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Marco teórico:

Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-
oral utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con
microorganismos que funcione como indicador de contaminación fecal. Estos
deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben
tener una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y debe de ser
capaces de desarrollarse extra intestinalmente.

El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal,


sin embargo, las características de sobrevivencia y la capacidad para
multiplicarse fuera del intestino también se observan en aguas potables, por lo
que el grupo coliforme se utiliza como indicador de contaminación fecal en
agua; conforme mayor sea el número de coliformes en agua, mayor será la
probabilidad de estar frente a una contaminación reciente.

Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se
multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un
significado distinto al que recibe en el agua. En productos alimenticios que han
recibido un tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.), se
utilizan como indicadores de malas prácticas sanitarias.

Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogéneo con hábitat


primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que involucra.

El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos


Gramnegativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que
fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a
35°C ± 1ºC. Este grupo está conformado por 4 géneros principalmente:
Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.

El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas


capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h. de incubación
a 44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la
más prominente es Escherichia coli.
La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse
mediante el empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con características
selectivas y diferenciales.

Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado


dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), existe como
comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, hay
algunas cepas de E. coli patógenas que provocan enfermedades diarreicas.
Estas E. coli se clasifican con base en las características que presentan sus
factores de virulencia únicos, cada grupo provoca la enfermedad por un
mecanismo diferente. Las propiedades de adherencia a las células epiteliales
de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en
plásmidos. De manera similar las toxinas son mediadas por plásmidos o fagos.

Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E.


coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli
enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli entero
agregativa (EAEC) E. coli entero adherente difusa (DAEC). Existen otras cepas
que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4
primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua
y alimentos contaminados.

Escherichia coli enterotoxigénica ETEC es reconocida como el agente


causal de la diarrea del viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con
o sin fiebre. Este tipo de infecciones es muy frecuente en países
subdesarrollados y afecta principalmente a los niños.

Patogénesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una


toxina termolábil de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y
función es similar a la toxina del cólera, la otra toxina que produce es
termoestable y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de resistir
temperaturas de ebullición hasta por 30 minutos.

La infección puede ser adquirida por el consumo de alimentos como vegetales


frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido
calculada en aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jóvenes y
ancianos la dosis infectiva puede ser más baja.
Escherichia coli enteropatógena ECEP. Es causa importante de diarrea en
los lactantes particularmente en los países en vías de desarrollo. La ECEP se
adhiere a las células de la mucosa del intestino delgado. Sus factores de
virulencia favorecen la adhesión y en ocasiones penetra a las células mucosas.
La infección por ECEP provoca diarrea acuosa generalmente autolimitada
aunque en ocasiones puede ser crónica.

Patogénesis. El microorganismo produce dos proteínas: la intimina que es


codificada por el gen eae y un factor de adherencia que es codificado por un
plásmido, ambas proteínas permite su unión a los enterocitos y la destrucción
de las microvellosidades intestinales.

Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de


agua contaminada y productos cárnicos. En estudios con voluntarios se
encontró que la dosis infectiva es de 106 microorganismos. La diarrea por ECEP
se ha vinculado con múltiples serotipos específicos de E. coli los cuales pueden
ser identificados mediante la tipificación del antígeno O (somático) y en
ocasiones del antígeno H (flagelar).

Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra


estrechamente relacionado con el género Shigella, produce una enfermedad
similar a la shigelosis. La enfermedad se presenta comúnmente en niños de
países subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares. La EIEC
provoca la enfermedad (diarrea disentérica invasiva) al invadir las células
epiteliales de la mucosa intestinal.

A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos,


en el caso de EIEC la dosis infectiva es de aproximadamente 10 6 bacterias.
Algunas características importantes de este microorganismo que permiten
diferenciarlo de la cepa típica de E. coli son: No utiliza la lactosa como fuente
de carbono, no descarboxilan la lisina, es inmóvil y anaerogenicos.

La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y


destruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los
fagolisosomas.

Escherichia coli enterohemorrágica EHEC produce verotoxina, denominada


así por su efecto citotóxico sobre las células Vero, una línea de células renales
de monoverde africano. Existen al menos dos variantes antigénicas de la toxina.
La ECEH se ha asociado con colitis hemorrágica, una variedad grave de
diarrea; y con el síndrome urémico hemolítico, enfermedad capaz de producir
insuficiencia renal aguda, anemia hemolítica microangiopática y
trombocitopenia. La verotoxina tiene muchas propiedades similares a la toxina
shiga producida por algunas cepas de Shigella dysenteriae tippo 1; De los
serotipos de E. coli que producen la verotoxina el más común y el único que
puede identificarse en muestras clínicas es el O157:H7. La E. coli O157:H7 no
emplea sorbitol y es negativa a la prueba de MUG.

La causa más común de esta infección es el consumo de carne sin cocinar o


poco cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes
cantidades. Los casos de colitis hemorrágica y sus complicaciones asociadas
pueden prevenirse mediante la cocción completa de la carne

En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y síntomas causados por


las cepas de Escherichia coli antes descritas.
Propiedades y síntomas causados por algunas cepas de Escherichia coli
patógenas
ETEC EPEC EHEC EIEC
Toxina Lábil/estable - Shiga o vero -

Invasiva
- - - +

Intiminas
- + + -

Enterohemolisina - - + -

Aspecto de las Aguadas Aguadas Aguadas muy Mucoides y


heces sanguinolentas sanguinolentas sanguinolentas
Presencia de
leucocitos en - - - +
heces
Fiebre baja + - +

Intestino Colon y parte


involucrado Delgado Delgado Colon baja del
delgado
Dosis infectiva Alta Alta baja Alta
Serotipos O26, O111 y O157:H7, O26,
varios Varios
otros O111 y otros

EQUIPOS Y MATERIALES:
a) Una autoclave
b) Un horno de aire caliente o estufa para esterilización
c) Un potenciómetro o cinta de pH universal
d) Una incubadora, con una temperatura de incubación de 35 +- 0.5°C,
con termostato y termómetro.
e) Un equipo de baño María, con una temperatura de reincubación de 44.5
+- 0.2 °C, con termostato y termómetro.
f) Un sistema de filtración.
g) Una bomba de vacío, frasco Erlenmeyer kitazato de un litro, mangueras
de conexión, equipo de multiplicación, porta filtro previamente
esterilizado (contiene Embudo en parte superior que se une o sujeta
con el soporte poroso o base
h) Placas de Petri de 60 milímetros x15 milímetros esterilizadas,
identificadas con el número de la muestra, así como el volumen de
muestra que va a ser filtrado.
i) Frascos de muestreo de vidrio y boca ancha estéril conteniendo agua
de dilución para enjuagar porta filtro.
j) Membranas filtrantes esterilizadas, de 47 milímetros de diámetro y una
porosidad de 0.45 micrómetros.
k) Frascos de dilución de 100 mililitros de boro silicato de vidrio neutro,
tapa rosca, con 90 mL de agua peptonada, auto clavada.
l) Pinza sin dientes.
m) Algodón, alcohol.
n) Pipetas estériles de 10 y 1 mililitros.
o) Estereoscopio o contador de colonias.
p) Refrigeradora.

Soluciones y medios:

 Agar Endo-LES (para coliformes totales).


 Agar m-FC (para coliformes termo tolerantes).
 Etanol al 95%.
 Ácido rosólico al 1% en NaOH al 0.2N.
 Agua destilada para la preparación de los medios y agua de dilución.
 Agua de dilución estéril (agua peptonada al 0.1%).

PROCEDIMIENTO ANALÍTICO
1. Preparar el sistema de filtración según indica la figura colocar un matraz
de seguridad (Kitazato) entre la bomba de vacío y el equipo de
multifiltración que sostiene la porta filtros. El porta filtros debe estar
estéril y frío.

2. Prepara las placas Petri estériles. Distribuir entre 3 y 5 mililitros del agar
licuado (a 45°C aproximadamente) a la placa de Petri estéril. Taparla y
dejar solidificar el medio antes de proceder al análisis. Identificar las
placas con lápiz de vidrio o tinta indeleble.
3. Retirar la parte superior de la porta filtros y, con una pinza previamente
desinfectada con alcohol y flameada al mechero y fría, colocar un filtro
de membrana estéril, con la cara cuadriculada hacia arriba y en el centro
de la parte superior de la porta filtros.
4. Acoplar la parte superior del porta filtros, teniendo cuidado de no dañar
la membrana.

5. Homogenizar la muestra, agitar un número no menor de 25 veces,


inclinando el frasco y formando un ángulo de 45°C entre el brazo y el
antebrazo.

6. Verte 30 mililitros de agua de difusión estéril con el fin de humedecer la


membrana. Verter 100 mililitros de la muestra de agua (también hacer
diluciones colocando 10 mL de muestra en frasco con agua de dilución,
y 1 mL de muestra de agua en otro frasco con agua de dilución).
Encender la bomba de vacío y filtrar. Desconectar el vacío una vez que
haya pasado toda la muestra a través del filtro. En total se filtrará 100
ml de muestra original, 10 mL y 1mL, tanto para coliformes totales como
para coliformes fecales. Después de la filtración de cada muestra,
enjuagar la porta filtros tres veces con proporciones de 20-30 mililitros
de agua de dilución estéril, para evitar la retención de alguna bacteria
en las paredes internas.
Evitar que se seque la membrana. Apagar la bomba de vacío al finalizar
la operación.

7. Separar la parte superior de la porta filtros y, con una pinza


previamente desinfectada, flameada y fría, retirar la membrana
cuidando de que la pinza toque apenas la parte periférica, fuera del
área de filtración. Acoplar nuevamente la parte superior de la porta
filtros a la parte inferior.
8. Teniendo cuidado de no contaminar el filtro de membrana, colocarlo
cuidadosamente con la superficie cuadriculada hacía arriba, sobre el
agar del medio de cultivo (Agar ENDO- LES, y Agar medio FC).

9. Verificar que no se formen bolsas de aire entre la membrana y la


superficie del Agar. Si esto ocurre, levantar uno de los bordes del filtro
de membrana con una pinza estéril y, haciendo movimientos circulares,
deslizarlo con la finalidad de eliminar las bolsas, pues ellas impiden el
contacto de las bacterias con el medio de cultivo, y así se dificulta o
evita su crecimiento.
10. Tapar la placa de Petri, verificar la identificación de la placa con el
número de la muestra, dilución y fecha de siembra. Colocarla en forma
invertida; es decir, con la tapa hacia abajo.

11. Lavar nuevamente el filtro con agua de dilución estéril y proceder a la


siguiente filtración. Los porta filtro deben estar estériles en el inicio de
cada serie de filtraciones. Si hubo un intervalo de 30 minutos entre
una filtración y otra, los porta filtros deben ser esterilizados
nuevamente, para evitar la contaminación accidental.
12. Incubar las placas de Petri colocándolas en posición invertida; para el
caso de los coliformes totales (placas con agar ENDO LES), en una
incubadora con bandejas de papel toalla humedecido. La incubación
será a 35 +- 0.5°C durante 24 horas.

13. Las placas destinadas a la determinación de coliformes termo


tolerantes en medio, m-FC o agar m-FC pueden ser incubadas de dos
formas: en una incubadora con 100% de humedad o colocando las
placas selladas con para film y envueltas en globo, en una bolsa de
plástico impermeable con cierre hermético y sumergiéndolas en baño
María a 4405+-0.2°C durante 24 horas.
ANEXOS:

PARTES DEL SISTEMA DE FILTRACIÓN.

BIBLIOGRAFIA:

 GTC GUÍA TECNICA COLOMBIANA 84. 2003. Calidad del agua.


Guía para la orientación acerca de la validación de métodos de
análisis microbiológicos. Editado ICONTEC, Instituto Colombiano de
Normas Técnicas y Científicas.
 APHA-AWWA-WEF (2005) Standard Methods for the Examination of
Water and Wastewater. 21th Edition. New York, 9 -153, 154 y 158,
método 9610D.
 SCHARLAU (2006) Handbook of Microbiological Media. Edition No. 9,
Barcelona, pág. 99.