las fermentaciones.

Para la producción de etanol, se probaran diferentes sustratos. Como base, se


usará glucosa, que servirá como referencia, y bagazo de caña. Se podrán elegir
disacáridos y polisacáridos dependiendo de la disponibilidad de los mismos:
xilosa, lactosa, sacarosa, etc. La composición del medio de cultivo en g/L es: 20
fuente de carbono, 2 (NH4)2SO4, 0.4 MgSO4 ∙7H2O, 5 KH2PO4, 1 extracto de
levadura.

La producción será por duplicado para cada fuente de carbono en matraces de


500 mL, cada uno con 250 mL de medio. Esterilizar en autoclave a 121°C por 15
min. En condiciones estériles, inocular los matraces con al menos 3 colonias de la
levadura previamente reactivada e incubar a 30°C y 150 rpm durante una semana.
Diariamente tomar al menos 3 muestras para evaluar el estado del cultivo.

Se determinará el crecimiento celular por absorbancia a 620 nm, usando como


blanco agua. El etanol producido será cuantificado por técnica de microdifusión..
El ensayo se realizara en dos tubos colocados uno dentro del otro. En el
compartimiento exterior (tubo ancho) se colocará 0.5 ml de solución saturada de
carbonato de potasio que causará que el alcohol sea menos soluble en la solución
acuosa. Por otro lado se prepara el compartimiento interior (tubo angosto) que

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contendrá 1.0 ml de solución de dicromato de potasio 0.145 % en ácido sulfúrico


10 N y se coloca dentro del tubo ancho con la ayuda de una pinza; en presencia
de esta solución el etanol es oxidado a ácido acético y el Cromo pasa a Cr3+
cambiando su color de amarillo anaranjado a transparente. Una vez preparado el
dispositivo se agrega al compartimiento exterior 0.1 ml de solución standard o
muestra y se tapa con un tapón de goma. Se incuba 60 min a 45°C, se saca el
tubo angosto y se le agrega 0.5 ml de agua destilada y se mide la absorbancia a
450 nm.

Reportar el rendimiento de producción de etanol para cada una de las fuentes de


carbono y elaborar un análisis de resultados detallado, en el que se comparen los
resultados obtenidos y las conclusiones respectivas.

V. Resultados y Análisis de Resultados

VI. CUESTIONARIO PREVIO (Entregar junto con la bitácora al inicio de la


práctica)

1. ¿Cuál es la importancia de obtener etanol a partir de compuestos


lignocelulósicos?
2. ¿En qué consiste la técnica de microdifusion de Conway?
3. Describa el proceso de fermentación alcohólica y mencione por que no se
requiere oxigeno para este ensayo.
4. ¿Qué desventaja tiene la producción de alcoholes a partir de biomasa
lignocelulosica? ¿Cómo se puede resolver este problema?
5. Investigue los rendimientos reportados en la producción de etanol a partir de
distintos sustratos como los usados en esta práctica.

VII. Conclusiones

Coloca las conclusiones de acuerdo a tus resultados y objetivos propuestos.

VIII. REFERENCIAS

- Gong, C.; Chen, L; Flickinger, M; et al. 1981. Production of Ethanol from D-Xylose by
Using D-Xylose Isomerase and Yeasts. Applied and Environmental Microbiology. 14 (2): 430-
436.
- Alterthumb, F and Ingram, L. 1989. Efficient Ethanol Production from Glucose, Lactose,
and Xylose by Recombinant Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 55 (8):
1943-1948.
- Himmel, M. and Sheehan, J. 1999. Improved Cellulases for Bioethanol Production.
Biotechnology Center for Fuels and Chemicals.

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- P. Escalante-Minakata 1 , H.P. Blaschek 2 , A.P. Barba de la Rosa 1 , L. Santos 1 and A. De


León-Rodríguez 1. Identification of yeast and bacteria involved in the mezcal fermentation of
Agave salmiana. Letters in Applied Microbiology. Volume 46 Issue, Pages 626 - 630
- Ostergaard, S., Olsson, L., Nielsen, J. Metabolic engineering of Saccharomyces
cerevisiae. Microbiol. MolBiol. Rev. 64 (2000) 34-50.
- Walker, G.M. Yeast Physiology and Biotechnology. John Wiley and Sons, Chichester,
1997.
- Demirbaş, A. 2005. Bioethanol from Cellulosic Materials: A Renewable Motor Fuel from
Biomass. Energy Sources, 21:327-337.
- Zaldivar, J.; Nielssen, J.; and Olsson, L. 2001. Fuel ethanol production from lignocellulose:
a challenge for metabolic engineering and process integration. Appl Microbiol Biotechnol.
56:17–34.
- Sun, Y.; Cheng, J. 2002. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a
review. Bioresource Technology. 83 : 1–11.

Práctica 6

“DETERMINACIÓN DEL KLA POR EL MÉTODO DEL SULFITO”

I. INTRODUCCIÓN

La concentración de oxígeno disuelto en una suspensión de microorganismos


aeróbicos depende de diferentes factores:

 Velocidad de transferencia de oxígeno de la fase gaseosa al líquido.


 Velocidad a la cual el oxígeno es transportado a las células (donde este es
consumido).
 La concentración de oxígeno utilizado por los microorganismos para el
crecimiento, mantenimiento y producción.

Los biorreactores de tanque agitado y las columnas burbujeadas son los


biorreactores más utilizados en bioprocesos.

 Los biorreactores agitados mecánicamente presentan altos valores de


transferencia de masa y energía, así como excelente mezclado.

 Velocidad de agitación
 Tipo y número de agitadores
 Flujo de gas

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 Las columnas burbujeadas y airlift presentan bajos esfuerzos de corte lo


cual es importante para aquéllos cultivos sensibles a los esfuerzos de corte
(células filamentosas).

La transferencia de materia gas-líquido en un bioproceso está fuertemente


influenciada por las condiciones hidrodinámicas del biorreactor que principalmente
dependen de la disipación de la energía:

 Condiciones de operación
 Propiedades fisicoquímicas del cultivo
 Parámetros geométricos del biorreactor
 Presencia de oxígeno consumido por las células

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La transferencia de oxígeno frecuentemente es el paso limitante en los


bioprocesos aeróbicos debido a su baja solubilidad en el medio de cultivo.

Las correctas mediciones y/o predicciones del coeficiente volumétrico de


transferencia de masa (kla) es un paso crucial en el diseño, operación y
escalamiento de biorreactores.

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La concentración de saturación de oxígeno se sitúa en las condiciones normales


de cultivo alrededor de 10 mg/L, concentración de todo insuficiente para abastecer
un proceso aerobio.

La ecuación básica para describir el transporte entre fases considera que la


densidad de flujo de propiedad (en este caso transporte de oxígeno) es
proporcional al gradiente de concentraciones quedando definido un coeficiente
individual de transferencia de materia entre fases kL según:

NO2=KL (CL-Ci)

NO2=Densidad de flujo de oxígeno entre fases, moles/s m2.

CL=Concentración de oxígeno en la fase líquida.

Ci=Concentración de oxígeno en la interfase.

Si se utiliza el coeficiente global KL y se expresa la velocidad de transferencia de


oxígeno por unidad de volumen de reactor N”O2 la ecuación se transforma en:

NO2=kLa (CL-C*)

C*= Concentración de oxígeno en la fase líquida correspondiente a la saturación.

a= Relación área interfacial/Vólumen de reactor (m2 de interfase/m3 reactor)

En cuanto al consumo del oxígeno por parte de la biomasa se define la velocidad


específica de consumo de oxígeno QO2, como el oxígeno consumido por unidad
de biomasa y de tiempo.

En un cultivo en estado estacionario han de igualarse las velocidades de consumo


y transferencia, por tanto:

NO2=QO2 .X

X=Concentración celular

La velocidad de consumo puede expresarse en función de la velocidad específica


de crecimiento: Mx y del rendimiento biomasa/oxígeno, Y X/O de forma que:

Kla (CL-C*)=Mx . X/Yx/o

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Esta ecuación relaciona la capacidad de transferencia del reactor (Kla) con las
velocidades específicas de crecimiento que se pueden alcanzar en su interior.

La determinación del coeficiente será pues esencial para establecer la eficiencia


de aireación y cuantificar los efectos que las variables de operación tienen sobre el
transporte de oxígeno.

MÉTODOS INDIRECTOS PARA LA DETERMINACIÓN DEL KLA

La determinación del coeficiente en las condiciones reales de operación del


biorreactor, que contiene el medio de cultivo, la población celular etc., implica una
serie de requerimientos experimentales (preparación de medios, inoculación,
prevención de la contaminación, control del proceso a nivel celular etc) que
pueden obviarse si se trabaja con un sistema sintético libre de células, que
reproduzca lo más fielmente posible el sistema real.

 El objetivo del método indirecto es encontrar el valor del coeficiente de


transferencia y su dependencia de las condiciones hidrodinámicas en el
biorreactor, utilizando un sistema que tenga las mismas propiedades
reológicas que el sistema real, las mismas tendencias en la formación de
interfases y los mismos valores para la difusividad y solubilidad del oxígeno.
 La fiabilidad del valor del coeficiente dependerá de en qué medida se haya
conseguido esta similitud. Estos métodos utilizan la ecuación del balance
sin el término del consumo.

dC/dt=Kla (C*-C)

Así se puede establecer la capacidad de un biorreactor para la absorción de


oxígeno, haciendo burbujear aire a través de una solución a la que previamente se
le ha eliminado el oxígeno por desplazamiento de nitrógeno como se esquematiza
en la siguiente figura.

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MÉTODO DE SULFITO PARA LA DETERMINACIÓN DE KLA

Este método está basado sobre la reacción del sulfito de sodio, un agente
reductor, con el oxígeno disuelto para producir sulfato en la presencia de un
catalizador (usualmente un catión divalente de Cu++op Co++, la ecuación puede
ser expresada de la siguiente manera:

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II. Objetivos

OBJETIVO GENERAL: Conocer y entender los principios básicos del coeficiente


de transferencia de oxígeno (Kla) en los cultivos aerobios en suspensión.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

 Analizar el método para determinación del Kla por el método del sulfito.
 Analizar y discutir los métodos indirectos y directos que se utilizan en la
determinación del Kla.
 Estimar el Kla por el método del sulfitoII.

III.MATERIAL Y REACTIVOS

Soluciones:

1. Solución de Na2SO3 0.03 M Considerando una pureza del 98.3%, adicionar


3.78 g de Na2SO3 a un litro de agua destilada.

2. Solución de catalizador, CoSO4 La concentración final de catalizador tiene que


ser de 2.5 x 10-4 mol Co++/L. Para esto se debe preparar una solución stock de
CoSO4. Adicionar 0.736 g CoSO4 en 100 mL. Adicionar 5 mL de la solución stock
a 1 L de reactor. Esta solución se puede guardar.

3. Solución de yodo (preparar justo antes de realizar la determinación de sulfito)


En 50 mL de agua destilada adicionar 0.9 g de KIO3, 0.5 g de KI y 1.5 mL de
H2SO4. Agitar vigorosamente y dejar sedimentar. Evitar tomar residuos de las
sales formadas.

4. Solución de Na2S2O3-5H2O 0.02 M En 500 mL de agua destilada disolver 2.48


g de Na2S2O3-5H2O (4.96 g/L). 5. Solución de almidón 1% Adicionar 1 g de
almidón de papa a 100 mL de agua destilada, hervir por 2 minutos y dejar enfriar.
Preparar justo antes de realizar la determinación de sulfito.

EQUIPO

- Agitadora orbital

- Bureta

- Soporte Universal

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IV. METODOLOGIA

1. Una vez que los matraces contengan la solución de sulfito (50 y 100 mL según
corresponda en cada uno), se inicia la agitación/aireación a 100 rpm y a 200 rpm.
Se permite la saturación. Detener la agitación/aireación, y tomar una muestra de 1
ml.

2. Mezclar la muestra inmediatamente con 0.2 mL de solución de yodo. La


reacción de oxidación de sulfito se detiene.

3. Titular la muestra con la solución de tiosulfato de sodio hasta que el líquido se


torne amarillo claro. Añadir 1 mL de una solución de almidón (la solución se
tornará azul oscuro). Continuar la titulación hasta que la solución quede incolora.

4. Registrar los mililitros de tiosulfato utilizados y hacer los cálculos


correspondientes para determinar la concentración de sulfito remanente.

V. RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS

Discuta los resultados obtenidos:

 Obtención del kla por el método del sulfito.


 Estime el kla por este método
 Dibuje el diagrama para obtención del kla por este método
 Explique el fundamento de la técnica

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VI. REFERENCIAS

Cooper C.M., Fermstrom G.A., Millar S.A. 1944. Performance of agitated gas-liquid
contactors. Industrial and Engineering Chemistry. 36:504-509.

Kensy F., Zimmermann H.F., Knabben I., Anderlei T., Trauthwein H., Dingerdissen
U., Büchs Jochen. 2005. Oxygen transfer phenomena in 48-well microtiter plates:
determination by optical monitoring of sulfite oxidation and verification by real-time
measurement during microbial growth. Biotechnology and Bioengineering. 89: 698-
708.

Zhao S, Kuttuva SG, Ju LK. 1999. Oxygen transfer characteristics of multiple-


phase dispersions simulating water-in-oil xanthan fermentations. Bioprocess
Engineering. 20: 313-323.

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Práctica 7. “BIODISEL”

PRODUCCIÓN DE BIODISEL A PARTIR DE ACEITE VEGETAL

I. Introducción

El biodiesel representa una alternativa energética viable, práctica y económica. Es


un combustible renovable obtenido principalmente a partir de aceites vegetales,
animales y aceites reciclados (Fuente CONAE).

Es un líquido con tonalidad variable que puede ir desde un color amarillo claro
hasta oscuro. Capaz de mezclarse con el diesel de origen fósil ya que tiene una
viscosidad similar y con ello se reducen las emisiones de contaminantes de los
vehículos automotores. La mezcla del biodiesel se denota normalmente por “BXX”
donde “XX” representa el porcentaje de biodiesel que contienen la mezcla. Por
ejemplo: B20 es una mezcla de 20 % biodiesel y 80 % diesel, mientras que B5
está conformado por 5 % biodiesel y 95 % de diesel o bien B100 % formado por
solo biodiesel.

El proceso de fabricación o refinamiento del biodiesel es realizado mediante


transesterificación, donde un aceite vegetal o de grasa animal caliente reacciona
con un alcohol, en presencia de un catalizador (NLT_H feb 2006).Los
componentes de la reacción con aceite vegetal son mono-, di- y triglicéridos,
consisten en cadenas largas de carbón y átomos de hidrogeno o ácidos grasos.
Por ejemplo: el aceite de soya consiste en trioleína pura, la cual es un triglicérido
donde todas la cadenas de ácidos grasos contienen un acido oleico. Si la trioleína
reacciona con metanol a 120 ºF, usando hidróxido de potasio como catalizador
(KOH), el ester alcalino llamado metiloleato se formara junto con glicerol (C 3H8O3)
como un subproducto.

En la industria para producir biodiesel se utilizan grasas, cultivos oleaginosos, y la


grasa reciclada de los restaurantes (CONAE). Por lo que requiere menos energía
para su producción comparado con el diesel de origen fósil, pues 30 % de la
energía contenida en un galón de combustible es la requerida para producir
biodiesel a partir de aceite de soya. Su empleo como combustible es atractivo
puesto que es amistoso con el medioambiente, reduce las emisiones de monóxido
de carbono (CO), dióxido de carbono (CO 2), dióxido de sulfuro (SO2),
hidrocarburos (HC) y otros materiales que causan daño respiratorio.

Sin embargo, es necesario enfatizar que, aunque el proceso de transesterificación


es relativamente sencillo, el biodiesel hecho en casa o en laboratorio de docencia
no va generar un producto de alta calidad. Éste probablemente contendrá diversas
impurezas alcohol residual, humedad, aceite vegetal sin reaccionar (triglicéridos),

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mono y di-glicéridos sin reaccionar por completo, ácidos grasos libresy trazas de
métales provenientes del catalizador(Feb 2006).

II. Objetivos

III. Material

 Aceite vegetal usado (1 litro)


 Aceite vegetal nuevo (1 litro)
 Grasa de puerco (Manteca, 1 litro)
 Lámpara de alcohol
 Termómetro
 Botella de plástico PET
 2 embudos
 1 vaso de precipitado de 600 ml
 Recipiente para calentar el aceite
 Agitador de vidrio

Reactivos

 NaOH(catalizador)
 Metanol al 99 %

(NOTA: comparar el procedimiento con otra información)

IV. Metodología

Valoración del aceite

Con ayuda de tiras de pH identifica el pH del aceite. Tiende a ser de 1.5 y 3


siempre y cuando el aceite haya sido empleado debido a la temperatura que
alcanzó en la freidora, los alimentos que fueron cocinados en él y el tiempo que
fue empleado. Deberá ser de con la adición dedebe estar entre 8 y 9 (básico)

Preparación del metóxido.

Medir 200 ml de metanol con una probeta, añadirlo con ayuda de un embudo a la
botella de plástico PET.

Añadir con ayuda de embudo 3.5 g de hidróxido de sodio (NaOH) mezclar con
cuidado.

Calentar la botella y agitar por 1 min 5 veces en intervalos de 5 min (el NaOH se
disuelve en el metanol formando metóxido de sodio).

Preparación de la reacción

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a) Calentar el aceite a 55 °C y se vierte dentro de la batidora, añadir el


metóxido con mucho cuidado y mezclar durante 25 min.
b) Pasar la mezcla en botellas de dos litros y cerrarlas.
c) Dejar reposar durante siete días.
d) Una vez transcurrido este tiempo se podrán apreciar dos capas, una
oscura corresponde a la glicerina (parte de abajo) y la otra capa clara
estará por encima de la oscura y será el biodisel.
e) Decantar el biodiesel en un recipiente nuevo cuidando que la glicerina
quede en el otro.
f) Probar el Biodiesel obtenido en una lámpara de alcohol.
V. Resultados y Análisis de Resultados

Discute los resultados obtenidos en tu práctica.

VI.CUESTIONARIO PREVIO (Entregar junto con la bitácora al inicio de la


práctica)

1. Escribe la reacción del proceso de transesterificación utilizando una base


como catalizador.
2. ¿Qué tipos de catalizadores se pueden emplear para producir Biodiesel?
Da un ejemplo de cada uno.
3. ¿Por qué es indispensable que la pureza del metanol empleado sea alta?
4. Menciona al menos 5 ácidos grasos presentes en el biodiesel.
5. ¿Dónde puede utilizarse el biodiesel?
6. ¿Cuál es la producción anual de biodiesel en México?
7. Menciona 5 ventajas del biodiesel sobre el diésel de origen fósil.

VII. Conclusiones

Coloca las conclusiones de acuerdo a tus resultados y objetivos propuestos.

VIII. REFERENCIAS
 http://www.conae.gob.mx/work/sites/CONAE/resources/LocalContent/466/2/biodiesel.pdf

 http://www.corpoica.org.co/sitioweb/Documento/JatrophaContrataciones/CURSO-BIODIESEL.pdf

 http://www.olade.org/sites/default/files/CIDA/IICA/Manual_Biocombustibles_ARPEL_IICA.pdf

 http://www.olade.org/sites/default/files/CIDA/Biocomustibles/Otros/Proceso%20de%20Produccion%20de
%20Biodiesel%20(Modelo%20de%20Peru).pdf

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